CN108982623A - 一种核酸适体生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

一种核酸适体生物传感器及其制备与应用 Download PDF

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CN108982623A CN201810500489.7A CN201810500489A CN108982623A CN 108982623 A CN108982623 A CN 108982623A CN 201810500489 A CN201810500489 A CN 201810500489A CN 108982623 A CN108982623 A CN 108982623A
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易喻
王敏君
梅建凤
陈建澍
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Abstract

本发明公开了一种核酸适体生物传感器及在检测内毒素中的应用，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。本发明有益效果主要体现在：本发明构建的核酸适体生物传感器用于细菌内毒素检测，构建简易，特异性高，检测限低，灵敏度达0.001EU/mL。所述细菌内毒素核酸适体生物传感器具有制备方便简单，易于操作，灵敏度高，检测限低等特点，可以进一步提高生物传感器的稳定性，进而使其具有广泛的应用前景。

Description

一种核酸适体生物传感器及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，属于生物技术领域，特别是生物传感器领域。
(二)背景技术
细菌内毒素在1892-1895年由Richard Pfeiffer从热灭活的霍乱弧菌(Vihriocholerae)溶解物中发现。内毒素的主要成分是脂多糖(LPS)，脂多糖又包括菌体多糖、核心多糖和类脂A(Lipid A)。类脂A是内毒素的主要活性成分，一种特殊的糖磷脂，是一种强免疫刺激因子，进入机体后作用于巨噬细胞，促使巨噬细胞产生多种细胞因子，引起发热，并造成心跳过速、休克、多器官功能衰竭等并发症甚至死亡。对机体的致热效应在临床上最为常见，内毒素致热非常敏感，作为外源性致热源，可引起内源性发热，同时它又可激活单核细胞，释放单核细胞因子形成内源性致热源，引起机体发热，中国药典对内毒素限量有着非常严格的规定，其中鞘内注射剂为0.2EU，放射性药品注射剂为2.5EU，每单位体重注射剂为5EU。因此检测和分离非肠道用药品尤其是注射针剂中的细菌内毒素成了生产工艺中的重要环节。近年来国内外报道革兰阴性菌感染有逐年增长的趋势，而内毒素作为革兰阴性菌的细胞壁结构成分，可使机体出现许多病理情况，因此建立一种能够对内毒素特异、灵敏的检测手段非常必要。上世纪90年代末期我国对生物传感器的研究开始发展，解决了材料的固定化技术、信号处理的电子技术，研发了一系列反应精确的分子装置，为生物传感器技术奠定了良好的技术基础。随着核酸适体作为生物传感器的敏感元件的优势越来越明显，基于核酸适体的生物传感器也成为国内外的研究热点。生物传感器所建立的分析方法主要包括两个大类，即光学检测和电化学检测。其中电化学分析技术作为一种灵敏度高、所需药品少、操作简单、便携和能在体检测等优点的检测手段，已经非常广泛的应用于生物传感器中，将其与核酸适体相结合构建新一代核酸适体电化学传感器，已成为分析与生命学科交叉研究的重要研究领域之一。基于核酸适体的电化学生物传感器结合了适配体与电化学分析两方面的优点，能将微小环境的变化转化为可测的电信号，对细菌内毒素进行定性定量分析，弥补了当前内毒素检测操作复杂、耗时长、检测范围窄等缺陷。
本发明选择金电极表面作为生物传感器的基底层，以3-巯基丙酸(3-Mercaptopropionic acid，简称MPA)为中间连接物，将氨基修饰的核酸适体固定到金电极表面，制备了一种核酸适体电化学生物传感器用于细菌内毒素的检测。
(三)发明内容
本发明涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，具有灵敏度高、检测限低、易于操作等优点。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种核酸适体生物传感器，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。
进一步，所述金电极先经过清洗处理再用作基底，所述清洗方法为：将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H2SO4，吹干后，获得清洗后的金电极。
进一步，所述H2SO4水溶液浓度为0.5M。
进一步，所述3～巯基丙酸自组装方法为：将金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，氮气吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。
进一步，所述氨基修饰的核酸适体偶联方法为：将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联反应体系中，在室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl 120mM，KCl 5mM，MgCl2 1mM，CaCl2 1mM，Tris 50mM，pH7.4。
进一步，所述所述氨基修饰的核酸适体中核酸适体为核酸适体EAQ3，核苷酸序列为：
