CN113804813A - 一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法,包括:乳化后的溶液A在惰性气体保护下原位聚合;然后轮流加入乳化后的溶液B和乳化后的溶液C进行原位沉积和交联获得所述用于糖化血红蛋白分离的色谱填料;溶液A包括2wt%~40wt%第一单体、0.5wt%~5wt%引发剂、0.5wt%~15wt%稳定剂,余量为水;溶液B包括5wt%~40wt%第三单体、1wt%~30wt%第四单体和0.5wt%~5wt%引发剂,余量为水;溶液C包括0.5wt%~15wt%的稳定剂,余量为水。其从而达到简化操作流程、缩短制备周期、降低生产成本、减少污染浪费的目的。

Description

一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法
技术领域
本发明涉及色谱填料领域,特别是涉及一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料。
背景技术
糖尿病在我国的发病率逐年提高,因血糖控制差引起的致残、致死案例不断增多。糖化血红蛋白(HbA1c)由于其能体现患者近2个月的血糖情况,对于帮助医生更好的评估病人病情具有较大帮助,因此其作为糖尿病患者的血糖监测指标在临床上被广泛认可。
目前测定糖化血红蛋白的方法主要包括高效液相离子交换色谱法、硼酸亲和层析法、免疫分析法等。其中高效液相色谱法已被临床医生作为评估糖尿病血糖控制水平的相对金标准。高效离子交换色谱法主要利用不同成分的血红蛋白带电性的不同,与其填料的结合力大小的不同而实现分离。
糖化血红蛋白分离填料以小粒径单分散亲水聚合物颗粒为主,此外还有少量的生物大分子填料和硅胶填料,其中单分散聚合物填料的制备以种子溶胀法和分散聚合法为主。
种子溶胀法是由Ugelstad J.于90年代初提出,主要是利用乳液聚合制备的颗粒作为种子,然后用单体、交联剂、溶胀剂等进行多步溶胀、聚合,从而得到粒径更大的聚合物颗粒。专利CN1412554A采用种子溶胀法合成了氯甲基化聚苯乙烯-二乙烯基苯基质微球,并在其基础上通过胺化和表面沉积制备得到磺酸化的单分散阳离子填料。但聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒由于其表面较强的疏水性容易对生物大分子产生不可逆吸附,从而导致分离效果下降。同样的,专利CN1132213A采用一步种子溶胀法制备了聚苯乙烯交联微球和聚乙烯吡啶交联微球,但是同样没能避免不可逆吸附的问题。专利CN110314664A和专利CN1785526A也都采用种子溶胀法制备得到可用于糖化血红蛋白分析的单分散色谱填料,它是主要利用亲水性单体等对种子颗粒进行溶胀聚合,从而制得表面亲水的单分散色谱填料。虽然一定程度上降低了填料对蛋白分子的不可逆吸附,但是填料制备过程依然复杂。总之,种子溶胀法的优点是制备的填料颗粒较为均一,缺点则是整个制备过程操作繁琐,条件苛刻,周期过长,成本过高,产生的废液过多等。
分散聚合主要通过在反应前将单体、甲醇或乙醇等有机溶剂、油溶引发剂等混合为均一的体系,升温引发反应后,聚合物单体开始聚合并达到一定分子量后析出并缠绕,最终形成一定大小的聚合物颗粒。分散聚合法主要用于制备非交联以及低交联聚合物颗粒。在利用分散聚合法制备聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球的过程中,当采用一次投料来制备交联聚苯乙烯微球时,交联剂二乙烯基苯的比例不能大于1%,否则将会使得制备得到的颗粒均一性下降,呈多分散状态,严重的可能导致物料结块而使反应彻底失败。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法,其简单、高效、低成本、环保用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明提供一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法,包括如下步骤:
乳化后的溶液A在惰性气体保护下原位聚合;然后轮流加入乳化后的溶液B和乳化后的溶液C进行原位沉积和交联获得所述用于糖化血红蛋白分离的色谱填料;
溶液A包括2wt%~40wt%第一单体、0.5wt%~5wt%引发剂、0.5wt%~15wt%稳定剂,余量为水;溶液B包括5wt%~40wt%第三单体、1wt%~30wt%第四单体和0.5wt%~5wt%引发剂,余量为水;溶液C包括0.5wt%~15wt%的稳定剂,余量为水。
优选地,所述溶液A中,第一单体的含量为8~25wt%。更优选地,所述溶液A中,第一单体的含量为10~25wt%。
优选地,所述溶液A中,所述引发剂的含量为0.5~2wt%。更优选地,所述溶液A中,所述引发剂的含量为0.5~1wt%。
优选地,所述溶液A中,所述稳定剂的含量为1~8wt%。更优选地,所述溶液A中,所述稳定剂的含量为1~2wt%。
优选地,所述溶液B中包括15~40wt%的第三单体。更优选地,所述溶液B中,所述第三单体的含量为28~40wt%。
优选地,所述溶液B中包括10~25wt%的第四单体。更优选地,所述溶液B中,所述第四单体的含量为20~25wt%。
优选地,所述溶液B中,引发剂的含量为1~3wt%。更优选地,所述溶液B中,引发剂的含量为1~2wt%。
优选地,所述溶液C中,稳定剂的含量为2~10wt%。更优选地,所述溶液C中,稳定剂的含量为2~4wt%。
