CN113769170A - 用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法 - Google Patents

用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法。本申请通过从自身外周血中分离提取血清、从自体脂肪组织中分离脂肪胶以及分离脂肪干细胞并进行体外扩增培养，再按比例将血清、脂肪干细胞和脂肪胶进行混合，从而得到复合脂肪胶。本申请方法避免了传统脂肪干细胞培养方法中非人源血清导致的外源性污染，同时凭借血清中的活性成分可为脂肪干细胞提供适宜生长的微环境，有利于其分化和发挥强大组织修复功能，使得复合脂肪胶具有相比玻尿酸、传统脂肪、脂肪胶填充具有更明显的抗衰效果，填充疗效更加持久。

Description

用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂 肪胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法。
背景技术
注射填充是指用经皮注射的方法把特定的填充剂（或注射物）注射到目标位置达到年轻化、美形化效果的一种微整形医学美容方法，具有微创（无创）、痛苦小、安全高效，以及根据特定部位的剂量要求定制等特点，目前用于注射填充的主要部位包括面部、胸部、臀部等，其中面部注射填充可以起到轮廓塑性、皮肤去皱紧致光滑、五官立体饱满等作用；胸部、臀部注射填充主要作用为解决下垂、增大塑性、以及对先天或者外科整形后造成的局部凹陷进行修复。目前，注射填充的主要填充剂包括肉毒素类、胶原蛋白、玻尿酸（透明质酸钠）、自体脂肪、以及自体脂肪胶等，其中肉毒素类、胶原蛋白、玻尿酸等存在存留时间短、易被周围组织吸收、消耗等缺点，因此为保持效果需要定期持续注射；自体脂肪、脂肪胶虽能解决以上问题，但因肽类物质的缺乏以及个体差异，成活的脂肪细胞量不稳定，难达到理想效果，需要多次填充，因此在技术上存在一定缺陷。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法。
第一方面，本发明提供一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，是采用以下技术方案得以实现的。
一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.获取自体血清
a.取自体外周血与洗液混合均匀，静置10-15min；
b.向含有Ficoll淋巴细胞分离液中加入稀释后的血液，400g-600g离心20-30min；
c.离心结束后，取上层血浆在55-56℃下补体灭活30-35min，2000g-3000g离心5-8min，取上层血清；
S2. 分离脂肪组织
将脂肪采集袋中的脂肪组织与脂肪组织清洗液混合，静置3-5min，吸弃下层清洗液，得到脂肪组织；
S3.脂肪干细胞分离培养
a.取步骤S2分离得到的脂肪组织与消化液混合，在37℃，振荡频率为100-150rpm的条件下，震荡消化40-60min；
b.消化完成后，加入基础培养基混合均匀，300-500g离心5-10min；
c.离心结束后吸弃上层漂浮组织及上清液，加入培养基重悬并用100um滤网进行过滤，将过滤后的细胞悬液接种至培养基中进行培养；
S4.制备复合脂肪胶
Ⅰ. 脂肪胶分离
a.取步骤S2中分离得到的脂肪组织至螺口注射器中；
b.将含有脂肪组织的螺口注射器和另一只注射器与三通管连接；
c.推动含脂肪组织的注射器推杆，使全部脂肪组织通过三通管进入另一只注射器中后，再将全部组织推回原注射器，此过程重复10-15次；
d.将获得的脂肪组织在400g-600g下离心5-10min，离心后去除油滴层，获取脂肪胶；
Ⅱ.细胞消化
待步骤S3c培养的脂肪干细胞融合度达到80%-95%，对细胞进行消化回收，取5×106-1×107个细胞进行洗涤并离心；
Ⅲ.混合
取步骤S1c制备的自体血清将细胞沉淀进行重悬，经100um滤网过滤后加入步骤S4Ⅰ制备的脂肪胶混合均匀，得到复合脂肪胶。
