CN113813386A - 组合肿瘤免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合肿瘤免疫疗法。提供的是用于使用某些CpG寡核苷酸(CpG ODN)的局部施用和检查点抑制剂(如抗PD‑1抗体、抗PD‑L1抗体和/或抗CTLA‑4抗体)的系统施用来治疗癌症的方法。在优选的实施方案中，基于其相对于白介素‑10(IL‑10)和B细胞激活诱导高量的干扰素α(IFN‑α)和T细胞激活的倾向来选择该CpG ODN。在某些实施方案中，该方法进一步包括用放疗进行预治疗，以增强该组合免疫疗法。

Description

组合肿瘤免疫疗法
本申请是申请日为2015年12月22日、中国申请号为201580075681.0、发明名称为“组合肿瘤免疫疗法”的发明申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2014年12月31日提交的美国临时专利申请号62/098,568；2015年1月22日提交的美国临时专利申请号62/106,526；和2015年2月19日提交的美国临时专利申请号62/118,165的优先权。
发明背景
许多科学家已经试图通过激活针对肿瘤的免疫系统来治疗癌症。然而，尽管偶然成功，对免疫疗法的持久应答是罕见的并且仅限于几种肿瘤类型。本领域技术人员目前对癌症免疫疗法的理解已经在最近的综述文章中得到总结，包括例如Chen and Mellman,Immunity 2013 39(1):1-10。用于诱导针对肿瘤的治疗性免疫应答的周期可以分为七个不同的步骤(图1)：
1.释放癌细胞抗原；
2.抗原呈递细胞(APC，通常在引流淋巴结中)呈递癌细胞抗原；
3.T细胞致敏和激活；
4.CD8+T细胞运至肿瘤；
5.CD8+T细胞浸润到肿瘤中；
6.浸润的CD8+T细胞识别癌细胞；以及
7.杀死癌细胞。
本领域教导到，抗肿瘤应答的每个步骤都有多种正负介质。最近的研究兴趣已经集中在理解和解决负介质在抑制抗肿瘤免疫应答方面的作用。例如，白介素-10(IL-10)是可以具有复杂作用，在肿瘤中局部免疫抑制，但是在系统实际上可以具有抗肿瘤活性的因子(概述于Vicari and Trinchieri,Immunol.Rev.,2004中)。尽管Toll样受体(TLR)激动剂如激活TLR9的CpG寡核苷酸(CpG ODN)具有促进抗肿瘤应答的免疫刺激作用，但是本领域还已知它们诱导免疫抑制因子如IL-10(概述于Lu,Frontiers Immunol,2014中)。本领域没有教导由于诱导较少量的IL-10产生而具有改进的抗肿瘤作用的TLR9激动剂的设计。虽然如此，但是最近对肿瘤免疫周期的这种日益增长的理解已经提高了通过使用在该周期中的不同点起作用的诱导针对肿瘤的治疗性免疫应答的药剂组合来提高癌症免疫疗法的临床疗效的意识，但是本领域并未提供用以预测许多不同的可能组合中的哪一种将是优选的癌症免疫生物学的足够深的理解。
用以考虑抗癌T细胞应答发展的另一种可能方法是诱导T细胞应答的3信号模型，由Kim and Cantor,Cancer Immunol Res 2014 2:929-936进行了总结并呈现于图2中。在此模型中，到T细胞的信号1来自适当的MHC上的APC将抗原呈递到T细胞受体。信号2是通过T细胞上的CD28与APC上的B7-1或B7-2的相互作用的共刺激信号的必要条件(此信号被存在于Treg上的CTLA-4拮抗：抗CTLA-4抗体在癌症免疫疗法中的疗效是由于它们对此“off”信号的抑制)。最后，信号3是经由炎性细胞因子受体和PD-1由信号产生的T细胞功能的调节。具体而言，对于诱导最佳CD8+T细胞应答(已知其对成功的癌症免疫疗法是至关重要的)，I型IFN信号传导是非常积极的信号，但是当长期或长时间时也可能自相矛盾地地导致T细胞耗尽和无应答性，这是通过PD-1表达的上调介导的。通过其抗体或其调节抗肿瘤免疫的主要配体阻断PD-1，PD-L1因此恢复T细胞在肿瘤微环境中增殖和产生细胞因子的能力。
最近，使用“检查点抑制剂”(CPI)化合物(如抗体)已经有若干早期临床成功，该化合物阻断检查点分子(如CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1)的负免疫作用。抗CTLA-4抗体的系统施用已经在约10％的患有黑色素瘤的患者中导致持久应答，并且在其他肿瘤类型中导致一些令人鼓舞的早期结果，但是以高比率的不利反应为代价，包括一些患者的死亡。抗PD-1/PD-L1人类临床试验也一直报道令人鼓舞的结果，显然地严重毒性的比率较低。然而，应答患者的分析已经揭示，跨多种不同类型的癌症，对抗PD-L1疗法的应答相对限于具有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和在肿瘤中有Th1基因表达谱的患者(Powles et al.,Nature 2014515:558；Herbst et al.,Nature 2014 515:563；Tumeh et al.,Nature 2014 515:568)。也就是说，在一些对该肿瘤具有预先存在的免疫力的患者中可以看到应答，但是在没有这种免疫力的患者中很不可能发生。除了预先存在的抗肿瘤免疫相对常见的黑色素瘤之外，TIL在大多数其他肿瘤类型中相对不常见，表明CPI在大多数类型的癌症中可能具有有限的益处。因此，需要改进CPI用于癌症疗法的疗效。
发明概述
本发明提供了用于促进免疫激活并减少免疫抑制(从而隐喻免疫系统的“踩油门”和“释放刹车”两者)以治疗癌症的方法。本发明可以例如用于将“冷”(治疗抗性或难治性)癌症或肿瘤转化为易于治疗(包括通过检查点抑制来治疗)的“热”癌症或肿瘤。
本发明提供了与在过去的癌症免疫疗法中最广泛使用的CpG ODN相比具有减少量的硫代磷酸酯修饰的具体CpG ODN亚型，及其与CPI和/或放疗(XRT)组合用于改进的癌症(包括对任何这些单独的疗法不可能作出应答的癌症)免疫疗法或在其他组合中的瘤内和瘤周施用的方法。
CpG ODN结合并刺激TLR9，一种仅在两种类型的人类免疫细胞中组成型地表达的先天免疫受体：B细胞，其通过增殖并分泌免疫球蛋白而对TLR9刺激作出应答；和浆细胞样树突细胞(pDC)，其通过分泌大量的I型IFN(IFN-α和IFN-β)而对TLR9刺激作出应答。本发明至少部分地基于以下发现，即对CpG ODN的IFN-α应答对于肿瘤免疫疗法而言是重要的。本发明至少部分地基于以下发现，即对CpG ODN的强IFN-α应答对于肿瘤免疫疗法(包括使用CpG ODN的瘤内施用的肿瘤免疫疗法)而言是重要的。
本发明的优选CpG ODN至少部分地通过其诱导高量的I型IFN的倾向进行表征。
据信I型IFN在肿瘤排斥中发挥关键作用。例如，I型IFN增加CD8+T细胞存活、扩增和效应子分化；促进树突细胞(DC)成熟、肿瘤相关抗原向CD8+T细胞的交叉呈递；为针对致癌物诱导的肿瘤的免疫监视所需；并且为植入肿瘤的排斥所需。另外，I型IFN相关mRNA的水平与人类转移瘤中的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)相关联。
除比任何其他诱导较高水平的I型IFN之外，TLR9配体(如CpG ODN)还激活pDC并诱导数以百计的其他促进Th1的基因和因子的分泌；并且将pDC从不成熟的/促进耐受性的表型转化为成熟的被激活的诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表型。
本发明还至少部分地基于以下发现，即CpG ODN向肿瘤的递送(直接地或间接地)诱导粘附分子在该肿瘤中和周围的局部脉管系统中的表达，并且促进被激活的T细胞(CD4+和CD8+)从毛细细管向该肿瘤和周围区域的流出。这些T细胞中的一些对未突变的和突变的肿瘤相关抗原(TAA)有特异性。在不存在检查点抑制剂和/或XRT的情况下，这些T细胞可以被该肿瘤抑制，但是组合时，这产生了比可以通过CpG或该检查点抑制剂或XRT自身实现的强得多的抗肿瘤效应。
在某些方面中，本发明基于不同于曾经用于癌症免疫疗法的那些的CpG ODN类别的使用。具体而言，在某些方面中，本发明基于与在过去已经广泛使用的B类CpG ODN相比具有减少量的硫代磷酸酯(PS)修饰的分泌高IFN-α的类别(即A类和E类)的使用。B类CpG ODN典型地是完全经硫代磷酸酯修饰的，以增加其对核酸酶的抗性和B细胞激活的幅值。相比之下，由于本发明的焦点在于实现高I型IFN应答而非B细胞激活，本发明的优选CpG ODN没有硫代磷酸酯修饰，或者仅在5'端具有1或2个硫代磷酸酯修饰并且在3'端具有1至4个硫代磷酸酯修饰。本发明的优选E类ODN还在该ODN内的CpG二核苷酸处以及任选地在其他位置处含有磷酸二酯(PO)键联，以便减少B细胞激活(和相伴的IL-10和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)诱导)，并且它们还优选地含有一个或多个回文以形成双链体或多联体。
本领域技术人员理解，人类癌症患者体内的瘤内或瘤周CpG将激活肿瘤引流淋巴结中的APC，增强癌症免疫周期的步骤2(参见图3)。然而，本领域技术人员不很好地理解的是，诱导高IFN的CpG ODN的这种施用途径还将诱导TIL并将该肿瘤微环境转化为更有利于诱导临床上有益的抗肿瘤免疫的更Th1样状态。诱导高IFN的CpG ODN的瘤内施用诱导T细胞浸润到该肿瘤中，尤其包括CD8+T细胞浸润。其重要性在于据信这种CD8+T细胞向肿瘤中的浸润是对用抗PD-1或抗PD-L1治疗的应答的最佳预测物。因为在过去用CpG寡核苷酸的瘤内施用进行的人类临床试验使用B类ODN，在肿瘤中有显著的IL-10局部产生，这将抑制抗肿瘤免疫应答。本发明的特征在于改进的优选的CpG ODN以及用于对其进行鉴定的设计和筛选，该CpG ODN与在过去使用的B类ODN相比诱导较低量的IL-10产生和较高量的I型IFN分泌。使用本发明的方法，当与检查点抑制剂组合时，此类优选的CpG ODN将在癌症疗法中提供改进的协同作用。
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的放疗、TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该放疗在施用该TLR9激动剂之前开始，并且该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂、第一检查点抑制剂(CPI)和第二CPI，其中该TLR9激动剂和该第一CPI施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近，并且该第二CPI系统施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂诱导IFN-α。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是CpG DNA，例如CpG ODN。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpG DNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A类CpG DNA。
在某些实施方案中，该A类CpG DNA的序列是GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:82)。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是C类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A/E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是P类CpG DNA。
在某些实施方案中，包括CpG DNA的该TLR9激动剂通过磷酸二酯骨架完全地连接。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是在5'端仅具有单个硫代磷酸酯核苷酸间键联并且在3'端仅具有单个硫代磷酸酯核苷酸间键联的CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是具有单个硫代磷酸酯键联的CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是环状的，具有天然磷酸二酯DNA骨架。
在某些实施方案中，该CPI系统施用。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合选自下组的抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3和LAG3。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合选自下组的一种或多种抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1和CTLA-4。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合选自下组的抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1和CTLA-4。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤或选自下组的器官或组织的癌性肿瘤，该组由以下各项组成：皮肤、头和颈、食管、胃、肝、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、子宫颈、卵巢、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑、肌肉和骨。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是黑色素瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是骨髓的癌症。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是类癌瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是神经母细胞瘤。
在某些实施方案中，该受试者是人。
附图简述
图1(现有技术)是癌症免疫周期的示意图，描绘了七个步骤。来自Chen andMellman,Immunity 2013。
图2是诱导抗肿瘤免疫所需的三个信号的示意图。每个T细胞表达在特异性MHC的背景下识别特异性抗原的独特TCR(信号1)。CD4和CD8辅助受体增加TCR的抗原识别的敏感性。最佳T细胞扩增和效应子功能的获得需要由共刺激受体转导的信号(信号2)。CD28—BB7-1/B7-2相互作用递送激活信号，而CTLA-4—B71/B7-2相互作用抑制T细胞激活。经由CD28和CTLA-4的信号传导对于CD4 Treg的发育和功能而言也是至关重要的。炎性信号通常诱导表面细胞因子受体和其他受体(包括PD-1)的上调(信号3)。PD-1的表达与感染和癌症期间T细胞的耗尽表型的获得是相关的。PD-1—PD-L1相互作用参与TFR活性的抑制并且还已经牵涉在pTreg产生中。使用抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1 Ab的检查点阻断的临床前和临床数据表明增加的抗肿瘤免疫可以通过增强的Teff活性和耗竭或减少的CD4 Treg抑制的组合效应加以实现。来自Kim and Cantor,Cancer Immunol.Res.2014 2:926-936。
图3是癌症免疫周期的示意图，描绘了CpG ODN、CPI和XRT的作用。改编自Chen andMellman,Immunity 2013。
图4是描绘了组1CpG-A寡核苷酸的IFN-α诱导的图。PBS，磷酸盐缓冲盐水对照。
图5是描绘了所选择的组1CpG-A寡核苷酸的IFN-α诱导的图。PBS，磷酸盐缓冲盐水对照。
图6是描绘了组2CpG-A寡核苷酸的IFN-α诱导的图。Y轴，pg/mL IFN-α。PBS，磷酸盐缓冲盐水对照；TE，Tris-EDTA。
图7是描绘了组2CpG-A寡核苷酸的白介素-10(IL-10)诱导的图。Y轴，pg/mL IL-10。PBS，磷酸盐缓冲盐水对照；TE，Tris-EDTA。
图8是描绘了二硫代磷酸酯骨架修饰对组3CpG-A寡核苷酸的IFN-α诱导的影响的图。
图9是描绘了减少CpG-A寡核苷酸G10中的5'和/或3'G的数目或改变诱导自正常人类外周血单核细胞(PBMC)的IFN-α分泌时的回文的结构-活性关系的图。nAb，新抗Qb抗体；oAb，旧抗Qb抗体；PBS，磷酸盐缓冲盐水对照。
图10是描绘了减少CpG-A寡核苷酸G10中的5'和/或3'G的数目或改变诱导自正常人类外周血单核细胞(PBMC)的IP-10分泌时的回文的结构-活性关系的图。nAb，新抗Qb抗体；oAb，旧抗Qb抗体；PBS，磷酸盐缓冲盐水对照。
图11是描绘了减少CpG-A寡核苷酸G10中的5'和/或3'G的数目或改变诱导自正常人类外周血单核细胞(PBMC)的IL-10分泌时的回文的结构-活性关系的图。nAb，新抗Qb抗体；oAb，旧抗Qb抗体；PBS，磷酸盐缓冲盐水对照。
图12是一对描绘了荷A20淋巴瘤小鼠体内的肿瘤体积的图。所有小鼠用低剂量(20μg)的CMP-001致敏以诱导抗Qb抗体，使得一旦治疗开始，病毒样颗粒(VLP)便被调理且激活DC。在第0天，将淋巴瘤细胞接种在小鼠的两胁。从第7天开始，直接用CpG(CMP-001)或盐水注射小鼠一侧的(经处理的)肿瘤，而另一侧的(未经处理的)肿瘤不注射。小鼠然后还每周接受两次腹膜内抗PD-1或盐水，如所指示的。图12小图A中的图描绘了“未经处理的”(远处的)肿瘤的平均肿瘤体积。图12小图B中的图描绘了“经处理的”肿瘤的平均肿瘤体积。N＝10，对于每个组而言。
图13是描绘了图12的实验中的小鼠的存活曲线的图。
发明详述
通常已知Toll样受体(TLR)配体是由APC呈递癌细胞抗原的潜在诱导剂。然而，先前不知道什么样的具体TLR配体是优选的，并且即使在TLR9配体的情况下，先前不知道哪种(如果有的话)CpG ODN是优选的，并且先前也不知道它们优选的剂量和施用途径。几乎所有的肿瘤学中的CpG ODN人类临床试验都使用了经由系统途径施用的B类ODN，而一些试验已经探索了瘤内施用(在下文进一步讨论)。
免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的发明以及CpG ODN的各种类型和设计的后续发明为癌症免疫疗法提供了新的机会。基于在啮齿动物模型中的令人鼓舞的临床前数据，已经在肿瘤患者中使用单独的或与各种化疗方案、疫苗、抗体和放疗组合的若干不同CpGODN的系统和瘤内施用进行CpG ODN人类临床试验，但是再一次，临床应答是不常见的，并且尽管有一些令人鼓舞的早期临床试验结果，3期试验迄今尚未成功(概述于Krieg,NucleicAcid Ther.2012 22(2):77-89中)。因此，需要提供改进的寡核苷酸治疗方法以提高癌症免疫疗法的成功率。
癌症患者用与保守的未突变的自身抗原连同佐剂接种的肿瘤疫苗已经成为免疫肿瘤学家多年的目标，但是尽管成功地诱导针对所选择的抗原的免疫，几乎一致地不能提供明确的临床益处。B类CpG ODN已经在多项癌症疫苗临床试验中增强了抗肿瘤CD8+T细胞应答的诱导(例如，Kruit et al.,J Clin Oncol 2013；Tarhini et al.,J Immunother2013；Lovgren et al.,Cancer Immunol Immunother 2012；Karbach et al.,Clin CancerRes 2011；Karbach et al.,Int J Cancer 2010；Speiser et al.,JCI 2005)，并且在单个试验中未经修饰的A类CpG ODN被用作疫苗佐剂(Speiser et al.,J.Immunother 2010)，但是这些很少与临床应答相关，并且使用MAGE-3肿瘤抗原由GSK(GlaxoSmithKline)进行的该方法的3期临床试验似乎已经失败了。具体而言，值得注意的是，与先前使用B类CpG ODN接种的那些黑色素瘤患者体内的增加近平均10倍的CTL应答相比，使用A类CpG ODN的疫苗临床试验显示出相对较弱的CTL应答的诱导，该CTL应答在仅约一半的患者中自基线增加大约两倍，指示现有技术的状态。有可能的是，免疫系统不容易在足以抵抗肿瘤的程度上克服对未突变的自身抗原的自身耐受性，导致许多本领域技术人员寻求诱导针对替代的突变的肿瘤抗原的肿瘤免疫的方法。使用肿瘤转录组深度测序的最近研究已经揭示，所有癌症都含有可变数量的独特的突变抗原，称为肿瘤特异性新抗原(Rajasagi et al.,Blood 2014124(3):453-462)，并且本领域技术人员已经寻求指导针对此类抗原的抗肿瘤免疫应答的方法。正在追求的一种方法是将这些新抗原的一些或全部合成为肽，并且用适当的有待在如病毒样颗粒等的配制品中呈递在II类MHC上的抗原肽且使用非常强的佐剂(如CpG B类ODN)接种癌症患者。这样一种方法开发起来将是极其复杂且昂贵的。因此，需要诱导针对肿瘤特异性新抗原的抗肿瘤免疫应答的改进的方法。
本发明提供了通过使用TLR9激动剂将肿瘤自身变为疫苗(归因于以解除检查点抑制剂的“制动器”的方式改变肿瘤微环境，同时诱导强的细胞介导的免疫)的优越方法。
放疗一直被用于癌症的治疗中，并且目前它已被用于大约60％患有实体瘤的患者的治疗中(概述于Prasanna et al.,J Thoracic Dis.2014 6(4):287-302中)。尽管放疗通常可以使肿瘤缩小，但这种效果是最常见地姑息的，并且持久的应答是极其罕见的。此外，放疗通常仅适于治疗一种或少量的肿瘤病变，并且因此通常不用于转移性癌症的治疗中。
在一些不寻常的情况下，XRT可以导致远处的肿瘤块的消退，这是由于诱导针对不仅在照射的病变中而且在远处的转移瘤中存在的肿瘤抗原的特异性免疫应答的结果。这已被称为“远端效应”，并且具体而言，由于Postow等人(N.Engl.J.Med.2012 366(10):925-31)的最近的病例报告，除了仅放疗之外，此术语已被用于包括其他形式的局部化肿瘤治疗。
当在抗CTLA-4疗法之前或之后施用XRT时都已经可以看到远端效应：例如，多于一半的在抗CTLA-4疗法之后用XRT治疗的21名黑色素瘤患者显示出远处的肿瘤消退的证据(Grimaldi et al.,Oncoimnunol.2014 3:e28780)。
I.定义
除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外需要，否则单数形式的术语应当包括复数形式并且复数形式的术语应当包括单数形式。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交结合使用的命名及其技术是本领域熟知的且通常使用的那些。
除非另外指示，否则本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的方法且如本说明书全篇所引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的来进行。此类参考文献包括例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)，Ausubel et al.,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)，和Harlow and Lane Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，将其通过引用并入本文。根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常所完成或如本文所述的。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名及其实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
如本文所用，以下术语各自具有与它在此部分中相关的含义。
本文使用冠词“一个/一种”(“a”和“an”)指代一个/一种或多于一个/一种(即，至少一个/一种)的该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
如本文所用的，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology--ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，将其通过引用并入本文。
本文使用常规符号来描绘多肽序列：多肽序列的左端是氨基末端；多肽序列的右端是羧基末端。
“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。本领域的技术人员熟知进行这种调整的手段。参见例如，Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。
具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可替代地，保守置换是在PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，披露于Gonnet et al.,Science 256:1443-45(1992)中，通过引用并入本文。“中等保守”置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
优选的氨基酸取代是以下那些：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，以及赋予或修饰此类类似物的其他物理化学或功能特性。包含取代、缺失和/或插入的类似物可以包括不同于天然存在的肽序列的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中(优选地在该多肽的形成分子间接触的结构域以外的部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代应当不实质上改变母体序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应当倾向于破坏在母体序列中出现的螺旋，或破坏表征母体序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的例子描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton et al.,Nature 354:105(1991)中，将其各自通过引用并入本文。
多肽的序列相似性以及类似地多肽的序列同一性典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给不同取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性的量度来匹配相似序列。例如，GCG含有如“Gap”和“Bestfit”等的程序，这些程序可以在默认参数下使用以确定紧密相关的多肽(如来自不同生物体物种的同源多肽)之间，或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG Version 6.1。也可以使用FASTA，使用默认的或推荐的参数(GCG Version 6.1中的程序)来比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。当比较本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是blastp或tblastn。参见例如，Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Altschul etal.,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)；通过引用并入本文。
完整“抗体”包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。总体上参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以其全文通过引用并入本文)。每条重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以将VH和VL区进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的称作框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个结构域的氨基酸分配符合Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature342:878-883(1989)的定义。
重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q))相结合。
术语“抗体”可以包括完整抗体的保留特异性地结合该完整抗体的抗原(例如，PD-1)的能力的抗原结合部分。可以通过重组DNA技术或通过对完整抗体进行酶促或化学裂解来产生抗原结合部分。
抗原结合部分的例子包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的单结构域抗体(“dAb”)，如Ward et al.,Nature 341:544-546(1989)中所述的；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该接头使得它们成为单条蛋白质链，其中VH和VL区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird etal.Science 242:423-426(1988)；和Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。提及术语“抗体”包括此类单链抗体。
“双特异性抗体”具有两种不同的结合特异性，参见例如，美国专利号5,922,845和美国专利号5,837,243；Zeilder J.Immunol.163:1246-1252(1999)；SomasundaramHum.Antibodies 9:47-54(1999)；Keler Cancer Res.57:4008-4014(1997)。例如，本发明提供了具有一个用于细胞表面抗原(如人类PD-1)的结合位点和用于效应细胞表面上的Fc受体的第二结合位点的双特异性抗体。本发明还提供了具有至少三个结合位点的多特异性抗体。
本发明考虑了结合任何两种不同检查点抑制剂的双特异性抗体。例如，该不同的CPI可以选自下组，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3和LAG3。因此，例如，双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1、PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM3、PD-1和LAG3、PD-L1和CTLA-4、PD-L1和TIM3、PD-L1和LAG3、CTLA-4和TIM3及CTLA-4和LAG3或TIM3和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1、PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM3或PD-1和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4、PD-L1和TIM3、PD-L1和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1或PD-1和CTLA-4。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4。
本发明还考虑了使用结合任何两种不同检查点抑制剂的双特异性抗体的本发明的方法。例如，该不同的CPI可以选自下组，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3和LAG3。因此，例如，双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1、PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM3、PD-1和LAG3、PD-L1和CTLA-4、PD-L1和TIM3、PD-L1和LAG3、CTLA-4和TIM3及CTLA-4和LAG3或TIM3和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1、PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM3或PD-1和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4、PD-L1和TIM3、PD-L1和LAG3。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1或PD-1和CTLA-4。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-1和PD-L1。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4。在某些实施方案中，该双特异性抗体可以结合PD-L1和CTLA-4。
术语“双特异性抗体”另外包括“双抗体”。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单条多肽链上，但是使用太短以致不允许在同一条链的两个结构域间进行配对的接头，从而迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Pollak etal.,Structure 2:1121-1123(1994))。
如在本文可互换使用的，术语“人类抗体”或“人类序列抗体”包括具有衍自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。本发明的人类序列抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的，术语“人类抗体”不旨在包括这样的“嵌合”抗体，其中衍生自另一种哺乳动物物种种系诸如小鼠的CDR序列已经嫁接到人类框架序列上(即，“人源化的”或PRIMATIZEDTM抗体)。
如本文所用的，术语“嵌合抗体”意指包含来自两种或更多种不同抗体的区域的抗体。例如，在一个实施方案中，该CDR中的一个或多个衍生自人类抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，该CDR全部衍生自人类抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，来自多于一种人类抗CTLA-4抗体的CDR组合在嵌合人类抗体中。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人类抗CTLA-4抗体的轻链的CDR1、来自第二人类抗CTLA-4抗体的轻链的CDR2和来自第三人类抗CTLA-4抗体的轻链的CDR3；并且类似地，来自重链的CDR可以衍生自一种或多种其他的抗CTLA-4抗体。另外，该框架区可以衍生自相同的抗CTLA-4抗体之一或衍生自一个或多个不同的人。
作为另一个例子，在一个实施方案中，该CDR中的一个或多个衍生自人类抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，该CDR全部衍生自人类抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，来自多于一种人类抗PD-1抗体的CDR组合在嵌合人类抗体中。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人类抗PD-1抗体的轻链的CDR1、来自第二人类抗PD-1抗体的轻链的CDR2和来自第三人类抗PD-1抗体的轻链的CDR3；并且类似地，来自重链的CDR可以衍生自一种或多种其他的抗PD-1抗体。另外，该框架区可以衍生自相同的抗PD-1抗体之一或衍生自一个或多个不同的人。
作为又另一个例子，在一个实施方案中，该CDR中的一个或多个衍生自人类抗PD-L1抗体。在另一个实施方案中，该CDR全部衍生自人类抗PD-L1抗体。在另一个实施方案中，来自多于一种人类抗PD-L1抗体的CDR组合在嵌合人类抗体中。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人类抗PD-L1抗体的轻链的CDR1、来自第二人类抗PD-L1抗体的轻链的CDR2和来自第三人类抗PD-L1抗体的轻链的CDR3；并且类似地，来自重链的CDR可以衍生自一种或多种其他的抗PD-L1抗体。另外，该框架区可以衍生自相同的抗PD-L1抗体之一或衍生自一个或多个不同的人。
此外，如本文先前所讨论的，嵌合抗体包括包含衍生自多于一个物种的种系序列的一部分的抗体。
如本文关于抗体所用的，术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中与在不存在该第二抗体的情况下该第一抗体的结合相比，该第一抗体与其同源表位的结合在该第二抗体的存在下是可检测地下降的。替代方案(其中该第二抗体与其表位的结合在该第一抗体的存在下也是可检测地下降的)可以但无需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而该第二抗体并不抑制该第一抗体与其相应表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论程度是相同、更大还是更小，该抗体被说成彼此“交叉竞争”其对应表位的结合。例如，交叉竞争抗体可以与本发明的抗体所结合的表位或该表位的一部分结合。竞争和交叉竞争两种抗体都被本发明所涵盖。不管发生这种竞争或交叉竞争的机制(例如，空间位阻、构象变化或与常见表位或其部分的结合等)，技术人员应基于本文提供的教导认识到此类竞争和/或交叉竞争抗体被涵盖并且可以用于本文公开的方法。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由如氨基酸或糖侧链等的分子的化学活性的表面集团组成，并且通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。构象和非构象的表位可以凭此区分，即在变性溶剂的存在下丧失与前者而非后者的结合。
如本文所用的，短语“特异性地结合”意指化合物(例如，蛋白质、核酸、抗体等)识别并结合特异性分子，但并不实质上识别或结合样品中的其他分子。例如，短语“特异性地结合”可以表征这样的抗体或肽抑制剂，其识别并结合样品中的同源配体(例如，与其同源抗原PD-1结合的抗PD-1抗体)，但并不实质上识别或结合该样品中的其他分子。因此，在指定的测定条件下，该指明的结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)优先结合特定靶分子并不以显著量结合测试样品中存在的其他组分。多种测定方式可以用来选择特异性地结合感兴趣的分子的抗体。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore和Western印迹分析被用来鉴定特异性地与PD-1反应的抗体。典型地特异性或选择性反应将至少是背景信号或噪声的两倍并且更典型地是背景的10倍多，甚至更具体地，当平衡解离常数(KD)≤1μM，优选地≤100nM，并且最优选地≤10nM时，抗体被说成“特异性地结合”抗原。
优选地，“特异性结合CPI的抗体”是这样的抗体或其抗原结合片段，除结合其靶CPI之外，其还干扰所结合的靶CPI与其同源配体之间的交互作用。例如，特异性结合PD-1的抗体优选地是这样的抗体或其抗原结合片段，除结合PD-1之外，其还干扰PD-1与其同源配体PD-L1之间的交互作用。
术语“KD”是指具体抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用的，“实质性纯的”意指目标种类是存在的主要种类(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其他个别的种类更丰富)，并且优选地，实质性纯化的级分是该目标种类(例如抗PD-1抗体)包含至少约50％(以摩尔计)的存在的所有大分子种类的组合物。通常，实质性纯的组合物将包含多于约80％的组合物中存在的所有大分子种类，更优选地多于约85％、90％、95％和99％。最优选地，该目标种类被纯化至必要的均质性(通过常规检测方法不能在该组合物中检测到污染物种类)，其中该组合物实质性由单个大分子种类组成。
如本文所用的，术语“治疗有效量”意指当施用哺乳动物(优选人)时，与在不存在该化合物的情况下检测到的应答相比，介导可检测的治疗性应答的量。治疗性应答(如但不限于肿瘤生长(包括肿瘤大小停滞)、肿瘤大小、转移等的抑制和/或减小)可以容易地通过大量的本领域公认的方法(包括例如诸如本文公开的方法)来评估。
技术人员应理解，本文施用的化合物或组合物的有效量变化并且可以容易地基于许多因素来确定，如所治疗的疾病或病症、疾病阶段、所治疗的哺乳动物的年龄和健康与身体状况、疾病的严重程度、所施用的具体化合物等。
“治疗有效量”旨在限定在一定程度上可检测地减少肿瘤性障碍的一种或多种症状所需的药剂的量，包括但不限于：1)癌细胞数目的减少；2)肿瘤大小的减小；3)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)癌细胞浸润到外周器官中；4)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)肿瘤转移；5)在一定程度上抑制肿瘤生长；6)在一定程度上减轻或减少与该障碍相关的一种或多种症状；和/或7)减轻或减少与抗癌剂的施用相关的副作用。
还可以使用本领域技术人员熟知的任何明确定义的TLR9激活的血液或组织标记物基于生物标记物应答来定义TLR9激动剂的“治疗有效量”。本发明的CpG ODN在其于血清、血浆、PBMC和/或组织或活检向诱导Th1样细胞因子和趋化因子应答方面大致类似于其他CpG ODN(例如，B类)，该应答可以如由Krieg et al.,J.Immunother.,2004 27:460-471所述的使用例如针对来自治疗之后大约24hr收集的血清或血浆的IP-10、I-TAC、MIG、MIP-1β、MIP-3β、IL-6、IL-12p40或IFN-α的细胞因子测定来测量，或还可以通过PBMC的RT-PCR测定来评估。瘤内地注射进癌症患者体内的治疗有效量的CpG ODN到24小时将把血清IP-10水平增加到至少100pg/ml，并且优选地增加到100-100,000pg/ml之间，并且最优选地增加到1,000至10,000pg/mL之间。
与剂量通常升级到最大耐受剂量(MTD)的化疗药物形成对照，免疫刺激性药物(如本发明的CpG ODN)在通常低于MTD的最佳生物剂量(OBD)下作用最佳。血清细胞因子和趋化因子提供了用于估计最佳生物剂量的一种简单量度。本发明的CpG ODN的预期生物效应是将肿瘤微环境(以及引流淋巴结的肿瘤微环境)从免疫抑制(具有低水平的IFN产生并缺少激活的TIL)转化为免疫激活的微环境，其显示出增加的IFN(尤其是I型IFN)产生，并且其现在已经增加了展示出激活标记物(如PD-L1)的TIL，如例如在表征对用抗PD-1或抗PD-L1的治疗作出响应的患者的肿瘤活检中所反映的，分别由Tumeh et.al.,Nature 2014 515:568-571；和由Herbst et al.,Nature 2014515:563-567进行了报道，或另外由Taube etal.,Clin Cancer Res.2014进行了报道。换句话说，最近的研究已经证明抗PD-1或抗PD-L1疗法通常仅在已经具有TIL且已经具有反映IFN效应(如通过IFN诱导的PD-L1的表达)的肿瘤微环境的患者中有效。在预治疗肿瘤活检中缺少这些特征的患者不可能对用抗PD-1或抗PD-L1的疗法作出应答，除非他们也接受用诱导TIL和高I型IFN产生的药剂的治疗：本发明的CpG ODN是用于此目的的完美药剂。
I型IFN在人类和其他动物体内的主要内源来源是浆细胞样树突细胞(pDC)。pDC产生多于99％的响应于病原体感染而出的I型IFN(Siegal et al.,Science 1999)。但是已经显示极少数分子定义的刺激物激活pDC以分泌高水平的I型IFN。事实上，到目前为止，A类CpG ODN是迄今为止科学文献中已经报道的用于I型IFN的pDC产生的最强刺激物，并且出人意料地，本发明的CpG ODN比本领域先前已知的那些甚至更有效。
某些优选的CpG ODN诱导高量的或大量的I型IFN。用于测量I型IFN的测定是本领域熟知的并且包括体外酶联免疫吸附测定法(ELISA)和基于细胞的测定法，如本文所述的。无意限制，大量的或高量的I型IFN可以是指大于或等于约1000pg/mL IFN-α，如根据此类体外测定法测量的。在某些实施方案中，大量的或高量的I型IFN可以是指大于或等于约2000pg/mL IFN-α，如根据此类体外测定法测量的。在某些实施方案中，大量的或高量的I型IFN可以是指大于或等于约3000pg/mL IFN-α，如根据此类体外测定法测量的。在某些实施方案中，大量的或高量的I型IFN可以是指大于或等于约4000pg/mL IFN-α，如根据此类体外测定法测量的。在某些实施方案中，大量的或高量的I型IFN可以是指大于或等于约5,000pg/mL IFN-α，如根据此类体外测定法测量的。
与本文所提供的教导相结合，通过选择多种活性化合物和权重因素(如效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的严重程度以及优选的施用方式)，可以设计不会导致严重毒性但又能有效治疗具体受试者的有效预防或治疗方案。针对任何具体应用的有效量可以根据因素如所治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重程度和受试者的健康和大小而变化。本领域普通技术人员可以在无需过度实验的情况下凭经验确定TLR9激动剂(例如，CpGODN)、CPI(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体)和/或其他治疗剂的有效量。
例如，B类CpG ODN连同抗CTLA-4抗体的人类临床试验由Millward et al.,2013进行了报道。该临床试验证明了可以用于其他CpG ODN和其他检查点抑制剂的未来临床试验中的将通过皮下注射施用的TLR9激动剂与系统施用的抗CTLA-4抗体组合的方式，但是该试验未能证明来自该组合的显著的明确的临床益处。这种失败证明了本发明的非显而易见性。尽管已经存在具有高IFN-α分泌的A类CpG ODN的出版物，但是对于进行该临床试验的研究人员来说使用这样一种CpG ODN而非B类CpG ODN并不是显而易见的。将CpG ODN或抗CTLA-4抗体局部地施用入肿瘤而非通过系统途径是不显而易见的。因此，在该试验完成后，该方法被放弃了。类似地，Mangsbo et al.(J.Immunother 2010 33:225)报道了小鼠肿瘤模型中的瘤内B类CpG ODN与抗CTLA-4或抗PD-1的组合。使用该组合看到了阳性结果，但是再一次，没有指导使用CpG ODN(如本发明的A类或其他ODN)的诱导高IFN的类型实施这样的疗法。
到目前为止，在本领域的技术人员之中似乎没有实现将CpG ODN的诱导高IFN的类别与检查点抑制剂疗法相结合的期望和优势。对于在癌症免疫疗法中具有最佳协同作用的药剂的组合，一种药剂的免疫抑制作用应当被另一种药剂逆转。例如，IFN诱导PD-L1在肿瘤上的表达，PD-L1抑制免疫应答。本发明的诱导高IFN的CpG ODN诱导PD-L1的表达，但是当将它们与抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗体组合使用时，该PD-L1的潜在免疫抑制效应被该抗体所克服。另一方面，本发明至少部分地基于以下发现，即瘤内B类CpG ODN与系统检查点抑制剂的组合将是小于最佳协同的(或完全不协同的)，因为IL-10的诱导导致不被检查点抑制剂疗法逆转的多效免疫抑制效应。因此，本发明提供了一起在癌症免疫疗法中提供意想不到的(例如，协同的)益处的药剂组合。
CpG ODN和/或抗体单独的或一起的治疗有效量可以最初从体外和/或动物模型确定。特异性CpG ODN和/或特异性抗体或已知展现出类似的药理活性的其他化合物的治疗有效剂量也可以从人类数据确定。所应用的剂量可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力进行调整。基于上文所述的方法和本领域熟知的其他方法调整用以达到最大疗效的剂量很好地在本领域技术人员的能力范围内。
如该术语在本文所用的，“说明材料”包括可以用于将本发明的化合物、组合和/或组合物的有用性在用于影响、缓解或治疗本文所述的各种疾病或障碍的试剂盒中显露的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。任选地或可替代地，该说明材料可以描述一种或多种缓解细胞、组织或哺乳动物中的疾病或障碍的方法，包括如在本文的其他地方所公开的。
该试剂盒的说明材料可以例如被固定在含有本发明的化合物和/或组合物的容器中或与含有该化合物和/或组合物的容器一起提供给市场。可替代地，可以将该说明材料与该容器分开地提供给市场，其目的在于接受者配合地使用该说明材料和该化合物。
本发明的CpG ODN和/或抗体可以被提供在药用分配器中。药用分配器是限定多个药物储存隔室的包装，每个隔室用于容纳单独的药物单元。在一个实施方案中，整个药物疗程被容纳在多个药物储存隔室中。
限定多个药物储存隔室的包装可以是任何类型的在单独的隔室中持有药物的一次性药物包装或卡(card)。例如，该包装是由卡构成的泡罩包装，该卡可以由硬纸材料、泡罩片和背衬片材制成。此类卡是本领域普通技术人员所熟知的。
作为例子，药用分配器可以容纳整个药物疗程。该分配器可以包括用以指示哪天将要服用单独的药物单位的日期标记。这些可以沿药物包装的第一侧标记。剂量标记也可以例如沿与药物包装的第一侧垂直的药物包装的第二侧标记，从而指示应该服用单独的药物单位的时间。单位剂量可以被含在作为泡罩包装的分配器中。
除非注明时，术语“患者”或“受试者”可互换使用并且是指哺乳动物，如人类患者和非人类灵长类动物以及兽医受试者，如兔子、大鼠和小鼠及其他动物。优选地，“患者”或“受试者”是指人。
在某些实施方案中，受试者是成人。
在某些实施方案中，受试者是儿童。在某些实施方案中，受试者不到约18岁。在某些实施方案中，受试者不到约12岁。
如本文所用的，“治疗”意指降低患者所经历的疾病症状(即，肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数量和/或活性介导的其他效应等)的频率。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病的发作，或以防止其临床或亚临床症状的表现)或在显示疾病之后症状的治疗性抑制或缓解。术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以(i)预防或延迟疾病、病症或障碍的症状、并发症或生物化学标记的出现，(ii)缓解疾病、病症或障碍的症状，和/或(iii)抑制或阻止疾病、病症或障碍的进一步发展。
“组合疗法”包括施用TLR9激动剂(例如，某些CpG ODN)和检查点抑制剂作为旨在提供来自这些治疗剂的共同作用的有益效果的特异性治疗方案的一部分。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是CPI特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是双特异性CPI特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。该组合的有益效果包括但不限于由该治疗剂组合引起的药代动力学或药效学共同作用。典型地在限定的时间段内(通常是数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选择的组合)以组合方式施用这些治疗剂。“组合疗法”通常不旨在涵盖施用两种或更多种的这些治疗剂作为偶然且随意地产生本发明组合的单独的单一疗法方案的一部分。
“组合疗法”包括以顺序方式施用这些治疗剂，也就是说，其中在不同时间施用每种治疗剂，以及以实质性同时的方式施用这些治疗剂或至少两种的这些治疗剂。每种治疗剂的顺序或实质性同时施用可以通过如本文所述的任何适当的途径来实现，包括但不限于瘤内和瘤周途径；系统途径，例如静脉内、腹膜内、肠内(包括口服)、肌内、皮下和经粘膜途径；以及局部和透皮途径。如本文所述的，通常，第一治疗剂(例如，CpG ODN)可以通过瘤内或瘤周注射来施用，并且第二药剂(例如，抗PD-1抗体)可以系统地(例如，静脉内地)施用。
“组合疗法”还可以包括与非药物疗法(如但不限于放疗(XRT)或手术)进一步组合地施用如上文所述的TLR9激动剂(例如，某些CpG ODN)和检查点抑制剂治疗剂。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是CPI特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是双特异性CPI特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。在该组合疗法进一步包括放射治疗的情况下，该放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要实现来自该治疗剂和放射治疗的组合的共同作用的有益效果即可。例如，在适当的情况下，当该放射治疗暂时从该治疗剂的施用中移除时(几天或甚至几周)，仍然实现该有益效果。
“组合疗法”还可以包括与其他生物活性成分(如但不限于另外且不同的抗肿瘤剂、树突状疫苗或其他肿瘤疫苗)进一步组合地施用如上文所述的TLR9激动剂(例如，某些CpG ODN)和检查点抑制剂治疗剂。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该检查点抑制剂是双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。然而，在某些实施方案中，“组合疗法”特异性地排除施用树突细胞或肿瘤疫苗。
II.CpG DNA
CpG寡核苷酸(CpG DNA；CpG ODN)含有发现可引起免疫应答的特异性序列。这些特异性序列被称为“免疫刺激性基序”，并且含有免疫刺激性基序的寡核苷酸被称为“免疫刺激性寡核苷酸分子”和等效地“免疫刺激性寡核苷酸”。免疫刺激性寡核苷酸包括至少一个免疫刺激性基序，并且优选地该基序是内部基序。术语“内部免疫刺激性基序”是指至少比基序序列长一个核苷酸(在5’端和3'端两者处)的寡核苷酸序列内的基序序列的位置。
CpG寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸是含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即，“CpG DNA”或含有通过磷酸键连接至3'鸟嘌呤的5'胞嘧啶的DNA)并激活免疫系统的寡核苷酸分子。整个CpG寡核苷酸可以是未甲基化的或部分可以是未甲基化的，但是至少5'CG 3’的C必须是未甲基化的。
CpG ODN通常长约8-100个核苷酸。在某些实施方案中，CpG ODN长约8-50个核苷酸、长约8-40个核苷酸、长约8-30个核苷酸、长约8-24个核苷酸、长约8-20个核苷酸或长约8-16个核苷酸。
到2004年，CpG ODN的结构-活性关系研究已经定义了三个具有不同结构和生物特征的家族(Hartmann et al.,Eur.J.Immunol.2003,33:1633-1641；Marshall et al.,J.Leukocyte Biol.2003 73:781-792；Vollmer et al.,Eur.J.Immunol.2004 34:251-262)。典型的B类ODN具有完全地硫代磷酸酯骨架，不形成高阶结构，并且是强的B细胞刺激物，诱导相对较高水平的IL-10分泌，但是诱导相对较少的NK活性或IFN-α分泌(Krieg,2002，和Krieg，未发表的观察结果)。B类CpG ODN诱导免疫抑制性反调节作用，不仅包括IL-10的分泌，还包括IDO的表达，IDO可以促进Treg细胞的体外发育(Moseman et al.,J.Immunol.2004 173(7):4433-4442；Chen et al.,J.Immunol.2008 181(8):5396-5404)。这些体外数据与体内肿瘤免疫疗法的相关性是不确定的，并且尚未延迟B类ODN的临床开发，但是本发明部分地基于以下新发现，即B类ODN的这些效果将抑制抗肿瘤免疫应答，这可以使用其他类别的在结构上被设计成不激活导致IL-10分泌的NF-κB途径的CpG ODN来避免。
与通过具有相同序列但没有硫代磷酸酯骨架的CpG ODN所看到的相比，在B类CpGODN中使用的硫代磷酸酯骨架对所产生的免疫应答具有多种复杂影响。硫代磷酸酯(PS)骨架的一种非常重要的影响是保护免于被核酸酶降解。经PS完全修饰的ODN在血清和组织中近乎完全地稳定至少24小时，而未修饰的且未保护的ODN在几分钟内便降解。在血清中，主要的核酸酶活性是3’外切核酸酶，为了对抗它，CpG ODN可以在该ODN的3’端用仅1个或几个PS键联进行保护。但是在组织中，还存在5'外切核酸酶以及内切核酸酶，并且这些可以降解未以其他方式进行保护的天然DNA。天然DNA可以使用在文献中良好描述的技术通过环化来保护免受外切核酸酶。参见例如，美国专利号8,017,591、7,635,468、7,074,772、6,849,725、6,451,593和6,451,563；以及美国公开专利申请号2003/0125279；将其全部的完整内容通过引用而特此并入。可替代地或另外，天然的(即，以其他方式未修饰的且未保护的)ODN可以被配制成纳米颗粒或本领域熟知的用以阻断核酸酶接近该ODN的其他配制品。
通常，天然CpG DNA(磷酸二酯)激活B细胞和pDC两者中的TLR9。B细胞产生细胞因子并且开始增殖(这主要是通过NF-κB激活来驱动)，但是除非TLR9刺激是持久的，否则增殖通常是适度的，并且发生相对较少的Ig分泌刺激和类别转换。pDC被天然CpG DNA激活以分泌I型IFN和表达共刺激受体，但是刺激的幅值关键取决于该DNA的形式。与天然CpG DNA的这些作用形成对照，B类硫代磷酸酯CpG DNA为B细胞提供远远更强大且持久的TLR9信号，诱导它们强烈增殖并且导致Ig分泌和类别转换，如在文献中所报道的。但是硫代磷酸酯骨架对TLR9介导的pDC应答具有非常不同的影响，实质上减少IFN分泌(明显是通过抑制IRF7介导的信号传导)，但是通常仍提供强的共刺激性分子表达的诱导。因此，对于本发明，使用天然DNA通常将提供较高的I型IFN应答并且将是治疗有效的，只要该天然DNA被保护免于降解即可。可以将从1至3个硫代磷酸酯修饰加到天然DNA的5’和3’末端以保护它免于核酸酶降解而不削弱I型IFN应答。
在用于癌症免疫疗法的CpG ODN早期开发中，本领域技术人员通常相信B细胞激活是令人希望的，并且因此将研制计划集中在B类ODN上。的确，也许B细胞激活对于肿瘤疫苗而言是令人希望的，以便驱动抗肿瘤Ab的产生，在本领域熟知这能够有助于抗肿瘤应答。利用B类CpG的瘤内施用的一些早期人类临床试验给出了树突细胞激活在肿瘤引流淋巴结中的令人鼓舞的证据(例如，Molenkamp BG et al.,Clin Cancer Res.2007 13(10):2961-2969)。然而，对这种局部瘤内疗法的临床应答是相当有限的，并且引流淋巴结中总淋巴细胞群的研究显示出经CpG治疗的患者体内近两倍增加的IL-10释放(Molenkamp et al.中的表2)。考虑到IL-10对肿瘤免疫疗法的负面影响以及对不诱导其产生或诱导较低水平的其产生的改进的CpG ODN的需求，本发明进一步提供了具有减少的IL-10诱导的改进的CpGODN。
虽然如此，但是现在已经发现，根据本发明，瘤内施用特别是伴随IL-10和IDO诱导的B细胞激活是不令人希望的并且可能是有害的。这难于或不可能使用小鼠模型来证明，因为TLR9表达的物种特异性差异和细胞因子应答差异。本发明基于对以前发表的和未发表的关于对各种CpG ODN的人类免疫细胞应答的数据的新分析，连同对其他癌症免疫疗法和XRT的免疫效应和缺陷的新分析。
对于癌症免疫疗法，IL-10有时可能具有积极影响(特别是在系统疗法的情况下，参见例如Mumm and Oft,Bioessays 2013 35(7):623-631)，但是IL-10通常被认为在局部肿瘤微环境中具有负面免疫效应，抑制免疫排斥(概述于Sato et al.,Immunol Res.201151(2-3):170-182中)。因此，本发明部分地基于以下发现，即诱导高水平的IL-10的B类CpGODN对于瘤内疗法而言不是优选的。
B类的CpG寡核苷酸由下式表示：
5'X1CGX2 3'
其中X1和X2是核苷酸。在一些实施方案中，X1可以是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶和/或X2可以是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
B类的CpG寡核苷酸也由下式表示：
5'X1X2CGX3X4 3'
其中X1、X2、X3和X4是核苷酸。X2可以是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。X3可以是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
B类的CpG寡核苷酸还包括至少由下式表示的寡核苷酸：
5'N1X1X2CGX3X4N2 3'
其中X1、X2、X3和X4是核苷酸并且N是任何核苷酸并且N1和N2是各自由从约0-25个N’构成的寡核苷酸序列。X1X2可以是选自下组的二核苷酸，该组由以下各项组成：GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG；并且X3X4可以是选自下组的二核苷酸，该组由以下各项组成：TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA。
B类的CpG寡核苷酸公开于分别发布于2001年2月17日和2001年5月29日的PCT公开专利申请PCT/US95/01570和PCT/US97/19791以及美国专利号6,194,388B1和美国专利号6,239,116B1。
与B类CpG ODN形成对照，A类CpG ODN是自然杀伤细胞和自浆细胞样树突细胞(pDC)的IFN-α分泌的有力激活物，但是仅弱地刺激B细胞并且诱导非常少的IL-10分泌。标准的A类ODN含有在5'和/或3'端处的能够形成称为G四联体的复杂的高阶结构的polyG基序和含有在自我互补回文内的一个或多个CpG基序的中心磷酸二酯区域(概述于Krieg,2006中)。例如，美国专利号6,949,520和7,776,344显示，在某些优选的实施方案中，A类CpG ODN具有对应于以下任一项的序列：
Figure BDA0003163310790000251
Figure BDA0003163310790000261
其中每个小写字母表示由硫代磷酸酯(PS)键联连接至其3’-相邻核苷酸的核苷酸；并且每个大写字母表示由磷酸二酯(PO)键联连接至其3’-相邻核苷酸(如果存在的话)的核苷酸，例外的是3’-末端核苷酸由大写字母表示，因为它没有3’-相邻核苷酸。
在某些更优选的实施方案中，该免疫刺激性核酸具有对应于以下项的序列：
Figure BDA0003163310790000262
其中每个小写字母表示由硫代磷酸酯(PS)键联连接至其3’-相邻核苷酸的核苷酸；并且每个大写字母表示由磷酸二酯(PO)键联连接至其3’-相邻核苷酸(如果存在的话)的核苷酸，例外的是3’-末端核苷酸由大写字母表示，因为它没有3’-相邻核苷酸。
在某些实施方案中，用于根据本发明的方法使用的A类CpG ODN具有被提供为以下项的序列：5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG-3’(SEQ ID NO:82；在本文也称为“G10”)。根据本发明有用的此类寡核苷酸及其配制品描述于WO 2003/024481、US 2003/0099668、US 2012/0301499、WO 2004/084940、US 7,517,520、US 2010/0098722、WO 2007/068747、US 2007/0184068、US 8,574,564、WO 2007/144150、US 8,541,559、WO 2008/073960和US 8,586,728中，将其各自的完整内容通过引用并入本文。
C类ODN的结构典型地基于硫代磷酸酯骨架，但是是不同的，因为CpG基序后面是可以形成双链体的3'回文。C类ODN描述于Krieg et al.的美国专利号7,566,703、Vollmer etal.的美国专利号8,198,251和Krieg et al.的美国专利号8,834,900中。C类CpG ODN具有介于A类与B类之间的中间免疫特性(Hartmann et al.,2003；Marshall et al.,2003；Marshall et al.,2005；Vollmer et al.,2004)。
C类ODN的例子包括：
Figure BDA0003163310790000271
Figure BDA0003163310790000281
其中每个Z是5-甲基胞嘧啶。
根据某些实施方案，该免疫刺激性核酸包括序列TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(SEQID NO:92)。
该寡核苷酸可以包含5'T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T3'(SEQ ID NO:106)，其中*表示稳定化的核苷酸间键联。任选地，当具体说明时，5'可以指代该寡核苷酸的自由5'端并且3'可以指代该寡核苷酸的自由3'端。
在本发明的一些实施方案中，该寡核苷酸具有下式之一：TCGTCGTTCGGCGCGCCG(SEQ ID NO:107)、TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO:108)、TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO:109)、TTCGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:110)或TTTCGTCGTTTCGTCGTT(SEQ ID NO:106)。
在本发明的其他实施方案中，该寡核苷酸具有下式之一：TCGTCGTC、CGTCGTCG、GTCGTCGT、TCGTCGTT、CGTCGTTC、GTCGTTCG、TCGTTCGG、CGTTCGGC、GTTCGGCG、TTCGGCGC、TCGGCGCG、CGGCGCGC、GGCGCGCG、GCGCGCGC、CGCGCGCC或GCGCGCCG。
在本发明的其他实施方案中，该寡核苷酸具有下式之一：T*C_G*T*C_G*T*C、C_G*T*C_G*T*C_G、G*T*C_G*T*C_G*T、T*C_G*T*C_G*T*T、C_G*T*C_G*T*T*C、G*T*C_G*T*T*C_G、T*C_G*T*T*C_G*G、C_G*T*T*C_G*G*C、G*T*T*C_G*G*C*G、T*T*C_G*G*C*G*C、T*C_G*G*C*G*C_G、C_G*G*C*G*C_G*C、G*G*C*G*C_G*C*G、G*C*G*C_G*C*G*C、C*G*C_G*C*G*C*C或G*C_G*C*G*C*C*G，其中*表示稳定化的核苷酸间键联。
在本发明的其他实施方案中，提供了包含以下项的寡核苷酸：T*C_G*T*C_G*T*C，其中*表示稳定化的核苷酸间键联并且_表示磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联。任选地，该寡核苷酸可以是5'T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C 3'(SEQ IDNO:111)、5'T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C 3'(SEQ ID NO:112)或5'T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C 3’(SEQ ID NO:113)，其中5'是指该寡核苷酸的自由5'端并且3'是指该寡核苷酸的自由3'端。
在其他实施方案中，提供了包含以下项的寡核苷酸：T*C_G*T*T*C_G*G，其中*表示稳定化的核苷酸间键联并且_表示磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联。任选地，该寡核苷酸可以是
5'C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:114)；
5'G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:115)；
5'T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:116)；
5'C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:117)；
5'G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:118)；或
5'T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:119)，
其中5'是指该寡核苷酸的自由5'端并且3'是指该寡核苷酸的自由3'端。
最近，鉴定出一种具有两个回文的结构特征的新类别的CpG寡核苷酸(相对于C类中的单个回文)。参见例如，美国专利申请公开号2008/0045473，将其完整内容通过引用并入本文。由于该两个回文，这些P类CpG ODN能够形成高阶多联体，该多联体被假定可以不同于线性B类ODN或双链体C类ODN的方式与TLR9相互作用，观察到的结果是与C类(或B类)相比，P类ODN诱导较高水平的I型IFN和大幅较低水平的IL-10。
P类ODN的例子包括：
T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:109)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T*T*T*T-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-T*T*T*T(SEQ IDNO:120)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-T-T-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-T-T-T(SEQ ID NO:121)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T(SEQ ID NO:122)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T*T*T*T-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T*T*T(SEQ ID NO:123)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-T-T-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-T(SEQ ID NO:123)；
T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A(SEQ ID NO:124)；
C*G*C*G*C*G*C*G*C*G*C*G*C*G*C*G*C*G*C*G(SEQ ID NO:125)；
G*A*G*A*A*C*G*C*T*C*G*A*C*C*T*T*C*G*A*T*biot(SEQ ID NO:126)；
A*G*C*T*C*C*A*T*G*G*T*G*C*T*C*A*C*T*G(SEQ ID NO:127)；
T*C*T*C*C*C*A*G*C*G*T*G*C*G*C*C*A*T(SEQ ID NO:128)；
T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*G*G*T*T(SEQ ID NO:129)；
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T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:333)；
T*C*G*T*C-G*A*C*G*A*T*G*C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:333)；
T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*C*C*G*C*G*C*T*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:334)；
T*C-G*T*C*G*T*A*C*G*A*T*G*C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:335)；
T*C-G*T*C*G*T*A*C*G*A*T*G*C*C*G*C*G*C*T*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:336)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T-G*C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:333)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T-G-C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C(SEQ ID NO:333)；
T*C*G*T*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:337)；
T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:337)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C-G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:337)；
T*C-G*T*G-C*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:338)；
T*Z-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:339)；
T*C-G*T*Z-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:340)；
T*C-G*T*C-G*A*Z-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:341)；
T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*Z-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:342)；
T*C-G*A*C*G*T*C-G*A*C*G*T*C-G*A*C*G(SEQ ID NO:343)；
T-C-G-A-C-G-T-C-G-A-C-G-T-C-G-A-C-G(SEQ ID NO:343)；
T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G(SEQ ID NO:343)；
T*C-G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:344)；
T*C*G*T*C-G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:344)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T-C-G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G-iT(SEQ ID NO:344)；
G*C*C*G*C*G-C*G*C*G*G-C*iT*iA*iG-iC*iA*iG-iC*iT*iG-iC*iT(SEQ ID NO:345)；
C*G*G*C*G*C-G*C*G*C*C-G*iT*iA*iG-iC*iA*iG-iC*iT*iG-iC*iT(SEQ ID NO:346)；
G*C*C*G*C*G*C*G*C*G*G*C*iT*iA*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:345)；
C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT*iA*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:346)；
C*G*G*C*G*C*C-G*T*G*C*C*G*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:347)；
G*C*C*G*T*G-C*C*G*C*G*G-C*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:348)；
C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:347)；
G*C*C*G*T*G*C*C*G*C*G*G*C*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ ID NO:348)；
T*C*G*G*C*G*C-G*C*G*C*C-G*A*iT*iA*iG-iC*iA*iG-iC*iT*iG-iC*iT(SEQ IDNO:349)；
T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*A*iT*iA*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ IDNO:349)；
T*C*G*G*C*G*C*C-G*T*G*C*C*G*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ IDNO:350)；
T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT*iT*iG*iC*iA*iG-iC*iT*iG*iC*iT(SEQ IDNO:350)；
CGGCGCXGCGCCG(SEQ ID NO:351)；
T-C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:287)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:352)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*J*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:353)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*L*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:354)；
T*C*G*T*C*G*A*C*G*A*D*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:355)；
G*G*G-G-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G*G*G(SEQ ID NO:79)；
T*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G(SEQ ID NO:356)；
T*C*C*A*G*G*A*C*T*T*C*T*C*T*C*A(SEQ ID NO:357)；
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:83)；
T*C*G*T*C-mG*mA*C*mG*mA*T*C*mG*mG*C*mG*C*mG*C*mG*C*C*mG(SEQ ID NO:358)；
T*C*mG*T*C*mG*mA*C*mG*mA*T*C*mG*mG*C*mG*C*mG*C*mG*C*C*mG(SEQ ID NO:359)；
T*C*G*T*C-mG*mA*C-mG*mA*T*C-mG*mG*C*mG*C-mG*C*mG*C*C*mG(SEQ ID NO:358)；以及
T*C-mG*T*C-mG*mA*C-mG*mA*T*C-mG*mG*C*mG*C-mG*C*mG*C*C*mG(SEQ ID NO:359)，
其中：-表示磷酸二酯键联；*表示稳定化的核苷酸间键联；biot表示生物素；but表示丁酸酯；chol表示胆固醇；Cy3表示双-羟丙基-3,3,3',3'-四甲基-4,5-苯并吲哚碳菁氯(benzindocarbocyanine chloride)(Glen Research)；D表示D间隔物(1'2'-双脱氧核糖，Glen Research,Sterling,VA)；dig表示洋地黄毒苷；doub-表示doubler；iN表示反向核苷酸(反方向：3’和5’交换)；J表示1,3-丙烷-二醇；L表示六乙二醇；mN表示2'-O-甲基核苷；rN表示核糖核苷；teg表示三乙二醇；vitE表示维生素E；并且Z表示5-甲基-脱氧胞苷。
另一个最近发现的CpG ODN类别是E类，其中经卤素修饰的核苷酸紧邻CpG基序的5’放置，如美国专利号8,580,268和美国公开申请2014/0163213中所述的，将两者的完整内容通过引用并入本文。相对于适度的IL-10产生，这些ODN也诱导高得多水平的I型IFN。
E类ODN的例子包括：
T*G*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:360)；
T*G*T*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:361)；
T*G*FF*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:362)；
T*G*T*FF-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:363)；
T*G*T*C-FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:364)；
T*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:365)；
T*G*T*C-G*T*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:366)；
T*G*BU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:367)；
T*G*T*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:368)；
T*G*BU*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:369)；
T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:370)；
T*G*T*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:371)；
T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:372)；
T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:373)；
T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:374)；
T*G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:375)；
JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:376)；
T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:377)；
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:378)；
JU*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:379)；
T*C*G*JU*C*G*JU*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:380)；
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*JU*T*T*T(SEQ ID NO:381)；
JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQ ID NO:382)；
T*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQ ID NO:383)；
T*G*T*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:384)；
T*G*EU*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:385)；
JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:386)；
T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:387)；
JU*C-G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:388)；
JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G(SEQ ID NO:389)；
T*C-G-A-C-G-JU-C-G-T-G-G*G*G*G(SEQ ID NO:390)；
T*C-G-A-C-G-JU-C-G-JU-G-G*G*G*G(SEQ ID NO:391)；
G*JU*C-G*T*T；
G*JU*C-G*JU*T；
T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:392)；
T*G*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:393)；
JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQ ID NO:394)；
T*C-G*JU*C*G*JU*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQ ID NO:395)；
T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:396)；
T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:397)；
JU*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:398)；
JU*C-T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:398)；
T*C*T*T*T*T*T*T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:399)；
JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:400)；
JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:400)；
JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T(SEQ ID NO:401)；
JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T(SEQ ID NO:401)；
EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:402)；
EU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:402)；
JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T(SEQ ID NO:403)；
JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T(SEQ ID NO:403)；
EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:404)；
JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:405)；
T*G*T*C-G*FU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:406)；
T*G*FU*C-G*FU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:407)；
T*G*U*C-G*UT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:408)；
T*G*T*C-6NB*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:409)；
T*G*T*6NB-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:410)；
T*G*T*6NB-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:410)；
JU*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:411)；
JU*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:412)；
T*G*T*C-G*T*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:413)；
T*G*FT*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:414)；
T*G*T*C-G*FT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:415)；
T*G*FT*C-G*FT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:416)；
T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:392)；
T*G*T*C-G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:417)；
T*G*CU*C-G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:418)；
T*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:419)；
T*G*JU*C-G*T*T*T*T；
T*G*JU*C-G*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T(SEQ ID NO:420)；
(T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-3mG；
(JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-3mG；
T*T*JU*C-G*T*C-G*T*T*T*C-G*T*C-G*T*T(SEQ ID NO:421)；
BU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G-G*G*G(SEQ ID NO:422)；
T*G*JU*G-C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:423)；
(T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-teg；
(JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-teg；
JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:424)；
T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:425)；
T*C*G*T*C*G*T*T*T*JU*C-G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:426)；
JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:427)；
T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:428)；
T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T(SEQ ID NO:429)；
T*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:430)；
JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*E*G*G(SEQ ID NO:431)；
T*mG*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:432)；
T*G*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:433)；
T*mG*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:434)；
JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:379)；
JU*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:379)；
T*G*PU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:435)；
T*G*T*C-G*PU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:436)；
BU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G-*G*G*G(SEQ ID NO:422)；
T*G*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:437)；
T*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T(SEQ ID NO:438)；
T*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:439)；
T*G*EU*G-C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO:440)；
JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:376)；
EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T(SEQ ID NO:441)；
G*JU*C-G*T*T-hex；
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其中：-表示磷酸二酯核苷酸间键联；*表示硫代磷酸酯核苷酸间键联；2doub表示Doubler2(Chemgenes)；3mG表示3'-O-甲基-rG；6NB表示6-硝基-苯并咪唑；BU表示5-溴代-2'-脱氧尿苷；BVU表示5-(d-溴代-乙烯基)-尿苷；CU表示5-氯代-2'-脱氧尿苷；E表示7-脱氮-dG；EU表示5-乙基-2'-脱氧尿苷；F表示5-氟代-dU；FF表示2,4-二氟甲苯；FT表示a,a,a-三氟-dT；FU表示5-氟代-dU；hex表示十六烷基甘油基；I表示肌苷；iT表示反向核苷酸(3’和5’交换)；JU表示5-碘代-2'-脱氧尿苷；L表示间隔物18(六乙二醇磷酸酯)；NI表示硝基吲哚；NP表示硝基吡咯；PU表示5-丙炔基(proynyl)-dU；Teg表示间隔物9(三乙二醇磷酸酯)；U表示尿苷；并且Z表示5-甲基-dC。
用以减少CpG ODN激活的B细胞的量并增加或维持IFN-α诱导的量的方法不是本领域技术人员所熟知的，但是在没有致力于作为本发明基础的具体作用机制的情况下，现在已经发现，根据本发明，与诱导浆细胞样树突细胞(pDC)分泌IFN-α所需的相比，B细胞增殖和IL-10分泌似乎需要更持久的TLR9信号。这样一种持久的TLR9信号由B类CpG ODN所提供的程度比上文提及的其他CpG ODN类别要大。另外，TLR9信号的持续时间可以通过将磷酸二酯(PO)键联定位在CpG处(“半软”设计)和或ODN内的其他位置处来缩短。具有最不持久的B细胞激活的“最软的”CpG ODN是具有完全地磷酸二酯骨架的那些，但是这些在体内降解地如此之快以致于IFN-α应答也被损害，除非该ODN是环状的(以保护免受外切核酸酶)，或在也保护免受核酸酶的配制品(如病毒样颗粒(VLP)、纳米颗粒(NP)、免疫刺激复合物(ISCOM)等)中进行递送。
该免疫刺激性寡核苷酸分子可以具有均质骨架(例如，完全地磷酸二酯(PO)或完全地硫代磷酸酯(PS))或嵌合骨架。例外是A类CpG设计(和A/E类)，其中包括至少8个核苷酸并且优选地10个或更多个核苷酸的ODN的中心部分必须是用于最适活性的磷酸二酯。出于本发明的目的，嵌合骨架是指部分地稳定化的骨架，其中至少一个核苷酸间键联是磷酸二酯或磷酸二酯样的，并且其中至少一个其他核苷酸间键联是稳定化的核苷酸间键联，其中该至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样键联和该至少一个稳定化的键联是不同的。该稳定化的键联优先地被放置在该寡核苷酸的5’和3'端，以便保护该端免受外切核酸酶：该磷酸二酯键联被放置在中间并且与单独的PS可以容易地实现的相比，有助于诱导更强的IFN-α应答。
由于已经报道硼烷膦酸酯键联相对于磷酸二酯键联是稳定化的，出于骨架嵌合性质的目的，取决于上下文，硼烷膦酸酯键联可以被分类为磷酸二酯样的或稳定化的。例如，在一个实施方案中，根据本发明的嵌合骨架可以包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)键联和至少一个硼烷膦酸酯(稳定化的)键联。在另一个实施方案中，根据本发明的嵌合骨架可以包括硼烷膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)和硫代磷酸酯(稳定化的)键联。“稳定化的核苷酸间键联”应当意指与磷酸二酯核苷酸间键联相比，相对地对体内降解(例如，经由外切或内切核酸酶)有抗性的核苷酸间键联。优选的稳定化的核苷酸间键联包括而不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和甲基硫代磷酸酯。其他稳定化的核苷酸间键联包括而不限于肽、烷基、脱磷酸类型键联以及如上所述的其他核苷酸间键联。
修饰的骨架(如硫代磷酸酯)可以使用利用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学的自动化技术来合成。芳基膦酸酯和烷基膦酸酯可以例如如美国专利号4,469,863中所述的制备；并且烷基磷酸三酯(其中带电的氧模块被烷基化)(例如，如美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所述的)可以使用可商购的试剂通过自动化固相合成来制备。已经描述了用于进行其他DNA骨架修饰和取代的方法。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90:544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1:165。用于制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如，发给Uhlmann et al.的专利已经描述了此类技术，包括例如美国专利号7,566,703、7,795,235、8,283,328和8,304,396。
混合的骨架修饰的ODN可以使用可商购的DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学来合成。F.E.Eckstein,“Oligonucleotides and Analogues--A Practical Approach”,IRLPress,Oxford,UK,1991；和M.D.Matteucci and M.H.Caruthers,Tetrahedron Lett.21,719(1980)。在偶联之后，通过使用Beaucage试剂(R.P.Iyer,W.Egan,J.B.Regan andS.L.Beaucage,J.Am.Chem.Soc.112,1253(1990))(0.075M，在乙腈中)或苯乙酰二硫化物(PADS)硫化，随后用四氢呋喃中的乙酸酐、2,6-二甲基吡啶(1:1:8；v:v:v)和N-甲基咪唑(16％，在四氢呋喃中)加帽来引入硫代磷酸酯(PS)键联。这个加帽步骤在硫化反应之后进行以最小化在硫代磷酸酯键联应当定位的位置处的不希望的磷酸二酯(PO)键联的形成。在例如在CpG二核苷酸处引入磷酸二酯键联的情况下，通过用水/吡啶中的碘溶液处理来氧化中间体磷-III。在从固相支持体上裂解并通过用浓氨水处理最终脱保护((15hr，在50℃下)之后，使用NaCl梯度(例如缓冲液A：10mM NaH2PO4在乙腈/水＝1:4/v:v中pH 6.8；缓冲液B：10mM NaH2PO4，1.5M NaCl，在乙腈/水＝1:4/v:v中；在30分钟内以1ml/min 5至60％B)在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters)上通过HPLC或者通过毛细管凝胶电泳来分析该ODN。该ODN可以通过HPLC或通过FPLC在Source High Performance柱(Amersham Pharmacia)上纯化。将HPLC均质级分合并并经由C18柱或通过超滤脱盐。通过MALDI-TOF质谱分析该ODN以确认所计算的质量。
本发明的寡核苷酸还可以包括其他修饰。这些包括非离子DNA类似物，如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电的磷酸酯氧被烷基或芳基基团置换)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中带电的氧模块被烷基化)。还已经显示在任一或两个末端含有二醇(如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸是实质性抗核酸酶降解的。
在一些实施方案中，该寡核苷酸可以是“软的”或“半软的”寡核苷酸。软的寡核苷酸是具有部分地稳定化的骨架的免疫刺激性寡核苷酸，其中磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联仅出现在至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)内并且与其紧邻。优选地，YZ是YG，即嘧啶-鸟苷(YG)二核苷酸。该至少一个内部YZ二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联。紧邻该至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联可以在该至少一个内部YZ二核苷酸的5'、3'或5’和3’。
具体而言，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联涉及“内部二核苷酸”。内部二核苷酸通常应当意指由核苷酸间键联连接的任何相邻核苷酸对，其中该核苷酸对中的核苷酸都不是末端核苷酸，即该核苷酸对中的核苷酸都不是限定了该寡核苷酸的5'或3'端的核苷酸。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个二核苷酸和仅n-3个内部二核苷酸。内部二核苷酸中的每个核苷酸间键联都是内部核苷酸间键联。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个核苷酸间键联和仅n-3个内部核苷酸间键联。因此，策略性地放置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联是指定位在寡核苷酸序列中的任何核苷酸对之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联。在一些实施方案中，该磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联不被定位在任一离5'或3'端最近的核苷酸对之间。
优选地，紧邻该至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联本身是内部核苷酸间键联。因此，对于序列N1 YZ N2(其中N1和N2各自彼此独立地是任何单个核苷酸)，该YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联，并且另外(a)当N1是内部核苷酸时，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联连接，(b)当N2是内部核苷酸时，Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联连接，或(c)当N1是内部核苷酸时N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联连接并且当N2是内部核苷酸时Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联连接。
与完全地稳定化的寡核苷酸相比，据信根据本发明的软寡核苷酸对核酸酶裂解是相对敏感的。不希望被束缚于具体理论或机制，据信相对于全长软寡核苷酸，本发明的软寡核苷酸对裂解是敏感的，导致具有减少的或没有免疫刺激活性的片段。据信掺入至少一个核酸酶敏感型核苷酸间键联(特别是在寡核苷酸的中间附近)提供改变该寡核苷酸的药代动力学和药效学以便减少该寡核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时间的“断路开关”。具体而言，该核酸酶敏感型键联可以减少NF-κB诱导的幅值同时增加IRF3和/或IRF7诱导的幅值。TLR9激活可以导致NF-κB途径(导致细胞因子如IL-6的表达和共刺激性分子的表达)和IRF3/7途径(导致IFN-α分泌)的任一者或两者的强烈激活。这些途径之间通常似乎存在一些拮抗作用。例如，B类CpG ODN主要激活前者，而A类CpG ODN激活后者。强的NF-κB诱导与B类CpG寡核苷酸相关并且可以导致增加的IL-10分泌。虽然这对于系统CpG寡核苷酸疗法而言可能是有用的，但是对于瘤内疗法是不令人希望的。由核酸酶敏感型核苷酸间键联提供的增加的IRF3/7诱导导致在肿瘤微环境中大量产生IFN-α，这改进了瘤内疗法之后生产性和治疗性抗肿瘤免疫应答的机会而不增加不令人希望的IL-10产生。含有核酸酶敏感型键联的CpG寡核苷酸的这种减少的半衰期在组织和在临床应用中可以是特别有价值的，在该组织和临床应用中令人希望的是避免与慢性局部炎症或免疫刺激有关的损伤(例如，肾)，因为该寡核苷酸不太可能在该组织中积累到较高浓度。
半软的寡核苷酸是具有部分地稳定化的骨架的免疫刺激性寡核苷酸，其中磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联仅出现在至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸内。相对于对应的完全稳定化的免疫刺激性寡核苷酸，半软的寡核苷酸通常具有增加的免疫刺激效力。由于半软寡核苷酸的效力更大，在一些情况下，半软寡核苷酸可以以较低的有效浓度使用并且具有比常规的完全稳定化的免疫刺激性寡核苷酸低的有效剂量，以便实现希望的生物效应。
据信半软寡核苷酸的前述特性通常随涉及内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联的“剂量”增加而增加。因此，据信通常例如对于具有四个内部YZ二核苷酸的给定寡核苷酸序列而言，具有四个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸比具有三个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸更具免疫刺激性，具有三个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸进而比具有两个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸更具免疫刺激性，具有两个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸进而比具有一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联的寡核苷酸更具免疫刺激性。重要的是，包括即使一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联通常比没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间键联可以是有利的。除磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联的数目之外，沿着该寡核苷酸长度的位置也可以影响效力。
除优选的内部位置处的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联之外，该软的和半软的寡核苷酸通常将包括抗降解的5’和3'端。此类抗降解端可以涉及相对于对应的未修饰端导致对外切核酸酶消化抗性增加的任何适合的修饰。例如，该5’和3'端可以通过包括该骨架的至少一个磷酸酯修饰而稳定化。在优选的实施方案中，在每端的该骨架的至少一个磷酸酯修饰独立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或甲基硫代磷酸酯核苷酸间键联。在另一个实施方案中，该抗降解端在3'端包括一个或多个通过肽或酰胺键联连接的核苷酸单位。
磷酸二酯核苷酸间键联是在自然界中发现的寡核苷酸特有的键联类型。磷酸二酯核苷酸间键联包括侧翼于两个桥接氧原子并且还被两个另外的氧原子(一个带电并且另一个不带电)结合的磷原子。当重要的是减少该寡核苷酸的组织半衰期或得到自pDC的I型IFN分泌的最强的可能诱导时，磷酸二酯核苷酸间键联是特别优选的。
磷酸二酯样核苷酸间键联是化学地和/或非对映异构类似于磷酸二酯的含磷桥接基团。与磷酸二酯的相似性的量度包括对核酸酶消化的敏感性和激活RNase H的能力。因此，例如磷酸二酯而非硫代磷酸酯寡核苷酸对核酸酶消化是敏感的，而磷酸二酯和硫代磷酸酯两种寡核苷酸都激活RNAse H。在优选的实施方案中，该磷酸二酯样核苷酸间键联是硼烷磷酸酯(或等效地，硼烷膦酸酯)键联。美国专利号5,177,198；美国专利号5,859,231；美国专利号6,160,109；美国专利号6,207,819；Sergueev at al.,(1998)J Am Chem Soc120:9417-27。在另一个优选的实施方案中，该磷酸二酯样核苷酸间键联是非对映异构纯的Rp硫代磷酸酯。据信与混合的或非对映异构纯的Sp硫代磷酸酯相比，非对映异构纯的Rp硫代磷酸酯对核酸酶消化更敏感并且在激活RNAse H方面更好。CpG寡核苷酸的立体异构体是公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO 00/06588)的主题。应当指出的是，出于本发明的目的，术语“磷酸二酯样核苷酸间键联”特异性地排除二硫代磷酸酯和甲基膦酸酯核苷酸间键联。
如上所述的，本发明的软的和半软的寡核苷酸可以在C与G之间具有磷酸二酯样键联。磷酸二酯样键联的一个例子是处于Rp构象的硫代磷酸酯键联。取决于测量活性的时间点，寡核苷酸p-手性可能可能对CpG寡核苷酸的免疫活性具有明显的相反作用。Krieg etal.,Oligonucleotides 200313(6):491-499。在40分钟的早期时间点，硫代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp而非Sp立体异构体在小鼠脾脏细胞中诱导JNK磷酸化。相比之下，当在44小时的晚时间点测定时，该Sp而非Rp立体异构体在刺激脾脏细胞增殖方面是具活性的。Rp和Sp立体异构体的动力学和生物活性的这种差异不是来自细胞摄取的任何差异，而是最有可能是由于p手性的两种相反的生物作用。首先，在早期时间点对于刺激免疫细胞与Sp相比Rp立体异构体的增强的活性指示Rp在与CpG受体TLR9相互作用或诱导下游信号传导途径方面可能是更有效的。另一方面，与Sp相比Rp PS-寡核苷酸的更迅速降解导致信号传导的持续时间短得多，使得该Sp PS-寡核苷酸当在较晚时间点测试时似乎更具生物活性，可能是因为Sp键联的核酸酶抗性更大，这通过TLR9为B细胞增殖提供了更持久的信号。
因此，该寡核苷酸在骨架组成中可以是异质的，由此含有连接在一起的任何可能的聚合物单位组合。
术语“寡核苷酸”还涵盖如在糖中具有取代或修饰的寡核苷酸。例如，它们包括具有在2'位置处共价附接至不同于羟基基团的低分子量有机基团且在5'位置处共价附接至不同于磷酸酯基团或羟基基团的低分子量有机基团的骨架糖的寡核苷酸。因此，修饰的寡核苷酸可以包括2'-O-烷基化的核糖基团。另外，修饰的寡核苷酸可以包括糖如阿拉伯糖或2'-氟代阿拉伯糖取代核糖。
与天然RNA和DNA相比，本发明的免疫刺激性寡核苷酸可以涵盖各种化学修饰和取代，涉及磷酸二酯核苷酸间桥接或13-D-核糖单位。化学修饰的例子是熟练人员已知的并且描述于例如Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90:543；“Protocols forOligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties&Synthesis andAnalytical Techniques,S.Agrawal,Ed,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke S T etal.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129；和Hunziker J et al.(1995)ModSynth Methods 7:331-417中。根据本发明的寡核苷酸可以具有一个或多个修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的相同序列的寡核苷酸相比，每个修饰位于具体磷酸二酯核苷酸间桥接处和/或具体β-D-核糖单位处。
例如，本发明涉及可以包含一个或多个修饰的寡核苷酸，并且其中每个修饰独立地选自：a)位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯核苷酸间桥接被修饰的核苷酸间桥接置换；b)位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯桥接被脱磷酸桥接置换；c)来自糖磷酸骨架的糖磷酸单位被另一个单位置换；以及d)β-D-核糖单位被修饰的糖单位置换。
寡核苷酸的化学修饰的更详细的例子如下：
位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸间桥接置换，其中该修饰的核苷酸间桥接例如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羟苄基膦酸酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯桥接、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(例如，披露于WO 95/01363中)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基任选地被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，并且其中R1和R2彼此独立地是氢、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，优选氢、(C1-C8)-烷基，优选(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或R1和R2连同携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环，该杂环可以另外含有来自O、S和N的组的另外的杂原子。
位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯桥接被脱磷酸桥接(脱磷酸桥接描述于例如Uhlmann E and Peyman A in“Methods in Molecular Biology”,Vol.20,“Protocolsfor Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa 1993,Chapter 16,pp.355ff中)置换，其中脱磷酸桥接例如选自脱磷酸桥接甲缩醛、3'-硫代甲缩醛、甲基羟基胺、肟、亚甲基二甲基-亚肼基、二亚甲基砜和/或甲硅烷基基团。
来自糖磷酸骨架(即，由糖磷酸单位构成的糖磷酸骨架)的糖磷酸单位(即，一起形成糖磷酸单位的β-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥接)可以被另一个单位置换，其中该其他单位例如适于建立“吗啉代衍生物”寡聚体(如描述于例如Stirchak E P et al.(1989)Oligonucleotides Res 17:6129-41中)，也就是说，例如被吗啉代衍生物单位置换；或适于建立聚酰胺寡核苷酸(“PNA”；如描述于例如Nielsen P E et al.(1994)Bioconjug Chem5:3-7中)，也就是说，例如被PNA骨架单位置换，例如被2-氨基乙基甘氨酸置换。
3-核糖单位或β-D-2'-脱氧核糖单位可以被修饰的糖单位置换，其中该修饰的糖单位例如选自β-D-核糖、α-D-2'-脱氧核糖、L-2'-脱氧核糖、2'-F-2'-脱氧核糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选地2'-O-(C1-C6)烷基-核糖是2'-O-甲基核糖、2'-O-(C2-C6)烯基-核糖、2'-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2'-NH2-2'-脱氧核糖、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2,4-二脱氧-β-D-赤-六-吡喃糖和碳环的(描述于例如Froehler J(1992)J Am Chem Soc 114:8320中)和/或开链的糖类似物(描述于例如Vandendriesscheet al.(1993)Tetrahedron 49:7223中)和/或双环糖类似物(描述于例如Tarkov M et al.(1993)Helv Chim Acta 76:481中)。
在一些实施方案中，该糖是2'-O-甲基核糖，特别是对于通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键联连接的一个或两个核苷酸而言。
在本文描述的具体序列中，定义了一组修饰的碱基。例如，字母Y用于指代含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。如本文所用的修饰的胞嘧啶是胞嘧啶的天然存在的或非天然存在的嘧啶碱基类似物，其可以置换此碱基而不损害该寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-氟代-胞嘧啶、5-氯代-胞嘧啶、5-溴代-胞嘧啶、5-碘代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如，N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如，N,N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟代-尿嘧啶、5-溴代-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一个实施方案中，该胞嘧啶碱基被通用碱基(例如，3-硝基吡咯、P碱基)、芳香族环系统(例如，氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代。
字母Z用于指代鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。如本文所用的修饰的鸟嘌呤是鸟嘌呤的天然存在的或非天然存在的嘌呤碱基类似物，其可以置换此碱基而不损害该寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-7-取代的鸟嘌呤(如7-去氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-去氮杂-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如，N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如，N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(例如，8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)以及6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中，该鸟嘌呤碱基被通用碱基(例如，4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚和K碱基)、芳香族环系统(例如，苯并咪唑或二氯代-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-甲酸酰胺)或氢原子(dSpacer)取代。
该寡核苷酸可以具有一个或多个可及5'端。有可能的是产生具有两个这样的5'端的修饰的寡核苷酸。这可以例如通过将两个寡核苷酸经由3'-3'键联附接以产生具有一个或两个可及5'端的寡核苷酸来实现。该3'3'-键联可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他修饰的核苷酸间桥接。用于完成此类键联的方法是本领域已知的。例如，此类键联已经描述于Seliger,H.et al.,Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleosides&Nucleotides(1991),10(1-3),469-77；和Jiang,et al.,Pseudo-cyclicoligonucleotides:in vitro and in vivo properties,Bioorganic&MedicinalChemistry(1999),7(12),2727-2735中。
另外，3'3’连接的寡核苷酸(其中3'-末端核苷酸之间的键联不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他修饰的桥接)可以使用另外的间隔物如三或四乙二醇磷酸酯模块制备(Durand,M.et al,Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridged by two hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197-204，美国专利号5,658,738，和美国专利号5,668,265)。可替代地，该非核苷酸接头可以使用标准亚磷酰胺化学衍生自乙二醇、丙二醇或衍生自脱碱基脱氧核糖(dSpacer)单位(Fontanel,Marie Laurence et al.,Stericalrecognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides；Oligonucleotides Research(1994),22(11),2022-7)。该非核苷酸接头可以被掺入一次或多次，或彼此组合，允许有待连接的两个ODN的3’端之间的任何令人希望的距离。
该寡核苷酸可以是部分地抗降解的(例如，是稳定化的)。“稳定化的寡核苷酸分子”应当意指相对抗体内降解(例如，经由外切或内切核酸酶)的寡核苷酸。寡核苷酸稳定化可以经由骨架修饰完成。具有硫代磷酸酯键联的寡核苷酸通过细胞内外切和内切核酸酶为该寡核苷酸提供最大保护免于被降解。其他修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的寡核苷酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸的组合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基及其组合。还已经显示在任一或两个末端含有二醇(如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸是实质性抗核酸酶降解的。环状ODN被保护免于外切核酸酶降解。例如，Mologen双茎环免疫调节剂MGN1703(以前是dSLIM-30L1)是共价地闭合的116个核苷酸的哑铃状的含有CpG的磷酸二酯骨架寡核苷酸，序列为5'-AGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT-3'(SEQ ID NO:501)。Schmidt M et al.,Allergy 2006 61:56-63；Kapp,K et al.,MolTher Nucleic Acids 2014 3:e170。
该免疫刺激性寡核苷酸在该核苷酸或核苷酸类似模块之间还可以含有一个或多个不常见键联。该不常见核苷间键联是3'5'-键联。所有其他键联都被认为是不常见核苷间键联，如2'5'-、5'5'-、3'3'-、2'2'-、2'3'-键联。根据核糖的碳原子选自命名2’到5’。然而，如果利用非天然糖模块，如环扩展糖类似物(例如己糖、环己烯或吡喃糖)或双环或三环糖类似物，则此命名根据单体的命名改变。在3'-脱氧-β-D-吡喃核糖类似物(亦称p-DNA)中，单核苷酸例如经由4'2'-键联连接。
如果该寡核苷酸含有一个3'3'-键联，则此寡核苷酸可以具有两个未连接的5’端。类似地，如果该寡核苷酸含有一个5'5'-键联，则此寡核苷酸可以具有两个未连接的3’端。核苷酸的未连接端的可及性可以通过其受体而是更好地可及的。两种类型的不常见键联(3'3'-和5'5’)由Ramalho Ortigao et al.(Antisense Research and Development(1992)2,129-46)进行了描述，借此具有3'3'-键联的寡核苷酸被报道对核酸酶裂解显示出增强的稳定性。
不同类型的键联也可以组合在一个分子中，这可以导致该寡聚物分支。如果该寡核苷酸的一部分在3’端经由3'3'-键联连接至第二寡核苷酸部分并且在2’端经由2'3'-键联连接至该分子的第三部分，这例如导致具有三个5’端的分支寡核苷酸(3'3'-，2'3'-分支的)。
III.检查点抑制剂
A.PD-1
编程的死亡-1受体(PD-1)，也称为CD279，是一种在激活的T细胞(包括CD8+T细胞)、B细胞和巨噬细胞上表达的1型膜蛋白。其同源配体是PD-L1和PD-L2，并且PD-1特别是被PD-L1结合阻断T细胞中的“信号3”并且潜在地抑制适应性免疫应答的效应分支，例如通过导致表达PD-1的T细胞死亡。
在人类中，PD-1是具有如GenBank登录号NP_005009所公开的氨基酸序列的268个氨基酸的多肽。该蛋白质包括细胞外IgV结构域、跨膜结构域和具有两个磷酸化位点的细胞内结构域。
PD-1与PD-L1之间的相互作用的KD是770nM。
在本发明的优选的实施方案中，该抗体抑制PD-1与PD-L1之间的结合。优选地，该抗体能以约100nM或更低的IC50抑制与PD-L1的结合；更优选地，约10nM或更低，例如约5nM或更低；又更优选地，约2nM或更低；或甚至更优选地，例如约1nM或更低。
另外，在另一个实施方案中，该抗PD-1抗体对PD-1具有至少与PD-L1的一样强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-1抗体对PD-1具有至少如PD-L1的10倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-1抗体对PD-1具有至少如PD-L1的100倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-1抗体对PD-1具有至少如PD-L1的1000倍强的结合亲和力。
抗PD-1抗体是本领域已知的并且包括例如Wood et al.的美国专利号6,808,710、Collins et al.的美国专利号7,488,802和Honjo et al.的美国专利号8,728,474中披露的那些。抗PD-1抗体可作为派姆单抗(以前称为拉姆单抗(lambrolizumab)和MK-3475，
Figure BDA0003163310790000671
Merck，KD 29pM)和纳武单抗(
Figure BDA0003163310790000672
Bristol-Myers Squibb，KD2.6nM)商购。目前正在开发的另外的抗PD-1抗体包括匹迪单抗(pidilizumab)(CT-011，Cure Tech)。
B.PD-L1
编程的死亡-配体1受体(PD-L1)，也称为CD274和B7同系物1(B7-H1)，是一种在激活的T细胞(包括CD8+T细胞和所谓的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL细胞))、B细胞、巨噬细胞和树突细胞以及许多类型的肿瘤细胞上表达的1型膜蛋白。其同源配体是PD-1和B7.1(CD80)，并且PD-1被PD-L1结合阻断T细胞中的“信号3”并且可以潜在地抑制介导适应性免疫应答的T细胞效应子功能，例如通过导致表达PD-1的T细胞死亡。
PD-L1表达响应于干扰素γ(IFN-γ)在T细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓系树突细胞、B细胞、上皮细胞和血管内皮细胞上被上调。PD-L1表达响应于IFN-γ在肿瘤(例如，肾细胞癌和卵巢癌)上也被上调。
在人类中，PD-L1表达于两种同等型的任一者中，较长的同等型a或较短的同等型b。同等型a是具有如GenBank登录号NP_054862公开的氨基酸序列的290个氨基酸的多肽；该成熟肽包含氨基酸残基19-290，其中残基239-259表示跨膜结构域。同等型b是具有如GenBank登录号NP_001254635所公开的氨基酸序列的176个氨基酸的多肽；该成熟肽包含氨基酸残基19-259。
如上文所提到的，PD-1与PD-L1之间的相互作用的KD是770nM。
在本发明的优选的实施方案中，该抗体抑制PD-1与PD-L1之间的结合。优选地，该抗体能以约100nM或更低的IC50抑制与PD-1的结合；更优选地，约10nM或更低，例如约5nM或更低；又更优选地，约2nM或更低；或甚至更优选地，例如约1nM或更低。
另外，在另一个实施方案中，该抗PD-L1抗体对PD-L1具有至少与PD-1的一样强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-L1抗体对PD-L1具有至少如PD-1的10倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-L1抗体对PD-L1具有至少如PD-1的100倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗PD-L1抗体对PD-L1具有至少如PD-1的1000倍强的结合亲和力。
抗PD-L1抗体是本领域已知的并且包括例如Korman et al.的美国专利号7,943,743中披露的那些。尽管在美国FDA尚未批准抗PD-L1抗体进行商业化，但若干抗PD-L1抗体在人类临床试验中目前正在开发之中，包括MPDL3280A(Genetech/Roche，KD 0.4nM)、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和MEDI-4736(AstraZeneca)。
C.CTLA-4
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CTLA4或CD152，是一种在T细胞和调节性T细胞(Treg)上表达的膜蛋白。其同源配体包括抗原呈递细胞(APC)上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)。B7-1或B7-2被CTLA-4结合阻断T细胞中的“信号2”并抑制适应性免疫应答的启动。
在人类中，CTLA-4被编码为多种同等型，包括具有如GenBank登录号NP_001032720所公开的氨基酸序列的同等型。
优选的抗CTLA-4抗体是特异性结合人类CTLA-4的抗体。更具体地，该抗CTLA-4抗体特异性结合人类CTLA-4的细胞外结构域中的表位并且抑制CTLA-4与其同源配体B7-1和B7-2之一或两者之间的结合。
优选的抗CTLA-4抗体是特异性结合人类CTLA-4的人类抗体。更具体地，该抗CTLA-4抗体特异性结合人类CTLA-4的细胞外结构域中的表位并且抑制CTLA-4与其同源配体B7-1和B7-2之一或两者之间的结合。示例性人类抗CTLA-4抗体详述于2000年6月29日公开为WO00/37504的国际申请号PCT/US99/30895、2002年4月12日公开的欧洲专利申请号EP1262193 A1、Hanson等人的现在发布为美国专利号6,682,736的美国专利申请序列号09/472,087、公开为US 2002/0086014的美国专利申请序列号09/948,939、公开为US 2009/0117132的美国专利申请序列号11/988,396和公开为US 2012/0003179的美国专利申请序列号13/168,206中，将其完整公开内容通过引用并入本文。此类抗体包括但不限于3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1以及MDX-010。人类抗体在本发明的治疗方法中提供了实质性优势，因为预期它们最小化与在人类患者中使用非人类抗体相关的免疫原性和过敏性应答。
抗CTLA-4抗体特异性地包括伊匹单抗(
Figure BDA0003163310790000691
Bristol-Myers Squibb)。
本发明的有用的人类抗CTLA-4抗体的特征集中披露于WO 00/37504、EP 1262193和美国专利号6,682,736以及美国专利申请公开号US2002/0086014和US2003/0086930中，并且其中所述的氨基酸和核酸序列通过引用以其整体并入本文。简言之，本发明的抗体包括具有以下抗体的氨基酸序列的抗体，如但不限于抗体3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、12.9.1.1和MDX-010本发明还涉及具有这些抗体的重链和轻链的CDR的氨基酸序列的抗体以及在该CDR区域中具有变化的那些，如上文引用的申请和专利中所述的。本发明还涉及具有那些抗体的重链和轻链的可变区的抗体。在另一个实施方案中，该抗体选自具有以下抗体的重链和轻链的全长、可变区或CDR氨基酸序列的抗体：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1以及MDX-010。
施用抗CTLA-4抗体的方法是本领域熟知的。最常见地，该抗体通过系统施用(通常是IV)来施用。在动物模型而非人类中，瘤内施用也已经作为减少剂量和毒性的方式进行了探索(Fransen MF et al.,Oncoimmunology 2013Nov 1；2(11):e26493)。
在一个实施方案中，本发明包括包含在公开为美国专利申请公开号2002/0086014和2003/0086930的美国专利申请序列号09/948,939和其中引用的参考文献中披露的人类抗CTLA-4抗体的抗体-治疗剂组合，包括但不限于MAb 10D1(MDX-010，Medarex，普林斯顿，新泽西州)。甚至更优选地，该抗CTLA-4抗体是MDX-010。可替代地，该抗CTLA-4抗体是11.2.1(替西木单抗(Ticilimumab)；CP-675,206)。
在本发明的优选的实施方案中，该抗体抑制CTLA-4与B7-1、B7-2或两者之间的结合。优选地，该抗体能以约100nM或更低的IC50抑制与B7-1的结合；更优选地，约10nM或更低，例如约5nM或更低；又更优选地，约2nM或更低；或甚至更优选地，例如约1nM或更低。同样地，该抗体能以约100nM或更低的IC50抑制与B7-2的结合；更优选地，10nM或更低，例如甚至更优选地，约5nM或更低；又更优选地，约2nM或更低；或甚至更优选地，约1nM或更低。
另外，在另一个实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少与B7-1的一样强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-1的10倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-1的100倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-1的1000倍强的结合亲和力。
另外，在另一个实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少与B7-2的一样强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-2的10倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-2的100倍强的结合亲和力。在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4具有至少如B7-2的1000倍强的结合亲和力。
另外，在另一个实施方案中，该抗CTLA-4抗体对CTLA-4的结合亲和力是约10-8M或更大的亲和力，更优选地约10-9M或更大的亲和力，更优选地约10-10M或更大的亲和力，并且甚至更优选地约10-11M或更大的亲和力。
在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体可以与具有选自下组的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合，该组由以下各项组成：4.1.1、6.1.1、11.2.1、4.13.1和4.14.3。另外，在某些实施方案中，该抗CTLA-4抗体可以与MDX-010抗体竞争结合。
在另一个实施方案中，该抗CTLA-4抗体优选地与具有抗体4.1.1,4.13.1,4.14.3,6.1.1或11.2.1的重链和轻链序列、可变重链和可变轻链序列和/或重链和轻链CDR序列的抗体交叉竞争。例如，该抗体可以结合至具有选自下组的抗体的重链和轻链氨基酸序列、可变序列和/或CDR序列的抗体所结合的表位，该组由以下各项组成：4.1.1、4.13.1、4.14.3、6.1.1或11.2.1。在另一个实施方案中，该抗CTLA-4抗体与具有MDX-010的重链和轻链序列或抗原结合序列的抗体交叉竞争。
在另一个实施方案中，使用抗CTLA-4抗体实践本发明，该抗体包括包含选自下组的抗体的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的重链和包含选自下组的抗体的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的轻链，该组由以下各项组成：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1，或具有来自所述CDR序列的选自下组的变化的序列，该组由以下各项组成：保守变化，其中该保守变化选自下组，该组由以下各项组成：非极性残基被其他非极性残基置换、极性带电残基被其他极性不带电残基置换、极性带电残基被其他极性带电残基置换和结构上类似的残基的取代；不保守取代，其中该不保守取代选自下组，该组由以下各项组成：极性带电残基被极性不带电残基取代和非极性残基被极性残基取代，添加和缺失。
在本发明的另外的实施方案中，该抗体在框架或CDR区域中含有来自该种系序列的少于10、7、5或3个氨基酸变化。在另一个实施方案中，该抗体在框架区中含有少于5个氨基酸变化并且在CDR区域中含有少于10个变化。在一个优选的实施方案中，该抗体在框架区中含有少于3个氨基酸变化并且在CDR区域中含有少于7个变化。在优选的实施方案中，框架区中的变化是保守的并且CDR区域中的那些是体细胞突变。
在另一个实施方案中，该抗体在重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列上与以下抗体的CDR序列具有至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、又更优选地至少95％、更优选地至少99％的序列同一性：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1。甚至更优选地，该抗体在重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3上与以下抗体的序列具有100％序列同一性：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1。
在又另一个实施方案中，该抗体在重链和轻链可变区序列上与以下抗体的可变区序列具有至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、又更优选地至少95％、更优选地至少99％的序列同一性：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1。甚至更优选地，该抗体在重链和轻链可变区序列与以下抗体的序列具有100％序列同一性：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1。
D.其他检查点抑制剂
除上文列出的那些之外，其他检查点是本领域已知的并且其抑制剂被包括在本发明中。例如，BTLA响应于HVEM提供负信号，并且TIM3响应于Gal9提供负信号。腺苷可以通过腺苷A2a受体触发抑制效应，并且IDO和TDO是被认为参与抗肿瘤免疫的熟知的免疫抑制途径。与CD4相比，LAG3由更高的亲和力结合至MHC II类。LAG3以类似于CTLA-4和PD-1的方式负向地调节T细胞的细胞增殖、激活和稳态，并且已经报道它在Treg抑制功能中发挥作用。LAG3还帮助将CD8+T细胞维持为耐受状态，并且与PD-1合作，在慢性病毒感染期间帮助维持CD8耗尽。已知LAG3参与树突细胞的成熟和激活。用于本发明的另外的检查点抑制剂包括而不限于能够特异性结合BTLA、TIM3和LAG3中的任何一个或多个的抗体及其抗原结合片段。本发明还考虑了能够特异性结合BTLA、TIM3和LAG3中的任何一个或多个的双特异性抗体及其双特异性抗原结合片段。
本发明考虑了TLR9激动剂和检查点抑制剂的组合，其中该检查点抑制剂可以是单个CPI或两个或更多个CPI的任何组合。虽然在临床上很有可能将使用仅一个或仅一对CPI，但本发明考虑了使用选自例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM3、LAG3或BTLA的抑制剂的任何一个、任何两个、任何三个或任何四个或更多个CPI。
E.抗体来源
虽然本文先前所讨论的抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体可以是优选的，但基于本文提供的公开文本，技术人员应理解本发明涵盖多种多样的抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体并且不限于这些具体抗体。更具体地，虽然人类抗体优选用于人类，但本发明绝不限于人类抗体；相反，本发明涵盖有用的抗体，不管物种来源如何，并且尤其包括嵌合的人源化的和/或灵长化的抗体。并且，尽管某些本文示例的抗体使用转基因哺乳动物(例如，包含人体免疫谱的小鼠)来获得，但基于本文提供的公开文本，技术人员应理解，本发明不限于通过这或通过任何其他具体方法产生的抗体。而是，本发明包括通过任何方法产生的抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体，包括但不限于本领域已知(例如，筛选噬菌体展示文库等)或在未来开发的用于产生本发明的抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体的方法。基于本文以及在例如Bedian et al.的美国专利号6,682,736和美国专利申请公开号2002/0088014中提供的广泛的公开内容，本领域技术人员可以使用本文公开的新颖方法容易地生产和鉴定有用于治疗癌症的与CpG ODN组合的抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体。
本发明涵盖使用转基因非人类哺乳动物产生的人类抗体，即XenoMouseTM(Abgenix公司，弗里蒙特，加利福尼亚州)，如在Hanson et al.的美国专利号6,682,736中披露的。
用于产生“人类”抗体的另一种转基因小鼠系统被称为“HuMAb-MouseTM”(Medarex，普林斯顿，新泽西州)，其含有编码非重排人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因迷你座位连同使内源μ和γ链座位失活的靶向突变(Lonberg etal.Nature 368:856-859(1994)，和美国专利号5,770,429)。
然而，本发明使用了使用任何转基因哺乳动物产生的人类抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体，如但不限于Kirin TC MouseTM(Kirin Beer Kabushiki Kaisha，东京，日本)，如例如Tomizuka et al.,Proc Natl Acad Sci USA 97:722(2000)、Kuroiwa et al.,Nature Biotechnol 18:1086(2000)、Mikayama et al.的美国专利申请公开号2004/0120948中所述的；以及HuMAb-MouseTM(Medarex，普林斯顿，新泽西州)和XenoMouseTM(Abgenix公司，弗里蒙特，加利福尼亚州)，同上。因此，本发明涵盖使用用任何转基因或其他非人类动物产生的抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体。
此外，虽然产生人类抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体的优选方法包括使用包含人类免疫谱的非人类转基因哺乳动物产生抗体，但本发明绝不限于这种方法。相反，如本领域技术人员所理解的，一旦掌握了本文所提供的公开文本，本发明涵盖使用用于产生根据本领域已知的或在未来开发的用于产生特异性地结合感兴趣的抗原的抗体的任何方法产生的对PD-1、PD-L1或CTLA-4有特异性的人类或任何其他抗体的任何方法。
人类抗体可以通过以下方法来开发，包括但不限于使用噬菌体展示抗体文库。例如，使用这些技术，可以针对表达CTLA-4的细胞、CTLA-4自身、CTLA-4的各种形式、其表位或肽、及其表达文库(参见例如，美国专利号5,703,057)产生抗体，之后可以针对上文描述的活性对其进行筛选。
在另一个实施方案中，本发明的方法中利用的抗体不是完全人类的，而是“人源化的”。具体而言，鼠抗体或来自其他物种的抗体可以使用本领域熟知的技术“人源化”或“灵长化”。参见例如，Winter and Harris Immunol.Today 14:43-46(1993)，Wright etal.Crit.Reviews in Immunol.12:125-168(1992)，和Cabilly et al.的美国专利号4,816,567，以及Mage and Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications pp.79-97,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.(1987)。
如基于本文提供的公开文本所理解的，用于本发明的抗体可以从转基因非人类哺乳动物或自其衍生的杂交瘤获得，但是也可以表达于不同于杂交瘤的细胞系中。
作为表达用宿主可供使用的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)以及人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)。还可以利用非哺乳动物原核和真核细胞，包括细菌、酵母、昆虫和植物细胞。
各种表达系统可以如本领域熟知的来使用，如但不限于描述于例如Sambrook andRussell,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(2001)，和Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(2002)中的那些。这些表达系统尤其包括基于二氢叶酸还原酶(DHFR)的系统。谷氨酰胺合成酶表达系统全部地或部分地结合欧洲专利号EP 216 846、EP 256 055和EP 323 997以及欧洲专利申请89303964进行讨论。在一个实施方案中，使用的抗体在NS0细胞中使用谷氨酰胺合成酶系统(GS-NS0)来制备。在另一个实施方案中，该抗体在CHO细胞中使用DHFR系统来制备。两种系统都是本领域熟知的并且尤其描述于Barneset al.Biotech&Bioengineering 73:261-270(2001)以及其中引用的参考文献中。
定点诱变抗体CH2结构域以消除糖基化可以是优选的，以便防止由非人类糖基化作用引起的免疫原性、药代动力学和/或效应子功能的变化。另外，该抗体可以通过酶促(参见例如，Thotakura et al.Meth.Enzymol.138:350(1987))和/或化学方法(参见例如，Hakimuddin et al.,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987))来去糖基化。
另外，本发明涵盖使用包含改变的糖基化模式的抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体。技术人员应理解，基于本文提供的公开文本，与对应的未改变的抗体相比，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体可以被修饰成包含另外的、较少的或不同的糖基化位点。此类修饰描述于例如美国专利申请公开号2003/0207336和2003/0157108以及国际专利申请号WO 01/81405和00/24893中。
另外，本发明包括使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体，无论该抗体上存在的糖型(如果有的话)如何。此外，用于集中重塑糖蛋白上存在的糖型的方法是本领域熟知的并且包括例如描述于国际专利申请号WO 03/031464、WO 98/58964和WO 99/22764与美国专利申请公开号2004/0063911、2004/0132640、2004/0142856、2004/0072290以及Umana et al.的美国专利号6,602,684中的那些。
另外，本发明涵盖使用具有任何本领域已知的共价和非共价修饰的抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体，包括但不限于以例如美国专利申请公开号2003/0207346和2004/0132640以及美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337中所述的方式将该多肽连接至多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
另外，本发明涵盖使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分，包含例如人血清白蛋白多肽的嵌合蛋白或其片段。无论该嵌合蛋白是使用重组方法通过例如克隆编码该嵌合蛋白的嵌合核酸还是通过两个肽部分的化学键联来产生，技术人员应理解，一旦掌握了本文所提供的教导，此类嵌合蛋白是本领域熟知的并且可以为本发明的抗体赋予令人希望的生物特性如但不限于增加的稳定性和血清半衰期并且此类分子因此被包括在本文中。
产生用于本发明的抗体无需开始便具有具体的所希望的同种型。相反，所产生的抗体可以具有任何同种型并且可以是之后使用常规技术转换的同种型。这些包括直接重组技术(参见例如，美国专利号4,816,397)和细胞-细胞融合技术(参见例如，美国专利号5,916,771)。
本发明抗体的效应子功能可以通过同种型转换变为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM用于各种治疗应用。此外，依赖细胞补体，杀伤可以通过使用例如双特异性分子、免疫毒素或放射性标记来避免。
因此，虽然本发明中使用的优选抗CTLA-4抗体由具有3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、12.9.1.1和MDX-010的氨基酸序列或例如其V区或CDR的序列的抗体来示例，但本发明不以任何方式限于使用这些或任何其他具体的抗CTLA-4抗体。优选地，该抗体是4.1.1、4.13.1、11.2.1和/或MDX-010。然而，任何抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分(如在本文其他地方所述的或如本领域已知的或在未来开发的)可以在本发明的方法中使用。更具体地，人源化的嵌合抗体、衍生自任何物种的抗CTLA-4抗体(包括从骆驼科动物获得的单链抗体，如例如Casterman和Hamers的美国专利号5,759,808和6,765,087中所述的)以及任何人类抗体可以与CpG ODN组合以实践本文公开的新颖方法。
本发明还涵盖如尤其披露于国际专利申请号WO 00/37504(2000年6月29日公开的)、WO 01/14424(2001年3月1日公开的)、WO 93/00431(1993年1月7日公开的)和WO 00/32231(2000年6月8日公开的)中的此类抗体。
因此，一旦掌握了本文所提供的教导，技术人员应容易地理解，本发明的抗CTLA-4抗体-治疗剂组合可以包括众多的抗CTLA-4抗体。
另外，基于本文提供的公开文本，本领域技术人员应理解，本发明不限于仅施用单个抗体；相反，本发明涵盖施用与CpG ODN组合的至少一种抗CTLA-4抗体，例如4.1.1、4.13.1和11.2.1。此外，本发明涵盖施用任何已知的抗CTLA-4抗体的任何组合，包括但不限于施用与例如4.1.1、4.13.1、11.2.1和MDX-010组合的CpG ODN。因此，抗CTLA-4抗体的任何组合都可以与至少一种治疗剂组合并且本发明涵盖任何此类组合及其排列。
IV.CpG DNA和检查点抑制剂组合免疫疗法
本发明涉及组合肿瘤免疫疗法，该疗法包括将CpG ODN局部地施用入癌性肿瘤或其附近，并且系统地施用检查点抑制剂(如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体)，以治疗癌症。已经报道了用CpG ODN(B类，皮下地施用高达0.15mg/kg/wk)和抗CTLA-4抗体的组合治疗的患者中的单个人类临床试验(Millward M et al.,Br.J.Cancer 2013 108(10):1998-2004)。此项研究在21名患有IV期黑色素瘤的患者中确定了IV抗CTLA-4和皮下CpG的每周组合持续12周的疗法的MTD。尽管该研究的结果不被认为是足够令人鼓舞的以保证TLR9激动剂在肿瘤学上的持续发展(赞助者的所有免疫肿瘤学药物开发终止)，但来自该研究的若干有趣的发现支持了本发明的实用性。首先，TLR9激动剂和检查点抑制剂的组合是相对良好耐受的–没有观察到系统性自身免疫疾病，并且仅有三名患者在预先设定的开始6周期间过程中出现了剂量限制性毒性，其中的两名在该抗CTLA-4抗体的最高剂量组中。其次，没有来自该组合方案的针对该抗CTLA-4抗体的抗体应答的诱导。第三，两名患者对该治疗实现了部分应答，并且若干其他患者患有异常持久的稳定的疾病。
诱导高IFN的CpG ODN和抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4的组合对于原发性和继发性(即，转移性)癌症的治疗是有用的。更具体地，在许多潜在的治疗选择中，CpG ODN和抗检查点组合疗法可以用于治疗癌症。在某些实施方案中，有待治疗的癌症是或包括癌性肿瘤。如本文所用的，“癌性肿瘤”是指细胞的异常肿胀或肉眼可见的集合，包括由其在不受正常外部信号调节的情况下生长或增殖表征的异常细胞。在某些实施方案中，癌性肿瘤是癌、肉瘤或腺癌；这些有时被称为实体瘤。在某些实施方案中，癌性肿瘤排除血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，癌性肿瘤包括某些血液恶性肿瘤，例如淋巴瘤。
可通过本发明的方法治疗的代表性癌症具体包括而不限于皮肤、头和颈、食管、胃、肝、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、子宫颈、卵巢、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑、肌肉和骨的癌症。可通过本发明的方法治疗的癌症还具体包括黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。可通过本发明的方法治疗的癌症还具体包括淋巴瘤、骨髓的癌症、类癌瘤和神经母细胞瘤。
虽然在一些实施方案中，前述癌症是优选的，但本发明涉及多种多样的恶性细胞增殖性障碍的治疗，包括但不限于卡波西肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、肝胆管的(肝胆管)、原发性或继发性脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、皮肤癌、头或颈的癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、肛区的癌症、胃(胃的)癌、胃肠(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、结肠癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管的癌症、小肠的癌症、内分泌系统的癌症、甲状腺的癌症、甲状旁腺的癌症、肾上腺的癌症、软组织肉瘤、尿道的癌症、前列腺癌、阴茎的癌症、睾丸癌、膀胱的癌症、肾或输尿管的癌症、肾盂癌、胰腺癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)(包括原发性或继发性CNS肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、肌母细胞瘤、星形细胞瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)；以及，在一些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤(NHL，包括惰性的和侵袭性的)、霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、慢性或急性髓系白血病、慢性或急性淋巴细胞性白血病、成红细胞瘤和多发性骨髓瘤；或前述癌症中两种或更多种的组合。
有待治疗的癌症可以是难治性癌症。如本文所用的，难治性癌症是抗所开处方的普通护理标准的癌症。这些癌症可能最初对治疗有反应(并且然后复发)，或者它们可能对该治疗完全无反应。普通护理标准将取决于癌症类型和受试者中的进展程度而变化。它可以是化疗、免疫疗法、手术、放射或其组合。本领域普通技术人员知道这些护理标准。针对难治性癌症根据本发明治疗的受试者因此可能已经为了其癌症而暴露于另一种治疗。可替代地，如果该癌症可能是难治性的(例如，鉴于癌细胞的分析或该受试者的病史)，则该受试者可能没有已经暴露于另一种治疗。
在某些实施方案中，难治性癌症包括对用检查点抑制剂的治疗而言难治性的癌症。这种类型的癌症有时被称为“冷的”。本发明的方法可以用于治疗此类“冷”癌症或肿瘤以将它们转化为“热”癌症或肿瘤，即对治疗(包括用检查点抑制剂的治疗，即使是相同的检查点抑制剂)作出应答的癌症或肿瘤。
难治性癌症的例子包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、结肠癌、肝(肝的)癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和白血病。
在某些情况下，本发明的方法可以用于替代现有的外科手术或药物疗法，但是在其他情况下，本发明在改进现有的用于治疗此类病症的疗法的疗效方面是有用的。因此，组合疗法可以用于治疗正在经历或将经历用于癌症的治疗的受试者。例如，可以将该药剂与另一种抗增殖(例如，抗癌)疗法组合地施用于受试者。适合的抗癌疗法包括用于去除肿瘤块的外科手术、化疗或局部放射。该其他抗增殖疗法可以在用本发明的CpG ODN/CPI组合的治疗之前、与同时或在之后施用。不同治疗的施用之间还可以有若干小时、若干天以及在一些情况下若干周的延迟，使得该CpG ODN/CPI组合可以在该其他治疗之前或之后施用。本发明进一步考虑了在手术、放射或化疗之前和之后在癌症受试者中使用该CpG ODN/CPI组合。
在一个实施方案中，本发明提供了使用CpG ODN-CPI组合产生或增加抗肿瘤应答的组合物和方法，其中CpG ODN增强由当单独使用时用于诱导相同水平的抗肿瘤应答的另外次优的量的CPI引起的抗肿瘤应答。在某些实施方案中，当不将该CpG ODN与CPI结合用于引起抗肿瘤应答时，单独施用CpG ODN不产生或增加抗肿瘤应答。在替代实施方案中，该CpGODN和该CPI两者单独的和/或当组合地施用时可以引起抗肿瘤应答。
在一个实施方案中，本发明提供了使用CpG ODN-CPI抗体组合产生或增加抗肿瘤应答的组合物和方法，其中CpG ODN增强由当单独使用时用于诱导相同水平的抗肿瘤应答的另外次优的量的抗体引起的抗肿瘤应答。在某些实施方案中，当不将该CpG ODN与CPI抗体结合用于引起抗肿瘤应答时，单独施用CpG ODN不产生或增加抗肿瘤应答。在替代实施方案中，该CpG ODN和该CPI抗体两者单独的和/或当组合地施用时可以引起抗肿瘤应答。
在某些实施方案中，该CpG ODN能以加性方式增强该CPI的效果(或反之亦然)。在优选的实施方案中，该CpG ODN以协同方式增强该CPI的效果(或反之亦然)。在另一个实施方案中，该CPI以加性方式增强CpG ODN的效果。优选地，该效果以协同方式增强。因此，在某些实施方案中，本发明涵盖提供比基于单独的CpG ODN和单独的CPI的施用预期的更好的治疗谱的疾病治疗或预防方法。
在某些实施方案中，该CpG ODN能以加性方式增强该CPI抗体的效果(或反之亦然)。在优选的实施方案中，该CpG ODN以协同方式增强该CPI抗体的效果(或反之亦然)。在另一个实施方案中，该CPI抗体以加性方式增强CpG ODN的效果。优选地，该效果以协同方式增强。因此，在某些实施方案中，本发明涵盖提供比基于单独的CpG ODN和单独的CPI抗体的施用预期的更好的治疗谱的疾病治疗或预防方法。
在某些实施方案中，该CpG ODN与CPI(与或不与其他方式如放疗)一起施用作为新辅助治疗方案的一部分以实现使治愈性手术成为可能的抗肿瘤效应。
在某些实施方案中，在手术切除原发性或转移性肿瘤之后或在微小残留疾病的环境中，该CpG ODN与CPI(与或不与其他方式如放疗)一起施用，以便防止肿瘤复发。
本发明还涵盖具有加性效力或加性治疗效果同时减少或避免不想要的或不良的反应的组合疗法。本发明还涵盖治疗疗效大于加性的，同时不想要的或不良的反应被减少或避免的协同组合。在某些实施方案中，本发明的方法允许治疗或预防疾病和障碍，其中治疗通过使用较低的和/或较不频繁的剂量的CpG ODN和/或CPI增强抗肿瘤应答而得到改进以降低由单独的CpG ODN和/或单独的CPI的施用导致的不想要的或不良的反应的发生率，同时维持或增强治疗疗效，优选地增加患者依从性、改进疗法和/或减少不想要的或不良的反应。
本发明的方法
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂诱导IFN-α。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpG DNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是C类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A/E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是P类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂具有被提供为以下项的序列：5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG-3'(SEQ ID NO:82)。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是具有天然骨架(例如，MGN1703)的环状CpGDNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是在包含纳米颗粒、VLP、ISCOM或其他抗核酸酶递送运载体的配制品中施用的未修饰的天然CpG DNA。
在某些实施方案中，该CPI系统施用。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合选自下组的抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1和CTLA-4。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合选自下组的抗原的第二抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1和PD-L1。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-L1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-L1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合TIM3的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和选自下组的抗原的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1和PD-L1。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和PD-1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和PD-L1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和PD-L1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-L1和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-L1和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合TIM3和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂在施用该CPI之前施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂和该CPI实质性同时施用。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤或选自下组的组织的癌性肿瘤，该组由以下各项组成：皮肤、头和颈、食管、胃、肝、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、子宫颈、卵巢、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑、肌肉和骨。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是黑色素瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是骨髓的癌症。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是类癌瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是神经母细胞瘤。
在某些实施方案中，该受试者是人。
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的放疗、TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该放疗在施用该TLR9激动剂之前开始，并且该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
在某些实施方案中，该放疗是放疗。
在某些实施方案中，该放疗是大分割放疗。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂诱导IFN-α。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpG DNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是C类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A/E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是P类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂具有被提供为以下项的序列：5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG-3'(SEQ ID NO:82)。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是具有天然骨架(例如，MGN1703)的环状CpGDNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是在包含纳米颗粒、VLP、ISCOM或其他抗核酸酶递送运载体的配制品中施用的未修饰的天然CpG DNA。
在某些实施方案中，该CPI系统施用。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合选自下组的抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1和CTLA-4。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI不是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合选自下组的抗原的第二抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1和PD-L1。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-L1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合PD-L1的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合TIM3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合PD-L1的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含(i)特异性结合TIM3的第一抗体或其抗原结合片段，和(ii)特异性结合LAG3的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和选自下组的抗原的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1和PD-L1。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和PD-1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和PD-L1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合CTLA-4和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和PD-L1的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-1和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-L1和TIM3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合PD-L1和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该CPI包含特异性结合TIM3和LAG3的双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂在施用该CPI之前施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂和该CPI实质性同时施用。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤或选自下组的组织的癌性肿瘤，该组由以下各项组成：皮肤、头和颈、食管、胃、肝、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、子宫颈、卵巢、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑、肌肉和骨。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是黑色素瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是骨髓的癌症。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是类癌瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是神经母细胞瘤。
在某些实施方案中，该受试者是人。
本发明的一个方面是治疗癌性肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂、第一检查点抑制剂(CPI)和第二CPI，其中该TLR9激动剂和该第一CPI施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近，并且该第二CPI系统施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂诱导IFN-α。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpG DNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是C类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是A/E类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是P类CpG DNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂具有被提供为以下项的序列：5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG-3'(SEQ ID NO:82)。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是具有天然骨架(例如，MGN1703)的环状CpGDNA。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂是在包含纳米颗粒、VLP、ISCOM或其他抗核酸酶递送运载体的配制品中施用的未修饰的天然CpG DNA。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该第一CPI是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合片段；并且该第二CPI是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂在施用该第一CPI之前施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂和该第一CPI实质性同时施用。
在某些实施方案中，该TLR9激动剂在施用该第一CPI之后施用。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤或选自下组的组织的癌性肿瘤，该组由以下各项组成：皮肤、头和颈、食管、胃、肝、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、子宫颈、卵巢、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑、肌肉和骨。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是黑色素瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是淋巴瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是骨髓的癌症。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是类癌瘤。
在某些实施方案中，该癌性肿瘤是神经母细胞瘤。
在某些实施方案中，该受试者是人。
在某些实施方案中，该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的放疗(XRT)。标准XRT剂量在1.8至2.2Gy/天的范围内，但是最近的研究表明，通过以3-20Gy/d的剂量使用XRT持续1-3天可以增加XRT对肿瘤的免疫效应。本领域的那些专家应认识到，不同的肿瘤具有不同的放射敏感性水平，并且将相应地调整XRT的量和强度。
在某些实施方案中，该放疗是放疗。
在某些实施方案中，该放疗是大分割放疗。
V.另外的组合疗法
本发明的方法可以与其他抗癌疗法(包括化疗、其他免疫疗法、放疗、激素疗法等)结合使用。已经基于以下简单概念开发了常规化疗剂和靶向抗肿瘤剂，即癌症构成细胞自主遗传或表观遗传疾病。然而，越来越清楚的是，许多已经共同挽救了数百万的生命年的可用的抗癌药物通过引起从头或重新激活预先存在的肿瘤特异性免疫应答来介导治疗效果。积累的证据表明，若干抗肿瘤剂的治疗疗效依赖于其影响肿瘤-宿主相互作用的能力，将平衡倾向于对恶性细胞具有特异性的免疫应答的激活。
例如，表1列出了某些FDA批准的其疗效由于免疫缺陷而减少的抗癌剂(ZitvogelL.et al.,Immunity 2013 39(1):74-88)。
表1。
Figure BDA0003163310790000891
Figure BDA0003163310790000901
表1缩写：APL，急性早幼粒细胞白血病；ATRA，全反式视黄酸；BRAF，B-Raf；GIST，胃肠道间质瘤；IFN，干扰素；IL，白介素；MCA，3-甲基胆蒽；NK，自然杀伤细胞；SCID，重度组合免疫缺陷的
VI.剂量方案
可以调整剂量方案以提供最适的所希望的应答。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧迫性所示的按比例减少或增加剂量。尤其有利的是将胃肠外组合物配制成剂量单位形式为了便于施用和剂量均匀。如本文所用的，剂量单位形式是指适合作为有待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需药物载体相关的所希望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下因素支配且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和有待实现的具体治疗或预防效果，和(b)调配这种活性化合物以用于治疗个体的敏感性的领域中固有的限制。
因此，基于本文提供的公开文本，技术人员应理解，剂量和施用方案根据治疗领域中熟知的方法进行调整。也就是说，可以容易地建立最大可耐受剂量，并且还可以确定向患者提供可检测的治疗益处的有效量，并且可以确定施用每种药剂以向该患者提供可检测的治疗益处的时间要求。因此，虽然在本文示例了某些剂量和施用方案，但这些例子决不限制在实践本发明中的可以向患者提供的剂量和施用方案。另外，一旦掌握了本文所提供的教导，本领域技术人员应理解，治疗益处(如但不限于肿瘤大小和/或转移的可检测减少和增加的复发时间等许多其他参数)可以通过本领域已知的用于评估癌症治疗疗效的多种方法来评估，并且这些方法以及在将来开发的方法被涵盖在本文中。
应当指出的是，剂量值可以随有待缓解的病症的类型和严重程度而变化，并且可以包括单个或多个剂量。应进一步理解的是，对于任何具体受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。例如，可以基于药代动力学或药效动力学参数来调整剂量，该参数可以包括临床效果如毒性作用和/或实验室价值。因此，本发明涵盖如由技术人员确定的患者内剂量递增。确定活性化合物或化合物的适当剂量和施用方案在相关领域是熟知的并且应被理解为一旦提供了本文公开的教导就被技术人员所掌握。
CpG ODN施用
根据本发明的方法，向癌性肿瘤局部地施用CpG ODN，即通过瘤内或瘤周施用。可替代地或另外，在某些实施方案中，通过例如腹膜内注射或输注或囊内滴注向癌性肿瘤局部地施用CpG ODN。
大多数用CpG的现有技术使用皮下而非瘤内或瘤周施用。肿瘤学中的瘤内疗法通常仅对原发病灶的治疗而言是优选的，在转移性疾病的情形下并不如此。原因在于大多数瘤内疗法仅具有局部作用。在一些不寻常的情况下，瘤内疗法可以导致远处的肿瘤块的消退，这是由于诱导针对不仅在注射的病变中而且在远处的转移瘤中存在的肿瘤抗原的特异性免疫应答的结果。在放疗(XRT)的情况下，这已经被称作如上所述的“远端效应”。一些作者已经注意到由TLR激动剂(包括瘤内TLR9)诱导了远端效应的情况(Brody et al,J.Clin.Oncol.2010 28(28):4324-4332；Kim et al.,Blood 2012 119(2):355-363)，但是这些应答尚不常见并且通常具有短暂的持续时间。
在CpG ODN施用之前施用的XRT的免疫效应将破坏正常地限制CpG诱导的应答的疗效的抑制机制，增加临床应答的潜力。另外，IFN-α在肿瘤中的产生已经与对XRT改进的应答相关并且为其所需(Burnette et al,Cancer Res.2011 71:2488-2496)，为从在XRT后使用瘤内高IFN CpG获益提供了另外的证据。
在一种形式中，本发明包括用于通过以下方式改进诱导来自XRT的远端应答的方法：向癌症患者施用XRT(优选大分割XRT)(如Prasanna et al.中所述的)并且然后在同一区域或淋巴引流中施用瘤内或瘤周诱导高IFN的CpG ODN。优选的瘤周注射与肿瘤在相同的淋巴引流中，以便于相同的APC既暴露于在XRT后向肿瘤释放的肿瘤Ag，又暴露于TLR配体。
瘤内或瘤周递送CpG ODN的方法不仅包括直接注射，还可以包括局部递送、针对腹部肿瘤(如卵巢的、胰腺的、结肠的或胃的)的腹膜内递送、针对眼睛恶性肿瘤的眼内递送、针对胃肠癌的口服递送以及针对膀胱癌的囊内施用。用于CpG ODN的瘤内施用还考虑了使用肿瘤递送运载体的系统递送，如肿瘤靶向适体、抗体缀合物、纳米颗粒、ISCOMS、VLP、多层囊泡、pH敏感肽和阳离子肽。
对于系统疗法，CpG ODN的施用可以基于体重、体表面积而变化，或使用固定剂量。对于瘤内或瘤周施用，CpG ODN的剂量典型地是固定的。当将CpG ODN与其他治疗剂(如本发明的CPI)组合地施用时，用于胃肠外(包括瘤内和瘤周)递送以诱导免疫应答的CpG ODN的剂量的范围典型地是每次施用从约1μg至100mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。
在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10μg至约100mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100μg至约100mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约100mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10mg至约100mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。
在又其他实施方案中，当将CpG ODN与其他治疗剂(如本发明的CPI)组合地施用时，用于胃肠外(包括瘤内和瘤周)递送以诱导免疫应答的CpG ODN的剂量的范围典型地是每次施用从约1μg至约50mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10μg至约50mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100μg至约50mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约50mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10mg至约50mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。
在又其他实施方案中，当将CpG ODN与其他治疗剂(如本发明的CPI)组合地施用时，用于胃肠外(包括瘤内和瘤周)递送以诱导免疫应答的CpG ODN的剂量的范围典型地是每次施用从约1μg至约10mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10μg至约10mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100μg至约10mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约10mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。
在又其他实施方案中，当将CpG ODN与其他治疗剂(如本发明的CPI)组合地施用时，用于胃肠外(包括瘤内和瘤周)递送以诱导免疫应答的CpG ODN的剂量的范围典型地是每次施用从约1μg至约1mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10μg至约1mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。在某些实施方案中，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100μg至约1mg，取决于应用，其可以每天、每周或每月以及之间的任何其他时间量施用。
对于上述每个固定剂量，在某些实施方案中，将以小于或等于约1mL的体积施用该剂量。在某些实施方案中，将以约0.1mL高达约1mL的体积施用该剂量。在其他实施方案中，该剂量体积将高达4mL，其常用于瘤内注射某些溶瘤病毒，如talimogene laherparepvec(T-vec)。
在本发明的某些实施方案中，持久的释放递送系统(包括例如纳米颗粒、ISCOMS、VLP和树枝状大分子)(概述于例如Gomes Dos Santos AL et al.,Curr PharmBiotechnol.2005 6(1):7-15；Joshi VB et al.,AAPS J.2013 15(1):85-94；和Arima Het al.,Curr Top Med Chem.2014 14(4):465-77中)可以用于施用单个瘤内或瘤周治疗剂量的CpG ODN。在本发明的某些实施方案中，持久的释放递送系统(包括例如纳米颗粒、ISCOMS、VLP和树枝状大分子)可以用于施用单个瘤内或瘤周治疗剂量的CpG ODN而无需另外的CpG ODN。
如本领域熟知的，当使用良好描述于文献中的任何类型的持久的递送系统时，个体剂量是增加的。
在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约0.1mg至约500mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约500mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10mg至约500mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100mg至约500mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。
在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约0.1mg至约250mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约250mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10mg至约250mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约100mg至约250mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。
在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约0.1mg至约100mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约1mg至约100mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。在某些实施方案中，使用单次施用的CpG ODN的持久释放配制品，用于瘤内和瘤周递送的CpG ODN的受试者剂量的范围典型地是每次施用从约10mg至约100mg，并且在XRT的一周内将其施用；在检查点抑制剂的一周内将其施用；或在XRT和检查点抑制剂两者的一周内将其施用。
使用本领域技术人员熟知的标准测定和方法可以容易地产生所施用剂量的CpGODN的所希望的临床效果。例如，可以如在本文的其他地方所述的测量对TLR9刺激的生物标记物应答。
CPI抗体剂量给药
某些可商购的抗PD-1抗体目前在美国被批准用于以2mg/kg体重每三周一次静脉内输注施用。其他可商购的抗PD-1抗体目前在美国被批准用于以3mg/kg体重每两周一次静脉内输注施用。可商购的抗CTLA-4抗体目前在美国被批准用于以3mg/kg体重每三周一次静脉内输注施用。
根据本发明的方法，在某些实施方案中，至少部分地系统地(例如，静脉内地)施用CPI抗体。
根据本发明系统地施用的CPI抗体的治疗有效量的示例性的非限制性剂量是至少约0.1mg/kg体重、至少约0.3mg/kg体重、至少约0.5mg/kg体重、至少约1mg/kg体重、至少约2mg/kg体重、至少约3mg/kg体重、至少约4mg/kg体重、至少约5mg/kg体重和至少约6mg/kg体重。
在某些实施方案中，系统地施用的CPI抗体的治疗有效量的范围可以是从约0.1至约30mg/kg体重、约0.3至约25mg/kg体重、约1至约20mg/kg体重、约2至约20mg/kg体重、约3至约20mg/kg体重、约5至约20mg/kg体重、约10至约20mg/kg体重、约1至约15mg/kg体重、约2至约15mg/kg体重、约3至约15mg/kg体重、约5至约15mg/kg体重、约10至约15mg/kg体重、约1至约10mg/kg体重、约2至约10mg/kg体重、约3至约10mg/kg体重或约5至约10mg/kg体重。
在某些实施方案中，该CPI抗体以至少约0.3mg/kg体重、至少约1mg/kg体重、至少约2mg/kg体重、至少约3mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约6mg/kg体重、至少10mg/kg体重、至少约15mg/kg体重或至少约20mg/kg体重的剂量系统地施用。
在某些实施方案中，该CPI抗体以范围从约0.1至约50mg/kg体重、从约0.3至约20mg/kg体重、从约1至约15mg/kg体重、从约2至约15mg/kg体重、从约3至约15mg/kg体重或从约6至约15mg/kg体重的剂量通过静脉内(i.v.)输注来施用。
在某些实施方案中，该CPI抗体作为适当的缓冲系统中的含有约5至约20mg/mL的CPI抗体的无菌水性溶液在静脉内配制品中来施用。
根据本发明的方法，在某些实施方案中，向癌性肿瘤至少部分地局部地施用CPI抗体，即通过瘤内或瘤周施用。在某些实施方案中，这样的局部施用是通过直接注射，而在其他实施方案中，这样的施用可以是局部递送、针对腹部肿瘤(如卵巢的、胰腺的)的腹膜内递送、针对眼睛恶性肿瘤的眼内递送、针对胃肠癌的口服递送以及针对膀胱癌的囊内施用。用于CPI抗体的瘤内施用还考虑了使用肿瘤递送运载体的系统递送，如肿瘤靶向适体、纳米颗粒、ISCOMS、VLP和阳离子肽。
对于局部(即，瘤内或瘤周)施用，该CPI抗体可以有利地以比上文刚刚列出的系统剂量低约10倍至低约20倍的剂量来施用。
根据本发明，CPI抗体施用将典型地比CpG ODN施用较不频繁。例如，抗PD-1抗体可以约每三周一次至约每三个月一次来施用。类似地，抗PD-L1抗体可以约每三周一次至约每三个月一次来施用。类似地，抗CTLA-4抗体可以约每三周一次至约每三个月一次来施用。本发明进一步具体地考虑了比约每三周一次更频繁的和比约每三个月一次更不频繁的CPI抗体施用。
瘤内或瘤周CpG和系统CPI可以在同一天或不同天施用。例如，瘤内或瘤周CpG和静脉内抗PD-1或抗PD-L1可以在同一天或不同天施用。
另外，关于CpG ODN、CPI抗体或CpG ODN和CPI抗体两者，示例性的剂量递增方案可以用于确定最大耐受剂量(MTD)、评估与CpG ODN-CPI抗体组合疗法的施用相关的剂量限制性毒性(DLT)(如果有的话)。例如，关于给定剂量的CpG ODN下的CPI抗体剂量递增，这样的方案可以包括施用增加的剂量，如但不限于约0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg或多于15mg/kg或其任何组合，更优选地施用0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg的连续剂量并且针对毒性(如果有的话)以及治疗疗效等其他参数对患者进行评估。用于确定剂量方案的毒性和疗效的此类研究是本领域熟知的。参见例如，MillwardM.et al.,Br.J.Cancer 2013 108(10):1998-2004。
VII.药物组合物
在某些实施方案中，将该CpG ODN与有助于施用入有待治疗的肿瘤中和/或与该肿瘤邻近的CpG ODN的可视化的标记物(例如，不透射线的标记物或染料)一起配制。可替代地，该CpG ODN共价地缀合至如下化合物或以另外的方式用其标记，该化合物使得可以检测施用部位。此类标记的例子是本领域熟知的，并且包括荧光染料、适体、荧光RNA如spinach及其衍生物、量子点、金和其他纳米颗粒、抗体等。
CpG ODN可以直接地施用于受试者或可以与核酸递送复合物结合地施用。核酸递送复合物应当意指与靶向工具(例如，导致与靶细胞的亲和力结合更高的分子)结合(例如，离子键地或共价地与其结合；或封装在其中)的核酸分子。核酸递送复合物的例子包括与固醇(例如胆固醇)、脂质(例如，阳离子脂质、病毒体或脂质体)或靶细胞特异性结合剂(例如，靶细胞特异性受体所识别的配体)结合的寡核苷酸。优选的复合物在体内可以是足够稳定的以防止在被靶细胞内化之前显著的解偶联。然而，该复合物在适当的条件下在细胞内可以是可切割的，使得该核酸以功能形式被释放。
已经描述了用于向表面递送寡核苷酸和/或抗原的递送运载体或递送装置。该CpGODN和/或该抗原和/或其他治疗可以单独地(例如，在盐水或缓冲液中)或使用本领域已知的任何递送运载体来施用。例如，已经描述了以下递送运载体：螺旋体(Cochleate)；乳脂体，ISCOM；脂质体；活细菌载体(例如，沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)、志贺氏菌属(Shigella)、乳杆菌属(Lactobacillus))；活病毒载体(例如，牛痘、腺病毒、单纯疱疹)；微球；寡核苷酸疫苗；聚合物；聚合物环；蛋白体；氟化钠；转基因植物；病毒体；病毒样颗粒和阳离子脂质、肽或具有与聚阴离子寡核苷酸电荷相互作用的其他载体。其他递送运载体是本领域已知的并且在下文的载体讨论中提供了一些另外的例子。
在一个实施方案中，该CPI在水性溶液中胃肠外地(例如，静脉内地)施用，而该CpGODN通过瘤内或瘤周注射来施用。CpG ODN的优选配制品和剂型描述于美国专利申请公开号US 2004/0198680中，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。然而，基于本文提供的公开文本，技术人员应理解，本发明不限于这些或任何其他配制品、剂量、施用途径等。因此，以下讨论描述了用于实践本发明方法的包含与CpG ODN组合的任何CPI抗体的施用的多种配制品，但是本发明并不限于这些配制品，而是包括一旦掌握了本文所提供的教导可以由本领域技术人员容易地确定的用于本发明的方法的任何配制品。
可以将本发明中利用的抗体掺入适于向受试者施用的药物组合物中。典型地，该药物组合物包含该抗体和药学上可接受的载体。如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、海藻糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选的是将等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包括在该组合物中。药学上可接受的物质如润湿或少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强该抗体或抗体部分的保质期或有效性。
该抗体可以处于多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和难溶溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的优选组合物处于可注射或难溶溶液的形式，如类似的用于用其他抗体被动免疫人类的那些的组合物。优选的施用方式是胃肠外的(例如，静脉内的、皮下的、腹膜内的、肌内的)。在优选的实施方案中，该抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个优选的实施方案中，该抗体通过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物典型地必须在制造和储存条件下是无菌且稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。按照需要，可以通过将抗体以需要的量掺入具有以上列举的成分之一或组合的适当溶剂中，随后进行无菌过滤来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备分散体，该无菌运载体含有基础分散介质和来自以上列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何另外的所希望的成分的粉末。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐和明胶的延迟吸收的药剂来实现注射组合物的延长的吸收。
该CpG ODN可以通过本领域已知的多种方法来施用，包括而不限于局部注射或输注进肿瘤和/或与该肿瘤邻近。如本文所用的，“进肿瘤”或“瘤内”意指总体上在肿瘤的边缘内的任何地方。如本文所用的，“与肿瘤邻近”或“瘤周”意指总体上在肿瘤的边缘周围约2.5cm厚区域的任何地方。本发明还考虑了在手术切除肿瘤后将该CpG ODN局部注射或输注进肿瘤床和/或与肿瘤床邻近。如果希望的话，可以利用无针注射。在某些实施方案中，该CpG ODN可以通过吸入或支气管肺泡灌洗而向肺局部地施用。如技术人员所理解的，施用途径和/或施用方式将取决于所希望的结果而变化。
该CPI可以通过本领域已知的多种方法来施用，包括而不限于口服、胃肠外、经粘膜、吸入、局部、经颊、经鼻和经直肠。对于某些治疗应用，优选的施用途径/方式是皮下、肌内或静脉内输注。如果希望的话，可以利用无针注射。如技术人员所理解的，施用途径和/或施用方式将取决于所希望的结果而变化。
可以调整剂量方案以提供最适的所希望的应答。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧迫性所示的按比例减少或增加剂量。尤其有利的是将胃肠外组合物配制成剂量单位形式为了便于施用和剂量均匀。如本文所用的，剂量单位形式是指适合作为有待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需药物载体相关的所希望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下因素支配且直接取决于以下因素：(a)抗体的独特特征和有待实现的具体治疗或预防效果，和(b)调配这种活性化合物以用于治疗个体的敏感性的领域中固有的限制。
应当指出的是，剂量值可以随有待缓解的病症的类型和严重程度而变化，并且可以包括单个或多个剂量。应进一步理解的是，对于任何具体受试者，可以根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。
在一个实施方案中，该抗体作为pH范围从约5至6的含有5或10mg/mL的抗体与乙酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠的无菌水性溶液在静脉内配制品中来施用。优选地，该静脉内配制品是pH 5.5的含有5或10mg/mL的抗体与20mM乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨醇酯80和140mM氯化钠的无菌水性溶液。
在一个实施方案中，该剂量的一部分通过静脉内推注来施用并且剩余剂量通过输注该抗体配制品来施用。例如，该抗体的0.01mg/kg静脉内注射剂可以作为推注开施用，并且剩余的预定抗体剂量可以通过静脉内注射来施用。预定剂量的抗体可以例如经一个半小时到两个小时到五个小时的时间来施用。
本文描述的药物组合物的配制品可以通过已知的或药理学领域中以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合并且然后将产品成型或包装成所希望的的单剂量或多剂量单位(如果需要或希望的话)的步骤。
本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量来批量制备、包装或销售。如本文所用的，“单位剂量”是离散量的包含预定量的活性成分的药物组合物。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量或这种剂量的方便分数(例如，这种剂量的一半或三分之一)。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、大小和状况并且还取决于施用该组合物的途径而变化。通过举例，该组合物可以包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
除活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种另外的药物活性剂。具体考虑的另外的药剂包括止吐药、止泻药、化疗药、细胞因子等。
本发明的药物组合物的受控释放或持久释放配制品可以使用常规技术来制备。
如本文所用的，药物组合物的“胃肠外施用”包括由物理破坏受试者的组织表征的施用和通过组织的伤口施用药物组合物的任何途径。因此，胃肠外施用包括但不限于通过注射组合物、通过经手术创口应用组合物、通过经组织穿透性非手术创口应用组合物等来施用药物组合物。具体而言，将胃肠外施用考虑为包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脑池内和肾透析输注技术。
适于胃肠外施用的药物组合物的配制品包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类配制品能以适于推注施用或适于连续施用的形式来制备、包装或销售。可注射配制品能以单位剂型如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中来制备、包装或销售。用于胃肠外施用的配制品包括但不限于如下文所讨论的悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂以及可植入的持久释放或可生物降解的配制品。此类配制品可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外施用的配制品的一个实施方案中，该活性成分被提供为干燥(例如，粉末或粒状)形式用于在胃肠外施用所重构的组合物之前用适合的运载体(例如，无菌无热原水)进行重构。
本发明的组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所希望的结果而变化。该活性化合物可以用将保护该化合物免于快速释放的载体来制备，如受控释放配制品，包括植入物、经皮贴片和微囊化递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备此类配制品的许多方法由例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1978)进行了描述。药物组合物优选地在GMP条件下制造。
该药物组合物能以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式来制备、包装或销售。此悬浮液或溶液可以根据本领域已知的来配制，并且除活性成分之外，还可以包含另外的成分，如本文描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。例如，此类无菌可注射配制品可以使用无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(如水或1,3-丁二醇)来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油如合成甘油单酯或甘油二酯。其他有用的胃肠外可施用的配制品包括包含处于微晶形式的、脂质体制剂中的或作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可以向动物(优选哺乳动物，更优选人)施用本发明的CpG ODN和CPI活性成分组分。每种活性成分施用的精确剂量将取决于任何数量的因素而变化，包括但不限于所治疗的动物的类型和疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。
本发明的CpG ODN和CPI活性成分组分可以与任何众多其他化合物(尤其是抗激素治疗剂、细胞因子、抗细胞因子抗体或抗细胞因子受体抗体、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)抑制剂、化疗药物、抗生药物和/或抗病毒药物)共施用。可替代地，这样的其他化合物可以在该CpG ODN–CPI组合之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更久施用，或其任何排列。另外，这样的其他化合物可以在施用放射、干细胞移植或施用任何治疗剂(例如，细胞因子、化疗化合物等)之后一小时、一天、一周或甚至更久施用，或其任何排列。频率和施用方案对技术人员而言将是显而易见的并且将取决于任何数量的因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状况、所施用的该化合物或化合物的特性、不同化合物的施用途径等。提供了若干展示共施用CpG ODN–CPI组合以治疗癌症的方法的指导性例子，但是本发明决不限于这些例子，它们仅用于说明本发明所涵盖的方法。
VIII.试剂盒
本发明包括用于治疗癌症的多种试剂盒。该试剂盒包含治疗有效量的CpG ODN和治疗有效量的CPI连同描述该组合的使用以执行本发明方法的说明材料。在某些实施方案中，该试剂盒包含治疗有效量的CpG ODN和治疗有效量的CPI抗体连同描述该组合的使用以执行本发明方法的说明材料。尽管下文描述了示例性试剂盒，但其他有用的试剂盒的内含物鉴于本公开文本对于技术人员而言将是明显的。每种这些试剂盒都被包括在本发明内。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含CpG ODN和抗PD-1抗体的任何组合的试剂盒。虽然此试剂盒是优选的，但本发明不限于这种具体组合。另外，该试剂盒可以包含众多的另外的用于治疗癌症的药剂。此类药剂在先前进行了陈述并且尤其包括化疗化合物、癌症疫苗、不同于CpG ODN的TLR激动剂、其他CpG ODN、受体酪氨酸激酶抑制剂(如但不限于SU11248)、有用于治疗异常细胞生长或癌症的药剂、通过结合至IGF-1R抑制肿瘤生长的抗体或其他配体、化疗剂(尤其是紫杉烷、长春花生物碱、铂化合物、嵌入抗生素)和细胞因子以及用于处理例如治疗期间产生的任何毒性的姑息剂(如但不限于止泻药、止吐药等)。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含CpG ODN和抗PD-L1抗体的任何组合的试剂盒。虽然此试剂盒是优选的，但本发明不限于这种具体组合。另外，该试剂盒可以包含众多的另外的用于治疗癌症的药剂。此类药剂在先前进行了陈述并且尤其包括化疗化合物、癌症疫苗、不同于CpG ODN的TLR激动剂、其他CpG ODN、受体酪氨酸激酶抑制剂(如但不限于SU11248)、有用于治疗异常细胞生长或癌症的药剂、通过结合至IGF-1R抑制肿瘤生长的抗体或其他配体、化疗剂(尤其是紫杉烷、长春花生物碱、铂化合物、嵌入抗生素)和细胞因子以及用于处理例如治疗期间产生的任何毒性的姑息剂(如但不限于止泻药、止吐药等)。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含CpG ODN和抗CTLA-4抗体的任何组合的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒用于经由瘤内或瘤周途径每周一起施用的两种药剂持续一个疗程。当通过瘤内或瘤周施用替代系统施用来递送该抗CTLA-4抗体时，该剂量如本领域技术人员所熟悉的调整：瘤内抗CTLA-4抗体的优选剂量作为固定剂量来施用，通常在从0.1mg至10mg的范围内，并且最优选地在从1mg至5mg的范围内。疗程的持续时间可以如本领域标准的变化，但是持续时间将典型地是至少12周。只要患者不发生严重的毒性并且继续具有可测量的肿瘤，治疗便可以继续，甚至持续若干年的时间。也涵盖药物假期和治疗中断。治疗中断可以是1周、2周或更长，并且可以每个月或更不经常地提供，或取决于患者耐受来提供。虽然此试剂盒是优选的，但本发明不限于这种具体组合。另外，该试剂盒可以包含众多的另外的用于治疗癌症的药剂。此类药剂在先前进行了陈述并且尤其包括化疗化合物、癌症疫苗、不同于CpG ODN的TLR激动剂、其他CpG ODN、受体酪氨酸激酶抑制剂(如但不限于SU11248)、有用于治疗异常细胞生长或癌症的药剂、通过结合至IGF-1R抑制肿瘤生长的抗体或其他配体、化疗剂(尤其是紫杉烷、长春花生物碱、铂化合物、嵌入抗生素)和细胞因子以及用于处理例如治疗期间产生的任何毒性的姑息剂(如但不限于止泻药、止吐药等)。
现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅为了说明的目的而包含在本文中并不旨在限制本发明。
实施例
实施例1
为了实现CpG ODN和检查点抑制剂(+/-XRT)的组合的最佳协同作用，该CpG ODN应当设计成诱导可能的最高水平的I型IFN与可能的最低水平的IL-10。在上文描述的CpG ODN类别中，最接近这个理想的是A类。为了改进A类ODN，它们可以依据两种半独立的组分来理解：(i)A类CpG ODN的5’和3’末端，和(ii)核心回文。5’和3'末端中的polyG结构域的目的是形成自组装成纳米颗粒的G四联体，将回文以有利于激活TLR9的方式定位并且在早期内涵体中提供非常强的TLR9多聚化，导致强烈的IRF3/7激活(和下游IFN-α分泌)而不触发导致B细胞激活和强烈的IL-10产生的更持久的信号。由polyG结构域形成的G四联体还可以通过与清道夫受体和结合G四联体的其他细胞表面受体相互作用来帮助在细胞外稳定ODN并改善ODN向树突细胞(DC)和其他APC中的摄取。polyG结构域通常在5’和3'端具有一个或几个PS键联，但是这并不为高水平刺激pDC IFN-α分泌所需，尤其是如果剂量增加的话，或者使用稳定化配制品(如纳米颗粒、VLP、ISCOM等)递送ODN的话。回文的目的是在细胞外形成双链体，稳定将被靶DC有效地吸收到内涵体中并且然后以瞬时方式激活TLR9以诱导IRF3/7而不诱导强烈的NF-κB激活的结构。
A类ODN的5’和3'末端的优化
1.G的数量。描述于现有技术中的A类ODN几乎总是在两端或至少在一端含有5个或更多个连续的G。然而，这并不为ODN活性所需，并且实际上包括更少的G使ODN更容易合成并且不必然地显著影响所诱导的IFN-α的量。根据本发明，某些优选的A类ODN在一端或两端具有4个G，而其他优选的A类ODN在ODN的5'和3'端或至少在3'端具有多于6个G、10个G或多于10个G。
2.硫代磷酸酯(PS)键联的数量。描述于现有技术中的一些A类ODN根本不含硫代磷酸酯键联，但是通常它们在ODN的5'端具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键联并且在3'端有五个。虽然这些硫代磷酸酯键联的确在一定程度上针对核酸酶稳定ODN并且增加蛋白质结合和细胞表面摄取，但它们也引入手性中心并增加制造复杂性。本发明的某些优选的A类ODN在5'端含有0个、1个或2个PS键联，并且在3'端含有2个、3个或4个PS键联。在某些实施方案中，本发明的优选A类ODN在5'端含有1个或2个PS键联，并且在3'端含有2个、3个或4个PS键联。
3.硫代磷酸酯(PS)键联的手性。当公开于现有技术中的A类ODN具有PS键联时，它们总是立体随机的。然而，两种立体异构体对TLR9信号传导具有完全不同的免疫效应，如先前公开的(Krieg AM et al.,Oligonucleotide 2003 13(6):491-9)。改进的A类CpG可以在polyG结构域内的每个位置处全部具有R手性，全部具有S手性，或具有指定的R和S手性。当CpG ODN含有任何PS键联时，优选地至少CpG ODN的3’端具有Sp键联，这是由于它对核酸酶降解的抗性较大。
A类CpG ODN的回文的优化
1.脱氧腺苷核苷酸的定位。优选的回文含有至少一个，并且优选地两个或更多个脱氧腺苷。这些优选地位于回文的5'半，结果是互补的胸苷位于优选回文的3’半(除了当胸苷被卤素修饰时，如下文的点3中所述的，优选的回文可以在回文的5'或3'或两个区域中具有脱氧腺苷或胸苷)。
2.CpG二核苷酸的位置。优选的回文含有至少一个之前是5’T的CpG二核苷酸和/或至少一个之前是5’A的CpG二核苷酸。
3.胸苷核苷的修饰。我们在本发明中已经定义了一种新的类型的A类CpG ODN，我们现在称之为A/E类CpG ODN，其不仅含有上文列出的新颖的设计特征，还含有先前描述为E类CpG ODN的对一个或多个胸苷核苷的修饰，如美国专利号8,580,268和美国公开申请2014/0163213中所述的。确切地，本发明的优选A/E类CpG ODN在回文中含有经卤素修饰的尿嘧啶代替一个或多个胸苷。经卤素修饰的尿嘧啶最优选地是5-碘代-2’-脱氧尿苷(“I”)，但是也可以是5-溴代-2’-脱氧尿苷或5-氯代-2’-脱氧尿苷。
优选的A类CpG ODN的例子是：
ggGGGACGAGCTCGTCgggggG(SEQ ID NO:80)；
ggGGGACGATCGTCGgggggG(SEQ ID NO:58)；
ggGGACGATCGAACGTgggggG(SEQ ID NO:81)；
ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG(SEQ ID NO:78)；以及
ggGGACGACGTCGTGgggggG(SEQ ID NO:79)，
其中每个小写字母表示由硫代磷酸酯(PS)键联连接至其3’-相邻核苷酸的核苷酸；并且每个大写字母表示由磷酸二酯(PO)键联连接至其3’-相邻核苷酸(如果存在的话)的核苷酸，例外的是3’-末端核苷酸由大写字母表示，因为它没有3’-相邻核苷酸。
优选的新颖的A类CpG ODN序列的例子是：
Figure BDA0003163310790001061
Figure BDA0003163310790001071
其中再一次每个小写字母表示由硫代磷酸酯(PS)键联连接至其3’-相邻核苷酸的核苷酸；并且每个大写字母表示由磷酸二酯(PO)键联连接至其3’-相邻核苷酸(如果存在的话)的核苷酸，例外的是3’-末端核苷酸由大写字母表示，因为它没有3’-相邻核苷酸。
优选的新颖的A/E类CpG ODN序列的例子是：
Figure BDA0003163310790001072
Figure BDA0003163310790001081
Figure BDA0003163310790001091
其中“I”表示5-碘代-2’-脱氧尿苷；每个小写字母表示由硫代磷酸酯(PS)键联连接至其3’-相邻核苷酸的核苷酸；并且每个大写字母表示由磷酸二酯(PO)键联连接至其3’-相邻核苷酸(如果存在的话)的核苷酸，例外的是3’-末端核苷酸由大写字母表示，因为它没有3’-相邻核苷酸。
本发明的优选CpG ODN将使用本领域熟知的以及上文描述的标准方法来合成。将使用体外剂量应答测定在人类外周血单核细胞(PBMC)上针对IFN-α和IL-10分泌评价ODN的活性，如A类和E类专利(例如，针对IFN-α的美国专利号8,580,268的图27，和针对IL-10的美国专利号7,795,23的图27)中所述的。因为人类在对TLR9刺激的IFN-α应答的幅值上显示出个体间差异，将测试来自最少3个不同个体的PBMC用于所有细胞因子、趋化因子和IFN测定。新鲜收集的PBMC对于最大应答性是强烈优选的-在24hr之后，对TLR9连接的体外应答的幅值将显著降低。典型地在人类PBMC上以从大约0.1μM至大约10μM的浓度测试A类CpG ODN。在大约24、48或72hr之后收集上清液并且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他标准测定针对IFN-α和/或其他IFN诱导的趋化因子和细胞因子的量对其进行测试(通常该测定仅测量许多IFN-α亚型中的一种或多种)。
本发明的优选A类和A/E类CpG ODN在该测定中在最有效的浓度下将诱导平均大于1000pg/ml的IFN-α(在这方面效力与峰值疗效相比较不重要)或更优选地大于3,000pg/ml的IFN-α并且最优选地大于10,000pg/ml的IFN-α；在任何情况下，优选的ODN诱导比阳性对照B类CpG ODN诱导的IFN-α大至少10倍的产量。也使用类似的ELISA测定针对IL-10分泌测试了来自相同实验的上清液。本发明的优选A或A/E类ODN在这些测定条件下将诱导小于1000pg/ml，优选地小于300pg/ml，并且最优选地小于100pg/ml的IL-10分泌。
然后将使用本领域熟知的标准系统在小鼠肿瘤模型中评价选自这些体外测定的最优选CpG ODN。小鼠测定不是用于选择有待进入人类临床试验的最具活性的ODN，因为ODN的秩序将不同，这是小鼠与人类TLR9之间的结构差异以及表达TLR9的细胞类型的物种特异性差异的结果。由于这些原因，对进入人类临床试验的首选候选CpG ODN的初选将基于来自使用人类细胞的体外测定的结果。
实施例2
进行体外实验以检查回文序列的变化、5’和3’G的数量、5’和3'硫代磷酸酯核苷酸间键联的数量和回文内的5-碘代-2’-脱氧尿苷的取代对人类外周血单核细胞(PBMC)的IFN-α分泌的影响。
将来自正常人类供体的PBMC在存在或不存在指示的ODN下一式三份地进行培养，并且将两名不同人类供体的结果在图4和5中绘为平均值+/-标准差(SD)。将PBMC在histopaque-1077(西格玛公司(Sigma))上分离并在96孔U型底组织培养板中以1.25x106/mL，220μL/孔在RPMI 1640(10％FBS，谷氨酰胺，Pen/Strep)中铺板。加入ODN至5、1或0.2μg/mL的终浓度(图4)或以0.5μg/mL的最低浓度加入(图5)并且将细胞孵育48小时。然后将细胞旋下并且将上清液转移到新板中并在-20℃下冷冻直到使用。随后将上清液解冻并且遵循制造商的说明书用于IFN-αELISA(PBL Verikine人类IFN-α)。
表2。制备并测试的组1CpG-A寡核苷酸
Figure BDA0003163310790001101
Figure BDA0003163310790001111
#1(ODN 2006)是对照CpG-B
#2(ODN 2216)是对照CpG-A
#34(ODN SD-101)是对照CpG-C
##3-23是新颖的A类寡核苷酸
##24-33是含有5-碘代-2’-脱氧尿苷(“I”)的CpG-A寡核苷酸
小写字母＝PS键联(其他是PO)
来自这组实验的数据表明：
寡核苷酸的3'端上大于四个G赋予良好活性：将例如ODN 2247a-c(五个或更多个3’G)与ODN 2247d(在3'端上有四个4G)进行比较。
3'端上的五个G可能次于六个G(将具有5G的ODN 2334d与具有六个或更多个3'G的ODN 2334a-c进行比较)。
在5'端上存在一个还是两个PS键联没关系：将ODN 2334b(2个PS)与ODN 2334c(1个PS)进行比较。
5'端上一个PS键联在至少一些情况下优于5'端上有两个PS：ODN 2336c是仅有的具有两个5'PS键联的2336版本并且对于IFN-α诱导而言似乎弱于其他具有一个PS的版本。
只要在3'端存在至少五个G，3'端上有三个PS似乎刚刚和四个PS一样强：将ODN2336a和2336e(在3'端有三个PS)与分别具有五个或四个PS的ODN 2336b和2336d进行比较。
不管其他要素，ODN 2301中存在的回文是弱的(但仍强于CpG-B)：因此并非所有回文都很好地发挥作用。
回文内有一个或两个卤素取代在CpG-A中耐受良好，但是不增加IFN-α诱导活性(例如，将ODN 2329a与2329b、c、d进行比较；或将ODN 2336a与2336b进行比较；或将ODN2216与2216a进行比较)。
实施例3
进行体外实验以检查回文序列的变化、5’和3'硫代磷酸酯核苷酸间键联的数量、病毒样颗粒(VLP)中天然DNA CpG-A ODN的配方和CpG-A ODN的3’端内的2-O-甲基糖的取代对效力和人类PBMC的峰值IFN-α分泌的影响。
实验条件总体上是如实施例2中的，除了在这种情况下，对于除两个样品以外的所有ODN，将指示的ODN在5μg/mL(图6和7中的浓度或“浓度A”)、1μg/mL(图6和7中的“浓度B”)和0.5μg/mL(“浓度C”)的浓度下一式三份地与PBMC一起培养：
1.将完全地PO ODN G10(在图6和7中标记为“CYT003”)在50μg/mL(图6和7中的“浓度A”)、10μg/mL(“浓度B”)和2μg/mL(“浓度C”)的ODN浓度下进行培养；以及
2.在图6和7中标记为“CytQbAb”的样品含有在病毒样颗粒内包装的G10 ODN，该病毒样颗粒包含如由Cytos在名称CYT003或QbG10下先前描述的且由Cytos赞助的在名称CYT003或QbG10下处于临床开发中的噬菌体蛋白Qb(Beeh et al.,J Allergy ClinImmunol 2013；131:866-74)连同抗Qb抗体以有助于将VLP摄取进免疫细胞中。将这些样品中的VLP在50μg/mL(图6和7的“浓度A”)、10μg/mL(“浓度B”)和2μg/mL(“浓度C”)下像G10一样地进行培养，但是由于该剂量是基于整个VLP的，仍只有20％的质量的VLP包含G10，所以每个孔中G10的实际质量更接近于10μg/mL(图6和7中的“浓度A”)、2μg/mL(“浓度B”)和0.5μg/mL(“浓度C”)。
表3。制备并测试的组2CpG-A寡核苷酸
Figure BDA0003163310790001131
#1(ODN 2216)是对照CpG-A
##2-13是新颖的A类寡核苷酸
小写字母＝PS键联(其他是PO)
mG＝2’-O-甲基G
mT＝2’-O-甲基T
来自这组实验的数据表明：
在3’端有少于三个PS键联并且在5'端没有PS键联在最高ODN浓度下导致CpG-A的效力严重降低，但是可得到的峰值IFN-α诱导没有明显降低(将ODN 2336a和2336a1(分别在3'端具有三个或四个PS键联)诱导的非常强的IFN-α(甚至在仅0.5μg/mL下仍是可检测的)与由分别具有2个、0个或1个PS键联的ODN 2336a2、2336PO和2336ST诱导的非常类似的峰值水平的IFN-α进行比较)。
在5'端具有多于一个PS并且在3'端具有三个PS没有明显效力优势(将ODN 2336c与2336e之间的类似的活性水平进行比较，在两端具有一个PS键联的差异)。
ODN 2329(TCGTCGACGA)(SEQ ID NO:524)中的回文与ODN 2216(GACGATCGTC)(SEQID NO:525)或ODN 2336系列(ACGACGTCGT)(SEQ ID NO:526)中的回文相比对于IFN-α诱导似乎效力较低。
基于像ODN 2329中的一样的效力较低的回文的CpG-A ODN可以经受效力的相应地较大的降低，如果5’和3'端的PS键联的数量减少的话(将ODN 2329a与2329a1进行比较，具有减少的PS键联)。
在CpG-A ODN的5'和/或3'端有一个或多个2'-O-甲基碱基的取代导致效力和可得到的峰值IFN-α诱导严重降低(将2-O-甲基取代的ODN 2336m1、2336m2和2336mU与ODN 2336的原始未甲基化版本进行比较)。
伴随任何ODN所见的最高峰值IFN-α诱导来自G10(图6中的“CYT003”)以及来自含有G10的VLP(图6中的“CytQbAb”)。由于G10是根本不含PS修饰的天然DNA，这表明PS修饰并不为IFN-α诱导所需，只要使用较高浓度的CpG-A ODN，或者ODN以保护它免于核酸酶的方式(如在VLP中)包装或递送即可，如在本实验中使用的。VLP包装似乎大大地增加CpG-A ODN效力，因为“裸”G10(“CYT003”)的剂量应答非常类似于VLP内包装的G10，但是后者仅含有约20％的ODN质量。
根据本发明，CpG-B(“2006”)和CpG-C(SD-101”)对照ODN的IL-10诱导显著高于任何CpG-A ODN的(图7)。这支持使用本发明的瘤内注射的CpG-A ODN用于局部的IL-10诱导(例如，被CpG-B ODN)是不令人希望的癌症免疫疗法。
实施例4
进行体外实验以检查与天然DNA(PO)相比具有二硫代磷酸酯(PS2)或硫代磷酸酯(PS)的CpG-A ODN骨架的变化对效力和正常人类PBMC的峰值IFN-α分泌的影响。
实验条件总体上是如实施例2中的，除了在这种情况下，将指示的ODN在0.5μg/mL或5μg/mL的浓度下一式三份地与PBMC一起培养72小时。
表4。制备并测试的组3CpG-A寡核苷酸
Figure BDA0003163310790001151
#＝二硫代磷酸酯(PS2)核苷酸间键联
来自这组实验的数据表明(图8)：
在5’和3'端含有一个或两个PS2修饰的CpG-A ODN(例如，ODN AF185A和H)大致与PO(G10)或PS端(ODN 2216在5’和3'端具有PS键联)一样有效。
与在polyG内的一端没有PS2或在两端没有PS2相比，回文内的PS2严重降低活性。
有可能的是由于增加的蛋白质结合和核酸酶抗性，PS2端可能被证明在体内优于PO或PS。
实施例5
进行体外实验以检查减少G10 CpG-A ODN的5'和/或3'端的G的数量或改变回文同时保持骨架天然DNA的影响。
实验条件总体上是如实施例2中的，除了在这种情况下，将指示的ODN(表5)在2.5μg/mL的浓度下与PBMC一起一式两份培养48hr。
表5。制备并测试的组4CpG-A寡核苷酸
Figure BDA0003163310790001161
#1G10变体：5'端减少了G
#2G10变体：3'端减少了G
#3G10变体：两端减少了G
#4TCGGTC回文
#5GACGAG回文
#6GACGA回文
#7TCGACGTC
#8ACGAC
#9AACGAC
#10ACGACGACGA(SEQ ID NO:548)
#11CACGAC
#12SD-101回文
#13SD-101b
#14TTCGAAC
#15GACGTC
#16GTCGAC
#17ACGTCGACGT(SEQ ID NO:549)
#18TACGAT低CG
#19TACGCT
#20GACGTC
#21GC对照
来自这组实验的数据表明：
减少G10的5'和/或3'端的G的数量(如1-3中的，表5)减少IFN-α表达的诱导(图9)而不减少IP-10诱导(图10)。
当在5’和3'端侧翼有10个G时，几乎所有的新回文都诱导优于CpG-B(ODN 2006)的IFN-α和IP-10分泌，但未必优于对照CpG-C(ODN SD-101)。
CpG-B和CpG-C具有与任何新CpG-A ODN相比不令人希望的诱导较高的IL-10分泌的特性(图11)。
实施例6
进行体内实验以评价用涉及A类CpG寡核苷酸的瘤内施用和抗PD-1检查点抑制剂的系统施用的组合肿瘤免疫疗法治疗淋巴瘤的疗效。
在-14天将四十只雌性BALB/c小鼠用12.5μg的CMP001(配制成VLP的CpG-A G10)致敏。此致敏步骤被包括的目的在于诱导对Qb VLP的抗Qb抗体应答，使得通过后续注射，VLP将被调理并被pDC迅速吸收。然后在第0天，将经致敏小鼠在每胁上接种5x106个A20淋巴瘤细胞。然后将小鼠分成四个处理组，每组N＝10。在第7、12和15天，组1(阴性对照)中的小鼠接受直接地注射进淋巴瘤肿瘤中的盐水；并且从第7天开始每周接受两次盐水注射i.p.。在第7、12和15天，组2(单独的CpG)中的小鼠接受直接地注射进淋巴瘤肿瘤中的CMP001 100μg；并且从第7天开始每周接受两次盐水注射i.p.。在第7、12和15天，组3(单独的CPI)中的小鼠接受直接地注射进淋巴瘤肿瘤中的盐水；并且从第7天开始每周接受两次抗PD-1抗体175μg注射i.p.。在第7、12和15天，组4(CpG+CPI)中的小鼠接受直接地注射进淋巴瘤肿瘤中的CMP001 100μg；并且从第7天开始每周接受两次抗PD-1抗体175μg注射i.p.。监测所有小鼠的肿瘤大小(经处理的和未经处理的(即，远处的))和存活。结果示于表6以及图12和图13中。
表6
Figure BDA0003163310790001181
*在外周淋巴结和/或背部不同位置发展的转移性肿瘤。
如图12所示，组2(单独的CpG)和组3(单独的CPI)中的经处理的和未经处理的(远处的)肿瘤比阴性对照中的都生长地更慢。值得注意地，在组4(CpG+CPI)中，经处理的和未经处理的(远处的)肿瘤都生长地慢得多，并且在若干情况下甚至消失了，并且这种效应明显是协同的。
如图13所示，在肿瘤接种(“肿瘤激发”)后，组1(阴性对照)中的小鼠具有15天的平均存活；组2(单独的CpG)中的小鼠具有19天的平均存活，但是没有小鼠存活超过约第60天；组3(单独的CPI)中的小鼠具有20.5天的平均存活，但是没有小鼠存活超过约第60天；而组4(CpG+CPI)中的小鼠具有48.5天的平均存活，并且小鼠在超过60天之后仍存活。
援引加入
上述说明书中提及的所有专利和公开的专利申请通过引用以其整体并入本文。
等同
出于清楚理解的目的现在已经通过说明和示例的方式对本发明进行了相当详细的完整描述，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以通过在宽的且等效的条件、配制和其他参数的范围内修改或改变本发明来执行本发明而不影响本发明的范围或其任何具体实施方案，并且这些修改或改变旨在被涵盖在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 查克美特制药公司（Checkmate Pharmaceuticals, INC）
<120> 组合肿瘤免疫疗法
<130> 581552: CPS-001PC
<150> US 62/098,568
<151> 2014-12-31
<150> US 62/106,526
<151> 2015-01-22
<150> US 62/118,165
<151> 2015-02-19
<160> 550
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 1
ggggacganc gtcggggg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 2
ggggacgana tcgtcggggg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 3
ggggacgagc ngctcggggg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 4
ggggncaccg gtgaggggg 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 5
ggggncgacg tacgtcgagg ggg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 6
ggggncgacg nacgtcgagg ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 7
ggggncgacg tacgncgagg ggg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 8
ggggncgacg nacgncgagg ggg 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 9
ggggacgncg acgtgggg 18
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 10
ggggncgacg tcgacgtcga gggggg 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 11
ggggncgacg ncgacgtcga gggggg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 12
ggggncgacg tcgacgncga gggggg 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 13
ggggncgacg ncgacgncga gggggg 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(14)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 14
ggggacgacg ncgngggggg 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 15
ggggncgtcg acgaggggg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(8)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 16
ggggtcgncg acgaggggg 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(8)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 17
ggggncgncg acgaggggg 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 18
ggggacgagc ncgtcggggg g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 19
gggggacgag cncgtcgggg g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 20
ggggacgagc ncgtcggggg 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 21
ggggacgagc ncgtcgggg 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 22
ggggacganc gtcggggggg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 23
gggggacgan cgtcgggggg 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 24
ggggacganc gtcgggggg 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 25
ggggacganc gncggggggg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(13)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 26
gggggacgan cgncgggggg 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 27
ggggacganc gncgggggg 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 28
ggggacganc gncggggg 18
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 29
ggggacganc gaacgtgggg gg 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 30
ggggacganc gaacgtgggg g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 31
ggggacganc gaacgtgggg 20
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 32
ggggacganc gaacgngggg gg 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 33
ggggacganc gaacgngggg g 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 34
ggggacganc gaacgngggg 20
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 35
ggggncgacg tcgacgtcga ggggggg 27
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 36
ggggncgacg tcgacgtcga ggggg 25
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 37
ggggncgacg ncgacgtcga ggggggg 27
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 38
ggggncgacg ncgacgtcga ggggg 25
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 39
ggggncgacg tcgacgncga ggggggg 27
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 40
ggggncgacg tcgacgncga ggggg 25
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 41
ggggncgacg ncgacgncga ggggggg 27
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 42
ggggncgacg ncgacgncga ggggg 25
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 43
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 44
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 45
ggggtcgtcg ttttgggggg 20
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 46
tcgtcgtttt gtcgttttgg gggg 24
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 47
ggggtcgacg tcgagggggg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 48
ggggtcatcg atgagggggg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 49
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 50
gggggtcgta cgacgggggg 20
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 51
gggggacgat atcgtcgggg gg 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 52
gggggacgac gtcgtcgggg gg 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 53
gggggacgag ctgctcgggg gg 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 54
gggggacgta cgtcgggggg 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 55
gggggacgat cgttgggggg g 21
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 56
ggggaacgat cgtcggggg 19
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 57
ggggggacga tcgtcggggg g 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 58
gggggacgat cgtcgggggg g 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 59
gggggtcatc gatgaggggg g 21
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 60
ggggtcgtcg acgagggggg 20
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 61
ggggtcgttc gaacgagggg gg 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 62
ggggacgttc gaacgtgggg gg 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 63
ggggaacgac gtcgttgggg gg 22
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 64
ggggaacgta cgtcgggggg 20
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 65
ggggaacgta cgtacgttgg gggg 24
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 66
ggggtcaccg gtgagggggg 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 67
ggggtcgacg tacgtcgagg gggg 24
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 68
ggggaccggt accggtgggg gg 22
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 69
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<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 70
ggggtcgacg tcgagggg 18
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 71
ggggaacgtt aacgttgggg gg 22
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 72
ggggacgtcg acgtggggg 19
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 73
gggggtcgtt cgttgggggg 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 74
gggacgatcg tcggggggg 19
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 75
gggtcgtcga cgaggggggg 20
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 76
ggtcgtcgac gaggggggg 19
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 77
ggggacgatc gtcggggggg 20
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 78
ggggtcgacg tcgacgtcga ggggggg 27
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 79
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 80
gggggacgag ctcgtcgggg gg 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 81
ggggacgatc gaacgtgggg gg 22
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 82
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 83
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<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 84
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 85
tcgtcgtttt cggcgcgccg cg 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 86
tcgtcgtttt cggcgccggc cg 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 87
tcgtcgtttt cggcccgcgc gg 22
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 88
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgttttt 27
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 89
tcctgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(14)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (18)..(18)
<223> m5c
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(21)
<223> m5c
<400> 90
tngtngtttt nggngngngn ng 22
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 91
tcctgacgtt cggcgcgcgc cc 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 92
tcggcgcgcg ccgtcgtcgt tt 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 93
tcgtcgtttt cggcggccga cg 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 94
tcgtcgtttt cgtcggccgc cg 22
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 95
tcgtcgtttt cgacggccgc cg 22
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 96
tcgtcgtttt cggcggccgt cg 22
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 97
tcgtcgtttc gacggccgtc g 21
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 98
tcgtcgtttc gacgatcgtc g 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 99
tcgtcgtttc gacgtacgtc g 21
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 100
tcgtcgcgac ggccgtcg 18
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 101
tcgtcgcgac gatcgtcg 18
<210> 102
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 102
tcgtcgcgac gtacgtcg 18
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 103
tcgttttttt cgacggccgt cg 22
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 104
tcgttttttt cgacgatcgt cg 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 105
tcgttttttt cgacgtacgt cg 22
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 106
tttcgtcgtt tcgtcgtt 18
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 107
tcgtcgttcg gcgcgccg 18
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 108
tcgtcgtcgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 109
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 110
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 110
ttcgtcgttt tgtcgtt 17
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 111
tcgtcgtcgt tcggcgcgcg cc 22
<210> 112
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 112
tcgtcgtcgt tcggcgc 17
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 113
tcgtcgtcgt tcggcgcgcg c 21
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 114
cgtcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 115
gtcgtcgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 116
tcgtcgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 117
cgtcgttcgg cgcgcgccg 19
<210> 118
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 118
gtcgttcggc gcgcgccg 18
<210> 119
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 119
tcgttcggcg cgcgccg 17
<210> 120
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 120
tcgtcgacga ttttacgacg tcgttttt 28
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 121
tcgtcgacga ttttacgacg tcgtttt 27
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 122
tcgtcgacga acgacgtcgt 20
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 123
tcgtcgacga tttttcgtcg acgattt 27
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 124
tcgtcgacga tcgtcgacga 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 125
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 附加的生物素
<400> 126
gagaacgctc gaccttcgat 20
<210> 127
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 127
agctccatgg tgctcactg 19
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 128
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 129
tccatgacgt tcctgaggtt 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 130
tccaggactt ctctcaggtt 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 131
tccacgacgt tttcgacgtt 20
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 132
tcgtcgtttt gacgttttga cgtt 24
<210> 133
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 133
tcgcgtgcgt tttgtcgttt tgacgtt 27
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 134
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 附加的地高辛配基
<400> 135
ccggccggcc ggccggccgg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 附加的地高辛配基
<400> 136
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 20
<210> 137
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 137
tccaggactt ctctcaggtt tttt 24
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 138
gtgctcgagg atgcgcttcg c 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 139
gccgaggtcc atgtcgtacg c 21
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 140
accgataccg gtgccggtga cggcaccacg 30
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 141
accgataacg ttgccggtga cggcaccacg 30
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 142
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 143
cggcgcgcgc cgcggcgcgc gccg 24
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 144
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 145
tcgtccagga cttctctcag gtt 23
<210> 146
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 146
tcgtcgtcca ggacttctct caggtt 26
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 147
tcgtgacggg cggcgcgcgc cc 22
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 148
acgacgtcgt tcggcggccg ccg 23
<210> 149
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 149
ggggacgacg tcgtgcggcg gccgccg 27
<210> 150
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 150
ccacgacgtc gtcgaagacg acgtcgtgg 29
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 151
ctgcagctgc agctgcagct gcag 24
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 152
cggccgctgc agcggccgct gcag 24
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 153
catgacgttt ttgatgtt 18
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 154
atgacgtttt tgatgtt 17
<210> 155
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 155
tgacgttttt gatgtt 16
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 156
atgacgtttt tgatgttgt 19
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 157
tccatgacgt ttttgatgtt 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 158
tccatgcgtt tttgaatgtt 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 159
tccatgacgt ctttgatgtc 20
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 附加的胆固醇
<400> 160
acgacgtcgt tcacgacgtc gt 22
<210> 161
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 161
acgacgtcgt ggccacgacg tcgtnnn 27
<210> 162
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 162
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnn 27
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(3)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(17)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(30)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 163
nnnacgacgt cgtnnnnacg acgtcgtnnn 30
<210> 164
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(3)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(17)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (27)..(27)
<223> 附加的胆固醇
<400> 164
nnnacgacgt cgtnnnnacg acgtcgt 27
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 165
gggacgacgt cgtggccacg acgtcgtccc 30
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 166
cccacgacgt cgtggg 16
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 167
cccvacgacg tcgtgggg 18
<210> 168
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 168
atgacgtttt tgacgtt 17
<210> 169
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 169
acgacgtttt tgatgtt 17
<210> 170
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 170
atgatgtttt tgatgtt 17
<210> 171
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 171
atgacgtttt gatgtt 16
<210> 172
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 172
atgacgtttg tgatgtt 17
<210> 173
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 173
ttgacgtttt tgatgtt 17
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 174
atgagctttt gtatgtt 17
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 175
tcgacgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 176
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 176
tcctgacgtt ttcggcggcc gccg 24
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 177
tcctgacgtt cggcggccgc cg 22
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 178
tccatgacgt tcggcgcgcg ccc 23
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 179
tcctgacgtt cggcgcgcgc c 21
<210> 180
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 180
tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 181
tcgacgtcga cgttagggtt aggg 24
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 182
acgacgtcgt tagggttagg g 21
<210> 183
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 183
gtcggcgttg ac 12
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(16)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 184
acgacgtcgt cgnnnncggc cgccg 25
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 185
tcgtcgacga cgtcgtcg 18
<210> 186
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (19)..(22)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 186
tcgtcgacga cgtcgtcgnn nn 22
<210> 187
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(25)
<223> 三乙二醇
<400> 187
acgacgtcgt ttttacgacg tcgtn 25
<210> 188
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 188
acgacgtcgt ttttacgacg tcgtnnn 27
<210> 189
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 189
acgacgtcgt ttttacgacg tcgtttt 27
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 190
acgacgtcgt ttttacgacg tcgt 24
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(25)
<223> 六乙二醇
<400> 191
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtn 25
<210> 192
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 六乙二醇
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 六乙二醇
<400> 192
acgacgtcgt nacgacgtcg tn 22
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(12)
<223> 三乙二醇
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 三乙二醇
<400> 193
acgacgtcgt nnacgacgtc gtn 23
<210> 194
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(13)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(25)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 194
cgacgtcgtn nnnacgacgt cgnnn 25
<210> 195
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(13)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(25)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 195
acgacgtcgn nnncgacgtc gtnnn 25
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(12)
<223> n is a, c, g, 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (21)..(23)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 196
cgacgtcgnn nncgacgtcg nnn 23
<210> 197
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 197
tcgacgtcgt nnnnacgacg tcgannn 27
<210> 198
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 198
acgtcgtcgt nnnnacgacg acgtnnn 27
<210> 199
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 199
tcgtcgacgt nnnnacgtcg acgannn 27
<210> 200
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 200
tcgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnn 27
<210> 201
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 201
acgacgtcgt nnnnacgtcg tcgtnnn 27
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(12)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (21)..(23)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 202
acgacgttnn nnaacgtcgt nnn 23
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(11)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (19)..(21)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 203
acgtcgtnnn nacgacgtnn n 21
<210> 204
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(12)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (21)..(23)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 204
ggcggccgnn nncggccgcc nnn 23
<210> 205
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(12)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (21)..(23)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 205
gcggccggnn nnccggccgc nnn 23
<210> 206
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(11)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(24)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 206
acgtcgtnnn nacgacgtcg tnnn 24
<210> 207
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(15)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (26)..(26)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 207
nacgacgtcg tnnnnacgac gtcgtn 26
<210> 208
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (26)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 208
acgacgtcgt cgaagacgac gtcgtnnt 28
<210> 209
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (26)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 209
tcgacgtcgt cgaagacgtc gtcgtnnt 28
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 210
tccangacgt ttttgatgtt 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 211
tccatgacgt tnttgatgtt 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 1,3-丙二醇
<400> 212
tccangacgt ttttgatgtt 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 1,3-丙二醇
<400> 213
tccatgacgt tnttgatgtt 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 附加的二-羟基丙基-3,3,3',3'-四甲基-4,5-苯并茚并碳花菁氯化物
<400> 214
tccatgacgt ttttgatgtt 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(5)
<223> 1,3-丙二醇
<400> 215
nnnnngacgt ttttgatgtt 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 1,3-丙二醇
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 1,3-丙二醇
<400> 216
tccangacgt tnttgatgtt 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 217
tccangacgt tnttgatgtt 20
<210> 218
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> ribouracil
<400> 218
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnnn 28
<210> 219
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 核糖胍
<400> 219
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnng 28
<210> 220
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 核糖腺嘌呤
<400> 220
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnna 28
<210> 221
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(3)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(17)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(30)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(31)
<223> 核糖尿嘧啶
<400> 221
nnnacgacgt cgtnnnnacg acgtcgtnnn n 31
<210> 222
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(31)
<223> 核糖腺嘌呤
<400> 222
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnnaaa a 31
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 223
tcgatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 224
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(17)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(30)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(31)
<223> 核糖尿嘧啶
<400> 224
tttacgacgt cgtnnnnacg acgtcgtnnn n 31
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 225
tcgcgacgtt cgcgcgcgcg 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 226
nccatgacgt ttttgatgtt 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 227
tncatgacgt ttttgatgtt 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 228
tcnatgacgt ttttgatgtt 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 229
tccntgacgt ttttgatgtt 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 230
tccatgacgt tttngatgtt 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(13)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 231
tccatgacgt ttntgatgtt 20
<210> 232
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 232
tcgaacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 233
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 233
tcgtcgaacg ttcggcgcgc gccg 24
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 234
tcgtcgaacg ttcggcgctg cgccg 25
<210> 235
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 235
tcgcgacgtt cgttgcgcgc gccg 24
<210> 236
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 236
tacgtcgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 237
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 237
ttcgcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 238
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 238
tcggcgcgcg ccgtcgcgac gt 22
<210> 239
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 239
tagcgtgcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 240
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 240
tagcgagcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 241
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 241
ttgcgagcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 242
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 242
atgcgtgcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 243
ttacgtgcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 244
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 244
ttgcatgcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 245
ttgcgtacgt tttgacgttt tttt 24
<210> 246
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 246
ttgcgtgcat tttgacgttt tttt 24
<210> 247
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 247
ttgcgtgcga tttgacgttt tttt 24
<210> 248
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 248
ttgcgcgcgt tttgacgttt tttt 24
<210> 249
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 249
ttgcgtgcgc tttgacgttt tttt 24
<210> 250
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 250
ttgcgtgcgt ttcgacgttt tttt 24
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 251
tcgtcggacg ttcggcgctg cgccg 25
<210> 252
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 252
tggcgacgtt cgttgcgcgc gccg 24
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 253
tcgcgacgtt ttgcgcgcgc 20
<210> 254
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 254
tcgcgacgtc gttgcgcgcg ccg 23
<210> 255
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 255
tcgcgacgtt cgaagcgcgc gccg 24
<210> 256
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 256
tcgcgacgaa cgttgcgcgc gccg 24
<210> 257
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 257
tcgacgtcgt nnnntcgacg tcgtnnn 27
<210> 258
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 258
tcgtcgttag ctcgttagct cgtt 24
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 259
tcgtcgttac gtaattacgt cgtt 24
<210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 260
tcgtcgttac gtcgttacgt aatt 24
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 261
tcgtcgttac gtaattacgt aatt 24
<210> 262
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 262
tcgacgtcga cgtgacggg 19
<210> 263
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 263
tcgcgacgtt cggcgcgctg ccg 23
<210> 264
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 264
tcgcgacgtt cggcgcgtcg ccg 23
<210> 265
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 265
tcgcgacgtt cggcggctcg ccg 23
<210> 266
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 附加的维生素E
<400> 266
tcgacgtcgt 10
<210> 267
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 267
tcgacgtcga cgtgacgtc 19
<210> 268
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 268
tcgacgtcga cgtgacg 17
<210> 269
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 附加的维生素E
<400> 269
tcgacgtcga 10
<210> 270
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 270
tcgtcgttac gtaactacgt cgtt 24
<210> 271
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 271
tcgtcgttac gtaacgacgt cgtt 24
<210> 272
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 272
tcgtcgttag ctaattagct cgtt 24
<210> 273
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 273
tcgtcgttac gtaattagct cgtt 24
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 274
cccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 275
gccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 276
accatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 277
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 277
tggatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 278
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 278
tttatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 279
taaatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 280
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 280
ccatgacgtt cctgacgtt 19
<210> 281
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 281
catgacgttc ctgacgtt 18
<210> 282
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 282
atgacgttcc tgacgtt 17
<210> 283
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 283
tgacgttcct gacgtt 16
<210> 284
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 附加的胆固醇
<400> 284
tcgacgtcga nnnntcgacg tcga 24
<210> 285
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 三乙二醇
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(15)
<223> n is a, c, g, 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 附加的胆固醇
<400> 285
nagctgcagc tnnnntcgac ga 22
<210> 286
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 286
tcgcgacgtt cgggcgcgcc g 21
<210> 287
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 287
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 288
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 288
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 289
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 289
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 290
tcgcgacgtt cggcgcgccg 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 291
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 292
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 292
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 293
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 293
tcgcgacgtt cggcgccg 18
<210> 294
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 294
tcgcgacgtt cggccg 16
<210> 295
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 295
tcgacgttcg gcgccg 16
<210> 296
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 296
tcgtcgacgt tcggcgggcc g 21
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 297
tcgtcgacgt tcgggcgccg 20
<210> 298
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 298
tcgacgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 299
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 299
tcgacgtcgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 300
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 300
tcgtcgacgt tcgccgcgcg gcg 23
<210> 301
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 301
tcgtcgacgt tcggcgccgt gccg 24
<210> 302
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 302
tcgtcgacgt tcgactcgag tcg 23
<210> 303
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 303
tcgacgtcga cgtgacgtt 19
<210> 304
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 304
tcgtcgacgt tcggcgcgcc g 21
<210> 305
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(14)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (25)..(27)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 逆取向核糖尿嘧啶
<400> 305
acgacgtcgt nnnnacgacg tcgtnnnn 28
<210> 306
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 306
tcgtcgacga tcgggcgccg tgccg 25
<210> 307
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 307
tcgtcgacga tcggcgccgt gccg 24
<210> 308
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 308
tcgtcgacga cggcgccgtg ccg 23
<210> 309
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 309
tcgtcgacga cgtgtcgat 19
<210> 310
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 310
tcgtcgacga cggcgccgtg ccgt 24
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 311
tcgtcgacga tcggcggcgt gccgt 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 312
tcgtcgacgt tcggcgccgt gccgt 25
<210> 313
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 313
tcgtcgacgt cggcgccgtg ccgt 24
<210> 314
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 314
tcgtcgacgc ggcgccgtgc cgt 23
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 315
tcgtcgacga agtcgacgat 20
<210> 316
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 316
tcgtcgacga gaatcgtcga cgat 24
<210> 317
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 317
tcgtcgtacg gcgccgtgcc gt 22
<210> 318
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 318
tcgtcgacga tcggcgccgt gccgt 25
<210> 319
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 319
tcgtcgacga cgtgtcgat 19
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 320
tcgacgtcga agacgtcgat 20
<210> 321
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 321
tcgacgtcga gaatcgacgt cgat 24
<210> 322
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 322
tcgtcgacga cggcgaagcc g 21
<210> 323
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 323
tcgtcgacga cggcgaagcc gt 22
<210> 324
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 324
tcgacgtcga cgtgacgttg t 21
<210> 325
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 附加的丁酸根
<400> 325
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 326
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 326
acgacgtttt cgacgtt 17
<210> 327
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 327
tcgtcgacga tcggcgcgcg cccgt 25
<210> 328
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 328
ttcgtcgacg atcggcgcgc gcccgt 26
<210> 329
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 329
tcgtcgacga tcgacgcgcg tcg 23
<210> 330
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 330
tcgtcgacga tcaacgcgcg ttg 23
<210> 331
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 331
tcgtcgacga tcggcacgtg ccg 23
<210> 332
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 332
tcgtcgacga tcggcatatg ccg 23
<210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 333
tcgtcgacga tgccgcgcgc ggc 23
<210> 334
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 334
tcgtcgacga tgccgcgctg cggc 24
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 335
tcgtcgtacg atgccgcgcg cggc 24
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 336
tcgtcgtacg atgccgcgct gcggc 25
<210> 337
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 337
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 338
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 338
tcgtgcacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 339
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> m5c
<400> 339
tngtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 340
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> m5c
<400> 340
tcgtngacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 341
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(8)
<223> m5c
<400> 341
tcgtcganga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 342
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(12)
<223> m5c
<400> 342
tcgtcgacga tnggcgcgcg ccg 23
<210> 343
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 343
tcgacgtcga cgtcgacg 18
<210> 344
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 344
tcgtcgacgt tcggcgccgt gccgt 25
<210> 345
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 345
gccgcgcgcg gctagcagct gct 23
<210> 346
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 346
cggcgcgcgc cgtagcagct gct 23
<210> 347
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 347
cggcgccgtg ccgttgcagc tgct 24
<210> 348
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 348
gccgtgccgc ggcttgcagc tgct 24
<210> 349
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 349
tcggcgcgcg ccgatagcag ctgct 25
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 350
tcggcgccgt gccgttgcag ctgct 25
<210> 351
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 351
cggcgcngcg ccg 13
<210> 352
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 352
tcgtcgacga cggcgcgcgc cg 22
<210> 353
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 1,3-丙二醇
<400> 353
tcgtcgacga ncggcgcgcg ccg 23
<210> 354
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 六乙二醇
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 1'2'-双脱氧核糖(D间隔物)
<400> 354
tcgtcgacga ncggcgcgcg ccg 23
<210> 355
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 355
tcgtcgacga ncggcgcgcg ccg 23
<210> 356
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 356
tcgacgtcgt ggggg 15
<210> 357
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 357
tccaggactt ctctca 16
<210> 358
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 2'-O-甲基腺嘌呤
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(14)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (18)..(18)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 2'-O-甲基胍
<400> 358
tcgtcnncnn tcnncncncn ccn 23
<210> 359
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 2'-O-甲基腺嘌呤
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(14)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(16)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (18)..(18)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 2'-O-甲基胍
<400> 359
tcntcnncnn tcnncncncn ccn 23
<210> 360
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 360
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 361
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 361
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 2,4-二氟甲苯
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 362
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 363
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 363
tgtngttttt tttttttttt 20
<210> 364
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 364
tgtcnttttt tttttttttt 20
<210> 365
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 365
tncgtttttt tttttttttt 20
<210> 366
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 2,4-二氟甲苯
<400> 366
tgtcgtnttt tttttttttt 20
<210> 367
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-溴-2'-脱氧尿苷
<400> 367
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 368
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-溴-2'-脱氧尿苷
<400> 368
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 369
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-溴-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-溴-2'-脱氧尿苷
<400> 369
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 370
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 370
tgncgttttt ttttttttt 19
<210> 371
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 371
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 372
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 372
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 尿苷
<400> 373
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 374
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 尿苷
<400> 374
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 375
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 尿苷
<400> 375
tgncgntttt ttttttttt 19
<210> 376
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 376
ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 377
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 377
tcgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 378
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 378
tcgtcgtttt tcggncgttt t 21
<210> 379
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 379
ncgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 380
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 380
tcgncgnttt tcggtcgttt t 21
<210> 381
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (18)..(18)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 381
tcgtcgtttt tcggncgntt t 21
<210> 382
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 382
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 383
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 383
tcgncgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 384
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 384
