ES2939534T3 - Activación moduladora de inflamasomas de células supresoras derivadas de mieloides para tratar EICH - Google Patents
Activación moduladora de inflamasomas de células supresoras derivadas de mieloides para tratar EICH Download PDFInfo
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Abstract
En un aspecto, un método para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) generalmente incluye administrar al sujeto una pluralidad de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) efectivas para mejorar al menos un síntoma o signo clínico de la enfermedad de injerto contra huésped en comparación con un sujeto de control adecuado. En otro aspecto, un método para tratar un tumor en un sujeto generalmente incluye administrar al sujeto una terapia antitumoral y coadministrar al sujeto un agente incitador del inflamasoma en una cantidad efectiva para aumentar la activación del inflamasoma de las MDSC lo suficiente como para reducir la función supresora. de los MDSC. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Activación moduladora de inflamasomas de células supresoras derivadas de mieloides para tratar EICH
Resumen
La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a una célula supresora derivada de mieloides (MDSC) deficiente en proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC). En la medida en que se describen otras células supresoras derivadas de mieloides en el presente documento, se incluyen únicamente con fines de referencia. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a las células, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o diagnóstico.
Esta descripción describe, en un aspecto, un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener enfermedad injerto contra huésped (EICH). Generalmente, el método incluye administrar al sujeto una pluralidad de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) eficaces para mejorar al menos un síntoma o signo clínico de la enfermedad injerto contra huésped en comparación con un sujeto de control adecuado.
El método puede incluir una pluralidad de administraciones en serie de MDSC a medida que las MDSC previamente administradas experimentan activación de inflamasomas.
Al menos una porción de la pluralidad de MDSC puede comprender una modificación genética que provoca que la MDSC resista la activación de inflamasomas.
El método puede incluir administrar conjuntamente al sujeto un agente que inhibe la activación de inflamasomas.
En otro aspecto, esta descripción describe un método de tratamiento de un tumor en un sujeto. En general, el método incluye administrar al sujeto una terapia antitumoral y administrar conjuntamente al sujeto un agente que estimula los inflamasomas en una cantidad eficaz para aumentar la activación de inflamasomas de las MDSC de manera suficiente para reducir la función supresora de las MDSC.
La descripción que sigue ejemplifica más particularmente las realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud se proporcionan directrices mediante listas de ejemplos, cuyos ejemplos pueden usarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista enumerada sirve sólo como un grupo representativo y no debe interpretarse como una lista exclusiva. El documento WO 2010/062990 se refiere a métodos de aislamiento, cultivo y diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) a partir de células madre embrionarias (ES) y células madre hematopoyéticas (HSC)
Highfill y col. (Blood, 2010, 116:25: 5738-47) se refieren a células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) que inhiben la enfermedad injerto contra huésped (EICH) a través de un mecanismo dependiente de arginasa-1 que está regulado por incremento por interleucina-13.
Messmann y col. (Blood, 2015, 126:9:1138-48) se refieren a MDSC generadas in vitro que previenen la EICH murina mediante la inducción de células T de tipo 2 sin deshabilitar la citotoxicidad antitumoral.
Boros y col. (Hum. Immunol., 2010, 71:11:1061-66) se refieren a células supresoras derivadas de mieloides: reguladoras naturales para la tolerancia al trasplante.
Jankovic y col. (J. Exp. Med., 2013, 210:10:1899-1910) se refieren al inflamasoma N1rp3 que regula la enfermedad injerto contra huésped aguda.
Breve descripción de las figuras
FIGURA 1. La MDSC-IL13 derivada de médula ósea mejora la supervivencia con EICH, pero la supresión se ve comprometida después de cinco días in vivo. (A) Se administró a los receptores BALB/c irradiados mortalmente 1 x 107 células de médula ósea C57Bl/6 (sólo MO) o médula ósea más 2 x 106 células T con agotamiento de CD25 (EICH) o médula ósea, células T y 6 x 106 MDSC-IL13 (EICH MDSC-IL13) tal como se indica. La curva de supervivencia de Kaplan-Meier representa cuatro experimentos agrupados e independientes (n=40 animales/grupo). EICH frente a EICH+MDSC, p<0,0001. (B-C) Expresión superficial de MDSC-IL13 congénica (CD45.2+) recuperada de bazos cinco días después de la transferencia a animales irradiados que recibieron médula ósea sólo (sin EICH) o médula ósea más células T (EICH). Los datos representan tres réplicas por grupo con p<0,001 para todos los marcadores mostrados. (D) Histogramas representativos que indican la proliferación de células T que responden tal como se indica mediante dilución de CFSE. Se sembraron MDSC-IL13 purificadas a partir de los bazos agrupados cinco días después del trasplante a 5 x 105/ml con un número igual de células T que responden marcadas con CFSE, 0,25 pg/ml de AcM anti-CD3s y 2,5 x 105/ml de esplenocitos agotados de células T irradiados en medio L-Arginina-RPMI 150 pM especialmente formulado. El histograma sombreado indica la
proliferación de controles no estimulados. Los datos son representativos de tres muestras por grupo y un total de tres experimentos independientes. (E) Datos de resumen de MDSC recuperadas que muestran viabilidad y números de células totales recuperadas, CD11 b+ CD45.2+ separadas. Los datos representan tres muestras por grupo y son representativos de tres experimentos independientes. (F) Receptores Balb/c irradiados mortalmente trasplantados tal como anteriormente, o a los que se les administra tres infusiones consecutivas de MDSC-IL13 tal como se indica en el día 0, el día 3 y el día 6. Todos los ratones que recibieron MDSC demostraron una supervivencia aumentada frente a EICH, p<0,001. MDSC frente a MDSC día 0, día 3 y día 6 p<0,0001. La curva de supervivencia representa 20 animales por grupo de dos experimentos independientes, y es representativa de un experimento adicional que administra múltiples infusiones en el día 0, el día 7 y el día 14.
FIGURA 2. Actividad de inflamasomas evidente en MDSC recuperadas. (A) Inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares recuperados de MDSC-IL13 de tipo natural o ASC-/- con sonda para la forma activa de p10 de caspasa-1 y pactina. Se usó el software ImageJ para convertir a escala de grises, enderezar y recortar la imagen del gel para resaltar los carriles de interés según el tamaño. (B) Cuantificación de inmunotransferencia de caspasa-1 p10 en relación con p-actina, EICH frente a todos los demás grupos, p< 0,05. La cuantificación se llevó a cabo en inmunotransferencias escaneadas mediante análisis densitométrico a partir del software ImageJ (NIH) (C) ELISA de IL-1 p de MDSC-IL13 recuperadas de los sobrenadantes después del día 5 sembradas en placa en medio RPMI completo durante la noche, EICH frente a todos los demás grupos, p<0,05. La línea de puntos indica el límite de detección de ELISA. Todos los datos son representativos de dos experimentos independientes.
FIGURA 3. La inducción de inflamasomas in vitro en MDSC conduce a la pérdida de función supresora. La inducción de inflamasomas en MDSC-IL13 de tipo natural y ASC-/- recién cultivadas se llevó a cabo añadiendo 0,2 pg/ml de LPS durante tres horas, seguido de la adición de ATP 2 mM o de 0,8 pg/ml de transfección de poli(dT). (A) Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de una hora adicional y se analizaron para determinar la producción de IL-1 p mediante ELISA. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) Las MDSC-IL13 inducidas por inflamasomas se lavaron extensamente y se sembraron en placas en un ensayo de supresión con CFSE en una razón 1:1, los datos son representativos de células T que responden CD8+ marcadas con CFSE separadas, n=6 muestras/grupo de dos experimentos independientes. NLRP3 indica el tratamiento de LPS+ATP y AIM2 indica el tratamiento con LPS+poli(dT), el histograma gris representa un control de proliferación sin MDSC. Células T que responden CD4+ separadas mostradas en la figura 10. (C) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier del modelo de EiCh de C57Bl/6^BALB/c que usa MDSC-IL13 inducidas por inflamasomas, tratado como anteriormente. MDSC frente a sin MDSC p<0,0001, MDSC frente a MDSC AIM2 p<0,0001, MDSC frente a MDSC NLRP3 p=0,0029. Los datos representan n=18 animales por grupo, combinados de dos experimentos independientes. (D) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de EICH que usa MDSC-IL13 generadas a partir de ratones de tipo natural o ASC-/- tal como se indica. Los datos representan n=30 animales por grupo en tres experimentos independientes. MDSC frente a sin MDSC p=0,0399, MDSC frente a ASC-/-MDSC p=0,0006. (E) Los histogramas representan el % de células T que responden marcadas con CFSE divididas cuando se siembran en placas frente a MDSC-IL13 de natural o ASC-/- recuperadas a partir del día 5 después del trasplante en una razón 1:1 y recogidas en el día 3. Se hallaron valores de p significativos (<0,05) al comparar cualquier grupo individual con MDSC-IL13 de tipo natural recuperadas de ratones con EICH.