进一步的，步骤S1a中，洗液为含有25IU/ml肝素钠的氯化钠注射液。
进一步的，步骤S2中，脂肪组织清洗液为含庆大霉素10-50IU/ml的氯化钠注射液。
进一步的，步骤S3c中，所述培养基为含有10-20 v%自体血清的基础培养基。
进一步的，步骤S4Ⅲ中，自体血清与脂肪胶的体积比为1:（2-8）。
第二方面，本发明提供一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶，是采用以下技术方案得以实现的。
一种上述用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法制备得到的复合脂肪胶。
本申请具有以下有益效果。
本申请复合脂肪胶中含有的自体血清中含有大量的生长因子等活性成分，这些因子能够促进细胞的增殖和活化，促进胶原蛋白及弹性纤维增生；自体脂肪干细胞通过自身增殖和分化直接参与组织重建，并且在其分泌的活性成份作用下，刺激周围组织细胞增殖、分化、合成大量新生的胶原、弹力纤维和透明质酸，从而辅助填充部位脂肪胶的移植成功率。上述两种成分均来自自体，无免疫原性，因此制备的复合脂肪胶填充后维持时间更久、更稳定，相较传统脂肪、脂肪胶填充具有更好的填充效果。
附图说明
图1是本申请培养得到的脂肪干细胞镜下图；
图2是本申请制备得到的复合脂肪胶的成品图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明进行进一步的说明。
本发明提供一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）获取自体血清：
① 取15ml-30ml自体外周血至离心管中，补加洗液（含有25IU/ml肝素钠的氯化钠注射液）至30-60ml，混合均匀后静置10-15min。
② 将稀释后的血液沿离心管内壁缓慢加入到含有15-20ml Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中，在400g-600g离心力下离心20-30min。
③ 离心结束后，取上层血浆至新的离心管中，55-56℃ 30-35min补体灭活，在2000g-3000g离心力下离心5-8min，取上层血清至新的离心管中4℃冷藏保存。
（2） 脂肪组织分离、冻存：
将脂肪采集袋中的脂肪组织80-120ml倒入250ml离心杯中，向离心管中倒入脂肪组织清洗液（含庆大霉素10-50IU/ml的氯化钠注射液）至总体积150-200ml，颠倒混合后静置3-5min，吸弃下层清洗液。取30-50%脂肪组织分装至50ml离心管中-80℃冷冻保存。
（3）脂肪干细胞分离培养：
取（2）中剩余的50-70%脂肪组织用于脂肪干细胞分离：
①按照15-20ml/管吸取脂肪组织加入到含有2-4ml消化液（基础培养基中含有1-2%的Ⅰ型胶原酶）的离心管中，颠倒混合3-5次后，呈45°插入到事先预热至37℃的气浴恒温振荡器的钢丝网中，调整振荡频率为100-150rpm，震荡消化40-60min。
② 消化完成后，取出离心管观察，组织块明显减少、变小，且呈现半透明结缔组织状态。加入10-15ml基础培养基，颠倒混合3-5次后，在300-500g离心力下离心5-10min。
③ 离心结束后吸弃上层漂浮组织及上清液，每管加入30-40ml培养基（培养基为含有10-20 v%自体血清的基础培养基）重悬，用100um滤网进行过滤，将过滤后的细胞悬液平均接种至2个T-75细胞培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
（4）制备复合脂肪胶：
当上述T-75细胞培养瓶中细胞生长状态良好，融合度达到80%-95%，进行复合脂肪胶制备。
a.取（2）中冻存的脂肪组织解冻复温后进行脂肪胶分离：
① 按照8-10ml/支吸取上述脂肪组织至10ml螺口注射器中。
② 取1个医用三通管，旋转旋钮使其处于所有通口连通的状态，将装好脂肪组织的注射器和一支新的10ml注射器连接于医用三通管的主、侧两个通口。开放主通口，排出注射器内空气，旋转旋钮使主、侧通口连接处于连通状态。
