CN113846046A - 石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在改善脱发症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在改善脱发症中的应用。石斛来源外泌体样囊泡预防、改善脱发症的效果明显高于石斛提取物。该外泌体样囊泡作为一种天然的纳米级囊泡结构，具有良好的生物相容性和口服安全性，并可以跨越生物学屏障，相对于一般植物提取物，对活性成分的传递具有更高促进作用，植物来源外泌体样囊泡可以更好的穿过皮肤屏障作用于毛囊干细胞。此外，本文采用差速离心法结合密度梯度离心从石斛中获得石斛外泌体样囊泡，进一步提高了纯度，增加了其预防、改善脱发症的效果。

Description

石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在改善脱发症中的应用

技术领域

本发明属于精细化工领域，涉及石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在改善脱发症中的应用，具体涉及石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在预防、改善脱发症方面的应用。

背景技术

脂溢性脱发(seborrheic alopecia，SA)是临床最为常见的脱发性疾病。现代医学认为其是一种雄激素依赖的常染色体显性多基因遗传性禿发，雄激素过多或对雄激素敏感增加是该病发生的主要因素，SA的发生与睾酮(testosterone,T)及其代谢产物二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)和雄激素受体(Androgen receptor，AR)的水平增高直接相关，而5α-还原酶(5α-reductase，5a-R)在其中起到重要作用，另外长期精神紧张、饮食失调、心理失衡及病菌感染为诱发或加重本病的重要因素。

治疗脱发方法包括自体毛囊移植术、口服非那雄胺、外用米诺地尔等，但存在副作用、停药后脱发进程会继续，因此探索新的有效的方法很有必要。

中医认为脱发的原因为肾血亏虚、身体机能失调引起。因此在治疗脱发问题上往往采用固肾补血的方法来治疗。肺开窍于皮毛，发为血之余，中医将脱发分虚与实二类，虚指气血不足，肝肾亏虚，实指血热或血瘀。

石斛又名仙斛兰韵、不死草、还魂草、是我国最珍贵的中药材之一被尊为「中华九大仙草之首」、素有「药中黄金」之美称。其茎入药，属补益药中的补阴药，具有益胃生津，滋阴清热效果。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。至今为止，科学家已经相继从生姜、葡萄柚、梨、柠檬等数十种果蔬中分离得到外泌体样囊泡(exosome-like nanoparticles，ELNs)，对其结构和化学组成进行了表征，并对其生理功能进行了评价，发现果蔬来源的外泌体样囊泡具有递送药物的潜在载体功能，显示出了广阔的应用前景。

目前，外泌体样囊泡通常采用离心法、超滤法、排阻色谱法、免疫亲和法、聚合物，沉淀法以及微流控技术获得。离心法是根据外泌体样囊泡的密度和尺寸进行分离的一种方法，目前最为常用，离心法包括差速离心法和密度梯度离心法，差速离心法是通过逐步提高离心速度，依次去除较大的颗粒，最终通过超高的离心速度得到外泌体样囊泡，为了进一步提高纯度，可在差速离心基础上对得到的外泌体样囊泡进行再次密度梯度离心。

从获得手段可知，植物来源外泌体样囊泡与一般植物提取物具有明显区别，植物来源外泌体样囊泡是石斛内具有的直径为20-500nm囊泡结构，植物提取物往往为某类成分，如石斛中的石斛多糖。

目前暂无对石斛外泌体样囊泡加以应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供石斛来源外泌体样囊泡及其制备和在改善脱发症中的应用。

本文采用差速离心法结合密度梯度离心从石斛中获得石斛外泌体样囊泡，制备工艺与传统的石斛提取物具有明显不同，研究发现，通过次此工艺制备的石斛外泌体样囊泡具有预防、改善脱发症方面的效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为:

一种石斛来源外泌体样囊泡，其从石斛的茎部位中分离得到。

作为优选，所述石斛选自铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛、小粉花石斛、鼓槌石斛、马鞭石斛、黄草石斛、环草石斛，蝴蝶石斛中的一种或多种。

进一步优选，所述石斛选自：铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛中的一种或多种。

在某些具体的实施方式中，石斛来源外泌体样囊泡，通过以下步骤分离得到：

1)粉碎石斛茎获得石斛茎汁液；

2)离心分离所述石斛茎汁液获得上清液；

3)密度梯度离心步骤2)所得上清液，取密度范围为1.00-1.20g/ml的级层继续超速离心，即得颗粒状的石斛来源外泌体样囊泡。

在某些更具体的实施方式中，步骤2)所述的离心具体为将所述石斛茎汁液在4℃，500-1000g条件下离心10-20min获得第一上清液；然后，将第一上清液在4℃，2000-4000g条件下再次离心15-30分钟获得上清液。

在某些更具体的实施方式中，所述步骤3)中的密度梯度离心具体为：先将80％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液、所述上清液添加至超速离心管中，在4℃、80,000g条件下密度梯度离心4h，取位于80％蔗糖溶液层和30％蔗糖溶液层之间的分离层；再将分离层配置成50％碘克沙醇溶液，并将其与35％碘克沙醇溶液、20％碘克沙醇溶液、150mM NaCl/20mM HEPES溶液依次添加至超速离心管中，在4℃和220,00g下进行密度梯度离心3小时。

在某些更具体的实施方式中，所述步骤3)超速离心具体为将密度范围为1.00-1.20g/ml的级层稀释后，在4℃和120,000g下超速离心1小时。

本发明还提供了一种石斛来源外泌体样囊泡在预防、改善脱发症方面的应用。

作为优选，可以将其用于头部护理产品。

本发明的有益效果在于：

石斛来源外泌体样囊泡预防、改善脱发症的效果明显高于石斛提取物，可能是由于植物来源外泌体样囊泡作为一种天然的纳米级囊泡结构，具有良好的生物相容性和口服安全性，并可以跨越生物学屏障，相对于一般植物提取物，对活性成分的传递具有更高促进作用，植物来源外泌体样囊泡可以更好的穿过皮肤屏障作用于毛囊干细胞。此外，本文采用差速离心法结合密度梯度离心从石斛中获得石斛外泌体样囊泡，进一步提高了纯度。

本发明所公开的石斛来源外泌体样囊泡具有较好的预防、改善脱发症的效果。

附图说明

图1为试验例1中睾酮5α-还原酶的抑制作用对比图；

图2为试验例2中毛乳头细胞生长促进作用对比图；

图3为试验例3中促进FGF-7基因、VEGF基因及BMP-2基因的mRNA的表达的对比图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。对于本发明的目的，下面定义了以下术语。本文所用术语“约”指与参比品的数量、水平、数值、维度、大小或用量相比，差异可高达30％、20％或10％的数量、水平、数值、维度、大小或用量。

在全篇说明书和权利要求书中，除非另有要求，以下词语“包含”和其变体“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整体或步骤，或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤，或其它一组整体或步骤。

实施例1：差速离心法结合密度梯度离心制备的不同石斛的石斛来源外泌体样囊泡含量测定

为方便理解，本发明对比了不同石斛来源外泌体样囊泡含量，制备原料为：铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛、小粉花石斛、鼓槌石斛、马鞭石斛、黄草石斛、环草石斛，蝴蝶石斛，部位为新鲜茎。

操作步骤：

1)依次粉碎100g上述9种石斛新鲜茎得到石斛汁；

2)将该汁液在4℃、500×g下离心20分钟获得上清液。然后，将该上清液再次在4℃、2,000×g条件下离心30分钟获得上清液。

3)在35ml超速离心管中依次添加0.5ml的80％蔗糖水溶液、1ml的30％蔗糖水溶液和32m1的除去杂质的上清液后，将该混和物在4℃和80,000×g下超速离心4小时。在超速离心后，石斛来源外泌体样囊泡由于其密度而位于80％蔗糖层和30％蔗糖层之间。因此，通过从管的上部移除溶液，分离出含有石斛来源外泌体样囊泡的层。

4)将得到的石斛来源外泌体样囊泡的分离层配置成50％碘克沙醇溶液，取10ml50％碘克沙醇溶液添加到50m1超速离心管中。然后，在向管中依次添加10m1的35％碘克沙醇、10m1的20％碘克沙醇和10m1的150mM NaC1/20mMHEPES之后，在4℃和220,00×g下进行超速离心3小时。随后，从离心管上层取出各层，通过测量密度，得到对应含有斛外泌体样囊泡的级层(密度范围：1.00-1.20g/ml)。

5)将所得到的级层用60ml的HBS(HEPES-缓冲盐水)稀释，并加入到70m1超速离心管中。然后，在4℃和120,000×g下超速离心1小时，获得颗粒状的石斛来源的外泌体样囊泡。

6)去除上清液后，加入50ml PBS缓冲液分散，即得到高纯度的石斛来源外泌体样囊泡悬液。

7)浓度计算：分别取各组泌体样囊泡悬液100μl稀释于2ml PBS内，使用纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight)测算各组泌体样囊泡溶液浓度，每个样品重复3次。

结果如表1所示，铁皮石斛来源的外泌体样囊泡含量最高(8.89±0.36)*10⁸/ml，铁皮石斛，金钗石斛，细茎石斛来源的外泌体样囊泡超过8.0*10⁸/ml，明显高于另外6种石斛来源的外泌体样囊泡含量(低于7.0*10⁸/ml)。

实施例2：制备石斛来源外泌体样囊泡

本发明提供一种活性成分为石斛来源外泌体样囊泡的制备方法，制备原料为：铁皮石斛(DENDROBIUMOFFICINALE)新鲜茎。

操作步骤：

1)通过粉碎铁皮石斛新鲜茎得到石斛汁；

2)将该汁液在4℃、1000×g下离心10分钟获得上清液。然后，将该上清液再次在4℃、4,000×g条件下离心20分钟获得上清液。

3)在35ml超速离心管中依次添加0.5ml的80％蔗糖水溶液、1ml的30％蔗糖水溶液和32m1的除去杂质的上清液后，将该混和物在4℃和80,000×g下超速离心4小时。在超速离心后，石斛来源外泌体样囊泡由于其密度而位于80％蔗糖层和30％蔗糖层之间。因此，通过从管的上部移除溶液，分离出含有石斛来源外泌体样囊泡的层。

4)将得到的石斛来源外泌体样囊泡的分离层配置成50％碘克沙醇溶液，取10ml50％碘克沙醇溶液添加到50m1超速离心管中。然后，在向管中依次添加10m1的35％碘克沙醇、10m1的20％碘克沙醇和10m1的150mMNaC1/20mMHEPES之后，在4℃和200,00×g下进行超速离心4小时。随后，从离心管上层取出各层，通过测量密度，得到对应含有斛外泌体样囊泡的级层(密度范围：1.00-1.20g/ml)。

5)将所得到的级层用60ml的HBS(HEPES-缓冲盐水)稀释，并加入到70m1超速离心管中。然后，在4℃和120,000×g下超速离心1小时，获得颗粒状的石斛来源的外泌体样囊泡。

实施例3：制备石斛来源外泌体样囊泡

本发明提供一种活性成分为石斛来源外泌体样囊泡的制备方法，制备原料为：金钗石斛(DENDROBIUM NOBILE)新鲜茎。

操作步骤：

1)通过粉碎铁皮石斛新鲜茎得到石斛汁；

2)将该汁液在4℃、500×g下离心20分钟获得上清液。然后，将该上清液再次在4℃、2,000×g条件下离心30分钟获得上清液。

3)在35ml超速离心管中依次添加0.5ml的80％蔗糖水溶液、1ml的30％蔗糖水溶液和32m1的除去杂质的上清液后，将该混和物在4℃和80,000×g下超速离心4小时。在超速离心后，石斛来源外泌体样囊泡由于其密度而位于80％蔗糖层和30％蔗糖层之间。因此，通过从管的上部移除溶液，分离出含有石斛来源外泌体样囊泡的层。

4)将得到的石斛来源外泌体样囊泡的分离层配置成50％碘克沙醇溶液，取10ml50％碘克沙醇溶液添加到50m1超速离心管中。然后，在向管中依次添加10m1的35％碘克沙醇、10m1的20％碘克沙醇和10m1的150mM NaC1/20mMHEPES之后，在4℃和220,00×g下进行超速离心3小时。随后，从离心管上层取出各层，通过测量密度，得到对应含有斛外泌体样囊泡的级层(密度范围：1.00-1.20g/ml)。

5)将所得到的级层用60ml的HBS(HEPES-缓冲盐水)稀释，并加入到70m1超速离心管中。然后，在4℃和120,000×g下超速离心1小时，获得颗粒状的石斛来源的外泌体样囊泡。

实施例4：制备石斛提取物

为方便理解，本发明提供一种活性成分为石斛提取物的制备方法，制备原料为：铁皮石斛(DENDROBIUMOFFICINALE)干燥茎。

步骤：

干燥石斛茎→称重→粉碎→80℃热水浸提→过滤→滤液浓缩→80％乙醇(4～5倍)沉淀→过滤→烘干→质量体积比1:1水复溶→3倍体积95％醇沉→烘干→铁皮石斛提取物。

表1

石斛种类	浓度
		铁皮石斛	(8.89±0.36)*10<sup>8</sup>/ml
金钗石斛	(8.49±0.42)*10<sup>8</sup>/ml
		细茎石斛	(8.36±0.25)*10<sup>8</sup>/ml
小粉花石斛	(6.68±0.22)*10<sup>8</sup>/ml
		鼓槌石斛	(6.56±0.19)*10<sup>8</sup>/ml
马鞭石斛	(6.54±0.27)*10<sup>8</sup>/ml
		黄草石斛	(6.32±0.39)*10<sup>8</sup>/ml
环草石斛	(5.86±0.30)*10<sup>8</sup>/ml
		蝴蝶石斛	(5.21±0.33)*10<sup>8</sup>/ml

试验例1：睾酮5α-还原酶抑制作用试验

雄激素是重要的激素，但是如果其过度地作用，则诱发男性型脱发症、多毛症、脂溢症、痤疮(粉刺等)、前列腺肥大症、前列腺肿瘤、男儿性早熟等各种不良的症状。因此，一直以来为了改善这些各种症状，采用抑制过剩的雄激素作用的方法，具体地采用通过抑制将睾酮(T)还原为活性型5α-DHT(双氢睾酮，DHT)的睾酮5α-还原酶(5α-R)的作用，抑制活性型5α-DHT的生成的方法。

对制备例2所得石斛来源外泌体样囊泡，如下进行睾酮5α-还原酶抑制作用试验。

用PBS缓冲液分散制备例2所得石斛来源外泌体样囊泡，得到质量浓度为0.01％，0.05％，0.1％的斛来源外泌体样囊泡溶液(样品1，样品2，样品3)。

测试方法：

1.粗酶提取物的制备以及5α-R含量的测定

1)取雄性大鼠4只，禁食不禁水过夜后脱臼处死。迅速取肝脏，剥离脂肪组织，称重，剪碎，置于烧杯，加入预冷的提酶缓冲液(提酶缓冲液：0.32mol/L蔗糖；0.1mmol/LDTT；1mmol/LEDTA；20mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4)按照1:4(w/v)的比例在冰水浴中用匀浆器匀浆，制成匀浆液，然后将其分装至离心管，在4℃、10,000×g条件下离心20min，除去漂浮的脂肪，取上层液体，同样条件下再离心1h，上清液即为微粒体粗提取物。采用Bradford法对粗酶提取物定量，以其总蛋白质含量表示5α-R的含量。

2.5α-R酶促反应体系的建立与5α-R活性测定

1)T标准曲线的制备:配制系列浓度T溶液：5μmol/L～2000μmol/L，将不同浓度T溶液用0.22μm微孔滤膜过滤至液相瓶，进入高效液相色谱仪检测，以峰面积A(AU*min)为纵坐标，以T浓度C(μmol/L)为横坐标，绘制标准曲线。

液相色谱条件：色谱柱：LunaC18(2)柱(4.6mm×250mm,5μm)不锈钢柱；柱温：30℃；流动相：甲醇/水70/30(V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：242nm；进样体积：20μL。

2)5α-R酶促反应体系的建立

在1000μL测活体系中，将300μLPBS缓冲液(pH7.4)、500μL粗酶提取物稀释液、50μLT、50μL样品(空白组为PBS缓冲液,阳性对照为20ug/mL的米诺地尔PBS溶液，含0.05％石斛提取物PBS溶液)、100μLNADPH按顺序添依次加至离心管，于旋涡混合仪快速混合均匀3s，37℃恒温水浴锅反应30min，在t₀时刻与t₃₀时刻快速分别取样400μL，快速加入800μL甲醇(甲醇起到失活蛋白酶的作用)，涡旋5s终止反应。上述反应液在12,000r/min离心15min，除蛋白，取上清液，0.22μm有机相滤膜过滤至液相瓶，待检测。

3)5α-R活性测定

HPLC检测比较反应前t₀时刻与反应后t₃₀时刻T峰面积的变化。将T峰面积带入T标准曲线，计算出相应浓度，以及T浓度的变化量，从而实现测定5α-R的活性。设置不同的反应管包括：空对照管(酶提取物用甲醇失活)、酶正常反应管。

定义5α-R活性(μmolT/gprot·30min)为每克酶提取物每30min转化T的量，C_5α-R(g/L)表示5α-R粗提取物的浓度，即5α-R粗提取物蛋白质的浓度。计算公式如下：

△T_(μmol/L)＝C_t0–C_t30

C_t0表示0min时T浓度，C_t30表示30min时T浓度，△T表示反应前后T浓度的差值。

5α-R活性(μmolT/gprot·30min)＝(C_t0–C_t30)/C_5α-R

结果如图1所示，确认了石斛来源外泌体样囊泡的睾酮5α-还原酶(5α-R)的抑制作用。且石斛来源外泌体样囊泡对睾酮5α-还原酶(5α-R)的抑制作用明显优于石斛提取物。

试验例2：毛乳头细胞生长促进作用试验

毛乳头细胞在毛囊上皮细胞的增殖、分化以及毛发的形成中发挥重要的作用，由此认为通过促进毛乳头细胞的生长，可以预防、改善脱发症。对由制备例2得到的石斛来源外泌体样囊泡溶液，如下进行毛乳头细胞生长促进作用试验。

用PBS缓冲液分散制备例2所得石斛来源外泌体样囊泡，得到质量浓度为0.01％，0.05％，0.1％的石斛来源外泌体样囊泡溶液(样品1，样品2，样品3)。

将正常人头发毛乳头细胞使用含有2％胎牛血清(FBS)及生长添加剂的毛乳头细胞生长培养基(CellApplication公司制)培养后，通过胰蛋白酶处理回收细胞。将回收的细胞用含有10％FBS的DMEM培养基稀释到1.0×10⁴cells/mL的细胞密度后，在胶原涂敷的96孔板上每孔各接种200μL，培养3天。培养后，除去培养基，在每孔中各添加200μL在无血清DMEM中溶解有各样品的样品溶液，进一步培养4天。

采用MTT分析法测定毛乳头细胞生长促进作用。培养结束后，除去培养基，在每孔中各添加100μL溶解在无血清DMEM中的MTT(终浓度0.4mg/mL)。培养2小时后，将细胞内生成的蓝色甲臜用100μL 2-丙醇提取。提取后，在570nm波长下测定吸光度。同时测定650nm波长下的吸光度作为混浊度，以两者的差作为蓝色甲臜的生成量。另外，对添加无血清DMEM作为空白对照，对添加20ug/mL的米诺地尔PBS溶液、0.05％石斛提取物PBS溶液作为阳性对照。由所得结果基于下式算出毛乳头细胞生长促进率(％)。

