CN113846061A - 一种结肠癌类器官的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种结肠癌类器官的培养基及其应用，该类器官培养基的制备方法为在传统的结肠癌类器官培养基中加入黄芪皂苷VI Astragaloside VI，培养液最终成分为：黄芪皂苷VI、头蛋白、A83‑01、DMEM/F12培养基、Rspo‑1条件培养基、GlutaMax。本发明的结肠癌类器官培养基能够应用于人结肠癌类器官培养和小鼠结肠癌类器官培养；在培养结肠癌类器官时，细胞增殖速率高于传统培养液的细胞增殖速率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种类器官培养液的制备方法和应用。
背景技术
结肠癌是一种发病率逐年升高的疾病，然而晚期结肠癌的治疗效果仍然欠佳，目前主要的治疗方式是化学治疗。然而目前结肠癌的化疗药物较多，而中国病人因体质问题，难以耐受超过2种药物的联合治疗。肿瘤类器官(tumor organoid)不仅能够保留原发肿瘤的特点，保持不同病人肿瘤之间的差异性，而且能够保持同一个病人原发肿瘤内肿瘤细胞的异质性。肿瘤类器官还能准确地预测原发肿瘤的药物敏感性，是未来肿瘤病人个体化治疗的潜在工具。已有研究发现，利用结肠癌类器官给病人筛选药物，准确率达到90％。然而，结肠癌类器官培养液的成分复杂，技术门槛高，限制了结肠癌类器官在实验室研究中的普及。
发明内容
为了弥补目前肿瘤类器官培养技术门槛高、成功率低的不足，本发明对目前的结肠癌类器官的培养液配方和培养方法进行了改进，提供一种新的培养液配方，可以降低成本并提高类器官的活性。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种结肠癌类器官的培养基，在结肠癌类器官培养基中加入黄芪皂苷VIAstragaloside VI，培养液的最终成分为：黄芪皂苷VI、头蛋白、A83-01、DMEM/F12培养基、Rspo-1条件培养基、GlutaMax。
作为优选的方案，培养液中含有的黄芪皂苷VI浓度为0.01-100μmol/L。
本发明还提供所述的结肠癌类器官的培养基在类器官培养中的应用。
进一步的，所述的类器官培养包括人结肠癌类器官培养和小鼠结肠癌类器官培养。
有益效果：
1、本发明在传统的类器官培养液中添加的黄芪皂苷VI价格低廉，不会显著增加类器官培养的成本。
2、本发明的类器官培养液在结肠癌类器官的培养中，细胞增殖速率高于不含黄芪皂苷VI的传统培养液。
附图说明
图1：收取结肠癌病人的肿瘤组织标本后，分成两份，建立结肠癌类器官，培养3天后的电镜图像；图中1A为其中一份结肠癌类器官用不含黄芪皂苷VI的传统培养液培养，图中1B 为另一份结肠癌类器官用含黄芪皂苷VI的传统培养液培养。
图2：建立结肠癌类器官后，10例采用不含有黄芪皂苷VI的培养液和10例采用含有黄芪皂苷VI的培养液的结肠癌标本建立肿瘤类器官的活性图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
制备含黄芪皂苷VI的结肠癌类器官的培养基：
在结肠癌类器官培养基中加入黄芪皂苷VI Astragaloside VI，培养液的最终成分为：黄芪皂苷VI、头蛋白、A83-01、DMEM/F12培养基、Rspo-1条件培养基、GlutaMax。
其中，培养液中含有的黄芪皂苷VI浓度为0.01-100μmol/L。
实施例2
结肠癌肿瘤组织的建立：
1.将手术切除的结肠癌肿瘤组织放入含有10ml DMEM培养液的15ml离心管中，运送到实验室。用镊子将标本从样本运送管中取出，放入空的10cm培养皿中，用一次性无菌手术刀切成碎片，每块均小于0.5X0.5X0.5mm。
2.将切碎后的肿瘤组织转移到15ml离心管中，加入3ml胶原酶，放入摇床中37℃震荡 10分钟。
3.取出离心管，在超净台内室温竖直放置30s，此时肿瘤组织已沉降到管子底部。用1ml 移液器吸出全部上清，转移到新的15ml离心管中，将新的离心管放在冰上；在沉降的肿瘤组织中再加入3ml的胶原酶。再次放入摇床中37℃震荡10分钟。
4.重复步骤3一次；其中，将后一次吸出的上清液直接加入到前一次的上清液中。
5.400g离心10分钟后，弃上清。
6.在细胞沉淀中加入5ml红细胞裂解液，轻轻吹打后，立即400g离心10分钟。
7.弃上清后，用5ml DMEM培养液重悬细胞，轻轻吹打混匀后，400g离心10分钟。
8.弃上清后，每管加入300微升的Matrigel重悬细胞，并分别接种到24孔板中，每孔50 微升。之后立即放入37℃培养箱中10分钟。
实施例3
培养基培养肿瘤组织并测定活性：
1.收取10例结肠癌病人的结肠癌肿瘤组织标本后，每例分成两份，为试验组和对照组，按实施例2的步骤分别建立结肠癌肿瘤组织；在Matrigel固化后，每例共建立6个孔的类器官，其中3个孔采用传统培养基，为对照组，另外3个孔采用含有特丁基对苯二酚的培养基，为试验组；在Matrigel固化后，对照组每个孔加入2ml的不含有黄芪皂苷VI的传统培养液，试验组每个孔加入2ml的实施例1制备的含黄芪皂苷VI的培养液。
2.培养3天后，观察结肠癌类器官的生长情况，相比于不含黄芪皂苷VI的培养液(图1A)，含有黄芪皂苷VI的培养液能够显著促进结肠癌类器官的生长(图1B)。
3.用CellTiter Glo检测了培养3天后结肠癌类器官的活性；结果显示，黄芪皂苷VI能够显著提高结肠癌类器官的活性(图2)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种结肠癌类器官的培养基，其特征在于：在结肠癌类器官培养基中加入黄芪皂苷VI Astragaloside VI，培养液的最终成分为：黄芪皂苷VI、头蛋白、A83-01、DMEM/F12培养基、Rspo-1条件培养基、GlutaMax。
2.根据权利要求1所述的结肠癌类器官的培养基，其特征在于：培养液中含有的黄芪皂苷VI浓度为0.01-100 µmol/L。
3.权利要求1、2任意一项所述的结肠癌类器官的培养基在类器官培养中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的类器官培养包括人结肠癌类器官培养和小鼠结肠癌类器官培养。
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