NH2-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTGGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGAAGTA。
本发明还提供一种核酸适体生物传感器的制备方法，所述方法为：(1)将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗电极上残留的H2SO4，吹干，获得清洗后的金电极；(2)将清洗后的金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极；(3)将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联体系中，室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl120mM，KCl 5mM，MgCl2 1mM，CaCl2 1mM，Tris 50mM，pH7.4。
此外，本发明还提供一种所述核酸适体生物传感器在检测内毒素中的应用，具体所述应用方法为：将核酸适体生物传感器置于待测样品中，室温下反应40-60min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，然后置于电解液中，在0.1Hz～100kHz、振幅为1-5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，获得待测样品阻抗差值；根据内毒素标准曲线，进而获得待测样品中内毒素含量；所述内毒素标准曲线是在待测样品检测相同条件下，以内毒素浓度对数值为横坐标，以阻抗差值为纵坐标制成；所述电解液是含2～10mM K3Fe(CN)6、2～10mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤缓冲液是含体积浓度0.05％Tween 20的pH7.4的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液组成为：NaCl137mM、Na2HPO48mM、K2HPO4 1.2mM，KCl 2.7mM，溶剂为水，pH7.4。
进一步，所述内毒素标准曲线按如下方法制备：将核酸适体生物传感器分别浸入10-3EU/mL、10-2EU/mL、10-1EU/mL和1EU/mL的细菌内毒素水溶液(溶剂是内毒素检测用水)中，室温下反应40～60min，用洗涤缓冲液(取100mL上述PBS缓冲液加入50μLTween 20，混匀)洗去未结合的内毒素后，然后置于电解液中，在0.1Hz～100kHz、振幅为1-5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，以细菌内毒素浓度的对数值为横坐标，不同浓度内毒素表征得到的阻抗差值为纵坐标，获得内毒素标准曲线；所述电解液是含2～10mM K3Fe(CN)6、2～10mMK4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤缓冲液组成为：pH7.4、PBS缓冲液加体积浓度0.05％Tween 20。
所述pH7.4、PBS缓冲液组成为：NaCl137mM、Na2HPO48mM、K2HPO4 1.2mM，KCl2.7mM，溶剂为水。
所述电解液优选含2mM K3Fe(CN)6、2mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液。
本发明核酸适体生物传感器，以金电(Au)极基底，在金电极表面自组装3-巯基丙酸单分子层，作为核酸适体固定到金基底表面的中间连接物；所述单分子层为分子自发地通过Au-S键牢固地吸附在金电极表面而形成的一种有序分子组合体。在所述单分子层上通过羧胺反应共价偶联带有氨基修饰基团的核酸适配体。
综合文献及实际应用发现鲎试剂检验法是目前内毒素检测最常用的方法，简便，检测限低(0.03EU/mL)，但易受供试品颜色、浊度等因素影响，并且鲎试剂的成分来源是稀有动物鲎的血液，不符合可持续发展原则。本发明是国内首个以细菌内毒素为靶标，核酸适体为生物原件的生物传感器，与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明构建的核酸适体生物传感器用于细菌内毒素检测，构建简易，特异性高，检测限低，灵敏度达0.001EU/mL。所述细菌内毒素核酸适体生物传感器具有制备方便简单，易于操作，灵敏度高，检测限低等特点，可以进一步提高生物传感器的稳定性，进而使其具有广泛的应用前景。
(四)附图说明
图1根据本发明的构建过程中的组装原理图。
图2EAQ3的二级结构图。
图3单分子层形成示意图。
图4实施例1初始条件下电化学清洗后的金电极表面循环伏安图，Standard(正方形)为标准电极，Electropolishing(五角星)为清洗后的电极。
图5初始条件下电化学清洗后的金电极表面循环伏安图；none(圆形)为干净的金电极，MPA(五角星)为修饰有3-巯基丙酸的金电极，Aptamer(直线)为结合了核酸适体的金电极。
图6不同修饰步骤下生物传感器金电极表面循环伏安表征图；a-裸金电极；b-固定MPA的金电极；c-固定核酸适体的金电极。
图7实施例2不同修饰步骤下生物传感器金电极表面电化学阻抗谱表征图，Standard(正方形)为标准电极，Electropolishing(五角星)为清洗后的电极。
图8不同修饰步骤下生物传感器金电极表面电化学阻抗谱表征图。
图9核酸适体内毒素电化学生物传感器标准曲线。
图10不同修饰步骤下生物传感器金电极表面的电化学交流阻抗谱。