FIGURA 4. Inducción de inflamasomas en MDSC asociada con la pérdida de expresión de Arg1. Se indujeron MDSC-IL13 para los inflamasomas NLRP3 o AIM2 tal como se indica, se lavó extensamente y se volvió a sembrar en placa en medio completo durante la noche. (A) Actividad enzimática de Arg1 asociada a células para MDSC de tipo natural o (B) ASC-/-, normalizada al número total de células. Los datos se agrupan de dos experimentos independientes. MDSC generadas a partir de ratones transgénicos YFP-Arg1, seguido de la inducción in vitro de inflamasomas y volver a sembrar en placa en medio completo. (C) Fluorescencia de YFP para MDSC separadas de CD11b después de dos días adicionales en cultivo indicado como histogramas representativos (el histograma sombreado representa médula ósea de YARG no estimulada) y (D) datos de resumen del % de YFP+. (E) Detección de YFP para MDSC-IL13 recuperadas a partir del día 5 de animales trasplantados con médula ósea sólo (sin EICH) o médula ósea más células T completas (EICH). La médula ósea-YARG (médula ósea-YFP-Arg1) indica la fluorescencia de YFP de referencia. (F) Producción de IL-1 p antes y después de la activación de inflamasoma NLRP3 (ATP+LPS) para MDSC-IL13 a granel o los subconjuntos clasificados granulocíticos Ly6G+C+ (Ly6G+) y monocíticos Ly6C+. (G) Proliferación de CFSE de células T que responden CD8+ B6 dirigidas contra anticuerpo anti-CD3s en presencia de subconjuntos clasificados granulocíticos (Ly6G+) o monocíticos (Ly6C+) de MDSC-IL13 en una razón 1:1. (H) Bioactividad de arginasa asociada a células para MDSC-IL13 a granel y subconjuntos clasificados granulocíticos (Ly6G+) o monocíticos (Ly6C+). La línea de puntos indica la actividad de fondo para los esplenocitos deficientes en Arg1. Los datos relativos a los subconjuntos de MDSC son representativos de 3 experimentos independientes.
FIGURA 5. La inducción de inflamasomas en MDSC humanas interfiere con su función supresora. Se generaron MDSC humanas a partir de PBMC de donantes. (A) ELISA de IL-1 p de sobrenadantes de MDSC tratadas durante tres horas con 0,2 pg/ml de LPS durante tres horas seguido de ATP 2 mM durante una hora antes de la recogida. Los datos son representativos de n=2 experimentos. (B) Histogramas representativos de PBMC que responden marcadas con CellTrace Violet (Life Technologies, Carlsbad, CA) en presencia de MDSC humanas cultivadas de donantes no relacionados indicados por la línea continua. La línea de puntos indica un control de proliferación sin MDSC, el histograma gris indica PBMC solas (sin CD3s ni MDSC). No se representa la alorrespuesta contra MDSC sin anticuerpo anti-CD3s. Estim. indica la adición de microperlas de anticuerpo anti-CD3s (2:1) IL-2 (100 U/ml) para demostrar la supresión de MDSC de la activación de células T. Estim infl. Tx'd indica que las MDSC se han tratado para la activación de inflamasomas antes del sembrado en placa
con microperlas de anticuerpo anti-CD3£ IL-2. (C) Los datos de agregados muestran el porcentaje de división de células T CD8 y CD4 que responden. Los datos representan respuestas de tres donantes de PBMC no relacionados, y son representativos de dos experimentos independientes.
FIGURA 6. Fenotipo extendido de MDSC-IL 13 recuperadas. Expresión superficial de MDSC-IL13 congénica (CD45.2+) recuperada de bazos cinco días después de la transferencia a animales irradiados que recibieron médula ósea sólo (sin EICH) o médula ósea más células T (EICH). Los datos representan tres réplicas por grupo con p= ns (>0,05 para todos los marcadores mostrados. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
FIGURA 7. Recuperación de CD45.2+ MDSC-IL13. (A) Gráfico de flujo representativo que muestra frecuencias de CD45.2+ de esplenocitos agrupados antes y después del enriquecimiento. Los gráficos inferiores representan las células separadas indicadas en el gráfico superior (CD45.2+ CD45.1-ve) (B) eficacia de enriquecimiento de MDSC-IL13 (CD45.2+) sin EICH y grupos con EICH. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, n=3 por grupo.
FIGURA 8. MDSC-IL13 de alta dosis. Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el efecto del aumento de las dosis de MDSC-IL13 en el día 0 en el modelo de EICH. Para distinguir los grupos de tratamiento con 2x y 3x MDSC, los datos ya mostrados en la figura 1F se indican mediante una línea de puntos y símbolos ligeramente más pequeños. Los datos representan la combinación de dos experimentos independientes con n=10 por grupo para dosis de 2x y 3x. Todos los ratones que recibieron MDSC demostraron una supervivencia aumentada frente a EICH p<0,001. La dosis de 1x, 2x o 3x en el día 0 de MDSC-IL13 no son significativamente diferentes entre sí.
FIGURA 9. Fenotipo de infusión de MDSC-IL13 en el día 0. Expresión superficial de marcadores indicados para MDSC-IL13 B6 de tipo natural (sombreado) y ASC ko (en negrita) en el día de la cosecha (cultivo en el día 4) antes de la infusión. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
FIGURA 10. Pérdida inducida por inflamasomas dependientes de ASC de supresión de células T que responden CD4. Como en la figura 3B, MDSC-IL13 de tipo natural (wt) o ASC ko se trataron tal como se indica, y se lavaron extensamente, luego se aplicaron a un ensayo de proliferación de células T marcadas con CFSE en una razón 1:1. Se muestran gráficos representativos de células T que responden CD4+ separadas, de dos experimentos independientes.
Descripción detallada de realizaciones ilustrativas
La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a una célula supresora derivada de mieloides (MDSC) deficiente en proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC). En la medida en que se describen otras células supresoras derivadas de mieloides en el presente documento, se incluyen únicamente con fines de referencia. Esta descripción describe, en un aspecto, un método para mejorar el uso de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) para inhibir la enfermedad injerto contra huésped (EICH). Generalmente, los métodos implican combinar el uso de MDSC con al menos un enfoque para limitar la activación de inflamasomas de MDSC in vivo.
Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) son una población inmunorreguladora que se produce de manera natural implicada en la inhibición de respuestas inflamatorias en curso. La generación de MDSC in vitro a partir de la médula ósea puede mejorar la supervivencia en un modelo agudo de enfermedad injerto contra huésped (EICH) mortal. Sin embargo, la infusión de MDSC de donantes mejora sólo parcialmente la mortalidad de la EICH. Con el fin de mejorar el posible beneficio terapéutico y, en última instancia, los resultados de supervivencia de la terapia con MDSC, esta descripción describe una investigación de la destrucción de las MDSC después de la transferencia en el contexto de EICH aguda (EICHa). Las MDSC transferidas a receptores mortalmente irradiados de injertos hematopoyéticos de donantes alogénicos se exponen a un intenso entorno inflamatorio asociado con la EICHa, que puede debilitar directamente la capacidad supresora de las MDSC. En las condiciones inflamatorias de la EICH, la MDSC puede perder función supresora y, por tanto, su potencial para inhibir la mortalidad de la EICH. Incluso una breve exposición in vitro a los mediadores que activan los inflamasomas puede anular el potencial supresor de las MDSC murinas y derivadas de humanos cultivadas. Consistente con un papel para el inflamasoma, las MDSC de donantes deficientes en la ASC adaptadora (proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD) que ensambla los complejos de inflamasomas confirieron una supervivencia mejorada a los ratones que desarrollan EICH en comparación con las MDSC de donantes de tipo natural. Estos datos sugieren que el uso de MDSC como un enfoque terapéutico para inhibir la EICH y otras afecciones inflamatorias sistémicas puede ser más eficaz cuando se combinan con enfoques que limitan la activación de inflamasomas de MDSC in vivo, permitiendo de ese modo a las MDSC mantener su potencial supresor.
Por ejemplo, el trasplante de células hematopoyéticas alogénicas (aHCT) es una terapia potencialmente curativa para una variedad de hemopatías, incluyendo las leucemias y los linfomas. El riesgo de morbimortalidad de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) sigue siendo un obstáculo para el uso generalizado de un trasplante alogénico para muchas enfermedades, incluyendo, por ejemplo, trastornos linfohematopoyéticos malignos y no malignos. La inmunoterapia celular dirigida como complemento de aHCT puede controlar la EICH mientras se reducen también los efectos secundarios asociados con los regímenes de acondicionamiento al estar altamente dirigidos y autorregulados internamente. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), definidas ampliamente como células de linaje mieloide con capacidad supresora, surgen de acuerdo con patologías tales como tumores, traumatismos e infecciones. La producción de novo de
MDSC a partir de la médula ósea (MO) se produce en respuesta a la inflamación y la liberación de factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF, G-CSF).