优选地,所述第一单体选自苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、氯甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯等的一种或几种。
优选地,所述溶液A还包括0.5wt%~30wt%第二单体。更优选地,所述溶液A中还包括2~15wt%的第二单体。更优选地,所述溶液A中还包括3~8wt%的第二单体。
优选地,所述第二单体选自二乙烯基苯、二丙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种。
优选地,所述第三单体选自丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种。
优选地,所述第四单体选自二乙烯基苯、二丙烯基苯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种。
优选地,所述引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰叔丁酯、过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的一种或几种。
优选地,所述稳定剂选自聚乙烯醇、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、β-环糊精、明胶、木质素、吐温和司班中的一种或几种。
优选地,所述溶液A与所述溶液B之间的重量比为(1~4):(1~60)。
优选地,所述溶液B与所述溶液C之间的重量比为(1~6):(1~20)。
优选地,溶液B和溶液C逐滴滴加入溶液A中。
优选地,原位聚合温度、原位沉积和交联的温度为65~95℃。
优选地,所述溶液A反应1~4小时后加入溶液B。
优选地,滴加B结束至少30min后,再滴加溶液C。
优选地,水为溶液A引发剂的良溶剂,水为溶液B中引发剂的不良溶剂。如溶液A中的引发剂为选自过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的一种或多种;溶液B中引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰叔丁酯中的一种或多种。
本申请中通过对现有技术中的制备方法进行改进,即采用原位聚合、同步交联的方式质保单分散亲水交联聚合物色谱填料,从而达到简化操作流程、缩短制备周期、降低生产成本、减少污染浪费的目的,这种制备方法采用水作为反应溶剂,反应过程不会发生结块现象,聚合反应体系稳定可控,最终能够合成单分散性好的5~10μm微球。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中制备的色谱填料的扫描电镜照片。
图2显示为本发明实施例2中制备的色谱填料的扫描电镜照片。
图3显示为本发明实施例3中制备的色谱填料的扫描电镜照片。
图4显示为本发明实施例4中制备的色谱填料的是扫描电镜照片。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
本实施例中为5μm交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球的制备:
在250mL烧杯中量取20.69wt%苯乙烯,3.68wt%二乙烯基苯,73.56wt%去离子水,0.69wt%过硫酸钾,1.38wt%羟丙基纤维素,300rpm搅拌溶解得溶液A并转移至500mL三口烧瓶中;
另取一个250mL烧杯,量取37.97wt%甲基丙烯酸缩水甘油酯,22.78wt%乙二醇二甲基丙烯酸酯,37.97wt%水,1.27wt%偶氮二异丁腈,300rpm搅拌均匀得溶液B;
2.20wt%十二烷基磺酸钠溶液于97.80wt%去离子水中得溶液C;
将三口烧瓶置于油浴锅中,开动搅拌并加热升温至85℃,在惰性气体保护下反应2小时后开始将30mL溶液B缓慢滴加到烧瓶中,30min后滴加20mL溶液C。如此循环直至溶液B、C全部滴加完毕。继续反应4小时;然后关闭反应;
将反应物使用乙醇和去离子水各清洗3遍,然后70℃真空干燥。
本实施例中制备的用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的结果见图1。
实施例2
本实施例中为8μm交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球的制备:
在500mL烧杯中量取15.49wt%苯乙烯,82.60wt%去离子水,0.77wt%过硫酸钠,1.14wt%聚乙烯吡咯烷酮,300rpm搅拌溶解得溶液A并转移至500mL三口烧瓶中;
另取一个250mL烧杯,量取38.25wt%甲基丙烯酸缩水甘油酯,22.78wt%二乙烯基苯,37.97wt%水,1.27wt%过氧化苯甲酰叔丁酯,300rpm搅拌均匀得溶液B;
2.44wt%聚乙烯吡咯烷酮溶解于97.56wt%水中得溶液C。
将三口烧瓶置于油浴锅中,开动搅拌并加热升温至75℃,在惰性气体保护下反应2小时后开始将30mL溶液B缓慢滴加到烧瓶中,30min后将20mL溶液C滴加到到烧瓶中,如此循环直至溶液B、C滴加完毕;继续反应6小时。
然后关闭反应,将反应物使用乙醇和去离子水各清洗3遍,然后70℃真空干燥。
本实施例中制备的用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的结果见图2。
