KR100726963B1 - 바이오센서용 우레아제 고정화막의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실리콘 웨이퍼상에 전기화학적 에칭 방법으로 다공질 실리콘 층을 형성시키는 단계; 상기 다공질 실리콘 층에 상대전극으로서 Ti와 Pt 박막을 RF-스퍼터링 방법으로 증착시키는 단계; 상기 Ti 박막위에 작업전극으로서 Au 박막 및 기준전극으로서 Ag 박막을 RF-스퍼터링 방법으로 증착시키는 단계; 및 상기 Au 박막에 3-머캅토프로피온산을 이용하여 자기조립단일층을 형성시키는 단계가 결합되어 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서용 우레아제 고정화막의 제조 방법에 관한 것으로, 3-머캅토프로피온산을 이용한 자기조립 단일층은 직접적인 전자전달로 인하여 낮은 요소 농도에서 뛰어난 감도와 빠른 반응 시간을 나타내며, 특히, 다공질 실리콘을 기질로 사용한 경우 평면 전극보다 약 3배 정도 감도가 증가하는 효과가 있다.
바이오센서, 자기조립 단일층, 다공질 실리콘, 요소
Description
도 1은 다공질 실리콘에 형성된 금 박막 전극에 대한 SEM 사진도를 나타낸 것이다.
도 2는 자기조립 단일층과 우레아제의 공유결합을 통한 고정화를 간략하게 도시한 것이다.
도 3은 다공질 실리콘층 형성, Au 및 Ag 박막 증착, 자기조립 단일층 형성, 우레아제 고정화 등의 반도체 공정에 대한 전체 공정도를 도시하였다.
도 4는 각 전극의 형태와 전극의 형태에 따른 전류량을 시간대 전류법으로 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 인산염 완충액에서 금 평면 전극과 다공질 실리콘을 기질로 한 전극의 순환전압전류곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 인산염 완충액에서 금 평면 전극과 다공질 실리콘을 기질로 한 전극 상에 자기조립 단일층을 형성한 후 순환전압전류곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 Urease/SAM/Au/PSi 층의 XPS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 시간대 전류법에 의한 요소 농도에 따른 센서 전극의 감도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 시간대 전류법에 의한 감도를 보정곡선으로 나타낸 것이다.
본 발명은 바이오센서용 우레아제 고정화막의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 3-머캅토프로핀온산(3-mercaptopropionic acid)으로 된 자기조립 단일층의 전기화학적 특성을 고찰하여 바이오센서의 고정화막으로 사용한 우레아제 고정화막의 제조 방법에 관한 것이다.
바이오센서는 효소, 생분자, 항체, 세포 등의 생물학적 재료를 인지 물질로 하여 측정하고자 하는 분석 대상(analyte) 과 높은 선택성으로 반응을 일으키게 하여 그 결과를 기존의 물리, 화학센서로 감지해내는 방식이므로 기존의 의료용 화학센서를 대체하는 추세이다.
바이오센서가 기존의 센서와 구별되는 점은 생물질의 선택적인 반응 및 결합을 이용하는 것이므로 바이오센서의 실용화에 있어서 가장 중요한 것은 생체반응물질의 고정화 기술과 고정화막의 선택이라 할 수 있다.
바이오센서의 고체 표면과 인지 물질 고정화 기술은 바이오물질의 구조적 변형 억제와 표면에서 고유한 역할을 수행하기 위한 공간 확보의 두 가지 관점에서 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 효소를 이용한 바이오센서는 고체 표면과 많은 결합을 할 수 있는 작용기로 인한 구조적 변형 및 입체장애에 의한 문제를 가지고 있다. 또한 흡착이나 entrapment 등의 물리, 화학적 방법을 이용한 고정화 기술은 효소가 가지는 활성자리의 배향을 일정한 방향으로 유지시키기 어려운 단점을 가지고 있다.
자기조립 단일층(self-assembled monolayer, SAM)은 분자간 강한 상호작용(van der Waals interaction)으로 인해 조밀하고 안정한 단일층을 쉽게 얻을 수 있어 바이오물질 고정화막 이외에도 부식 방지를 위한 보호막이나 반도체 공정의 패터닝을 위한 마스크로도 쓰인다. 최근에는 자기조립 단일층의 전기적 활성 특성을 이용한 전자 전달 메커니즘 연구와 트랜지스터의 게이트 물질로서 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
대표적인 바이오센서로서 일정전압법을 이용한 요소센서가 많이 연구되어 왔으나 낮은 농도에서의 감도 저하에 따른 단점으로 상용화에 이르지 못하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 요소센서에 이용하기 위한 고정화막으로서 3-머캅토프로피온산으로된 자기조립 단일층을 제조하고 이의 전기화학적 특성을 조사하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 반도체공정을 이용하여 평면 전극과 다공질 실리콘의 표면에 금 박막을 증착한 전극을 제작하고 자기조립 단일층을 금 전극 위에 형성시키고, 우레아제를 고정화시키기 위한 막으로 자기조립 단일층을 이용하고, 작업전극의 전기화학적인 특성을 관찰하고, 순환전압전류법으로 전극에 인가한 전압에 대한 전류 크기 변화를 고찰하고, 우레아제에 의해 분해된 요소의 양을 생성된 물의 전기분해로 발생하는 전류로 측정하는 간접적 방법인 시간대 일정전압법을 이용하 여 요소의 농도에 따른 감도를 측정함으로써 달성하였다.
