CN113848201B - 一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 - Google Patents
一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113848201B CN113848201B CN202111134955.2A CN202111134955A CN113848201B CN 113848201 B CN113848201 B CN 113848201B CN 202111134955 A CN202111134955 A CN 202111134955A CN 113848201 B CN113848201 B CN 113848201B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mnps
- tio
- nts
- electrode
- ulinastatin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229950008558 ulinastatin Drugs 0.000 title claims abstract description 48
- ODVKSTFPQDVPJZ-UHFFFAOYSA-N urinastatin Chemical compound C1C=CCCC11COC(C=2OC=CC=2)OC1 ODVKSTFPQDVPJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 108010088854 urinastatin Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 7
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 238000001354 calcination Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 43
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010036226 antigen CYFRA21.1 Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000018578 heart valve disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,该电致化学发光生物传感器为三明治型传感器,以钛片为基础,钛片直接氧化后分别结合Ab1、乌司他丁和Ab2进行响应,其制备方法包括以下步骤:获得TiO2NTs、制备Ab2/CC/MNPs、制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2NTs电极、构建用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器。本发明的有益之处在于:本发明制备得到的电致化学发光生物传感器对乌司他丁具有检出限低、灵敏度高以及抗干扰性能良好等显著优点,在免疫分析方面有着很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器,具体涉及一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,属于生物传感器技术领域。
背景技术
乌司他丁又称尿抑制素(Ulinastatin,UTI),是人体尿液中所含有的一种蛋白酶抑制剂,由若干氨基酸组成,表现出广泛的酶抑制作用。UTI通过抑制各种蛋白质、糖和脂解酶,可有效保护血管内皮和毛细血管的通透性,改善微循环的作用。目前,乌司他丁在中国、韩国、日本和印度被广泛使用。大量令人信服的证据表明,乌司他丁不仅能减少促炎细胞因子的释放,而且对冠心病、心脏瓣膜病、先天性心脏病等进行心脏手术的患者具有重要的器官保护作用。
目前,用来检测乌司他丁的方法很少,主要采用酶标法和放射性碘标记法,此两种方法对设备和检测条件要求都比较高,但灵敏度又不高。因此,我们迫切需要一种新型、简单、快速、具有高灵敏度和高选择性的检测乌司他丁的方法。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种新型的、具有高灵敏度和高选择性的用于简单、快速检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,前述电致化学发光生物传感器为三明治型传感器,以钛片为基础,钛片直接氧化后分别结合Ab1、乌司他丁和Ab2进行响应。
前述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,前述电致化学发光生物传感器是采用如下方法制备而来的:
第1步:获得TiO2 NTs;
第2步:制备Ab2/CC/MNPs;
第3步:制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极;
第4步:构建用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器。
前述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第1步中,采用阳极氧化法获得TiO2 NTs,具体包括以下步骤:
(1)清洗钛片:将裁剪好的钛片依次在乙醇和超纯水中各清洗5min,然后在由HF、HNO3和H2O以体积比1:4:5混合而成的混合酸溶液中继续超声1~5min,再在乙醇和水中各超声5min;
(2)阳极氧化:将清洗干净的钛片浸到质量浓度为0.5%的HF溶液中,在20V的直流电位下,以钛片为阳极,以铂片为阴极,两个电极之间的距离控制在3cm,室温下氧化2h;
(3)煅烧:将经过阳极氧化后的钛片在超纯水中超声清洗,用氮气吹干,然后放入马弗炉中500℃煅烧1h,冷却之后在超纯水中超声1min,4℃保存备用。
前述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第2步中,制备Ab2/CC/MNPs具体包括以下步骤:
(1)清洗和活化CC:取10mgCC溶于10mL含有250mg EDC和120mg NHS的1-甲基咪唑中,室温活化1.5h,清洗后离心分离CC,之后将CC放在10mL PBS中获得活化的CC;
(2)合成CC/MNPs:将上一步获得的活化的CC与200mg EDC和100mg NHS进行混合,室温放置1.5h,向混合物中加入300μL浓度为4.0mg/mL的Fe3O4 MNPs,室温继续放置2h,形成CC/MNPs纳米复合材料,将得到的混合溶液进行磁力分离,用乙醇洗涤固体数次,将该固体命名为CC/MNPs,将CC/MNPs用乙醇调成浓度为1.0mg/mL的溶液备用;
(3)合成Ab2/CC/MNPs:取1mL浓度为1.0mg/mL的CC/MNPs与150μL Ab2混合,在4℃反应12h,加入100μL质量浓度为3%的BSA溶液于混合溶液中,在4℃再反应4h,最后离心分离后将固体分散于1mL PBS中,得到Ab2/CC/MNPs分散液。
前述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第3步中,制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极具体包括以下步骤:
(1)活化草酸的羰基:将第1步合成的TiO2 NTs浸入1mL 3mM草酸溶液中,4℃反应5h,然后用水和PBS分别润洗两次,之后浸入到1mL含有20mg EDC和10mg NHS的1-甲基咪唑中,室温活化草酸的羰基1h,最后用PBS洗去TiO2 NTs上多余的EDC和NHS;
(2)制备Ab1/TiO2 NTs电极:将TiO2 NTs置于1mL Ab1中,4℃反应15h,然后将TiO2NTs置于1mL质量浓度为3%的BSA溶液中,4℃反应2h,得到Ab1/TiO2 NTs电极;
(3)制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极:将上一步制备得到的Ab1/TiO2 NTs电极先置于不同浓度的乌司他丁溶液中,37℃孵育1h,再置于1mL第2步制备得到的Ab2/CC/MNPs分散液中,室温孵育1h,之后用PBS和水冲洗,得到Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极,4℃保存待用。
前述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第4步中,构建用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器的方法具体如下:
将第3步制备得到的Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极作为工作电极,将Ag/AgCl电极作为参比电极,将铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,将前述三电极体系与MPI-E型电致化学发光分析系统相连,以0.05M K2S2O8和0.1M PBS为共反应剂,调节共反应剂的pH值至7.4,构成用于检测乌司他丁的ECL生物传感器。
本发明的有益之处在于:
(1)本发明制备得到的ECL生物传感器为三明治型传感器,只需将钛片直接氧化并分别结合Ab1、乌司他丁和Ab2进行响应,便可实现高灵敏度和选择性;
(2)本发明制备得到的ECL生物传感器对乌司他丁具有检出限低、灵敏度高以及抗干扰性能良好等显著优点,在免疫分析方面有着很好的应用前景;
(3)本发明提供的ECL生物传感器的制备方法简单、成本低廉。
附图说明
图1是制备Ab2/CC/MNPs和TiO2 NTs电极的原理图,其中,(A)是制备Ab2/CC/MNPs的原理,(B)是制备TiO2 NTs电极的原理;
图2是本发明获得的TiO2 NTs的扫描电镜图;
图3是共反应剂的pH值优化图;
图4是本发明制备得到的TiO2 NTs电极的ECL-时间图;
图5(A)是TiO2 NTs电极对不同浓度的乌司他丁的ECL强度响应图;
图5(B)是ECL强度差与不同浓度乌司他丁之间的线性关系图;
图6是本发明制备得到的TiO2 NTs电极的选择性图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明所述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其是采用如下方法制备而来的:
第1步:获得二氧化钛纳米管阵列(TiO2 NTs)
采用阳极氧化法获得TiO2 NTs,具体包括以下步骤:
(1)清洗钛片
首先,将裁剪好的钛片依次在乙醇和超纯水中各清洗5min,除去钛片的表面杂质。接着,将钛片在HF:HNO3:H2O=1:4:5(体积比)的混合酸溶液中继续超声1~5min。之后,将钛片依次在乙醇和水中各超声5min。最后,将钛片用氮气吹干备用。
(2)阳极氧化
取清洗干净的钛片的一段(1cm×0.7cm),浸到质量浓度为0.5%的HF溶液中,在20V的直流电位下,以钛片为阳极,以铂片为阴极,两个电极之间的距离控制在3cm,室温下氧化2h。
(3)煅烧
将经过阳极氧化后的钛片在超纯水中超声清洗,用氮气将钛片吹干,然后将钛片放入马弗炉中500℃煅烧1h,使TiO2由无定型变成排列整齐的TiO2 NTs,冷却之后将钛片取出,在超纯水中超声1min后放入冰箱4℃保存备用。
图2是本发明获得的TiO2 NTs的扫描电镜图(SEM)。
从图2中可以看出:经过阳极氧化,在钛片表面生成了一层垂直导向、排列规则的TiO2纳米管管状阵列,管径约为60~70nm。
本发明所获得的TiO2 NTs是一种化学性质稳定、比表面积大、量子效应高、对生物无毒的新型材料,其制备过程简单,成本低廉,并有很好的稳定性,与其他形态的TiO2相比,TiO2 NTs具有更大的比表面积和更强的吸附能力以及良好的生物相容性,虽然TiO2 NTs在光电化学领域、电化学催化领域的应用研究较多,但关于其在电化学发光方面的应用研究却很少。
第2步:制备Ab2/CC/MNPs
参照图1中的(A),制备Ab2/CC/MNPs具体包括以下步骤:
(1)清洗和活化CC
取10mg导电炭黑(CC),溶于10mL含有250mg EDC和120mg NHS的1-甲基咪唑中,置于室温活化反应1.5h,然后分别用水和乙醇交替清洗两次,离心分离CC,之后将清洗好的CC放在10mL PBS中,获得活化的CC,放入冰箱4℃保存备用。