(五)具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式进行详细的阐述，在本发明实施方式中，为了使读者更好的理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于对实施方式的修改，也可以实现本申请各权利所要求保护的技术方案。
本发明所述二次去离子水是指通过离子交换树脂除去水中的离子态杂质而得到水。以市售娃哈哈纯净水为原料，依次以每秒3滴的速率通过强酸性阳离子交换树脂(大孔结构的带有磺酸基的苯乙烯-二乙烯苯共聚体)与强碱性阴离子交换树脂(大孔结构的带有季铵基的苯乙烯-二乙烯苯)收集获得。本发明所述室温是指25-30℃。
结合缓冲液组成为：NaCl 120mM，KCl 5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris 50mM，pH7.4。
所述洗涤缓冲液组成为：含体积浓度0.05％Tween 20的pH7.4、PBS缓冲液。
所述pH7.4、PBS缓冲液组成为：NaCl137mM、Na2HPO48mM、K2HPO41.2mM，KCl2.7mM，溶剂为水。
电解液是含2mM K3Fe(CN)6、2mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液。
本发明实施例所述金电极规格为CHI101，直径为2mm。
实施例1初始条件下核酸适体内毒素电化学生物传感器的构建
(1)电化学清洗金电极表面
本发明实施方法中的金电极应用于自组装膜的基底，金表面的清洗洁净程度对形成均一稳定的自组装膜至关重要，(图3为自组装单分子形成示意图)。
在处理前期依次采用粒径1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光金电极(所述金电极规格为CHI101，直径为2mm)。用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min。将上述二次去离子水超声后的电极吹干后置于0.2M的H2SO4水溶液中，在0-1.6V的电压，扫描速度为100mV/s的参数下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出电极用二次去离子水冲洗电极上残留的H2SO4，吹干后，获得清洗后的金电极，备用。所得清洗后的金电极表面与标准干净的金电极表面的循环伏安图如图4所示。
(2)3-巯基丙酸自组装单分子层的形成
本发明的实施方式中关于3-巯基丙酸自组装单分子层的形成步骤包括将步骤(1)获得的清洗后的金电极置于100mM 3-巯基丙酸(MPA)无水乙醇溶液中，室温下避光孵育8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极，交流阻抗谱中半圆电阻为3000Ω左右。
(3)氨基修饰的核酸适体的固定
NH2-ssDNA核苷酸序列为：
NH2-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTGGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGAAGTA(生工生物工程(上海)股份有限公司，生物试剂)，二级结构见图2所示。
所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和100nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液。
本发明的实施方法：将步骤(2)制备的3-巯基丙酸修饰的金电极浸入偶联反应体系中，室温下反应60min，在吗啉乙磺酸酸性环境下(pH值为6.0)通过EDC/NHS活化MPA的羧基端通过羧胺反应结合后固定到上述3-巯基丙酸修饰的金电极上，用二次去离子水将未结合的NH2-ssDNA洗去，获得核酸适体内毒素电化学生物传感器。在构建过程中本发明所选的表征方式是循环伏安法和电化学阻抗谱，循环伏安法其参数设置为-0.3～0.6V电压范围，100mV/s的扫描速率；电化学阻抗谱其参数设置为扫描频率范围为0.1Hz～100kHz，振幅为5mV。图5为不同修饰步骤下生物传感器金电极表面循环伏安表征图，从图中可以发现随着金电极表面修饰物的增加，峰电流不断下降，这是3-巯基丙酸的羧基端在电解液中呈电负性，在一定程度上阻碍电子在金电极表面的传递，导致峰电流下降。另外核酸适体由核苷酸组成，本身呈电负性，固定到金电极表面后，使阻碍电子传递的能力提高，电阻增大，导致峰电流下降，但不明显。图6为不同修饰步骤下生物传感器金电极表面电化学阻抗谱表征图(a-裸金电极；b-固定MPA的金电极；c-固定核酸适体的金电极)。一般情况下，阻抗谱图上的高频率部分是受动力学控制的区域，低频率部分是受扩散控制的区域，修饰3-巯基丙酸的电极较裸金电极比较，在高频率区出现一个直径较大的圆弧，表明在高频率区，修饰电极的电阻相对裸电极要大，当核酸适体固定到金电极表面后，高频部分的圆弧半径扩大了，这是由于核酸磷酸骨架的负电荷存在静电排斥作用，半径增大，与循环伏安实验结果相符合。结合缓冲液组成为：NaCl 120mM，KCl 5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris 50mM，pH7.4。
实施例2优化条件下核酸适体内毒素电化学生物传感器的构建
(1)电化学清洗金电极表面
将实施例1中第一步骤电化学清洗电极表面过程中的H2SO4溶液浓度改为0.5M，其他条件一致。图7为所得清洗后的电极表面与标准干净的金电极(同实施例1)表面的循环伏安图，从图7中可以发现优化后的电化学清洗条件得到的金电极表面几乎与标准干净的金电极表面一致。
(2)3-巯基丙酸自组装单分子层的形成
