CN111197029B - 一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，包括以下步骤：(1)从样本中分离单核细胞；(2)用含GM‑CSF的完全培养基对步骤(1)获得的单核细胞进行体外培养；(3)向步骤(2)所述培养体系中加入尿酸钠继续进行体外培养，获得髓系抑制性细胞。本发明方法安全简单，可快速诱导产生具有免疫抑制功能的髓系抑制性细胞，通过本发明方法制备得到的髓系抑制性细胞可用于治疗自身免疫性疾病和肿瘤性疾病等，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法。
背景技术
髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是最初在荷瘤小鼠中被鉴定的具有免疫抑制功能的异质类细胞群。肿瘤细胞通过释放可促进髓系细胞积聚的可溶性因子来调节骨髓和脾脏等部位的组织微环境，这些髓系细胞随后促进新生血管形成和转移，进而形成肿瘤微环境，致使原本髓系细胞从其正常分化途径发育为成熟巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞的最终分化转向高度免疫抑制状态下分化为未成熟髓系细胞的积累，这些细胞被命名为髓系抑制性细胞，以突出它们共同的髓系来源和免疫调节特性。与MDSCs表型相同的未成熟髓系细胞(Immature myeloid cells，IMCs)在健康个体的骨髓中不断生成并分化为成熟髓系细胞，但并没有免疫抑制功能。MDSCs主要分为两个亚群：粒细胞PMN-MDSCs和单核M-MDSCs。在大多数类型的癌症中，PMN-MDSCs占全部MDSCs的70-80％，而M-MDSCs通常不超过20％。
目前的研究表明MDSCs与肿瘤、慢性感染、创伤和炎症等多种疾病的发生发展密切相关。尽管目前在髓系来源的抑制性细胞相关领域的研究取得了重大的突破，但是由于髓系来源的抑制性细胞细胞数量少、可用于细胞治疗的、安全的、非肿瘤来源的髓系来源的抑制性细胞的体外扩增方法目前尚未有详尽描述。
尿酸钠，分子式为C5H3N4O3Na，外观为白色或白中夹带黄色的抛物状粉末。尿酸钠被认为和痛风性关节病的发病机理和草酸钙结石的形成有关。溶于氢氧化钠，几乎不溶于乙醇。尿酸钠已用于逆转活性氧和氮代谢产物对酶活性的抑制作用。有研究表明兔血清中分离的免疫球蛋白分子与尿酸钠晶体进行了抗体种群在其承担的结合位点的晶体表面结构的印记的形成。
因而，开发一种简单快速地体外扩增髓系来源的抑制性细胞的技术，用于炎症、自身免疫性等疾病的细胞治疗，将具有重大的现实意义和客观临床需求。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，所述方法安全简单，可快速诱导产生具有免疫抑制功能的髓系抑制性细胞。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，包括以下步骤：
(1)从样本中分离单核细胞；
(2)用含GM-CSF的完全培养基对步骤(1)获得的单核细胞进行体外培养；
(3)向步骤(2)所述培养体系中加入尿酸钠继续进行体外培养，获得髓系抑制性细胞。
优选地，所述步骤(1)中的样本为小鼠骨髓或人外周血。
更优选地，所述小鼠为6-8周龄的C57小鼠。
优选地，所述步骤(2)中的完全培养基由RPMI 1640和包含以下原料的组分制备而成：
胎牛血清 10v/v％；
β-巯基乙醇 50uM。
优选地，所述完全培养基中还含有抗生素。
更优选地，所述抗生素为青霉素和链霉素；所述青霉素在完全培养基中的浓度为100U/ml，所述链霉素在完全培养基中的浓度为0.1mg/ml。
优选地，所述步骤(2)中GM-CSF在完全培养基中的浓度为20-30ng/ml。
优选地，所述步骤(2)中单核细胞在完全培养基中的密度为0.8-1.0×106cells/ml。
更优选地，所述步骤(2)单核细胞在完全培养基中密度为0.8×106cells/ml。
优选地，所述步骤(3)中尿酸钠在培养体系中的浓度为200-600μg/ml。
更优选地，所述步骤(3)中尿酸钠在培养体系中的浓度为500μg/ml。
优选地，所述步骤(3)中加入尿酸钠后继续体外培养5-6天，培养至第3天时更换一次培养液。
本发明的另一目的在于提供尿酸钠在制备体外诱导产生髓系抑制性细胞的试剂中的用途。
本发明还提供了一种体外诱导产生髓系抑制性细胞的试剂盒，所述试剂盒包含尿酸钠和GM-CSF。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了尿酸钠在体外诱导产生髓系抑制性细胞的方法，所述方法安全简单，可快速诱导产生具有免疫抑制功能的髓系抑制性细胞。通过本发明方法制备得到的髓系抑制性细胞可用于治疗炎症、自身免疫性疾病和肿瘤性疾病等，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1尿酸钠诱导产生小鼠髓系抑制性细胞的流式检测结果图。
图2为实施例1尿酸钠诱导产生的小鼠髓系抑制性细胞的T细胞增殖实验检测结果图。