본 발명은 평면 전극과 다공질 실리콘의 표면에 금 박막을 증착한 전극을 제작하는 단계; 자기조립 단일층을 금 박막 상에 형성하여 전기화학적인 특성을 관찰하는 단계; 순환전압전류법을 통해 전극에 인가한 전압에 대한 전류 크기 변화를 고찰하는 단계; 시간대 일정전압법을 이용하여 요소의 농도에 따른 감도 측정단계로 구성된다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 고정화막의 제조
요소센서의 우레아제 고정화막은 다음의 반도체 공정에 따라 제조하였다.
제 1단계: 다공질 실리콘의 형성
불순물로서 붕소가 도우핑된 비저항 14~17Ω·cm, (100), p-type 실리콘 웨이퍼를 RCA 표준공정으로 세척한 후 작업전극(산화전극)으로 하여 전기화학적 방법으로 다공질 실리콘 층을 형성시켰다. 이를 구체적으로 설명하자면,
RCA 세척공정은 RCA1 습식 세척공정과 RCA2 습식 세척공정 순으로 이루어진 다. RCA1 세척공정은 유기 오물을 제거하기 위한 것으로, NH3(25% 수용액)와 DI H2O를 1:5의 비율로 혼합한 다음 가열하여 H2O2를 첨가하고(NH3:H2O:H2O2=1:5:1), 10분 동안 웨이퍼를 침수시킨다. RCA2 세척공정은 금속이온을 제거하기 위한 것으로, HCl과 DI H2O를 1:6의 비율로 혼합하여 가열한 다음 H2O2를 첨가하고(HCl:DI H2O:H2O2=1:6:1), 10분 동안 웨이퍼를 침수시킨다. RCA2 세척공정은 특히 금속 오염이 없는 산화 및 확산로에 필요하다.
상기 두 세척공정들은 웨이퍼상에 얇은 산화물을 남겨둔다. Si 식각 전에 웨이퍼를 1% HF 수용액에 잠깐 담궈 산화물을 벗겨낸다. 산화물(친수성) 표면에 물을 분사하고, 베어 Si(소수성) 표면에 방울지게 한다. 이렇게 함으로써 잔여 산화물의 여부를 확인할 수 있다.
대부분의 IC 실험실에서는 웨이퍼를 미리 KOH에 노출시키는 공정을 금하고 있다. 왜냐하면 칼륨이 IC 제작 공정을 망칠 우려가 있기 때문이다. 비교적 덜 엄격한 환경에서는 RCA1과 RCA2를 이용한 웨이퍼 세척이 조심스럽게 허용되고 있다(After Madou, M.J., Fundamentals of microfabrication, CRC press, Florida, USA(2002)).
RCA 표준 세척공정 후, 다공질 실리콘 층을 형성하기 위해, 붕소가 도우핑되고 한쪽면이 연마된 비저항 14~17Ω·cm과 (100) orientation의 p-type 실리콘 웨이퍼를 시작물질로 사용하였다. 전기화학적 에칭을 통해 PSi 층을 실리콘 웨이퍼 상에 부착시켰다. 산화처리 시스템은 특별히 제작된 테프론 셀(Teflon cell), Pt(99.99%) 와이어 캐소드(wire cathode), 양극으로서 웨이퍼 그 자체와 전해질 용액으로 구성되어 있다. 전해질 용액의 조성은 부피비로 HF(49%, CMOS grade, J.T.Baker): C2H5OH(95%, Ep, Daejung): 2차 증류수=1:2:1이었으며, 고순도(99.99%)의 백금전극을 상대전극(환원전극)으로 사용하였다. 전류밀도는 -7mA/cm2로 유지하였다. 산화처리 시간은 5분 이내가 바람직하며, 300초 동안 실시하였다. PSi 기질을 400℃에서 고체 산소(dry oxygen)로 1시간 동안 산화시킨 다음, 15분 동안 같은 온도에서 질소로 어닐링 시켰다. 다음으로, AZ1512 광저항기(photoresister)는 400rpm에서 스핀 코터(spin coater)로 코팅시켰다.