将步骤(1)中清洗后的金电极置于200mM的MPA无水乙醇溶液中，室温下避光孵育6h，得到MPA修饰的金电极，交流阻抗谱中半圆电阻为5500Ω左右。
(3)氨基修饰的核酸适体的固定
将实施例1中第三步骤中的“NH2-ssDNA浓度100nM”的条件改为“NH2-ssDNA浓度200nM”，其他参数不变，获得核酸适体内毒素电化学生物传感器，图8为不同修饰步骤下生物传感器金电极表面电化学阻抗谱表征图(a-裸金电极；b-固定MPA的金电极；c-固定核酸适体的金电极)。
按照实施例2的方法所构建的核酸适体内毒素电化学生物传感器性能较实施例1中的稳定，更有利于后续内毒素标准曲线的制作。
实施例3核酸适体生物传感器应用于细菌内毒素检测标准曲线
(1)依次用粒径1.00μm、0.30μm和0.05μm的氧化铝粉抛光金电极(所述金电极规格为CHI101，直径为2mm)，用二次去离子水冲洗后，立即用无水乙醇、二次去离子水超声处理(40KHz)，各5min。将超声处理后的金电极置入0.5M H2SO4水溶液中在0-1.6V电压下，扫描频率为100mV/s下进行循环伏安扫描至稳定，用二次去离子水冲洗后吹干，获得清洗后的金电极。
(2)室温下，避光，将清洗后的金电极浸入200mM 3-巯基丙酸无水乙醇溶液中，室温下避光孵育6h，然后用乙醇将未结合的MPA洗去，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。
(3)室温下，将3-巯基丙酸修饰的金电极浸入偶联反应体系中，反应1h，用二次去离子水将未结合的NH2-ssDNA洗去，获得核酸适体生物传感器。在电解液中进行电化学阻抗谱的表征。表征后用二次去离子水将电解液冲洗后吹干。所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和200nM氨基修饰的核酸适体(NH2-ssDNA)，溶剂为结合缓冲液。
(4)将核酸适体生物传感器分别浸入10-3EU/mL、10-2EU/mL、10-1EU/mL和1EU/mL的细菌内毒素溶液(溶剂是内毒素检测用水既去除热源的水)中，室温下反应40min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，在电解液中，在0.1Hz～100kHz，振幅为5mV条件下进行电化学阻抗谱表征。电解液是含2mMK3Fe(CN)6、2mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液。
(5)使用Origin数据软件对表征得到的电化学阻抗谱数据进行处理分析，以细菌内毒素浓度的对数值为横坐标，不同浓度内毒素表征得到的阻抗差值为纵坐标，进行origin绘图得到标准曲线。图9为核酸适体内毒素电化学生物传感器标准曲线。在最佳实验条件下，本发明所述核酸适体电化学生物传感器对0.001EU/mL内毒素浓度仍有响应信号，说明本发明所构建的核酸适体内毒素电化学生物传感器灵敏度高、检测限低的特点。高频区的半圆直径随着内毒素浓度的增加而增加，在0.001-1EU/mL细菌内毒素范围内，其对数值与响应R值变量呈现良好的线性关系，Y＝629.7×lgX+3407.4，其中R2＝0.9527。
实施例4核酸适体内毒素电化学生物传感器检测内毒素
(1)依次用粒径1.00μm、0.30μm和0.05μm的氧化铝粉抛光金电极，用二次去离子水冲洗后，立即用无水乙醇、二次去离子水超声处理(40KHz)，各5min。将金电极置入0.5MH2SO4水溶液中，在0-1.6V电压下，扫描频率为100mV/s下进行循环伏安扫描至稳定，电化学清洗结束，用二次去离子水冲洗后吹干，获得清洗后的金电极。在电解液中，0.1Hz～100KHz，振幅为5mV条件下进行电化学阻抗谱表征。表征后用二次去离子水将电解液冲洗后吹干。
(2)室温下，将清洗后的金电极浸入200mM 3-巯基丙酸无水乙醇溶液中，室温浸置6h，然后用乙醇将未结合的MPA洗去，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。
(3)室温下，立即将上述MPA修饰的电极浸入偶联反应体系中，室温反应1h，用二次去离子水将未结合的NH2-ssDNA洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；在电解液中进行EIS表征。表征后用二次去离子水将电解液冲洗后吹干。所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和200nM氨基修饰的核酸适体(NH2-ssDNA)，溶剂为结合缓冲液(组成同实施例1)。
(4)将上述方式制备的核酸适体电化学生物传感器浸入0.05EU/mL的细菌内毒素溶液中(溶剂为内毒素检测用水)，室温下反应40min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，置于电解液中，在0.1Hz～100kHz，振幅为5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，得到图10所示表征稳定的电化学交流阻抗谱(a-裸金电极；b-固定核酸适体的金电极；c-结合内毒素的金电极)。其中裸金电极由步骤1获得，固定核酸适体的金电极由步骤3获得，结合内毒素的金电极由步骤4获得。R值变量为2600Ω，查标准曲线值为0.052EU/mL(＜5％)。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种核酸适体生物传感器及其制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgagagcgt cggtgtggta tcgccgcgct ggccgatcgt tcctcccccc ccgtgtgtag 60