毛乳头细胞生长促进率(％)＝A/B×100％

式中，A表示“添加样品时的吸光度”，B表示“不添加样品时的吸光度”。

结果如图2所示，确认了石斛来源外泌体样囊泡的毛乳头细胞生长促进作用。且在0.05％同等浓度下，石斛来源外泌体样囊泡对毛乳头细胞生长促进作用明显高于石斛提取物。

试验例3：FGF-7生长促进作用试验、VEGF生长促进作用试验及BMP-2生长促进作用试验

FGF-7在男性型脱发症的毛乳头细胞中检出量低。因此，认为通过促进FGF-7的生成，可以预防、改善脱发症等。

VEGF除了在下垂体细胞以外，也在毛乳头细胞中产生。由此生成的VEGF在血管内皮细胞中发挥作用，促进血管内皮细胞的增殖、游走，并具有新生血管的作用。因此，认为通过促进VEGF的生成，可以预防、改善脱发症等

成骨蛋白(BMP)近年来被指出与毛囊形成有关，最近几年，BMP-2的生发、养发作用受到关注。

用PBS缓冲液分散制备例2所得石斛来源外泌体样囊泡，得到质量浓度为0.01％，0.05％，0.1％的石斛来源外泌体样囊泡溶液(样品1，样品2，样品3)。

将人正常毛乳头细胞(HFDPC)使用人正常毛乳头细胞生长培养基(PCGM)培养后，通过胰蛋白酶处理回收细胞。将回收的细胞用含有10％FBS的DMEM培养基稀释到2×10⁵个/mL的细胞密度后，在直径60mm的培养皿上各接种5mL，培养一晚。

培养结束后，交换到添加样品(样品1，2，3)的无血清DMEM培养基上培养2小时后，将细胞溶解于1mL的RNA提取用试剂中，添加200μL氯仿后，离心(12000转，4℃，15分钟)，分离出上层RNA层。然后，用异丙醇浓缩。将浓缩沉淀的总RNA溶解于TE溶液(10mM的Tris-HCl/1mM的EDTA，pH8.0)中，RT-PCR法测定FGF-7基因、VEGF基因及BMP-2基因的mRNA表达量。另一方面，对不添加样品作为空白对照，对添加米诺地尔(20μg/mL)PBS溶液、0.05％石斛提取物PBS溶液作为阳性对照。

然后，采用PCR装置，通过500ng总RNA合成单链DNA后，由单链DNA将FGF-7基因、VEGF基因、BMP-2基因及作为内标的G3PDH基因，采用各自基因的特异性的正义引物及反义引物通过PCR反应进行扩增，将10μL该扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，用溴化乙啶染色，将其在透照镜下用DC120型可变焦数码摄像机拍摄后，通过1D图像分析软件，定量测定RT-PCR产物。

基于由不添加样品、或添加样品而各自培养的细胞调制的总RNA标准品，用通过RT-PCR反应扩增的FGF-7基因、VEGF基因及BMP-2基因的谱带强度值除以G3PDH基因的谱带强度值来求得校正值。然后，基于下式求出FGF-7基因、VEGF基因及BMP-2基因的mRNA表达促进率。

mRNA表达促进率(％)＝(A/B)×100

其中，式中A表示“添加样品时的校正值”，B表示“不添加样品时(对照)的校正值”。

结果如图3所示，确认石斛来源外泌体样囊泡可以促进FGF-7基因、VEGF基因及BMP-2基因的mRNA的表达。由此确认石斛来源外泌体样囊泡具有成纤维细胞生长因子-7生成促进作用、血管内皮生长因子生成促进作用、成骨因子-2生成促进作用。且在同等浓度下(0.05％)，石斛来源外泌体样囊泡对成纤维细胞生长因子-7，血管内皮生长因子，成骨因子-2的促进作用高于石斛提取物。