Las MDSC pueden suprimir la patología inmunitaria sistémica a través de mecanismos únicos que incluyen privación local de aminoácidos, óxido nítrico, prostaglandina E2, citocinas antiinflamatorias, especies reactivas del oxígeno, así como promoción de células T reguladoras (Treg). Los cultivos derivados de médula ósea de las MDSC incubadas con interleucina-13 (IL-13) suprimen la EICHa a través de un agotamiento dependiente de arginasa-1 de L-arginina, que a su vez inhibe las respuestas de las células T alogénicas.
La EICH aguda (EICHa) se describe a menudo como que tiene tres fases: acondicionamiento de trasplante, sensibilización de células T de donante y apoptosis de tejido de fase efectora. El régimen de acondicionamiento y la sensibilización rápida de una alta frecuencia de células T de donantes aloespecíficas conducen a una intensa inflamación sistémica. Dado que la EICHa expande las células T de donantes que tienen la capacidad de atacar al receptor, un enfoque eficaz para inhibir la mortalidad implica amortiguar las respuestas de las células T temprano después del trasplante, cuando la inflamación va en aumento y las células T alorreactivas están contribuyendo a la lesión del órgano, amplificando la respuesta inflamatoria. Por tanto, para que las MDSC de donantes proporcionen una terapia eficaz, estas células deben permanecer viables y funcionar durante un periodo de tiempo suficientemente largo para impedir la sensibilización y la expansión de células T alorreactivas.
El inflamasoma es un complejo multimolecular que actúa como un componente aguas abajo de las rutas de detección inmunitaria innata. Los factores asociados con la activación de inflamasomas incluyen, por ejemplo, la fuga asociada al intestino de los productos bacterianos y las moléculas asociadas al daño (DAMP) de las células muertas y moribundas. Para que se produzca la activación de inflamasomas, las señales de iniciación convergen y conducen a la escisión autocatalítica de pro-caspasa-1 mediada por la proteína adaptadora ASC (proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD) y, en última instancia, la escisión y exportación de IL-1 p o IL-18 activas. Las moléculas implicadas en los diferentes inflamasomas varían dependiendo de la fuente de señales de activación y la molécula aguas arriba que coalesce con ASC. Por ejemplo, los inflamasomas de la familia del receptor de tipo AIM2 (ALR) puede iniciarse mediante la unión de ADNbc citosólico a AIM2 (ausente en el mieloma 2), mientras que el inflamasoma NLRP3 (familia de receptores de tipo NOD, dominio de pirina que contiene 3) se activa por señales de daño microbiano y del huésped, y cambios en el contenido de ATP extracelular.
Esta descripción demuestra que una única infusión de MDSC temprana después del trasplante suprime transitoriamente, pero no elimina la EICH en un modelo murino de EICH mortal. Los datos establecen que la inflamación de EICH impulsa las MDSC hacia un estado de activación de inflamasomas, que es contraproducente para la función supresora de MDSC en ratones con EICH. Sin embargo, alterar genéticamente las MDSC de donantes para deshabilitar la activación de inflamasomas puede aumentar la supervivencia de EICH en relación con la terapia de MDSC de control. Además, las mismas rutas están activas en las MDSC humanas. Tomada en conjunto, esta nueva información puede mejorar la aplicación terapéutica de las MDSC.
Las MDSC en el contexto de la EICH experimentan una rápida diferenciación a fenotipo activado CD11c+
Las MDSC se generaron a partir de médula ósea (MO) recién cultivada con factores de crecimiento de citocinas GM-CSF y G-CSF en cuatro días. La activación de las MDSC cultivadas 24 horas antes de la recogida con IL-4 o IL-13 estimula la expresión de arginasa-1 y promueve la supresión funcional de las células T tanto in vitro como en el contexto de la EICH. Para demostrar que la MDSC-IL13 es eficaz para prolongar la supervivencia en un modelo de EICHa murino, se les administró a los receptores BALB/c irradiados mortalmente médula ósea C57Bl/6 alogénica más células T agotadas con CD25 para inducir a la EICHa, en presencia o ausencia de terapia celular con MDSC-IL13 en el día 0. Las células T inducen EICHa dando como resultado un tiempo medio de supervivencia de 24,5 días. Sin embargo, los animales que recibieron la terapia con MDSC-IL13 tuvieron una supervivencia prolongada a 47,5 días (figura 1A). A pesar de un resultado clínico mejorado, una mayoría de los animales tratados sucumbieron a la muerte inducida por EICH en el día 100, lo que sugiere que la patología se redujo o retrasó, pero no se eliminó. Para investigar cómo las condiciones asociadas con la EICHa podrían alterar directamente la función de las MDSC, la médula ósea o la médula ósea más célula T (condiciones de EICH) con MDSC-IL13 congénicas CD45.2+ se administraron a los animales CD45.1+que luego se sacrificaron el día 5 después del trasplante para examinar el fenotipo y la función de las MDSC recuperadas.
Fenotípicamente, las MDSC recuperadas de animales trasplantados que recibieron sólo el acondicionamiento más médula ósea mantuvieron un aspecto inmaduro de CD11co, MHCIIb, F4/80int (figura 1B y figura 1C). Sin embargo, las MDSC-IL13 transferidas a animales sometidos a condiciones de EICHa (células T CD8+ CD4+, CD25-) regularon por incremento CD11c y MHC de clase II, características de las células mieloides activadas. La expresión de F4/80 también se aumentó, lo que sugiere que la activación y la diferenciación se produjeron rápidamente en respuesta al entorno inflamatorio en curso promovido por las células T alorreactivas (figura 1B y figura 1C). Otros marcadores de coestimulación y activación permanecieron sin cambios (figura 6). Para medir el estado funcional de las MDSC recuperadas, las MDSC aisladas ex vivo se cultivaron conjuntamente con células T marcadas con CFSE, activadas con AcM anti-CD3s. Las MDSC-IL13 del día 5 de animales trasplantados con médula ósea sólo eran altamente supresoras (figura 1D, sin EICH). Por el contrario, las respuestas de las células T en presencia de las MDSC-IL13 recuperadas de animales con EICH mostraron sólo una ligera reducción en la proliferación total en relación con el grupo de control sin MDSC (figura 1D), lo que indica una pérdida de función celular supresora de las MDSC en receptores con EICH.
Una explicación para la pérdida de supresión por las MDSC in vivo podría ser la supervivencia comprometida de las células supresoras. La viabilidad de las MDSC se mantiene mediante la supresión continua de las rutas de muerte mitocondrial de caspasa-8 extrínseca e intrínseca. La manipulación de cualquiera de estas rutas puede provocar una disminución rápida en la viabilidad de las MDSC y una disminución concomitante en la supresión. Se investigó el número y la viabilidad de las células transferidas en los bazos de receptores después de la transferencia. No se observaron diferencias significativas entre las condiciones de médula ósea sólo y las condiciones de EICH cuando se observó el número total de células CD45.2+ CD11b+ o la viabilidad en el día 5 (figura 1E). Estos datos sugieren que las MDSC-IL13 reducen la EICHa durante un periodo de tiempo limitado después del trasplante y que las MDSC-IL13 pierden posteriormente la función supresora en condiciones de EICH, dando como resultado un fallo en mantener un beneficio terapéutico.
Infusiones múltiples de MDSC-IL13 mejoran la supervivencia a largo plazo con EICH
El aumento de la razón de las MDSC-IL13 con respecto a las células T durante la inducción de EICH desde 3:1 hasta 6:1 (2x) o hasta 9:1 (3x) en el momento del trasplante no aumentó significativamente la supervivencia global (figura 8). En contraste, las dosis repetitivas de MDSC-IL13 recién cultivadas promovieron y/o mantuvieron un entorno supresor durante el periodo de peritrasplante de la sensibilización de células T durante la EICHa. Se administraron tres infusiones de MDSC-IL13 cultivadas el día 0, el día 3 y el día 6 después del trasplante, totalizando una razón de agregados de MDSC-células T de 9:1. Infusiones múltiples de MDSC-IL13 promovieron una cohorte (50 %) de supervivientes a largo plazo frente a <10 % de supervivientes a largo plazo cuando se administró una infusión de MDSC-IL13 en un único día 0 (figura 1F). La observación de que infusiones repetidas de MDSC-IL13 recién cultivadas aumentan la supervivencia respaldan la hipótesis de que el entorno inflamatorio intenso encontrado durante la inducción de EICHa no afecta la persistencia o viabilidad de las MDSC, sino que cambia el entorno del huésped de modo que las MDSC-IL13 transferidas son efectivamente menos supresoras con el tiempo.