(2)合成CC/MNPs
以EDC作为交联剂来组装CC和MNP,即将上一步获得的10mg活化的CC(放在10mLPBS中)与200mg EDC和100mg NHS进行混合,在室温下放置1.5h。接着,向混合物中加入300μL浓度为4.0mg/mL的Fe3O4 MNPs,室温下继续反应2h,形成CC/MNPs纳米复合材料。最后,将得到的混合溶液进行磁力分离,保留固体,并用乙醇洗涤固体数次,将经乙醇洗涤后的固体命名为CC/MNPs,之后将CC/MNPs用乙醇调成浓度为1.0mg/mL的溶液备用。
(3)合成Ab2/CC/MNPs
取1mL浓度为1.0mg/mL的CC/MNPs与150μL Ab2混合,得到混合溶液,在4℃条件下反应12h,为了封闭活性位点,再加入100μL质量浓度为3%的BSA溶液于混合溶液中,再在4℃条件下反应4h,最后离心分离后将固体分散于1mL PBS中,得到Ab2/CC/MNPs分散液。
第3步:制备TiO2 NTs电极
参照图1中的(B),制备TiO2 NTs电极具体包括以下步骤:
(1)活化草酸的羰基
将第1步合成的TiO2 NTs浸入1mL 3mM草酸溶液中,在4℃条件下反应5h,然后用水和PBS分别润洗两次,之后将润洗好的TiO2NTs浸入到1mL含有20mg EDC和10mg NHS的1-甲基咪唑中,室温活化草酸的羰基1h,最后用PBS洗去TiO2 NTs上多余的EDC和NHS。
(2)制备Ab1/TiO2 NTs电极
经PBS冲洗后,将TiO2 NTs置于1mL Ab1中,在4℃条件下反应15h,然后将TiO2 NTs置于1mL质量浓度为3%的BSA溶液中,在4℃条件下反应2h以封闭活性位点,得到Ab1/TiO2NTs电极。
(3)制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极
将制备得到的Ab1/TiO2 NTs电极先置于不同浓度的乌司他丁溶液中,37℃孵育1h,再置于1mL第2步制备得到的Ab2/CC/MNPs分散液中,在室温条件下孵育1h,之后用PBS和水冲洗,得到Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极(以下简称TiO2 NTs电极),在4℃条件下保存待用。
第4步:构建用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器(ECL生物传感器)
将第3步制备得到的TiO2 NTs电极作为工作电极,将Ag/AgCl电极作为参比电极,将铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,将所述三电极体系与MPI-E型电致化学发光分析系统相连,以0.05MK2S2O8和0.1M PBS为共反应剂,调节共反应剂的pH值至7.4,构成用于检测乌司他丁的ECL生物传感器。
关于共反应剂的pH值,事先配制了7份具有不同pH值的共反应剂(pH值分别为4.8、5.7、6.5、7.4、8.4、9.2、10.1),观察ECL生物传感器的强度。观察结果如图3所示。从图3可以看出:当共反应剂的pH值为7.4时,ECL生物传感器的强度最大。因此,本发明所使用的共反应剂的pH值为7.4。
本发明制备得到的ECL生物传感器为三明治型传感器,且只需将钛片直接氧化并分别结合Ab1、乌司他丁和Ab2进行响应,便可实现高灵敏度和高选择性。
利用本发明制备得到的ECL生物传感器检测乌司他丁的浓度时,采用循环伏安法,检测条件如下:
设置MPI-E型电致化学发光分析系统的扫描电位为-1.2~0V,扫描速率为100mV/s,光电倍增管高压为800V。
图4是本发明制备得到的TiO2 NTs电极的ECL-时间图。从图4中可以看出:在连续扫描13圈后,TiO2 NTs电极的稳定性良好。
图5(A)是本发明制备得到的TiO2 NTs电极对不同浓度的乌司他丁的ECL强度响应图,其中,乌司他丁的浓度分别为1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
图5(B)是ECL强度差(ΔI)与不同浓度(C)的乌司他丁之间的线性关系图,ΔI=2202.8logC+28800,R2=0.9883,其中,ΔI=I0–I,I0为组装乌司他丁后的ECL强度,I为组装Ab2/CC/MNPs后的ECL强度。
由图5(A)和图5(B)可知:该ECL生物传感器的检出限为1pg/mL。
图6是本发明制备得到的TiO2 NTs电极的选择性图。选择4种蛋白进行对比,这4种蛋白分别是:前列腺抗原特异性抗原(PSA)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、牛血清蛋白(BSA)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)。结果表明:该ECL生物生物传感器可准确地区分检测物与干扰物。
用本发明制备得到的ECL生物传感器,通过加标回收法,对小鼠血清中的乌司他丁进行检测。检测的结果见下表:
从上表中的检测结果可以看出:回收率在98.9%到102%之间,RSD在2.81%到6.08%之间,结果令人满意。这表明:该ECL生物传感器适用于血清中乌司他丁的检测。
综上,本发明制备得到的ECL生物传感器对乌司他丁具有检出限低、灵敏度高以及抗干扰性能良好等显著优点,在免疫分析方面有着很好的应用前景。
需要说明的是,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,所述电致化学发光生物传感器为三明治型传感器,以Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极作为工作电极,以Ag/AgCl电极作为参比电极,以铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,所述三电极体系与MPI-E型电致化学发光分析系统相连,以0.05M K2S2O8和0.1M PBS为共反应剂,共反应剂的pH值为7.4,其中,所述Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极以钛片为基础,钛片氧化成TiO2 NTs后直接结合Ab1、乌司他丁和Ab2/CC/MNPs,所述电致化学发光生物传感器是采用如下方法制备而来的:
第1步:获得TiO2 NTs;
第2步:制备Ab2/CC/MNPs;
第3步:制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极;
第4步:构建用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第1步中,采用阳极氧化法获得TiO2 NTs,具体包括以下步骤:
(1)清洗钛片:将裁剪好的钛片依次在乙醇和超纯水中各清洗5min,然后在由HF、HNO3和H2O以体积比1:4:5混合而成的混合酸溶液中继续超声1~5min,再在乙醇和水中各超声5min;
(2)阳极氧化:将清洗干净的钛片浸到质量浓度为0.5%的HF溶液中,在20V的直流电位下,以钛片为阳极,以铂片为阴极,两个电极之间的距离控制在3cm,室温下氧化2h;
(3)煅烧:将经过阳极氧化后的钛片在超纯水中超声清洗,用氮气吹干,然后放入马弗炉中500℃煅烧1h,冷却之后在超纯水中超声1min,4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第2步中,制备Ab2/CC/MNPs具体包括以下步骤:
(1)清洗和活化CC:取10mgCC溶于10mL含有250mg EDC和120mg NHS的1-甲基咪唑中,室温活化1.5h,清洗后离心分离CC,之后将CC放在10mL PBS中获得活化的CC;
(2)合成CC/MNPs:将上一步获得的活化的CC与200mg EDC和100mg NHS进行混合,室温放置1.5h,向混合物中加入300μL浓度为4.0mg/mL的Fe3O4 MNPs,室温继续放置2h,形成CC/MNPs纳米复合材料,将得到的混合溶液进行磁力分离,用乙醇洗涤固体数次,将该固体命名为CC/MNPs,将CC/MNPs用乙醇调成浓度为1.0mg/mL的溶液备用;
(3)合成Ab2/CC/MNPs:取1mL浓度为1.0mg/mL的CC/MNPs与150μL Ab2混合,在4℃反应12h,加入100μL质量浓度为3%的BSA溶液于混合溶液中,在4℃再反应4h,最后离心分离后将固体分散于1mL PBS中,得到Ab2/CC/MNPs分散液。
4.根据权利要求1所述的用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器,其特征在于,在第3步中,制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极具体包括以下步骤:
(1)活化草酸的羰基:将第1步合成的TiO2 NTs浸入1mL 3mM 草酸溶液中,4℃反应5h,然后用水和PBS分别润洗两次,之后浸入到1mL含有20mg EDC和10mg NHS的1-甲基咪唑中,室温活化草酸的羰基1h,最后用PBS洗去TiO2 NTs上多余的EDC和NHS;
(2)制备Ab1/TiO2 NTs电极:将TiO2 NTs置于1mL Ab1中,4℃反应15h,然后将TiO2 NTs置于1mL质量浓度为3%的BSA溶液中,4℃反应2h,得到Ab1/TiO2 NTs电极;
(3)制备Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极:将上一步制备得到的Ab1/TiO2 NTs电极先置于不同浓度的乌司他丁溶液中,37℃孵育1h,再置于1mL第2步制备得到的Ab2/CC/MNPs分散液中,室温孵育1h,之后用PBS和水冲洗,得到Ab2/CC/MNPs/Ab1/TiO2 NTs电极,4℃保存待用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111134955.2A CN113848201B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111134955.2A CN113848201B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113848201A CN113848201A (zh) | 2021-12-28 |
CN113848201B true CN113848201B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=78979883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111134955.2A Active CN113848201B (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113848201B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016150406A1 (zh) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | 中国科学院化学研究所 | 一种单层及多层空心碳纳米球、制备及其应用 |
CN109115751A (zh) * | 2018-08-15 | 2019-01-01 | 福建师范大学 | 针对呕吐毒素的TiO2-B整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建 |
CN109781714A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-21 | 福建师范大学 | 基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器对卵巢癌标记物的检测方法 |
CN110114664A (zh) * | 2017-02-09 | 2019-08-09 | 新加坡科技研究局 | 传感器 |
CN110927238A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-27 | 山东理工大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 |