实施例3
本实施例中为6μm交联聚丙烯酰胺微球的制备:
在500mL烧杯中量取23.31wt%甲基丙烯酸甲酯,74.59wt%去离子水,0.70wt%过硫酸钾,1.40wt%聚乙烯吡咯烷酮,300rpm搅拌溶解得溶液A并转移至500mL三口烧瓶中;
另取一个250mL烧杯,量取29.11wt%丙烯酰胺,22.87wt%二乙烯基苯,46.77wt%水,1.25wt%偶氮二异丁腈,300rpm搅拌均匀得溶液B;
2.91wt%聚乙烯吡咯烷酮溶解于97.09wt%水中得溶液C。
将三口烧瓶置于油浴锅中,开动搅拌并加热升温至65℃,在惰性气体保护下反应4小时后开始将溶液B缓慢滴加到烧瓶中,60min后将溶液C滴加到到烧瓶中;继续反应6小时。
然后关闭反应,将反应物使用乙醇和去离子水各清洗3遍,然后50℃真空干燥。
本实施例中制备的用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的结果见图3。
实施例4
本实施例中为5μm交联丙烯酸羟乙酯微球的制备:
在500mL烧杯中量取13.07wt%苯乙烯,6.53wt%甲基丙烯酸缩水甘油酯,78.39wt%去离子水,0.70wt%过硫酸钠,1.31wt%聚乙烯吡咯烷酮,300rpm搅拌溶解得溶液A并转移至500mL三口烧瓶中;
另取一个250mL烧杯,量取30.30wt%丙烯酸羟乙酯,22.73wt%乙二醇二甲基丙烯酸酯,45045wt%水,1.52wt%偶氮二异丁酸二甲酯,300rpm搅拌均匀得溶液B;
3.61wt%聚乙烯吡咯烷酮溶解于96.39wt%水中得溶液C。
将三口烧瓶置于油浴锅中,开动搅拌并加热升温至70℃,在惰性气体保护下反应2.5小时后,开始将1/2溶液B缓慢滴加到烧瓶中,30min后将1/2溶液C滴加到到烧瓶中,10min后将剩余溶液B、C分别滴加完毕;继续反应6小时。
然后关闭反应,将反应物使用乙醇和去离子水各清洗3遍,然后60℃真空干燥。
本实施例中制备的用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的结果见图4。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于,溶液A中不含有稳定剂,稳定剂的重量份替换为水,其他与实施例1相同。
本对比例由于在反应形成聚合种子阶段没有添加稳定剂,由此导致原位聚合形成种子的粒径大小不可控,从而导致最终形成的微球的颗粒大小不一致,单分散性差,不符合色谱使用要求。
对比例2
与实施例1不同之处在于,溶液A和溶液C中均不含有稳定剂,溶液A和溶液C中的稳定剂分别替换为水。由此导致反应过程中产生结块,无法有效合成单分散性良好的微球。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于糖化血红蛋白分离的色谱填料的制备方法,包括如下步骤:
乳化后的溶液A在惰性气体保护下原位聚合;然后轮流加入乳化后的溶液B和乳化后的溶液C进行原位沉积和交联获得所述用于糖化血红蛋白分离的色谱填料;
溶液A包括2wt%~40wt%第一单体、0.5wt%~5wt%引发剂、0.5wt%~15wt%稳定剂,余量为水;溶液B包括5wt%~40wt%第三单体、1wt%~30wt%第四单体和0.5wt%~5wt%引发剂,余量为水;溶液C包括0.5wt%~15wt%的稳定剂,余量为水。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述第一单体选自苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、氯甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯等的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述溶液A还包括0.5wt%~30wt%第二单体,所述第二单体选自二乙烯基苯、二丙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述第三单体选自丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述第四单体选自二乙烯基苯、二丙烯基苯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰叔丁酯、过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述稳定剂选自聚乙烯醇、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、β-环糊精、明胶、木质素、吐温和司班中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述溶液A与所述溶液B之间的重量比为(1~4):(1~60)。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述溶液B与所述溶液C之间的重量比为(1~6):(1~20)。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,水为溶液A中引发剂的良溶剂,水为溶液B中引发剂的不良溶剂。
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