상기와 같이, 전류밀도 일정 전류를 흘려주는 조건에서 다공질 실리콘 층을 형성시킨 결과 지름 2㎛, 깊이는 약 10㎛의 매우 균일한 다공질 실리콘 층이 형성되었다(도 1).
제 2단계: Au 및 Ag 박막 증착
상대전극(counter electrode)으로서 Ti와 Pt 박막을 RF-스퍼터링 방법으로 증착시켰다. 작업전극으로 사용하기 위한 Au 전극은 다공질 실리콘 층에 형성된 산화막과 Au 사이의 접착력 향상을 위하여 underlayer 로서 Ti를 약 200Å sputtering 하고 2,500Å의 Au를 evaporation하였다. 이때 진공 챔버의 베이스 압력은 2×105 mbar였으며, photoresist를 이용한 패터닝 공정을 고려하여 기판의 온도는 100℃ 이하로 유지하였다.
작업전극의 패터닝은 AZ-1512 positive photoresist를 이용하였으며, 식각은 포타슘 아이오다이드 용액(potassium iodide solution)을 이용하였다.
Pt 타겟(99.98% 순도, Heesung Metal Ltd.)은 진공 코터 시스템(vacuum coater system, Leybold, LS560, Korea basic science institute, Seoul branch)에 로딩하기에 적당한 9cm ×1.5mm이다.
기준전극의 제작을 위한 Ag 박막의 증착은 underlayer로서 Ti를 약 200Å sputtering하고 2,000Å의 두께로 evaporation하였다. 금속 증착에 이어 약 400℃에서 2시간 동안 열처리 공정을 수행하였다.
Ag 전극을 Ag/AgCl 기준전극으로 전환시키기 위해 전기화학적 방법을 사용하였다. 일명 "chloridation"이라 하는데, Ag 전극의 chloridation은 전위 범위를 0.6~1.2V로 하여 1 mmol/L NaCl 용액에서 전기화학적으로 수행하였다.
상기의 스퍼터링 조건은 아래 표 1에 요약하였다.
| 두께 | Ti: 200Å, Pt: 2,000Å |
| 기질 온도 | 100℃ |
| 베이스 압력 | 2×10-5 mbar |
| 기질-타겟 거리 | 40 mm |
| 스퍼터링 압력 | 5×10-3 mbar |
| 스퍼터링 전력 | 150 W |
| 스퍼터링 율 | 5Å/sec |
제 3단계: 자기조립 단일층의 형성과 우레아제 고정화
실리콘 웨이퍼 상에 증착된 금 박막 전극은 piranha solution(30% H2O:H2SO4=1:3)을 이용하여 80℃에서 약 5분간 세척하였다. 3-머캅토프로피온산(2 mmol/L, ACROS) 용액에 약 12시간 담가 자기조립 단일층을 형성하였다. 에탄올을 이용하여 충분히 세척한 후 NHS(3 mmol/L, N-hydroxysulfosuccinimide, Sigma Chemical Co.)와 EDC(100 mmol/L, 1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide, Sigma Chemical Co.)을 포함하는 0.1 mol/L 소듐 포스페이트 완충액(pH7.4)에 약 3시간 동안 반응시켰다. 인산염 완충액으로 세척한 후 0.1 mol/L 소듐 포스페이트 완충액(pH7.0) 용액에 희석시킨 5 mg/cm3 우레아제(EC 3.5.1.5, type III, from Jack Bean, Sigma Chemical Co.)용액에 24시간 정도 담가 실온에서 자기조립 단일층과 효소의 공유결합을 유도하였다. 그 후, 전극을 다음의 용액 순으로 완전히 세척하였다: 인산염 완충액(pH6.3), 1 mol/L NaCl, Milli Q Plus water 및 소듐 포스페이트 완충액(pH7.0).
도 2에는 자기조립 단일층과 우레아제의 공유결합을 통한 고정화를 간략하게 도시하였다. 도 3은 상기의 반도체 공정에 대한 전체 공정도를 도시하였다.
실험예 1: 전극 형태에 따른 체액에서의 전도도 비교
각 전극의 형태에 따른 체액에서의 전도도를 비교하기 위한 전극 구성을 도 4(a)와 같이 제작하여 특성을 비교하였다.
도 4(b)는 각 전극의 형태에 따른 전류량을 시간대 전류법으로 측정한 결과로써, 전극의 계면의 길이에 관계없이 전극의 면적에 비례하는 것으로 나타났으며, 작업전극을 중심으로 하여 양쪽에 기준전극과 상대전극이 위치하는, 도 4(a)에서 제시한, 4개의 전극 패턴 중 type 1이 가장 우수한 감도 특성을 보였다.