图3为实施例2尿酸钠诱导产生的人髓系抑制性细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1尿酸钠将小鼠单核细胞转化为髓系抑制性细胞(MDSCs)
一、实验方法
本实施例一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，包括以下步骤：
(1)从小鼠骨髓中分离单核细胞：
1)颈椎脱位法处死6周龄C57小鼠，将小鼠浸泡在75％酒精中3min消毒；取出小鼠，用眼科剪剪开小鼠双侧腿部皮肤，自髋关节剪下双侧腿骨。小心剪去股骨与胫骨的附着肌肉，勿伤及关节面，忌暴露骨髓腔；
2)在生物安全柜中，将剥离出的股骨、胫骨浸泡于75％酒精中3min后转移至预冷的RPMI 1640培养基中；
3)用眼科剪轻轻剪开股骨或胫骨两端，然后用5ml无菌注射器吸取RPMI1640培养基，对准50ml离心管冲出骨髓腔中骨髓组织；
4)3000rpm/min，室温离心5min，弃上清，加入5ml红细胞裂解液ACK，吹打混匀后裂解5min，然后加入30ml预冷的PBS终止裂解；室温3000rpm/min，离心5min以获取细胞沉淀；
5)弃上清后再加入10ml预冷的RPMI 1640，吹打重悬细胞，显微镜细胞计数板计数，备用。
(2)用含GM-CSF的完全培养基对步骤(1)获得的单核细胞进行体外培养：
1)细胞计数后，用完全培养基(RPMI1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+50uMβ-ME)将细胞密度调整至0.8×106cells/ml；
2)培养体系中加入重组小鼠源GM-CSF细胞因子(20ng/ml)，充分混匀后，将细胞悬液按每孔1ml铺于48孔板中。
(3)向步骤(2)所述培养体系中加入尿酸钠继续进行体外培养，获得髓系抑制性细胞：
向细胞培养板中加入尿酸钠(浓度分别为100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml)，对孔中的骨髓细胞进行相应尿酸钠处理，DMSO处理组作为对照。
(4)流式细胞术检测：
体外培养6天后，收集细胞进行流式细胞术检测：
1)取含0.5million的单细胞悬液，加入5ml PBS混匀，3000rpm/min离心5min，弃尽上清；
2)用于分析小鼠MDSC的流式抗体染色组合为：PMN-MDSC(CD11b+Gr1+Ly6C-Ly6Ghi)和M-MDSC(CD11b+Gr1+Ly6ChigLy6G-)；
3)按照抗体说明书，抗体1:200使用PBS稀释，每个样本用100μl抗体稀释液。将流式管于振荡器上振荡，充分混匀；于4℃冰箱避光染色30min。加入4ml PBS，3000rpm/min离心5min，弃去上清；加入500μl PBS重悬细胞后，流式上机检测，获取数据并用FlowJo10软件进行分析。
二、实验结果
流式检测结果如图1所示，由图1可知，与加入DMSO处理的对照组相比，尿酸钠处理能显著提高体外诱导培养体系中PMN-MDSCs的比例，说明尿酸钠成功在体外诱导产生了MDSCs。
本实施例还利用T细胞增殖实验对上述诱导产生的MDSCs的免疫抑制功能进行了检测，具体如下：
一、实验方法
(1)流式细胞术分选得到上述诱导产生的MDSCs：
在无菌条件下，将上述培养体系中的细胞进行流式染色PMN-MDSC(CD11b+Gr1+Ly6C-Ly6Ghi)和M-MDSC(CD11b+Gr1+Ly6ChigLy6G-))；染色后调整细胞浓度至5-10million/ml，然后进行流式分选；用含5v/v％FBS完全RPMI1640完全培养基收集目的细胞，放置冰上，备用。
(2)T细胞增殖实验：
T细胞增值实验用于界定MDSC的免疫抑制功能，包括以下步骤：
1)用含0.1％BSA的无菌PBS配制CFSE，配制成终浓度为2.5mM的储存液；
2)将分选的B/c小鼠脾脏来源CD3+T细胞重悬于37℃预热的0.1％BSA的PBS中，细胞浓度为0.35million/200μl；加入CFSE于细胞悬液中，使CFSE的终浓度为2.5μM；37℃孵育15min，中途颠倒混匀一次；
3)加入5倍体积的预冷的完全RPMI1640培养基，冰上放置5min，终止染色；3000rpm/min离心5min，弃尽上清；
4)调整细胞浓度至0.35million/200μl，待用；
5)将流式分选得到的目标MDSCs和对照细胞，均调整细胞浓度至0.35million/200μl；将T细胞与MDSCs以2:1的比例进行共培养至U底96孔板内，0.35million/孔；实验组孔内含小鼠来源anti-CD3 coated(5μg/ml)和anti-CD28(5μg/ml)功能抗体，每组设2个复孔；同时设立不加刺激抗体的空白对照组和比较MDSC的单独T细胞组；
6)培养3天后，收集细胞，进行CD4+和CD8+T细胞染色，进行流式分析T细胞增殖情况；FITC通道检测CFSE。
二、检测结果
检测结果如图2所示，由图2可知，尿酸钠诱导的小鼠来源PMN-DMSC具有更强的T细胞抑制功能。
实施例2尿酸钠将人外周血单核细胞转化为髓系抑制性细胞(MDSCs)
一、实验方法