Conversión asociada a la producción de IL-1 p, activación de inflamasomas
La actividad del inflamasoma NLRP3 del huésped puede exacerbar la EICH en un modelo murino. Además, los pacientes con EICH pueden presentar niveles aumentados de caspasa-1 e IL-1 p en suero asociadas con inflamasomas. Adicionalmente, las MDSC producen fácilmente IL-1 p cuando se exponen a determinados agentes quimioterápicos, dando como resultado una respuesta antitumoral alterada. Los lisados celulares de las MDSC-IL13 recuperados después de cinco días en las condiciones de EICH se sometieron a prueba para determinar la forma procesada de p10 de caspasa-1, un mediador aguas arriba de la actividad de inflamasomas. Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostraron cantidades aumentadas de caspasa-1 p10 en las MDSC-IL13 recuperadas de las condiciones de EICH en relación con las MDSC-IL13 recuperadas de receptores de control de trasplante de médula ósea sólo (figura 2A y figura 2B). Se encontró evidencia adicional de la conversión de las MDSC a la activación de inflamasomas cuando se colocaron las MDSC-IL13 recuperadas en medio completo durante un cultivo durante la noche; el análisis de los sobrenadantes demostró una mayor IL-1 p de las condiciones de EICH (figura 2C). Estos datos establecen una correlación entre las MDSC-IL13 en el contexto de condiciones de EICHa y la actividad de inflamasomas.
La inducción in vitrode MDSC-IL13 de IL-1 p implica ASC
IL-1 p puede interferir directamente con la supresión mediada por Treg y la promoción de la función de células T efectoras. Para investigar adicionalmente un papel para la activación de inflamasomas y la producción de IL-1 p, se examinó la inducción de inflamasomas in vitro en MDSC-IL13 cultivadas. NLRP3 y A1M2 representan dos familias principales de inflamasomas en donde una variedad de señales puede potenciar la cascada de inflamasomas, pero la proteína adaptadora ASC puede ser un componente común requerido para la activación completa del inflamasoma. Se usaron médula ósea de tipo natural y ASC-/-(Pycard1') para generar las MDSC-IL13 para someter a prueba si podrían inducirse para la actividad de inflamasomas. En el momento de la transferencia, las ASC-/- MDSC-IL13 tenían un fenotipo de superficie similar a las MDSC-IL13 de tipo natural (figura 9). El inflamasoma NLRP3 se sometió a prueba incubando las MDSC-IL13 con LPS durante tres horas seguido de ATP, mientras que el inflamasoma AIM2 se acopló usando LPS seguido de transfección de poli(dT). En tan solo una hora después del estímulo secundario, se detectó IL-1 p en los sobrenadantes de cultivo de las MDSC-IL13 de tipo natural (figura 3A). Sin embargo, las ASC-/- MDSC-IL13 no produjeron IL-1 p detectable, estableciendo que las MDSC-IL13 son capaces de responder rápidamente a los cambios en su entorno para producir el mediador proinflamatorio IL-1 p de una manera dependiente de ASC. Además, la inducción de inflamasomas de las MDSC-IL13 puede alterar su capacidad supresora. Siguiendo el mismo procedimiento para inducir inflamasomas en sólo cuatro horas, las MDSC-IL13 luego se lavaron extensamente y se sembraron en placa en un ensayo de supresión in vitro de proliferación de células T a estimulación con anticuerpo anti-CD3s. La inducción de inflamasomas in vitro reduce la capacidad de las MDSC-IL13 para suprimir funcionalmente las células T que responden CD8+ (figura 3B) y CD4+ (figura 10). Además, este efecto también dependía de la ASC, soportando la hipótesis de que la activación de inflamasomas está asociada con una pérdida de función supresora en lugar de, por ejemplo, la viabilidad comprometida y/u otros factores de maduración.
La inducción de inflamasomas reduce la eficacia de las MDSC-IL13 en la EICH
Las MDSC-IL13 cultivadas in vitro se trataron como anteriormente para la activación del inflamasoma NLRP3 o AIM2, seguido de un lavado extenso antes de la transferencia en el modelo de EICHa. Tal como se observa para la supresión in
vitro, la activación de inflamasomas de las MDSC-IL13 redujo el beneficio de supervivencia con EICH en comparación con la terapia con MDSC-IL13 de control, que aumentó significativamente la supervivencia con EICH (p<0,0001, figura 3C).
Dado que la conversión de las MDSC-IL13 a un estado maduro activado por inflamasomas después de la transferencia terapéutica está implicada en el contexto de la EICHa, usando las MDSC-IL13 genéticamente incapaces de la activación de inflamasomas pueden mantenerse mejor la función y mejorar aún más la supervivencia con EICH. De hecho, los receptores de las ASC-/- MDSC-IL13 habían mejorado aún más la supervivencia en relación con las MDSC-IL13 de tipo natural (p=0,0006), ambas de las cuales eran significativamente mejores que el grupo sin MDSC (figura 3D). Además, las ASC-/-MDSC-IL13 recuperadas de animales con EICH cinco días después de la transferencia tuvieron una mayor capacidad supresora de células T en comparación con las MDSC-IL13 de tipo natural (figura 3E). Estos hallazgos implican juntos directamente la activación de inflamasomas intrínseca de MDSC-IL13 en condiciones de EICH como desempeñando un papel en la limitación de la eficacia de la terapia celular con MDSC.
El mecanismo para la supresión mediada por MDSC-IL13 de EICH es la actividad de arginasa-1 (arg1) que directamente debilita la sensibilidad de las células T y promueve la supervivencia con EICH. La bioactividad de la enzima arg1 de las MDSC-IL13 después de la inducción de inflamasomas se midió para determinar si la actividad de arg1 se redujo de acuerdo con la inducción de inflamasomas. Se encontró una marcada caída en la actividad de arg1 tal como se midió por ARNm (no mostrado) o actividad bioenzimática cuando se indujeron los inflamasomas NLRP3 o AIM2 (figura 4A y figura 4B). No fue evidente una caída similar en las ASC-/- MDSC, aunque hubo una tendencia, lo que sugiere que las rutas pueden no estar conectadas directamente. Para investigar adicionalmente la actividad de arg1, se usaron animales transgénicos YFP-Arg1 (YARG, en donde la expresión de arg1 se une a la proteína amarilla fluorescente (YFP)), lo que permite analizar rápidamente una pérdida de expresión asociada. IL-13 regula por incremento fácilmente la fluorescencia de YFP, mientras que IFNy (que induce las MDSC que expresan iNOS) no aumentó la fluorescencia de YFP (figura 4C y figura 4D). Como anteriormente, la inducción de inflamasomas a través de las rutas de NLRP3 o AIM2 dio como resultado una pérdida concomitante de fluorescencia de YFP, lo que indica que la expresión de arg1 se había detenido en asociación con las condiciones de inducción de inflamasomas. Finalmente, se aplicaron las MDSC-IL13 generadas a partir de animales transgénicos YARG al modelo de trasplante, administrando o bien la médula ósea sólo o bien la médula ósea más células T completas para las condiciones de EICH. La fluorescencia de YFP de las MDSC recuperadas después de cinco días de animales con médula ósea sólo se redujo en relación con la expresión inmediatamente después del cultivo, pero todavía se detectó fácilmente por encima del fondo (figura 4E). Sin embargo, en las MDSC-IL13 recuperadas de animales con EICH, YFP ya no era detectable, reduciéndose a los niveles de fondo observados en la médula ósea no estimulada. Estos resultados respaldan además un vínculo entre una pérdida de expresión de arg1 y la actividad de inflamasomas durante la EICH.
Las MDSC a menudo se definen como heterogéneas, con dos subconjuntos principales descritos en los sistemas murinos que son granulocíticos (Ly6G+) y monocíticos (Ly6C+G-). Cada subconjunto se evaluó para determinar si cada uno tenía una capacidad similar para la activación de inflamasomas y cómo la capacidad supresora podría verse afectada diferencialmente. Las MDSC-IL13 de médula ósea cultivada son >90 % Ly6C+ (figura 9), y se clasificaron en base a la expresión de Ly6G. Las condiciones de activación de inflamasoma NLRP3 conducen a niveles equivalentes de producción de IL1p tanto para los subconjuntos monocíticos Ly6C+G- como para granulocíticos Ly6G+ (figura 4F). Sin embargo, cuando se aplica a un ensayo de supresión in vitro independiente de la activación de inflamasomas, la capacidad supresora se contuvo virtualmente en su totalidad dentro del subconjunto Ly6C+G-(figura 4G). Además, la bioactividad de arg1 se asoció con el subconjunto monocítico (figura 4H). En conjunto, estos datos indican que la pérdida de la función supresora en ratones con EICH se asoció con la actividad de inflamasomas y no se debe a un cambio hacia Ly6G+ o diferencias en la capacidad de producción de IL1 p. Por tanto, las frecuencias relativamente más altas del subconjunto Ly6C+G- en el grupo con EICH frente al grupo sin EICH no tiene en cuenta la pérdida de capacidad supresora in vivo.