실험예 2: 작업전극의 전기화학적 특징 고찰
Au 평면 전극과 다공질 실리콘을 기질로 하는 전극의 전류량을 순환전압전류법으로 고찰하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 기질의 구조적 차이로 인한 표면적 증가와 전류량 증가가 비례함을 볼 수 있다. 평면 전극일 때 보다 약 10배 정도의 전류량의 증가가 관찰되었다.
도 6은 금 박막 전극에 자기조립 단일층을 형성하여 얻은 순환전압전류 곡선으로써, 단일층을 형성한 후 전류량이 떨어지는 것으로 보아 절연체로서의 특성을 관찰할 수 있었다.
실험예 3: 효소 고정화 막의 표면 분석
효소가 고정화된 작업 전극의 표면을 X-ray photoelectron spectroscopy로 표면 분석하였다. 도7의 (a)는 C 1s 영역의 스펙트럼이며, 각각 탄소와 산소의 이중결합, 탄소-산소 단일결합, 탄소-탄소 단일결합을 나타내는 피크를 관찰할 수 있다. (b)는 O 1s 영역의 스펙트럼으로 각각 탄소-산소 이중결합, 탄소-산소 단일결합에 의한 피크이다. (c)는 N 1s 영역의 스펙트럼으로 폴리펩티드 체인의 아미드 결합에 대한 질소의 결합세기를 나타낸다. XPS 스펙트럼으로 우레아제와 자기조립 단일층이 공유결합을 이루고 있음을 알 수 있다.
실험예 4: 감도 측정
일정 전압(600mV) 하에서 시간에 따른 세로토닌의 농도에 따른 전류의 변화를 조사함으로써 시간대 전류법에 의한 요소 농도에 따른 센서 전극의 감도를 조사하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 요소 농도의 증가에 따라 확산한계전류 또한 증가함을 알 수 있다. 특히 감도의 90%가 되는 지점의 시간이 약 20초 이내로써 빠른 반응 시간을 보여주었다. 이때, 전해질 용액의 조성은 KCl 0.1mol/L, PBS 1mmol/L이며, 수소이온 농도 7.4, 인가 전압은 600mV로 하였다.
도 9는 시간대 전류법에 의한 감도를 보정곡선으로 나타낸 것이다. 요소의 농도에 따라 확산한계전류가 선형적으로 증가함을 알 수 있다. 요소는 0μmol/L~100mmol/L의 범위에서 각각 농도별로 측정되었으며, Urease/SAM/Au/Porous Si(device 1)에서의 감도는 11.21 μA/mMcm2로 측정되었고, Urease/SAM/Au/Planar Si(device 2)에서의 감도는 4.39μA/mMcm2로 측정되었다. device 1의 경우 device 2 보다 약 3배에 가까운 감도의 증가를 가져오는 것을 볼 수 있었다.
상기 결과를 종합하여 보면, 반도체 공정을 이용하여 금 박막 전극을 제작하고 자기조립 단일층을 금 전극 위에 형성시키고, 자기조립 단일층은 우레아제를 고정화시키기 위한 막으로 이용한 결과, 전자 터널링 효과에 의해 20초 이내의 빠른 반응시간을 보였다. 각각의 기질을 다공질 실리콘과 평면 전극으로 달리하였을 때 표면적의 증가 효과에 의한 감도가 약 3배 증가하는 것을 보였다. 바이오센서에 이용되는 자기조립 단일층은 취급의 용이성과 단백질과 고체사이의 안정한 결합을 이루며 균일한 분자 박막을 이룰 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나, 결합할 수 있는 작용기가 많은 단백질의 경우 구조적 변형으로 단백질의 기능 상실 및 조밀한 쌓임으로 인한 입체장애효과 등의 단점을 보완하는 연구가 수행되어야 할 것이다.
상기 실시예와 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 바이오센서의 고정화막용 자기조립 단일층에 관한 것으로, 3-머캅토프로피온산을 이용한 자기조립 단일층은 직접적인 전자전달로 인하여 낮은 요소 농도에서 뛰어난 감도와 빠른 반응 시간을 나타내며, 특히, 다공질 실리콘을 기질로 사용한 경우 평면 전극보다 약 3배 정도 감도가 증가하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (2)
- 실리콘 웨이퍼상에 전기화학적 에칭 방법으로 다공질 실리콘 층을 형성시키는 단계;상기 다공질 실리콘 층에 상대전극으로서 Ti와 Pt 박막을 RF-스퍼터링 방법으로 증착시키는 단계;상기 Ti 박막위에 작업전극으로서 Au 박막 및 기준전극으로서 Ag 박막을 RF-스퍼터링 방법으로 증착시키는 단계; 및상기 Au 박막에 3-머캅토프로피온산을 이용하여 자기조립단일층을 형성시키는 단계가 결합되어 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서용 우레아제 고정화막의 제조 방법.
- 제1항의 방법에 따라 제조된 바이오센서용 우레아제 고정화막.
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