WO2020099560A1 (en) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Danmarks Tekniske Universitet | Electrochemical sensor system comprising molecularly imprinted polymer for early warning of urinary tract infections |
CN112858266A (zh) * | 2021-01-23 | 2021-05-28 | 济南大学 | 一种基于g-C3N4-Au和ZnO@PDA-CuO的电化学发光传感器的制备及应用 |
CN113008971A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 重庆医科大学 | 一种基于PdIrBP介孔纳米球与科琴黑的循环肿瘤细胞生物传感器 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005040222A1 (en) * | 2003-10-16 | 2005-05-06 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies for detection of urinary trypsin inhibitors |
US10011549B2 (en) * | 2015-07-06 | 2018-07-03 | Robert Bosch Gmbh | Electrochemically active agents for pH modulation in biological buffers |
US20200217801A1 (en) * | 2019-03-18 | 2020-07-09 | Universiti Brunei Darussalam | Electrochemilumniscence immunosensor for detecting haptoglobin |
-
2021
- 2021-09-27 CN CN202111134955.2A patent/CN113848201B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016150406A1 (zh) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | 中国科学院化学研究所 | 一种单层及多层空心碳纳米球、制备及其应用 |
CN110114664A (zh) * | 2017-02-09 | 2019-08-09 | 新加坡科技研究局 | 传感器 |
CN109115751A (zh) * | 2018-08-15 | 2019-01-01 | 福建师范大学 | 针对呕吐毒素的TiO2-B整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建 |
WO2020099560A1 (en) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Danmarks Tekniske Universitet | Electrochemical sensor system comprising molecularly imprinted polymer for early warning of urinary tract infections |
CN109781714A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-21 | 福建师范大学 | 基于光热增强的比率型电致化学发光免疫传感器对卵巢癌标记物的检测方法 |
CN110927238A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-27 | 山东理工大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 |
CN113008971A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 重庆医科大学 | 一种基于PdIrBP介孔纳米球与科琴黑的循环肿瘤细胞生物传感器 |
CN112858266A (zh) * | 2021-01-23 | 2021-05-28 | 济南大学 | 一种基于g-C3N4-Au和ZnO@PDA-CuO的电化学发光传感器的制备及应用 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
A new biosensor based on the recognition of phages and the signalamplification of organic-inorganic hybrid nanoflowers fordiscriminating and quantitating live pathogenic bacteria in urine;Yuxia Li etc;《Sensors and Actuators B: Chemical》;第258卷;803–812 * |
A photoelectrochemical biosensor using ruthenium complex-reduced graphene oxide hybrid as the photocurrent signal reporter assembled on rhombic TiO2 nanocrystals driven by visible light;Lei Ge etc;《Analytica Chimica Acta》;第828卷;27-33 * |
An electrochemiluminescence sensor for the detection of prostate protein antigen based on the graphene quantum dots infilled TiO2 nanotube arrays;Chunyuan Tian etc;《Talanta》;第191卷;103-108 * |