试验例4：对小鼠脱毛区体毛长度及重量、毛囊数的影响

50只近交系C57BL/6小鼠按体重编号，采用随机排列表法分为生发组(涂抹试验组，同上述试验例样品3)、阳性对照组(涂抹0.2％米诺地尔溶液)、阳性对照组(涂抹0.1％石斛提取物水溶液)、模型对照组(不涂任何药物)，每组10只。

小鼠经乙醚麻醉后用松香/石蜡混合物(1:1)热融化后涂于背部，待凝固变硬后去，以小鼠背部光滑，无伤无毛根为净，诱导其毛发由休止期进入生长期，脱毛面积约为2cm×2cm。脱毛后第2日起分別于脱毛区涂抹相应药物，每日2次，每次0.2mL/只，连续15日。

1)于16日在每鼠脱毛区相同位置取最长毛10根，显微镜下用显微测微尺测量其长度，以10根毛均长代表每只鼠的毛长，求出各组小鼠毛长的均值；

2)随后脱颈处死小鼠，将背部脱毛区毛皮剪下，用14mm打孔器于每鼠脱毛区相同位置取一圆形皮片，用手术刀刮下皮片上所有体毛，万分之一天平称重计算每组平均毛重。

3)实验第16天各组分別颈椎脱白处死只小鼠，背部平行脊柱相同部位取材，观察毛囊组织学变化并对毛囊进行形态学分期。依据国际毛发周期评分法，对各期毛囊作以下评分：生长Ⅵ期为100分，退行早期为200分，退行中期为300分，退行晩期为400分。每只小鼠随机选择50个毛囊，确定各组毛囊所处的周期，计算平均毛发周期诉分及生长期I期、退行早期、退行中期、退行晩期毛囊所占百分比。

4)每例数3个视野下(X100)的毛囊数，取其均值为该例毛囊数，求出各组小鼠毛囊数的均值。

结果如表2所示，确认石斛来源外泌体样囊泡可以促进毛发长度增长，毛发重量增加，促进毛发从退行期进入生长期。

表2

本申请说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，从石斛的茎部位中分离得到。

2.根据权利要求1所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，所述石斛选自铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛、小粉花石斛、鼓槌石斛、马鞭石斛、黄草石斛、环草石斛，蝴蝶石斛中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，所述石斛选自：铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，通过以下步骤分离得到：

1)粉碎石斛茎获得石斛茎汁液；

2)离心分离所述石斛茎汁液获得上清液；

3)密度梯度离心步骤2)所得上清液，取密度范围为1.00-1.20g/ml的级层继续超速离心，即得颗粒状的石斛来源外泌体样囊泡。

5.根据权利要求4所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，步骤2)所述的离心具体为将所述石斛茎汁液在4℃，500-1000g条件下离心10-20min获得第一上清液；然后，将第一上清液在4℃，2000-4000g条件下再次离心15-30分钟获得上清液。

6.根据权利要求5所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，所述步骤3)中的密度梯度离心具体为：先将80％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液、所述上清液添加至超速离心管中，在4℃、80,000g条件下密度梯度离心4h，取位于80％蔗糖溶液层和30％蔗糖溶液层之间的分离层；再将分离层配置成50％碘克沙醇溶液，并将其与35％碘克沙醇溶液、20％碘克沙醇溶液、150mM NaCl/20mM HEPES溶液依次添加至超速离心管中，在4℃和220,00g下进行密度梯度离心3小时。

7.根据权利要求6所述的石斛来源外泌体样囊泡，其特征在于，所述步骤3)超速离心具体为将密度范围为1.00-1.20g/ml的级层稀释后，在4℃和120,000g下超速离心1小时。

8.一种石斛来源外泌体样囊泡在预防、改善脱发症方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将其用于头部护理产品。

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