gagggtgcga agta 74

Claims (10)

1.一种核酸适体生物传感器，其特征在于所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。
2.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述金电极先经过清洗处理再用于基底，所述清洗方法为：将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将金电极超声清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H2SO4，吹干后，获得清洗后的金电极。
3.如权利要求2所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述H2SO4水溶液浓度为0.5M。
4.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述3～巯基丙酸自组装方法为：将金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。
5.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述氨基修饰的核酸适体偶联方法为：将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联反应体系中，室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl 120mM，KCl 5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris 50mM，pH7.4。
6.如权利要求5所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述所述氨基修饰的核酸适体中核酸适体核苷酸序列为：
ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTGGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGAAGTA。
7.一种权利要求1核酸适体生物传感器的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将金电极依次采用粒径1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度为100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H2SO4，吹干，获得清洗后的金电极；(2)将清洗后的金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极；(3)将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联反应体系中，室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mM N-羟基丁二酰亚胺和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl 120mM，KCl 5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris 50mM，pH7.4。
8.一种权利要求1所述核酸适体生物传感器在检测内毒素中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将核酸适体生物传感器置于待测样品中，室温下反应40-60min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，置于电解液中，在0.1Hz～100kHz、振幅为1-5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，获得待测样品阻抗差值；根据内毒素标准曲线，进而获得待测样品中内毒素含量；所述内毒素标准曲线是在待测样品检测相同条件下，以内毒素浓度对数值为横坐标，以阻抗差值为纵坐标制成；所述电解液是含2～10mM K3Fe(CN)6、2～10mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤缓冲液是含体积浓度0.05％Tween 20的pH7.4、PBS缓冲液。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述内毒素标准曲线按如下方法制备：将核酸适体生物传感器分别浸入10-3EU/mL、10-2EU/mL、10-1EU/mL和1EU/mL的细菌内毒素水溶液中，室温下反应40～60min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，然后置于电解液中，在0.1Hz～100kHz、振幅为1-5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，以内毒素浓度的对数值为横坐标，不同浓度内毒素表征得到的阻抗差值为纵坐标，获得内毒素标准曲线；所述电解液是含2～10mM K3Fe(CN)6、2～10mM K4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤缓冲液是含体积浓度0.05％Tween 20的pH7.4、PBS缓冲液。
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