Imidazole metal-organic frameworks embedded in layered Ti3C2Tx Mxene as a high-performance electrochemiluminescence biosensor for sensitive detection of HIV-1 protein;Yunfei Wang etal;《Microchemical Journal 》;20210426;第167卷;106332(1-10) * |
Self-luminescent europium based metal organic frameworks nanorods as a novel electrochemiluminescence chromophore for sensitive ulinastatin detection in biological samples;Xin Li etc;《Talanta》;第250卷;1-8 * |
基于AgNCs-Ce:ZONPs发光复合纳米材料的电致化学发光免疫传感器对肿瘤标志物灵敏检测的研究;陈茂鑫;周莹;袁若;;化学传感器(第01期);832-838 * |
基于自增强Ru(Ⅱ)复合物构建的新型电致化学发光免疫传感器检测甲胎蛋白;廖妮;;分析测试学报(第07期);832-838 * |
碳纳米材料修饰阳极电极对微生物燃料电池传感器水体毒性检测灵敏度的影响;余登斌 等;《分析化学》;20180815(第07期);1032-1038 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113848201A (zh) | 2021-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | Zirconium–metalloporphyrin frameworks as a three-in-one platform possessing oxygen nanocage, electron media, and bonding site for electrochemiluminescence protein kinase activity assay | |
Gong et al. | Self-assembled dipeptide–gold nanoparticle hybrid spheres for highly sensitive amperometric hydrogen peroxide biosensors | |
EP0068664B1 (en) | A heme protein immobilized electrode | |
WO2016041405A1 (zh) | Pd基复合纳米粒子及其制备方法 | |
Ahammad et al. | Immobilization of horseradish peroxidase onto a gold-nanoparticle-adsorbed poly (thionine) film for the construction of a hydrogen peroxide biosensor | |
CN102590305A (zh) | 一种电化学生物传感器敏感膜及其制备方法 | |
JP2009031283A (ja) | 共有結合性酵素を有するcmセンサ | |
CN113237928B (zh) | 一种检测乙肝病毒dna的电化学发光传感器及其制备与应用 | |
JPWO2003054536A1 (ja) | 活性酸素種用電極及び該電極を使用したセンサー | |
CN110514712A (zh) | 一种聚合离子液体修饰MXene纳米复合材料及其制备方法和应用 | |
Sun et al. | Amperometric glucose biosensor based on layer-by-layer covalent attachment of AMWNTs and IO4−-oxidized GOx | |
CN114152657A (zh) | 提高电化学活性的氧化还原酶及含有该氧化还原酶的生物传感器 | |
CN113848201B (zh) | 一种用于检测乌司他丁的电致化学发光生物传感器 | |
CN108680633A (zh) | 一种用于羟自由基检测的N-CNF/AuNPs基电化学生物传感方法 | |
CN107764886A (zh) | 三维石墨烯纳米复合材料的制备及手性识别色氨酸的方法 | |
CN113777144A (zh) | 用于胃液中多巴胺检测的电化学传感器及制备方法与应用 | |
CN110531087B (zh) | 基于MXenes-ZnO QDs的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光传感器 | |
CN113514511B (zh) | 卟啉修饰的氨基功能金属有机骨架的制备及在电化学发光中的应用 | |
CN115096963B (zh) | 一种用于检测cd44的电致发光传感器的制备方法 | |
KR101311776B1 (ko) | 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 이를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지 | |
CN108982623A (zh) | 一种核酸适体生物传感器及其制备与应用 | |
KR100726963B1 (ko) | 바이오센서용 우레아제 고정화막의 제조 방법 | |
Huang et al. | Fabrication of new magnetic nanoparticles (Fe3O4) grafted multiwall carbon nanotubes and heterocyclic compound modified electrode for electrochemical sensor | |
CN112730351A (zh) | 一种快速检测高锰酸钾溶液浓度的方法 | |
CN110441372B (zh) | 以多金属氧酸盐为电子供体的羟基氧化铁复合材料光电化学传感器的制备方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |