CN112646777B - 一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，包括以下步骤：(1)获取小鼠骨髓细胞，使用完全培养基进行培养；(2)向步骤(1)所述培养体系中加入抑制c‑Myc基因表达的试剂，混匀后继续培养，获得髓系来源的抑制性细胞。本发明首次发现抑制c‑Myc基因的表达可促进MDSC的扩增，并建立了相应的方法学。通过本发明方法可在体外快速地安全地扩增出具有免疫抑制功能的MDSC，获得的MDSC可应用于自身免疫性疾病治疗等领域，对基于MDSC的细胞免疫治疗具有重要的价值。

Description

一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法

技术领域

本发明属于免疫学和细胞生物学技术领域，具体涉及一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法。

背景技术

髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是在某些病理情况下，因髓系细胞分化障碍所产生的未成熟髓系细胞及髓系祖细胞的集合。在正常状态下，髓系祖细胞及未成熟髓系细胞(IMCs)是骨髓中髓系细胞分化过程的中间环节，这些细胞会最终分化为成熟的巨噬细胞、粒细胞或树突状细胞。然而，在肿瘤、感染和炎症等病理情况下，髓系细胞分化过程受阻，造成处于不同分化阶段的髓系祖细胞及未成熟髓系细胞增多，并获得免疫抑制功能，即为MDSC。MDSC具有强大的免疫抑制功能，其可以诱导调节性T细胞(Treg)产生、抑制T细胞增殖、阻止T细胞的迁移、促进T细胞凋亡、抑制NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及B细胞等。

MDSC被认为是免疫学领域的十大进展之一，其可作为新的免疫治疗靶点。因此，开发一种快速地特异性扩增MDSC的方法对基于MDSC的细胞免疫治疗具有重要的意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，所述方法操作简单，可在体外快速扩增获得具有免疫抑制功能的MDSC。

具体技术方案为：

一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，包括以下步骤：

(1)获取小鼠骨髓细胞，使用完全培养基进行培养；

(2)向步骤(1)所述培养体系中加入抑制c-Myc基因表达的试剂，混匀后继续培养，获得髓系来源的抑制性细胞。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述培养体系中小鼠骨髓细胞的密度为1-2.2×10⁶/ml。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述完全培养基为包含以下浓度组分的RPMI 1640培养基：10-15v/v％FBS、45-55mMβ-ME、8-12ng/ml IL-6、15-25ng/ml GM-CSF。

在其中一些实施例中，所述完全培养基中还含有抗生素。

在其中一些实施例中，步骤(2)中待小鼠骨髓细胞培养12～24h再加入抑制c-Myc基因表达的试剂。

在其中一些实施例中，步骤(2)中加入抑制c-Myc基因表达的试剂，混匀后继续培养5-8天，获得髓系来源的抑制性细胞。

在其中一些实施例中，所述抑制c-Myc基因表达的试剂选自c-Myc基因抑制剂、shRNA、siRNA中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述c-Myc基因抑制剂为10074-G5。

在其中一些实施例中，所述shRNA和siRNA针对c-Myc基因序列设计，可特异性抑制c-Myc基因的表达。

在其中一些实施例中，所述10074-G5在培养体系中的浓度为5-25μM。

在其中一些实施例中，优选所述10074-G5在培养体系中的浓度为5-15μM。

本发明还提供了抑制c-Myc基因表达的试剂在制备扩增髓系来源的抑制性细胞的试剂盒中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:

本发明首次发现抑制c-Myc基因的表达可促进MDSC的扩增，并建立了相应的方法学。通过本发明方法可在体外快速地安全地扩增出具有免疫抑制功能的MDSC，获得的MDSC可应用于自身免疫性疾病治疗等领域，对基于MDSC的细胞免疫治疗具有重要的价值。

附图说明

图1为10074-G5 5μM组、10074-G5 10μM组和DMSO对照组细胞c-Myc基因表达的检测结果。

图2为10074-G5 5μM组、10074-G5 10μM组和DMSO对照组细胞MDSC比例的检测结果。

图3为10074-G5 5μM组、10074-G5 10μM组和DMSO对照组扩增获得的MDSC抑制T细胞增殖的实验结果。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下实施例中所述双抗含10000U/ml青霉素和10mg/ml链霉素。

实施例1

本实施例一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，包括以下步骤：

(1)获取小鼠骨髓细胞，使用完全培养基进行培养：

1)颈部脱位法处死小鼠，取出小鼠的股骨和胫骨，放入加有RPMI 1640培养基的无菌培养皿中；

2)用手术剪剪去小鼠股骨和胫骨的两端，用无菌注射器吸入5ml RPMI 1640培养基，将注射器插入骨髓腔，缓缓地将骨髓腔中的细胞冲至50ml无菌离心管中，可以重复冲洗一次；

3)加入5ml红细胞裂解液，将细胞于裂解液中混匀，静置5min后加入PBS10ml，终止反应，并且混匀，于3500rpm/min离心5min，弃上清；

4)用完全培养基(包含以下浓度组分的RPMI 1640培养基：10v/v％FBS、50mMβ-ME、10ng/ml IL-6、20ng/ml GM-CSF、1v/v％双抗)将小鼠骨髓细胞调整至2×10⁶/ml，然后接种到24孔培养板中(每孔2mL)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(2)向步骤(1)所述培养体系中加入c-Myc基因表达抑制剂10074-G5，混匀后继续培养6天，获得髓系来源的抑制性细胞：

待步骤(1)所述培养体系培养12h后向体系中加药进行处理：10074-G5 5μM(终浓度)组、10074-G5 10μM(终浓度)组、DMSO对照组，混匀后继续培养6天(培养至第3天时重新更换新的完全培养基，并加药处理)，获得髓系来源的抑制性细胞。

实施例2

本实施例利用荧光定量PCR法检测实施例1中加药处理的各组细胞的c-Myc基因表达水平。

实施例1中小鼠骨髓细胞加药处理24h后，在光学显微镜下观察细胞，发现细胞形态正常，说明加药处理没有产生细胞毒性。然后收集各组细胞，利用荧光定量PCR法检测c-Myc基因的表达，具体实验方法如下：

(1)收集各组细胞，利用TRIzol法提取总RNA；

(2)使用TaKaRa公司的

RT reagent Kit将总RNA逆转录为cDNA；

(3)使用TaKaRa公司的

Premix Ex TaqTM进行荧光定量PCR检测，检测引物如下：c-Myc-for：5'-CTGTACCTCGTCCGATTCCA-3'；c-Myc-Rev：5'-TCTCCTCATGCAGCACTAGG-3'。检测体系如下：2×SYBR Premix Ex Taq，5uL；10uM PCR Forward Primer，0.5uL；10uMPCR Reverse Primer，0.5uL；灭菌ddH₂O，3uL；cDNA，1uL。检测程序如下：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；第2步开始40个循环；

(4)观察扩增曲线和溶解曲线分析引物的扩增效率，用2^-ΔΔCT法分析实验结果。

结果如图1所示，由图1可知，与DMSO对照组相比，10074-G5 5μM(终浓度)组和10074-G5 10μM(终浓度)组中c-Myc基因的表达显著下调，且10074-G5对c-Myc基因的抑制作用具有浓度依赖性。

实施例3

本实施例利用流式细胞术检测实施例1中加药处理的各组细胞的MDSC(CD11b⁺Gr1⁺)比例。

实施例1中的小鼠骨髓细胞培养6天后，收集各组细胞，使用流式细胞术检测MDSC的比例，具体实验方法如下：

(1)收集约1×10⁶个细胞置于5ml流式管中，于3500rpm/min离心5min，弃上清；

(2)重新加入约5ml预冷的PBS吹打重悬细胞，以洗掉残余血清等杂质，于用3500rpm/min离心5min后弃上清；

(3)按照1:400的比例对流式抗体进行稀释，即每个样品中加入100μl PBS与0.25μl的流式抗体(CD11b和Gr1)。抗体避光保存且使用前短暂离心。用移液枪对细胞进行吸吹混匀后，于4℃进行避光孵育30min；

(4)加入约4ml预冷的PBS以终止染色，于3500rpm/min离心5min，弃上清；

(5)每管用500μl含0.5v/v％FBS的PBS重悬细胞，经100目细胞筛网过滤后于4℃保存，使用流式细胞仪进行检测。

结果如图2所示，由图2可知，与DMSO对照组相比，10074-G5 5μM(终浓度)组和10074-G5 10μM(终浓度)组中MDSC的比例显著增多，说明通过10074-G5抑制c-Myc基因的表达可促进MDSC的扩增。

本实施例同时还利用T细胞增殖实验检测实施例1中培养获得的MDSC的免疫抑制功能，具体实验方法如下：

(1)流式细胞术分选各组培养获得的MDSC细胞：

1)收集各组细胞，参照上述流式细胞术检测方法进行染色，流式抗体用量按照每1×10⁸的细胞加入3μl流式抗体，加入1ml预冷的PBS对细胞进行重悬，于4℃避光孵育30min；

2)加入无菌预冷的PBS终止染色，于3500rpm/min离心5min，弃上清；

3)加入含有0.5％FBS的PBS重悬细胞，经100目细胞筛网进行过滤后，调整细胞密度至1×10⁸/ml；

4)细胞进行流式分选，分选后的细胞收集于含有10v/v％FBS和1v/v％双抗的RPMI1640培养基中，以维持细胞活力；

5)将收集到的细胞于3500rpm/min离心5min，弃上清，获得的细胞沉淀即为MDSC细胞，用于T细胞增殖实验。

(2)T细胞增殖实验：

1)用含0.1％BSA的无菌PBS配制250μM的CFSE储存液；

2)流式细胞术分选获得小鼠脾脏CD3⁺T细胞，重悬于37℃预热的含0.1％BSA的无菌PBS中，调整细胞浓度达l×10⁶/ml；

3)加入4ul浓度为250μM的CFSE储存液于细胞悬液中，使CFSE终浓度达1μM；

4)37℃孵育15min，加入5倍体积的冷的培养基冰上放置5min终止染色，3500rpm/min离心5min；

5)用RPMI1640培养基洗涤3次，调整细胞浓度达3×10⁵/孔，铺板于96孔板；

6)各组加ConA(5ug/ml)刺激，每组设2个复孔。以MDSC:T＝1:2的比例加入步骤(1)获得的各组MDSC，培养72h后，收集细胞，经CD4-PE和CD8a-PE-Cy5双染色后，流式细胞术检测。

结果如图3所示，与DMSO对照组相比，10074-G5 5μM(终浓度)组和10074-G5 10μM(终浓度)组扩增获得的MDSC抑制T细胞增殖的能力明显增强，能更有效地抑制T细胞的增殖。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获取小鼠骨髓细胞，使用完全培养基进行培养；

（2）向步骤（1）所述培养体系中加入抑制c-Myc基因表达的试剂，混匀后继续培养，获得髓系来源的抑制性细胞；所述c-Myc基因抑制剂为10074-G5，所述10074-G5在培养体系中的浓度为5-25μM。

2.根据权利要求1所述的扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，其特征在于，步骤（1）所述培养体系中小鼠骨髓细胞的密度为1-2.2×10⁶/ml。

3.根据权利要求1所述的扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，其特征在于，步骤（1）所述完全培养基为包含以下浓度组分的RPMI 1640培养基：10-15v/v% FBS、45-55mM β-ME、8-12ng/ml IL-6、15-25ng/ml GM-CSF。

4.根据权利要求1所述的扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中待小鼠骨髓细胞培养12~24h再加入抑制c-Myc基因表达的试剂。

5.根据权利要求1所述的扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中加入抑制c-Myc基因表达的试剂，混匀后继续培养5-8天，获得髓系来源的抑制性细胞。

6.抑制c-Myc基因表达的试剂在制备扩增髓系来源的抑制性细胞的试剂盒中的用途；所述c-Myc基因抑制剂为10074-G5，所述10074-G5在所述试剂盒使用时的培养体系中的浓度为5-25μM。

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