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 385
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 385
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 386
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 386
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 387
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 387
tcgncgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 388
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 388
ncgncgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 389
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 389
ncgacgtcgt ggggg 15
<210> 390
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 390
tcgacgncgt ggggg 15
<210> 391
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 391
tcgacgncgn ggggg 15
<210> 392
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-氯-2'-脱氧尿苷
<400> 392
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 393
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 393
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 394
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 394
ncgncgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 395
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 395
tcgncgnttt acggcgccgt gccg 24
<210> 396
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 396
tcttttttgn cgtttttttt tt 22
<210> 397
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (13)..(13)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 397
tcttttttgn cgnttttttt tt 22
<210> 398
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 398
ncttttttgt cgtttttttt tt 22
<210> 399
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 399
tcttttttgc ngtttttttt tt 22
<210> 400
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 400
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 401
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 401
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 402
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 402
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 403
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 403
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 404
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 404
ncgtcgacga tcggcggccg ccg 23
<210> 405
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 405
ncgtcgacga tcggcggccg ccg 23
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-氟脱氧尿苷
<400> 406
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 407
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-氟脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-氟脱氧尿苷
<400> 407
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 408
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 尿苷
<400> 408
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 6-硝基-苯并咪唑
<400> 409
tgtcnttttt tttttttttt 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 6-硝基-苯并咪唑
<400> 410
tgtngttttt tttttttttt 20
<210> 411
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 411
ngtcgttttt tttttttttt 20
<210> 412
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 412
ngncgttttt tttttttttt 20
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (7)..(7)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 413
tgtcgtnttt tttttttttt 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> a,a,a-三氟-dT
<400> 414
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 415
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> a,a,a-三氟-dT
<400> 415
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 416
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(6)
<223> a,a,a-三氟-dT
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> a,a,a-三氟-dT
<400> 416
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-氯-2'-脱氧尿苷
<400> 417
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-氯-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-氯-2'-脱氧尿苷
<400> 418
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 419
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 419
tncgtttttt tttttttttt 20
<210> 420
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 420
tgncgttttg tcgtt 15
<210> 421
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 421
ttncgtcgtt tcgtcgtt 18
<210> 422
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-溴-2'-脱氧尿苷
<400> 422
ncgacgtcgt ggggg 15
<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 423
tgngcttttt tttttttttt 20
<210> 424
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
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<400> 424
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 425
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 425
tcgncgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 426
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 426
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cg 22
<210> 427
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
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<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 427
ncgtcgtttt tcggncgttt t 21
<210> 428
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 428
tcgncgtttt tcggncgttt t 21
<210> 429
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
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<220>
<221> 混杂特征
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<400> 429
tgncgttttt ttttgncgtt 20
<210> 430
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 430
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 431
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
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<223> 7-脱氮-dG
<400> 431
ncgacgtcgt ggngg 15
<210> 432
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 432
tnncgttttt tttttttttt 20
<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-甲基胍
<400> 433
tgncnttttt tttttttttt 20
<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 5-甲基胍
<400> 434
tnncnttttt tttttttttt 20
<210> 435
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-丙炔基-dU
<400> 435
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 436
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-丙炔基-dU
<400> 436
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 437
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 437
tgncgttttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 438
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 438
tncgttttcg gcgcgcgccg t 21
<210> 439
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 439
tncgtttttt tttttttttt 20
<210> 440
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 440
tgngcttttt tttttttttt 20
<210> 441
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 441
ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 442
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 442
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 443
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 443
tcgncgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 444
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
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<400> 444
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 445
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 445
nctttttttt ttttttt 17
<210> 446
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 446
nctttttttt cgtttttttt tt 22
<210> 447
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 447
tctttttttn cgtttttttt tt 22
<210> 448
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 448
nctttttttn cgtttttttt tt 22
<210> 449
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 449
ncgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 450
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 450
tcgtcgtttc gtcgttttgn cgtt 24
<210> 451
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 451
ncgtcgtttc gtcgttttgn cgtt 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> 7-脱氮-dG
<400> 452
tgncnttttt tttttttttt 20
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (5)..(5)
<223> inosine
<400> 453
tgncnttttt tttttttttt 20
<210> 454
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> m5c
<400> 454
tgnngttttt tttttttttt 20
<210> 455
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (8)..(8)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 455
tgtcgttntt tttttttttt 20
<210> 456
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 456
tgtcgtttnt tttttttttt 20
<210> 457
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 457
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 458
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 458
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 459
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 459
tcgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 460
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 460
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 461
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 461
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 462
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 462
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 463
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 463
ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 464
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 464
ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 465
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 465
ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 466
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 466
ncgtcgtttt gtcgttttcg tt 22
<210> 467
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 5-(d-溴-乙酰基)-尿苷
<400> 467
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 468
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (6)..(6)
<223> 5-(d-溴-乙酰基)-尿苷
<400> 468
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 469
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 469
ncggcggccg ccg 13
<210> 470
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 470
ncgtcgtttt acggcgccgt gccn 24
<210> 471
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 471
ncgtcgtttt acggcgccgt gccn 24
<210> 472
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 472
ncgncgtttt acggcgccgt gccn 24
<210> 473
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 473
ncgtcgtttt acggcgccgt gccgt 25
<210> 474
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 474
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 475
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 475
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 476
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (4)..(4)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 476
ncgncgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 477
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 477
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22
<210> 478
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (10)..(10)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3-甲基胍
<220>
<221> 混杂特征
<222> (22)..(22)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 478
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22
<210> 479
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> N_区
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 479
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 480
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 480
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 481
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 481
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn 24
<210> 482
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (24)..(24)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 482
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn 24
<210> 483
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 483
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn 23
<210> 484
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (23)..(23)
<223> 3'-O-甲基核糖胍
<400> 484
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn 23
<210> 485
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 485
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccgt 25
<210> 486
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 486
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 487
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 硝基吲哚
<400> 487
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 488
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 硝基吡咯
<400> 488
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 489
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (3)..(3)
<223> 6-硝基-苯并咪唑
<400> 489
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 490
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 490
ncgtcgacga tggcggcgcc gcc 23
<210> 491
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 491
ncgtcgacga tggcggcgcc gcc 23
<210> 492
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 492
ttcgttttcg gcgcgcgccg t 21
<210> 493
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 493
tncgttttcg gcgcgcgccg t 21
<210> 494
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 494
ncgttttcgg cgcgcgccgt 20
<210> 495
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(2)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 495
nncgttttcg gcgcgcgccg t 21
<210> 496
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 496
ncgtcgtttt acggcgccgt gccgt 25
<210> 497
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 497
tncgttttac ggcgccgtgc cgt 23
<210> 498
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 498
tncgttttac ggcgccgtgc cgt 23
<210> 499
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (12)..(13)
<223> 尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (15)..(15)
<223> 尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (17)..(17)
<223> 尿苷
<400> 499
ncgtcgtttt gnngngn 17
<210> 500
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(1)
<223> 5-乙基-2'-脱氧尿苷
<400> 500
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 501
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 501
aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc attggaaaac gttcttcggg gcgttcttag 60
gtggtaaccc ctaggggtta ccaccttcat tggaaaacgt tcttcggggc gttctt 116
<210> 502
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 502
ggggacgatc gtcggggg 18
<210> 503
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 503
ggggtcgacg tacgtcgagg ggg 23
<210> 504
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 504
ggggtcgtcg acgaggggg 19
<210> 505
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 505
ggggacgagc tcgtcggggg g 21
<210> 506
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 506
gggggacgag ctcgtcgggg g 21
<210> 507
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 507
ggggacgagc tcgtcggggg 20
<210> 508
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 508
ggggacgagc tcgtcgggg 19
<210> 509
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 509
ggggacgatc gtcgggggg 19
<210> 510
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 510
ggggacgatc gaacgtgggg g 21
<210> 511
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 511
ggggacgatc gaacgtgggg 20
<210> 512
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 512
ggggtcgacg tcgacgtcga gggggg 26
<210> 513
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 513
ggggtcgacg tcgacgtcga ggggg 25
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 514
ggggacgacg tcgtgggggg 20
<210> 515
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 515
ggggacgacg tcgtggggg 19
<210> 516
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 516
gggtcgtcga cgaggggg 18
<210> 517
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 517
gggggacgag ctcgtcgggg g 21
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (11)..(11)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<220>
<221> 混杂特征
<222> (14)..(14)
<223> 5-碘-2'-脱氧尿苷
<400> 518
ggggacgacg ncgngggggg 20
<210> 519
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 519
tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30
<210> 520
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(4)
<223> n is a, c, g, 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (16)..(20)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 520
nnnnacgacg tcgtgnnnnn 20
<210> 521
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 521
ggggacgacg tcgtgggggn 20
<210> 522
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 522
ggggacgacg tcgtgggggg tt 22
<210> 523
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 混杂特征
<222> (21)..(22)
<223> n is a, c, g, 或 t
<400> 523
ggggacgacg tcgtgggggg nn 22
<210> 524
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 524
tcgtcgacga 10
<210> 525
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 525
gacgatcgtc 10
<210> 526
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 526
acgacgtcgt 10
<210> 527
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 527
gggggagcat gcctgggggg 20
<210> 528
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 528
ggggggggac gatcgtcggg ggggggg 27
<210> 529
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 529
gggggggggg gacgatcgtc ggggggg 27
<210> 530
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 530
ggggggggac gatcgtcggg gggg 24
<210> 531
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 531
gggggggggg tcgtcgacga gggggggggg 30
<210> 532
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 532
gggggggggg acgagctcgt cggggggggg g 31
<210> 533
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 533
gggggggggg acgatcgtcg ggggggggg 29
<210> 534
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 534
gggggggggg tcgacgtcga cgtcgagggg gggggg 36
<210> 535
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 535
gggggggggg acgacgtcgt gggggggggg 30
<210> 536
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 536
gggggggggg aacgacgtcg ttgggggggg gg 32
<210> 537
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 537
gggggggggg acgacgacga tcgtcgtcgt gggggggggg 40
<210> 538
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 538
gggggggggg cacgacgtcg tggggggggg g 31
<210> 539
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 539
gggggggggg aacgttcgaa cgttgggggg gggg 34
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 540
gggggggggg aacgttcgaa cgttcgaacg ttcgaacgtt gggggggggg 50
<210> 541
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 541
gggggggggg ttcgaacgtt cgaagggggg gggg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 542
gggggggggg acgtcgacgt cggggggggg g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 543
gggggggggg tcgacgtcga cggggggggg g 31
<210> 544
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 544
gggggggggg acgtcgacgt acgtcgacgt gggggggggg 40
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<212> DNA
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 545
gggggggggg tacgatatcg tagggggggg gg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 546
gggggggggg tacgtatacg tagggggggg gg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 547
gggggggggg cagcatgctg gggggggggg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
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acgacgacga 10
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<213> 人工序列
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acgtcgacgt 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 550
tcgtcgttac gtaacgacgt cgtt 24

Claims (10)

1.一种治疗癌性肿瘤的方法，其包括
向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
2.一种治疗癌性肿瘤的方法，其包括
向对其有需要的受试者施用有效量的放疗、TLR9激动剂和检查点抑制剂(CPI)，其中该放疗在施用该TLR9激动剂之前开始，且该TLR9激动剂施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近。
3.权利要求1或2的方法，其中该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpGDNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、A/E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
4.权利要求1或2的方法，其中该CPI是特异性结合选自下组的抗原的抗体或其抗原结合片段，该组由以下各项组成：PD-1、PD-L1和CTLA-4。
5.一种治疗癌性肿瘤的方法，其包括
向对其有需要的受试者施用有效量的TLR9激动剂、第一检查点抑制剂(CPI)和第二CPI，其中该TLR9激动剂和该第一CPI施用入该肿瘤或实质性与该肿瘤邻近，且该第二CPI系统施用。
6.权利要求5的方法，其中该TLR9激动剂选自下组，该组由以下各项组成：A类CpG DNA、C类CpG DNA、E类CpG DNA、A/E类CpG DNA、P类CpG DNA及其任何组合。
7.权利要求5的方法，其中该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；且该第二CPI是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求5的方法，其中该第一CPI是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段；且该第二CPI是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求5的方法，其中该第一CPI包含特异性结合PD-1的第一抗体或其抗原结合片段，且该第二CPI包含特异性结合PD-L1的第二抗体或其抗原结合片段。
10.权利要求5的方法，其中该第一CPI包含特异性结合PD-L1的第一抗体或其抗原结合片段，且该第二CPI包含特异性结合PD-1的第二抗体或其抗原结合片段。
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