Las MDSC humanas cultivadas pierden función cuando se activa su inflamasoma.
Las MDSC se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tal como se describió previamente (Lechner y col., 2010, J Immunol 185(4):2273-2284). Estas MDSC se usaron para investigar si las MDSC humanas podrían tener una predisposición similar a la pérdida de función activada por inflamasomas tal como se encuentra con las MDSC murinas. Se cultivaron PBMC humanas, enriquecidas para el marcador mieloide CD33, durante siete días con GM-CSF e IL-6. En estas condiciones, las MDSC humanas suprimían la proliferación dirigida por AcM anti-CD3s de los pacientes que responden al tratamiento con PBMC no relacionados. Las MDSC humanas se confirmaron como capaces de responder a las condiciones de activación de inflamasomas, añadiendo LPS seguido de ATP para acoplarse al inflamasoma NLR3. Se necesitan tanto LPS como ATP para impulsar la producción de MDSC de IL-1 p (Figura 4A). A continuación, se añadieron MDSC activada por inflamasomas al ensayo de proliferación de PBMC dirigido a AcM anti-CD3s. Como en el sistema murino, las MDSC expuestas a los componentes de activación de inflamasomas (Estim. infl. Tx'd) perdieron la supresión concomitante con la producción de IL-1 p.
Por tanto, las células T alorreactivas son un factor contribuyente a la morbimortalidad en EICH clínica, y el uso de la terapia celular reguladora puede ser una estrategia viable para controlarlas. Las MDSC pueden generarse a partir de médula ósea normal en una cantidad de tiempo relativamente corta y pueden suprimir eficazmente la EICH, la autoinmunidad y el rechazo de aloinjerto. Esta descripción informa de que las MDSC activadas por la citocina IL-13 producen arg1 que, a su vez, permite que las MDSC supriman la EICH. Sin embargo, en un modelo de EICH riguroso con una coincidencia errónea de MHC completa, la terapia con MDSC promueve la supervivencia prolongada, pero no protege en última instancia a la mayoría de
los animales frente a EICH mortal. Esta descripción demuestra además que la activación de inflamasomas intrínseca de MDSC transferidas adoptivamente limita su eficacia in vivo. Las MDSC cultivadas son capaces de responder rápidamente de una manera dependiente de ASC para producir cantidades significativas de IL-1 p, dando como resultado una pérdida asociada de supresión in vitro. Además, poco después de la transferencia in vivo, las MDSC en el contexto de la EICHa se convierten en un fenotipo maduro de CD11c+ y presentan una pérdida de capacidad supresora ex vivo. Estas MDSC tienen cantidades aumentadas de caspasa-1 p10, un indicador de la activación de inflamasomas y secretan IL-1 p cuando se colocan en cultivo durante la noche, a diferencia de los controles en condiciones sin EICH.
En contraste, cuando la activación de inflamasomas está genéticamente prohibida usando las ASC-/- MDSC-IL13, la supervivencia con EICH se mejora sobre los receptores de trasplante con MDSC-IL13 de tipo natural y las ASC-/- MDSC-IL13 recuperadas mantienen una mejor capacidad supresora ex vivo. Los métodos adicionales para alterar la susceptibilidad de las MDSC a la activación/conversión de inflamasomas pueden incluir la atenuación génica de ASC u otros genes asociados a inflamasomas (por ejemplo, NLRP3, AIM2, caspasa-1). Las atenuaciones génicas pueden obtenerse usando, por ejemplo, ARNhc/ARNpi, TALEN, meganucleasas, megaTALEN y/o tecnologías CRISPER, y/o mutagénesis dirigida al sitio.
Las células mieloides están implicadas en el inicio y la conformación de respuestas inmunitarias tanto en las direcciones proinflamatorias como antiinflamatorias, y demuestran una plasticidad notable. Esta adaptabilidad puede ser tanto una ventaja como una desventaja, ya que permite generar rápidamente células altamente supresoras a partir de médula ósea normal in vitro, pero permite que la eficacia transitoria se vea tras la transferencia a un entorno inflamatorio grave tal como EICHa. Mientras que las MDSC se describen como heterogéneas por naturaleza y los marcadores fenotípicos no siempre se traducen entre modelos o especies de enfermedades, las rutas de activación de inflamasomas parecen estar altamente conservadas. En los datos informados en esta descripción, las MDSC generadas a partir de médula ósea de ratón o PBMC humanas activan fácilmente los inflamasomas dando como resultado la producción de IL-1 p que se correlaciona con una pérdida de la función supresora. Los pacientes con EICHa pueden presentar caspasa-1 escindida y IL-1 p aumentada, respaldando además la conclusión de que la EICH está asociada con la activación de inflamasomas. Las MDSC se asocian casi de manera ubicua con tumores establecidos y pueden perturbar activamente las intervenciones de inmunoterapia. Una distinción entre la activación inducida por tumor y la activación de inflamasomas inducida por EICH de las MDSC es que el desarrollo de las MDSC asociadas a tumor se produce en la situación de inflamación localizada crónica, en contraste con la respuesta inflamatoria sistémica intensa de EICH.
Debido a que las MDSC activadas por EICH secretan IL-1 p, es posible que tales MDSC contribuyan al proceso de mortalidad por EICH. La IL-1 p tiene efectos pleótropos dependientes de la célula que lo produce, el estado del microentorno circundante y la expresión temporal, pero generalmente se entiende que es proinflamatoria y, en algunos casos, contrarreguladora. Cuando las células MDSC-IL13 recuperadas del día 5 de los receptores de trasplante de EICH se aplican a un ensayo de supresión in vitro, la proporción de células T que proliferaron no eran diferentes de las de los controles sin MDSC, aunque las células T en proliferación se sometieron a menos divisiones celulares, lo que sugiere que quedaba cierta capacidad supresora. Estos datos sugieren que las MDSC-IL13 activadas por EICH no impulsaron directamente la mortalidad por EICH, lo que concuerda con el hallazgo de que las curvas de supervivencia en los receptores tratados con MDSC-IL13 son paralelas a las de los controles sin MDSC, después de un retraso de 2-3 semanas. La expresión de arginasa-1, que promueve el beneficio de supervivencia conferida por las MDSC-IL13 durante la transferencia adoptiva, se inhibió en las MDSC activadas por inflamasomas, contabilizando posiblemente la pérdida de supresión por las MDSC de donantes.
La familia NLR de mediadores de inflamasomas, tales como NLRP3, son un candidato para promover la conversión de inflamasomas bajo condiciones de EICH, ya que se encuentran tanto ATP como señales de daño asociadas después del acondicionamiento y pueden estar implicadas en la mejora de la EICH. La activación del inflamasoma NLRP3 en el contexto de EICH se ha demostrado tanto para protocolos de inducción de radioterapia como de quimioterapia, dando como resultado daño tisular y liberación de patrones moleculares asociados a daño (DAMP). Las MDSC transferidas de manera adoptiva también pueden ser susceptibles a la inducción de inflamasomas, y los mismos mediadores pueden contribuir a la activación in vivo. Los reactivos que se dirigen selectivamente al inflamasoma NLRP3 pueden promover fines dobles de inhibición de la activación de inflamasomas en el huésped y las MDSC de donantes infusionadas. Por ejemplo, MCC950, un inhibidor de molécula pequeña, y p-hidroxibutirato (BHB), una cetona producida bajo estrés metabólico, han demostrado especificidad hacia la activación de NLPR3 suprimida y enfermedades mediadas por NLRP3. Alternativamente, los productos virales y bacterianos, tales como el ADNbc, también pueden ser impulsores potentes tanto de EICH como de la familia de receptores de tipo AIM2 de los inflamasomas. Aunque el desarrollo de EICH no depende de la actividad de la ruta MyD88/TRIF del huésped, la liberación de ADNbc por células muertas/moribundas a partir de radiación y lesión inducida por EICH puede amplificar la mortalidad en algunas condiciones.
Tomados en conjunto, los datos informados en esta descripción indican que el potencial terapéutico de las MDSC de donantes puede aumentarse reduciendo el grado en que el entorno inflamatorio de la EICH inhibe el grado en que las MDSC experimentan la activación de inflamasomas. El tratamiento previo de la terapia celular con MDSC terapéutica para inhibir específicamente la activación de inflamasomas a través de alteración genética (por ejemplo, atenuación de la expresión génica, ARNhc/ARNip/meganucleasa, megaTAL, CRISPER) o a través de inhibición farmacológica (MCC950/BHB) son métodos para mantener intrínsecamente la función de las MDSC. Además, el tratamiento farmacológico o el direccionamiento específico de MDSC in vivo para administrar fármacos y agentes que pueden regular la formación o función de los inflamasomas o agentes que regulan los factores de estimulación en el paciente que conducen a la activación de
inflamasomas del paciente (antes, durante y/o después del trasplante) también pueden reducir la conversión de inflamasomas de la terapia celular con MDSC con el beneficio añadido de prevenir la actividad de inflamasomas derivada del huésped, que ha demostrado estar asociada con una mayor gravedad de la EICH.
Por el contrario, en el entorno crónicamente inflamado generalmente asociado con el crecimiento tumoral, la generación de novo de MDSC y la actividad de inflamasomas se asocian conjuntamente a menudo. Tal supresión de las MDSC puede reducir o eliminar la eficacia de la quimioterapia, radioterapia, cirugía y/o inmunoterapia con fármacos, anticuerpos/proteínas, vacunas y/o terapias celulares. Los hallazgos presentados en este caso que demuestran que la función de las MDSC está comprometida directamente a través de la actividad de inflamasomas asociada con la EICH aguda sugieren que el grado de inflamación influye en el soporte funcional de las MDSC. Por tanto, las terapias antitumorales tales como las enumeradas de manera inmediata anteriormente que están destinadas a la erradicación de tumores pueden promoverse adicionalmente estimulando la activación local o sistémica de inflamasomas con la intención de eliminar/desactivar las MDSC asociadas a tumor.
El estado de la técnica del campo sugirió inicialmente que la activación crónica de inflamasomas aumentaría la función supresora de MDSC. Sin embargo, los hallazgos del presente documento en EICH indican que la activación de inflamasomas de nivel alto revierte las capacidades supresoras de las MDSC. Por tanto, un enfoque novedoso para revertir la supresión de las MDSC en tumores puede implicar activar las MDSC dentro del tumor usando enfoques tales como, por ejemplo, proporcionar un agente de estimulación tal como, por ejemplo, ácido úrico, ATP, agentes que estimulan los receptores de tipo Toll, ADN, ARN y/u otros agentes que pueden regular por incremento la función de los inflamasomas.
Por tanto, en un aspecto, esta descripción describe un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener enfermedad injerto contra huésped (EICH). Generalmente, el método incluye administrar al sujeto una pluralidad de las MDSC en una cantidad eficaz para mejorar al menos un síntoma o signo clínico de la enfermedad injerto contra huésped en comparación con un sujeto de control adecuado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” o variaciones del mismo se refiere a reducir, limitar la progresión, mejorar o resolver, en cualquier medida, los síntomas o signos clínicos relacionados con la EICH. Un “tratamiento” puede ser terapéutico o profiláctico. “Terapéutico” y variaciones del mismo se refieren a un tratamiento que mejora uno o más síntomas o signos clínicos existentes asociados con la EICH. “ Profilácticos” y variaciones del mismo se refieren a un tratamiento que limita, en cualquier medida, el desarrollo y/o la aparición de un síntoma o signo clínico de la EICH. En general, un tratamiento “terapéutico” se inicia después de que la EICH se manifieste en un sujeto, mientras que el tratamiento “profiláctico” se inicia antes de que la EICH se manifieste en un sujeto. Tal como se usa en el presente documento, “síntoma” se refiere a cualquier evidencia subjetiva de la EICH, mientras que “signo” o “ signo clínico” se refiere a un hallazgo físico objetivo relacionado con la EICH capaz de ser encontrado por otra persona que no sea el paciente.
Además, el término “en riesgo” se refiere a un sujeto que puede o no poseer realmente el riesgo descrito. Así, por ejemplo, un sujeto “en riesgo” para desarrollar la EICH es un sujeto que posee uno o más indicios de riesgo aumentado de tener, o desarrollar, la EICH en comparación con individuos que carecen de uno o más indicios, independientemente de si el sujeto manifiesta cualquier síntoma o signo clínico de tener o desarrollar la EICH.
En algunas realizaciones, el método puede incluir administraciones repetidas de las MDSC para reemplazar a las MDSC en administraciones anteriores a medida que las MDSC previamente administradas experimentan activación de inflamasomas y se vuelven menos capaces de suprimir las células T alorreactivas. Es decir, readministrar secuencialmente las MDSC puede reponer una población de las MDSC que pierden la supresión en un entorno inflamatorio con nuevas MDSC que aún no han activado su función de los inflamasomas.
En algunas realizaciones, la terapia puede incluir un mínimo de al menos dos administraciones de las MDSC tales como, por ejemplo, al menos tres administraciones, al menos cinco administraciones, al menos diez administraciones, al menos quince administraciones, al menos veinte administraciones, al menos veinticinco administraciones o al menos cincuenta administraciones. En algunas realizaciones, la terapia puede incluir un máximo de no más de cincuenta administraciones de las MDSC tales como, por ejemplo, no más de cuarenta administraciones, no más de treinta administraciones, no más de veinte administraciones, no más de diez administraciones o no más de cinco administraciones. En algunas realizaciones, la terapia puede incluir un intervalo de administraciones que tienen puntos finales definidos por cualquier número mínimo de administraciones enumerado anteriormente y cualquier número máximo de administraciones enumerado anteriormente que sea mayor que el número mínimo de administraciones. Por tanto, en una realización a modo de ejemplo, la terapia puede incluir desde tres hasta cinco administraciones de las MDSC.
En algunas realizaciones, las administraciones secuenciales de las MDSC pueden separarse mediante un intervalo mínimo de al menos 24 horas tal como, por ejemplo, al menos dos días, al menos tres días, al menos siete días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 90 días. En algunas realizaciones, las administraciones secuenciales de las MDSC pueden separarse mediante un intervalo máximo de no más de un año, no más de seis meses, no más de 90 días, no más de 60 días, no más de 30 días o no más de 14 días. En algunas realizaciones, las administraciones secuenciales de las MDSC pueden separarse mediante un intervalo caracterizado como un intervalo que tiene puntos finales definidos por cualquier intervalo mínimo entre las administraciones enumeradas anteriormente y cualquier intervalo máximo entre las administraciones enumeradas anteriormente que sea mayor que el intervalo mínimo entre las administraciones. Por tanto,
en una realización a modo de ejemplo, la terapia puede incluir las MDSC administradas en un intervalo que tiene un mínimo de una vez al día a un máximo de una vez cada dos días.
En algunos casos, al menos una porción de las MDSC puede tratarse con y/o incluir una modificación genética que provoca que las MDSC resistan a la activación de inflamasomas. En algunos casos, las MDSC pueden tratarse previamente con, por ejemplo, un fármaco, ARNhc/ARNip y/o CRISPR que provoca que las MDSC resistan a la activación de inflamasomas. Una modificación genética a modo de ejemplo que provoca que las MDSC resistan a la activación de inflamasomas puede incluir una deficiencia en la proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC).
Puede lograrse un efecto similar en algunas realizaciones tratando adicionalmente al sujeto durante y/o después de la infusión de MDSC con un agente que inhibe el inflamasoma y reduce de ese modo el grado en que las MDSC infusionadas se someten a la activación de inflamasomas. Los enfoques a modo de ejemplo para inhibir el inflamasoma pueden incluir agentes que inhiben directamente el inflamasoma. Otros enfoques pueden implicar el uso de un agente que dirige y/o neutraliza al menos parcialmente un agente que estimula los inflamasomas. Los agentes que estimulan los inflamasomas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ácido úrico, ATP, un agente que estimula un receptor tipo Toll, ADN, ARN y/u otro agente que puede regular por incremento la función de los inflamasomas.
La terapia, ya sea profiláctica o terapéutica, puede administrarse durante una duración mínima de al menos una semana tal como, por ejemplo, al menos dos semanas, al menos un mes, al menos tres meses, al menos seis meses, o al menos un año. La terapia puede administrarse durante una duración máxima de no más de 20 años, tal como, por ejemplo, no más de 10 años, no más de cinco años, no más de dos años, no más de un año, no más de nueve meses, no más de seis meses, no más de tres meses, no más de dos meses, no más de un mes o no más de dos semanas. La terapia puede administrarse durante una duración caracterizada por un intervalo que tiene como puntos finales cualquier duración mínima enumerada anteriormente y cualquier duración máxima enumerada anteriormente que sea mayor que la duración mínima. Por tanto, en una realización a modo de ejemplo, la terapia puede tener una duración desde una semana hasta dos semanas.
Las MDSC pueden formularse en una composición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “ portador” incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, vehículo, recubrimiento, diluyente, agente antibacteriano y/o antifúngico, agente isotónico, agente retardante de la absorción, tampón, disolución de portador, suspensión, coloide y similares. El uso de tales medios y/o agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los principios activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. Tal como se usa en el presente documento, “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con las MDSC sin provocar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en donde está contenida.
La composición farmacéutica puede formularse en una variedad de formas adaptadas a una vía de administración preferida. Por tanto, una composición puede administrarse mediante vías conocidas que incluyen, por ejemplo, vías de administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, transcutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.).
Por tanto, las MDSC pueden proporcionarse en cualquier forma adecuada incluyendo, pero sin limitarse a, una disolución, una suspensión, una emulsión o cualquier forma de mezcla. La composición puede administrarse en formulación con cualquier excipiente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una formulación puede presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Los métodos de preparación de una composición con un portador farmacéuticamente aceptable incluyen la etapa de poner las MDSC en asociación con un portador que constituye uno o más componentes accesorios. En general, una formulación puede prepararse poniendo de manera uniforme y/o íntima el compuesto activo en asociación con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto en las formulaciones deseadas.
La cantidad de las MDSC administrada puede variar dependiendo de diversos factores, incluyendo, pero sin limitarse a, el peso, la condición física y/o la edad del sujeto, y/o la vía de administración. Por tanto, la cantidad absoluta de las MDSC incluidas en una forma de dosificación unitaria dada puede variar ampliamente y depende de factores tales como la especie, edad, peso y condición física del sujeto, y/o el método de administración. Por consiguiente, no es práctico establecer en general la cantidad que constituye una cantidad de las MDSC eficaz para todas las aplicaciones posibles. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad apropiada con la debida consideración de tales factores. En algunas realizaciones, una única administración de las MDSC puede incluir un mínimo de al menos 105 MDSC tal como, por ejemplo, al menos 106 MDSC, al menos 107 MDSC, al menos 108 MDSC, al menos 109 MDSC, al menos 1010 MDSC, al menos 1011 MDSC, o al menos 1012 MDSC. En algunas realizaciones, una única administración de las MDSC puede incluir un máximo de no más de 1013 MDSC tal como, por ejemplo, no más de 1012 MDSC, no más de 1011 MDSC, no más de 1010 MDSC, no más de 109 MDSC, no más de 108 MDSC, no más de 107 MDSC, o no más de 106 MDSC. En algunas realizaciones, una única administración de las MDSC puede incluir un número de las MDSC caracterizado como un intervalo que tiene puntos finales definidos por cualquier número mínimo de las MDSC enumerado anteriormente y cualquier número
máximo de las MDSC enumerado anteriormente que sea mayor que el número mínimo de las MDSC. Por tanto, en una realización a modo de ejemplo, una única administración de las MDSC puede incluir un intervalo de 107 MDSC a 1010 MDSC. En otra realización a modo de ejemplo, una única administración de las MDSC puede incluir un intervalo de 4 x 107 MDSC a 5 x 108 MDSC.
En otro aspecto, esta descripción describe un método de tratamiento de un tumor. Generalmente, el método incluye aumentar la activación de inflamasomas de las MDSC suficientemente para deshabilitar la función supresora de las MDSC en las proximidades del tumor. En algunos casos, el aumento de la activación de inflamasomas puede incluir proporcionar al menos un agente que estimula los inflamasomas tal como, por ejemplo, ácido úrico, ATP, un agente que estimula un receptor tipo Toll, ADN, ARN y/u otro agente que puede regular por incremento la función de los inflamasomas.
El agente que estimula los inflamasomas puede administrarse conjuntamente con una terapia antitumoral convencional diseñada para erradicar el tumor, tal como, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugía y/o inmunoterapia con fármacos, anticuerpos/proteínas, vacunas y/o terapias celulares. Tal como se usa en el presente documento, “ administrado conjuntamente” se refiere a dos o más componentes de una combinación administrada de modo que los efectos terapéuticos o profilácticos de la combinación pueden ser mayores que los efectos terapéuticos o profilácticos de cualquier componente administrado solo. Dos componentes pueden administrarse conjuntamente simultánea o secuencialmente. Pueden proporcionarse componentes administrados conjuntamente de manera simultánea en una o más composiciones farmacéuticas. La administración conjunta secuencial de dos o más componentes incluye casos en donde los componentes se administran de modo que cada componente pueda estar presente en el sitio de tratamiento al mismo tiempo. Alternativamente, la administración conjunta secuencial de dos componentes puede incluir casos en donde al menos un componente se ha eliminado de un sitio de tratamiento, pero al menos un efecto celular de administrar el componente (por ejemplo, producción de citocinas, activación de una determinada población celular, etc.) persiste en el sitio de tratamiento hasta que se administran uno o más componentes adicionales en el sitio de tratamiento. Por tanto, una combinación administrada conjuntamente puede, en determinadas circunstancias, incluir componentes que nunca existen en una mezcla química entre sí.
En algunos casos, la terapia antitumoral puede administrarse a la misma dosis y frecuencia para la que la terapia ha recibido la aprobación reguladora. En otros casos, la terapia antitumoral puede administrarse a la misma dosis y frecuencia en la que se evalúa en estudios clínicos o preclínicos. Pueden alterarse las dosificaciones y/o la frecuencia según sea necesario para lograr un nivel deseado de efecto antitumoral cuando se administra conjuntamente con el agente que estimula los inflamasomas. Por tanto, pueden usarse pautas posológicas convencionales/conocidas y/o puede personalizarse la dosificación según sea necesario.
De manera similar, el agente que estimula los inflamasomas puede formularse en cualquier forma adecuada. Además, por ejemplo, el agente que estimula los inflamasomas puede administrarse a la misma dosis y frecuencia para la que puede haber recibido la aprobación reguladora. En otros casos, el agente que estimula los inflamasomas puede administrarse a la misma dosis y frecuencia a la que puede evaluarse en estudios clínicos o preclínicos. Pueden alterarse las dosificaciones y/o frecuencia según sea necesario para lograr un nivel deseado del agente que estimula los inflamasomas. Por tanto, pueden usarse pautas posológicas convencionales/conocidas y/o puede personalizarse la dosificación según sea necesario. En la descripción anterior y en las siguientes reivindicaciones, el término “y/o” significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de cualesquiera dos o más de los elementos enumerados; los términos “comprende” , “que comprende” y variaciones de los mismos deben interpretarse como de extremos abiertos, es decir, los elementos o etapas adicionales son opcionales y pueden estar o no presentes; a menos que se indique lo contrario, “ un/uno” , “una” , “el/la” y “al menos uno” se usan de manera intercambiable y significan uno o más de uno; y las menciones de intervalos numéricos mediante puntos de extremo incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
En la descripción anterior, pueden describirse realizaciones particulares de manera aislada para mayor claridad. A menos que se especifique expresamente de otra manera que las características de una realización particular son incompatibles con las características de otra realización, determinadas realizaciones pueden incluir una combinación de características compatibles descritas en el presente documento en relación con una o más realizaciones.
Para cualquier método descrito en el presente documento que incluya etapas discretas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según sea apropiado, cualquier combinación de dos o más etapas puede realizarse simultáneamente.
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
Examples
Ratones
Se adquirieron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (H2d), C57BL/6NCr (H2b) y B6-Ly5.2/Cr (B6-CD45.1+, H2b) del Instituto Nacional del Cáncer. Los ratones con genes inactivados de ASC (Mariathasan y col., 2004. Nature
430(6996):213-218) y los ratones YFP-Arg1 (YARG) (Reese y col, 2007. Nature 447(7140):92-96) en un contexto genético C57BI/6 se ha descrito previamente. Se alimentó y se alojó a todos los ratones en una instalación libre de patógenos específica en jaulas Micro-isolator en protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Minesota.
