CN113826567B - 一种抑制刺参化皮的组合物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制刺参化皮的组合物与应用，属于海洋生物技术领域，所述所述组合物中的成分及终浓度为：30μMEmricasan、20μMIlomastat和15ug/mlNafamostat Mesylate，DMSO的体积比为1％，溶剂为超滤海水。将鲜活海参在所述组合物组成的溶液中4℃浸泡45min。浸泡后的鲜活海参能够在辐射强度为15W/m2，波长为365nm的UVA灯紫外灯照射40min后置于冰上保存96h不自溶。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制刺参化皮的组合物与应用。
背景技术
刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科，具有极高的营养价值和经济价值，是我国海参养殖的主要种类。刺参的鲜活程度在一定程度上影响其品质、价格以及再养殖。刺参受到外界环境的刺激，例如紫外辐射、高温、创伤、油渍等，会产生化皮现象，造成严重的经济损失。因此，在科研以及实际生产中通过抑制刺参响应外界刺激而产生的自溶，维持其鲜活程度，延长其储存及运输时间是亟待解决的重要问题。目前在实际生产中常用的延缓刺参化皮方式主要有低温、充氧和麻醉法，但这些方法维持刺参鲜活的时间较短，且无法缓和外界刺激对刺参产生的影响，此外麻醉法操作复杂，需饲养一段时间后才能出售。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种抑制刺参化皮的组合物及应用，所述抑制剂可以抑制刺参自溶时发挥关键作用的内源酶，延缓其自溶时间，为鲜活刺参的保藏、运输、再养殖提供技术支持。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：
一种抑制刺参化皮的组合物，所述组合物中的成分及终浓度为：30μMEmricasan、20μMIlomastat和15ug/mlNafamostat Mesylate，DMSO的体积比为1％，溶剂为超滤海水。
本发明还提供上述组合物的应用方法，将鲜活海参在上述组合物组成的溶液中4℃浸泡45min。
本发明与现有技术相比的有益效果：
使用本发明组合物浸泡后的鲜活海参能够在辐射强度为15W/m2，波长为365nm的UVA灯紫外灯照射40min后置于冰上保存96h不自溶。
附图说明
图1为UVA照射组和对照组刺参化皮斑点数。
图2为A、B、C、D四个处理组刺参的化皮斑点数。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
化皮模型构建：取鲜活刺参10只，均分为两组，分别为UVA照射组和对照组。UVA照射组刺参沥去海水，通过辐射强度为15W/m2，波长为365nm的UVA灯紫外灯照射40min，后置于冰上避光保存。对照组刺参沥去海水后不做处理置于冰上避光保存。每隔12h观察记录两组刺参的化皮斑点数。
数据分析：使用R语言aov函数进行单因素方差分析，使用aggregate函数计算均值和标准差。结果显示，UVA照射组和对照组从12h记录开始其就出现明显的差异如表1所示，到96h时UVA照射组刺参化皮程度明显高于对照组刺参(图1)。
表1两组不同时间段平均每只刺参化皮斑点数
通过泄殖腔注射和浸泡的方式，施加抑制剂，分别为Emricasan、Ilomastat和Nafamostat Mesylate。
1、Emricasan有效浓度与使用方法：
1.1分组：
取27只大小相似、体壁无损伤的鲜活刺参，均分9组，分别为对照组(3只)、注射组(12只)和浸泡组(12只)。
1.2Emricasan溶液配置：
A溶液：5mg Emricasan使用DMSO溶解，初始浓度为5mM，后用低温纯净水稀释，设置浓度梯度为10μM、30μM、50μM、70μM。
B溶液：5mg Emricasan使用DMSO溶解，初始浓度为5mM，后用低温超滤海水稀释，设置浓度为10μM、30μM、50μM、70μM。
1.3Emricasan使用方法：
注射组12只刺参均分为4组，采用泄殖腔注射的方式分别注射浓度为10μM、30μM、50μM、70μM的Emricasan溶液，注射量为1.5-2ml。
浸泡组12只刺参均分为4组，采用浸泡的方式分别浸泡在浓度为10μM、30μM、50μM、70μM的Emricasan溶液，浸泡温度为4℃，浸泡时间为45min。
1.4诱导化皮：
注射和浸泡结束后，采用上述紫外诱导化皮模型，诱导对照组、注射组和浸泡组40min，后置于冰上避光保存，每隔12h观察记录化皮程度。
1.5结果：定义平均每只刺参的化皮斑点小于5个时为轻微化皮，化皮斑点数5-15个时为中度化皮，化皮斑点数大于15个时为重度化皮。定义刺参轻微化皮的时间为抑制剂的有效时间。不同浓度和使用方法效果如表2所示。根据表2数据得出，当使用方式为泄殖腔注射时最佳的有效浓度为50μM，有效时间为48h。当使用方式为浸泡时最佳的有效浓度为30-50μM，有效时间为48h。
表2使用Emricasan后各组刺参的化皮程度
注：*表示轻微化皮，**表示中度化皮，***表示严重化皮。
2、Ilomastat有效浓度与使用方法：
2.1分组：
取27只大小相似、体壁无损伤的鲜活刺参，均分3组，分别为对照组(3只)、注射组(12只)和浸泡组(12只)。
2.2Ilomastat溶液配置：
A溶液：浓度为10mM的Ilomastat使用低温纯净水稀释，设置浓度梯度为10μM、20μM、30μM、40μM。
B溶液：浓度为10mM的Ilomastat使用低温超滤海水稀释，设置浓度为10μM、20μM、30μM、40μM。
2.3Ilomastat使用方法：
注射组12只刺参均分为4组，采用泄殖腔注射的方式分别注射浓度为10μM、20μM、30μM、40μM的Ilomastat溶液，注射量为1.5-2ml。
浸泡组12只刺参均分为4组，采用浸泡的方式分别浸泡在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM的Ilomastat溶液，浸泡温度为4℃，浸泡时间为45min。
2.4诱导化皮：
注射和浸泡结束后，采用上述紫外诱导化皮模型，诱导对照组、注射组和浸泡组40min，后置于冰上避光保存，每隔12h观察记录化皮程度。
2.5结果：定义平均每只刺参的化皮斑点小于5个时为轻微化皮，化皮斑点数5-15个时为中度化皮，化皮斑点数大于15个时为重度化皮。定义刺参轻微化皮的时间为抑制剂的有效时间。不同浓度和使用方法效果如表3所示。根据表3数据得出，当使用方式为泄殖腔注射时刺参普遍会出现吐肠行为，当使用方式为浸泡时最佳的有效浓度为20-40μM，有效时间为36h。
表3使用Ilomastat后各组刺参的化皮程度
注：*表示轻微化皮，**表示中度化皮，***表示严重化皮。
3、Nafamostat Mesylate有效浓度与使用方法：
3.1分组：
取27只大小相似、体壁无损伤的鲜活刺参，均分9组，分别为对照组(3只)、注射组(12只)和浸泡组(12只)。
3.2Nafamostat Mesylate溶液配置：
A溶液：10mg的Nafamostat Mesylate使用DMSO配置成10mg/ml的初始溶液，后用低温纯净水稀释，设置浓度梯度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml。
B溶液：10mg的Nafamostat Mesylatet使用DMSO配置成10mg/ml的初始溶液，后使用低温超滤海水稀释，设置浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml。
3.3Nafamostat Mesylate使用方法：
注射组12只刺参均分为4组，采用泄殖腔注射的方式分别注射浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml的Nafamostat Mesylate溶液，注射量为1.5-2ml。
浸泡组12只刺参均分为4组，采用浸泡的方式分别浸泡在浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml的Nafamostat Mesylate溶液中，浸泡温度为4℃，浸泡时间为45min。
3.4诱导化皮：
注射和浸泡结束后，采用上述紫外诱导化皮模型，诱导对照组、注射组和浸泡组40min，后置于冰上避光保存，每隔12h观察记录化皮程度。
3.5结果：定义平均每只刺参的化皮斑点小于5个时为轻微化皮，化皮斑点数5-15个时为中度化皮，化皮斑点数大于15个时为重度化皮。定义刺参轻微化皮的时间为抑制剂的有效时间。不同浓度和使用方法效果如表4所示。根据表4数据得出，当使用方式为泄殖腔注射时刺参普遍会出现吐肠行为，当使用方式为浸泡时最佳的有效浓度为15-20ug/ml，有效时间为36h。
表4使用Nafamostat Mesylate后各组刺参的化皮程度
注：*表示轻微化皮，**表示中度化皮，***表示严重化皮。
实施例2
通过上述方法得到不同抑制剂的使用方法和效果后，为了得到具有最佳抑制化皮效果的抑制剂，将抑制剂组合使用。
1.1分组：
根据上述不同抑制剂的使用效果，选择以下分组：A、Emricasan+Ilomastat+Nafamostat Mesylate浸泡组(3只)，B、Emricasan浸泡组(3只)，C、Ilomastat+NafamostatMesylate浸泡组(3只)，D、对照组(3只)。
2.2溶液配置
A抑制剂：初始浓度为5mM的Emricasan、10mM的Ilomastat和10mg/ml的NafamostatMesylate使用低温超滤海水混合稀释成A溶剂。其组成成分的终浓度为Emricasan 30μM、Ilomastat 20μM、Nafamostat Mesylate 15ug/ml。
B抑制剂：初始浓度为5mM的Emricasan。使用低温超滤海水稀释成B溶剂。其组成成分的终浓度为Emricasan 30μM。
C抑制剂：初始浓度为5mM的Ilomastat和10mg/ml的Nafamostat Mesylate，低温超滤海水混合稀释成C溶剂。其组成成分的终浓度为Ilomastat 20μM、Nafamostat Mesylate15ug/ml。
3.3使用方法：
A、B、C三组刺参分别置于配置好的A、B、C三种抑制剂中浸泡，浸泡温度为4℃，时间为45min。D组刺参不做处理。
4.4诱导化皮
浸泡结束后，采用上述紫外诱导化皮模型，对A、B、C、D四组刺参进行化皮诱导，后置于冰上避光保存，每隔12h观察记录化皮程度。
4.5数据分析
使用R语言aov函数和TukeyHSD函数进行单因素方差分析和多重比较分析，结果如表5所示。三种抑制剂对刺参化皮具有显著的抑制作用，其中三种抑制剂组合使用的A组抑制效果最好，B、C两组的抑制效果相似。各组抑制剂使用后96h的效果见图2。
表5各组不同时间段平均每只刺参的化皮斑点数
Claims (2)
1.一种抑制刺参化皮的组合物，其特征在于所述组合物中的成分及终浓度为：30μMEmricasan、20μMIlomastat和15ug/mlNafamostat Mesylate，DMSO的体积比为1％，溶剂为超滤海水。
2.权利要求1所述组合物的应用方法，其特征在于所述方法为将鲜活海参在权利要求1所述组合物组成的溶液中4℃浸泡45min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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