本实施例一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，包括以下步骤：
(1)从人外周血中分离单核细胞：
取健康志愿者外周血5ml，分离得到单个核细胞；
具体方法如下：
1)用含EDTA抗凝采血管收集健康志愿者外周血，然后加入等3倍体积的PBS溶液，轻轻混匀；
2)向50ml无菌离心管中加入3ml淋巴细胞分离液；然后用吸管将血稀释液沿着管壁缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层，于18℃下600g(升5，降0)，离心22min；
3)离心后，用移液枪将中间白膜层吸出，放于一干净的15ml离心管中，加入10ml预冷的PBS溶液，混匀；室温下，600g离心10min，弃尽上清；
4)加入1ml ACK红细胞裂解液进行裂红，3min后，加入10ml预冷的PBS进行终止；室温下，600g离心10min，弃尽上清；
5)用5ml PBS进行重悬细胞沉淀，进行细胞计数，放冰上备用。
(2)用含GM-CSF的完全培养基对步骤(1)获得的单核细胞进行体外培养：
1)细胞计数后，用完全培养基(RPMI1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+50uMβ-ME)将细胞密度调整至0.8×106cells/ml；
2)培养体系中加入重组人源GM-CSF细胞因子(20ng/ml)，充分混匀后，将细胞悬液按每孔1ml铺于48孔板中；
(3)向步骤(2)所述培养体系中加入尿酸钠继续进行体外培养，获得髓系抑制性细胞：
向细胞培养板中加入尿酸钠(浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml)，对孔中的单核细胞进行相应尿酸钠处理，DMSO处理组作为对照。
(4)流式细胞术检测：
体外培养6天后，收集细胞进行流式细胞术检测：
1)取含0.5million的单细胞悬液，加入5ml PBS混匀，3000rpm/min离心5min，弃尽上清；
2)用于分析人MDSC的流式抗体染色组合为：M-MDSC(HLA-DR-/lowCD11bhiCD33hi)和PMN-MDSC(HLA-DR-/lowCD11bmedCD33med)。
3)按照抗体说明书，抗体1:200使用PBS稀释，每个样本用100μl抗体稀释液。将流式管于振荡器上振荡，充分混匀；于4℃冰箱避光染色30min。加入4ml PBS，3000rpm/min离心5min，弃去上清；加入500μl PBS重悬细胞后，流式上机检测，获取数据并用FlowJo10软件进行分析。
二、实验结果
流式检测结果如图3所示，由图3可知，与加入DMSO处理的对照组相比，尿酸钠处理人外周血单核细胞细胞6天能显著提高体外诱导培养体系中PMN-MDSCs的比例，说明尿酸钠成功在体外诱导产生了MDSCs。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从样本中分离单核细胞；
(2)用含GM-CSF的完全培养基对步骤(1)获得的单核细胞进行体外培养；
(3)向步骤(2)所述培养体系中加入尿酸钠继续进行体外培养，获得髓系抑制性细胞；所述尿酸钠在培养体系中的浓度为200-600μg/ml。
2.根据权利要求1所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样本为小鼠骨髓或人外周血样本。
3.根据权利要求1-2任一项所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的完全培养基由RPMI 1640和包含以下原料的组分制备而成：
胎牛血清 10v/v％；
β-巯基乙醇 50uM。
4.根据权利要求3所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述完全培养基中还含有抗生素。
5.根据权利要求1-2任一项所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中GM-CSF在完全培养基中的浓度为20-30ng/ml。
6.根据权利要求1-2任一项所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中单核细胞在完全培养基中的密度为0.8-1.0×106cells/ml。
7.根据权利要求1-2任一项所述的尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入尿酸钠后继续体外培养5-6天，培养至第3天时更换一次培养液。
8.尿酸钠在制备体外诱导产生髓系抑制性细胞的试剂中的用途，其特征在于，所述尿酸钠在培养体系中的浓度为200-600μg/ml。
9.一种体外诱导产生髓系抑制性细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含尿酸钠和GM-CSF；所述尿酸钠在培养体系中的浓度为200-600μg/ml。
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