Generación de MDSC
Las MDSC murinas se generaron cultivando médula ósea C57Bl/6 a 3 x 105 células/ml en medio Eagle modificado por Dulbecco más suero bovino fetal al 10 %, 2-mercaptoetanal 50 gM, hEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y aminoácidos complementarios (1,5 mM de cada una de L-glutamina, L-arginina y L-asparagina). Se añadieron 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF/Neupogen, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) y 2,5 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos de ratón (GM-CSF, R&D Systems, Inc., Mineápolis, MN) y los cultivos se incubaron a 37 °C, el 10 % de CO2 durante cuatro días. En el día 3, se añadieron 40 ng/ml de IL-13 murino recombinante (R&D Systems, Inc., Mineápolis, MN) para la inducción de arginasa-1; alternativamente, se añadió IFNy a la misma concentración. Se recogieron las MDSC el día 4 eliminando suavemente el 70 % del sobrenadante de cultivo. Los medios restantes y las células poco adherentes se recogieron luego antes de la adición de tripsina/EDTA. Después de 10 minutos a 37 °C, las placas se rasparon ligeramente y se lavaron para recoger las células restantes, que cuando se agruparon con células ligeramente adherentes dieron como resultado la recuperación de >92 % de CD11b+. Para la inducción de inflamasomas, el día 4 se añadió LPS (0,2 gg/ml) a los cultivos. Después de tres horas, para estimular el inflamasoma NLRP3, se añadió ATP 2 mM durante una hora, alternativamente para la activación del inflamasoma AIM2 se añadió poli(dT) usando el reactivo Lipofectamine 2000 por las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) durante una hora antes del lavado y análisis de sobrenadantes o transferencia adoptiva. Se generaron las MDSC humanas a partir de PBMC de donantes normales, aisladas de sangre de adultos obtenida del Memorial Blood Center (Minéapolis, MN) mediante centrifugación usando un gradiente de Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La generación in vitro se llevó a cabo tal como se describió anteriormente (Lechner y col., 2010. J Immunol 185(4):2273-2284), modificado mediante enriquecimiento mieloide anterior con CD33+, que se llevó a cabo usando un sistema de MACs de Miltenyi según las instrucciones. Los cultivos se recogieron el día 7 para la inducción de inflamasomas, seguido de lavado y sembrado en placa en ensayos de supresión tal como se describió anteriormente (Hippen y col, 2008. Blood 112(7):2847-2857). Las muestras humanas del banco de sangre se obtuvieron mediante las directrices aprobadas por el Comité sobre el Uso de Sujetos Humanos en la Investigación de la Universidad de Minesota.
EICH
Los receptores BALB/c se irradiaron mortalmente usando una irradiación corporal total de 700 cGy un día antes de la infusión de 1 x 107 C57Bl/6 de médula ósea de donante, 2 x 106 células T agotadas con CD25 C57Bl/6 purificadas de gánglio linfático, y 6 x 106 C57Bl/6 MDSC-IL 13 cultivadas en el día 0 o tal como se indica. El enriquecimiento de células T se llevó a cabo usando un sistema de aislamiento celular negativo (EASYSEP, Stemcell Technologies Inc., Vancouver, Canadá) y anticuerpos biotinilados contra CD19, B220, CD11b, CD11c, NK1.1, y5 TCR y CD25, según las instrucciones del fabricante. Se monitorizaron diariamente los ratones para determinar la supervivencia.
Recuperación de MDSC ex vivo
MDSC-IL13 generadas a partir de donantes congénicos CD45.2+ (B6 o ASC ko) se transfirieron a receptores CD45.1+ tal como se describe. Cinco días después del trasplante, se agruparon los bazos de 3-4 receptores por muestra (n=3 muestras por grupo) para aumentar la recuperación y facilitar los ensayos funcionales. Se aislaron esplenocitos CD45.2+ (MDSC-IL13) por agotamiento de células T del huésped y de donantes usando el método RAPIDSPHERE EASYSEP (Stemcell Technologies Inc., Vancouver, Canadá) y un anticuerpo biotinilado anti-CD45.1 según las instrucciones del fabricante, dando como resultado una recuperación >80 % de CD45.2+ MDSC-IL13 (figura 7).
Clasificación de MDSC-IL13 de subconjuntos granulocíticos (Ly6G+) y monocíticos (Ly6C+ G-ve)
Los cultivos de MDSC-IL13 se marcaron a granel con anticuerpos anti-Ly6G (clon 1A8) conjugados con APC, seguido de marcaje de microperlas anti-APC y aplicación a columnas MACs LS de Miltenyi para la separación basándose en la expresión de Ly6G+ según las instrucciones del fabricante. Esto dio como resultado una clasificación eficaz de los subconjuntos granulocíticos y monocíticos que luego se usaron para un análisis adicional.
Citometría de flujo y ensayo de supresión
La adquisición de datos de citometría de flujo se llevó a cabo en un dispositivo BD LSRFortessa y el análisis se realizó usando el software FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland. OR). Para los ensayos de supresión murina, las células T que responden se tiñeron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) 3,5 gM y se incubaron con 0,25 gg/ml de anticuerpo anti-CD3s antes del análisis en el día 3. En ensayos de supresión de MDSC humanas, las PBMC que responden se marcaron con CELL TRACE Violet (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y se estimularon con perlas recubiertas con AcM anti-CD3s (DYNAL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; razón 2:1) más 100 U/ml de huIL-2; las muestras se recogieron el día 4.
ELISA, inmunotransferencia de tipo Western y ensayo de arginasa
Se evaluó la IL-1 p murina y humana en sobrenadantes de cultivo usando los respectivos conjuntos de ELISA BD OptEIA, siguiendo las instrucciones del fabricante (BD Biosciences, San José, CA). Para las inmunotransferencias de tipo Western, las MDSC purificadas se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía el cóctel inhibidor de RIPA, proteasa (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX) y fosfatasa (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO), después se congeló instantáneamente. Se fraccionaron 4 pg de proteína de lisados celulares en geles de SDS-PAGE al 4-12 % (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), se transfirieron a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (GE Healthcare Co., Little Chalfont, Reino Unido) y se sometieron a prueba para detectar caspasa-1 escindida usando AcM de conejo anti-caspasa-1 escindida p10 (sc-514, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX; 1:500). Los anticuerpos secundarios usados fueron un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) para la detección de los anticuerpos anticaspasa 1 escindida (1:10.000) y anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP para la detección del Ac anti-p-actina (1:2750). Se usó el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) para estimar las cuantificaciones relativas de las bandas de inmunotransferencia de tipo Western. La actividad de arginasa-1 se determinó usando el kit de ensayo de arginasa QuantiChrom (Bioassay Systems LLC, Hayward, CA). Las muestras se normalizaron a 4 x 105 células por muestra, se lavaron, se sedimentaron y se resuspendieron en 100 pl de tampón de lisado que contiene inhibidor de proteasa, luego se analizaron según las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Los estudios de supervivencia se representan por las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, con comparaciones estadísticas determinadas usando estadísticas de rango logarítmico. La prueba de la t de Student se usó para el análisis estadístico de los datos adquiridos in vitro (software Prism, software GraphPad, Inc., LaJolla, CA). p< 0,05 se definió como estadísticamente significativo.
En el caso de que exista cualquier inconsistencia entre la descripción de la presente solicitud y la(s) descripción/descripciones de cualquier documento referenciado en el presente documento, prevalecerá la descripción de la presente solicitud. La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han proporcionado sólo para claridad de comprensión. No debe entenderse ninguna limitación innecesaria de los mismos. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, sino que se define por las reivindicaciones.
A menos que se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etc., usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones han de entenderse modificados en todos los casos por el término “aproximadamente” . Por consiguiente, a menos que se indique de otro modo lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos informados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.
A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos en el presente documento sean aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Sin embargo, todos los valores numéricos contienen inherentemente un intervalo necesariamente resultante de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
Todos los títulos son para comodidad del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al título, a menos que así se especifique.
Claims (12)
1. Una célula supresora derivada de mieloides (MDSC) deficiente en proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC).
2. La MDSC según la reivindicación 1, en donde la MDSC comprende una modificación genética que da como resultado una resistencia a la activación de inflamasomas.
3. La MDSC según la reivindicación 2, en donde la modificación genética es una modificación del gen ASC que da como resultado una deficiencia de ASC.
4. La MDSC según la reivindicación 2 o 3, en donde la modificación genética se obtiene usando un ARNhc, ARNip y/o CRISPR.
5. Una pluralidad de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) que comprenden al menos una MDSC según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Una pluralidad de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) deficientes en proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC) para su uso en un método de inhibición de la EICH en un sujeto que recibe un trasplante alogénico para trastornos linfohematopoyéticos.
7. La pluralidad de MDSC deficientes en ASC para su uso según la reivindicación 6, en donde las MDSC deficientes en ASC son tal como se definen en la reivindicación 6.
8. Un método in vitro para potenciar el potencial terapéutico de una célula supresora derivada de mieloides (MDSC) que comprende interrumpir la expresión génica de la proteína de tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (ASC) de la célula, obteniendo de ese modo una MDSC que tiene un potencial terapéutico mejorado.
9. El método según la reivindicación 8, en donde la etapa de interrupción comprende una modificación genética usando un ARNhc, ARNip y/o CRISPR.
10. El método según la reivindicación 9, en donde la modificación genética provoca que la MDSC resista a la activación de inflamasomas y evite una disminución en la actividad de arginasa-1, en comparación con la MDSC no modificada.
11. El procedimiento según la reivindicación 8, en donde la MDSC que tiene potencial terapéutico mejorado es deficiente en ASC.
12. El método según la reivindicación 8, en donde el potencial terapéutico mejorado comprende resistencia a la activación de inflamasomas, supresión de la sensibilización y expansión de células T alorreactivas asociada con la EICH, reducción del riesgo de tener EICH y/o mejorar la supervivencia a largo plazo con EICH.
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