③ 推动含脂肪组织的注射器推杆，使全部脂肪组织通过三通管进入新的10ml注射器中后，再将全部组织推回原注射器，此过程重复10-15次。
取下含有脂肪组织的注射器，将脂肪组织打入离心管中。
④按照①-③方法连续处理2-6管脂肪组织，在400g-600g离心力下离心5-10min，离心结束后去除油滴层，取离心管中脂肪胶用于后续制备操作。
b．细胞消化：
当T-75细胞培养瓶中细胞生长状态良好，融合度达到80%-95%，对细胞进行消化回收，取5×106-1×107个细胞以复方电解质溶液离心清洗3-4次（300-500g，5-10min）。
c．混合灌装：
加入2-4ml自体血清将细胞沉淀重悬，经100um滤网过滤后加入8-16ml脂肪胶混合均匀。将此10-20ml混合均匀的复合脂肪胶灌装至10ml预充式注射器中。
实施案例：
患者李某，43岁，苹果肌下垂，太阳穴凹陷。
一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）获取自体血清：
① 取30ml自体外周血至离心管中，补加洗液（含有25IU/ml肝素钠的氯化钠注射液）至60ml，混合均匀后静置10min。
② 将稀释后的血液沿离心管内壁缓慢加入到含有15ml Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中，在500g离心力下离心23min。
③ 离心结束后，取上层血浆23.5ml至新的离心管中，56℃ 30min补体灭活，在3000g离心力下离心5min，取上层血清21.5ml至新的离心管中4℃冷藏保存。
（2）脂肪组织分离、冻存：
将脂肪采集袋中的脂肪组织110ml倒入250ml离心杯中，向离心管中倒入脂肪组织清洗液（含庆大霉素50IU/ml的氯化钠注射液）至总体积200ml，颠倒混合后静置5min，吸弃下层清洗液，共获得55ml脂肪组织。取25ml脂肪组织分装至2个50ml离心管中-80℃冷冻保存。
（3）脂肪干细胞分离培养：
上述（2）中剩余的30ml脂肪组织用于脂肪干细胞分离：
①取30ml脂肪组织平均加入到两个含有4ml消化液（基础培养基中含有1%的Ⅰ型胶原酶）的离心管中，颠倒混合5次后，呈45°插入到事先预热至37℃的气浴恒温振荡器的钢丝网中，调整振荡频率为120rpm，震荡消化45min。
②消化完成后，取出离心管观察，组织块明显减少、变小，且呈现半透明结缔组织状态。每管加入10ml基础培养基，颠倒混合5次后，在300g离心力下离心8min。
③离心结束后吸弃上层漂浮组织及上清液，每管加入15ml培养基（含自体血清3ml）重悬，用100um滤网进行过滤，将过滤后的细胞悬液接种至1个T-75细胞培养瓶中，共接种两个T-75培养瓶，放入CO2培养箱中培养。
培养得到的脂肪干细胞的镜下照片参见图1。
（4）制备复合脂肪胶：
培养4天后，上述T-75细胞培养瓶中细胞生长状态良好，融合度达到90%，进行复合脂肪胶制备。
a.取（2）中冻存的脂肪组织解冻复温后进行脂肪胶分离：
① 按照8ml/支吸取上述脂肪组织至10ml螺口注射器中。
② 取1个医用三通管，旋转旋钮使其处于所有通口连通的状态，将装好脂肪组织的注射器和一支新的10ml注射器连接于医用三通管的主、侧两个通口。开放主通口，排出注射器内空气，旋转旋钮使主、侧通口连接处于连通状态。
③推动含脂肪组织的注射器推杆，使全部脂肪组织通过三通管进入新的10ml注射器中后，再将全部组织推回原注射器，此过程重复15次。
取下含有脂肪组织的注射器，将脂肪组织打入离心管中。
④按照①-③方法连续处理3管脂肪组织，在500g离心力下离心8min，离心结束后去除油滴层，取离心管中脂肪胶共计24ml用于后续制备操作。
b．细胞消化：
对2瓶T-75培养瓶中的细胞进行消化回收，经计数，取1×107个细胞以复方电解质溶液离心清洗3次（300g，8min）。
c．混合灌装：
加入4ml自体血清将细胞沉淀重悬，经100um滤网过滤后加入16ml脂肪胶混合均匀。将此20ml混合均匀的复合脂肪胶灌装至5ml预充式注射器中，共4支。
制备得到的复合脂肪胶的成品参见图1。
患者接受了一次注射填充治疗，双侧苹果肌、太阳穴共一次性注射20ml复合脂肪胶。3天肿胀消失，填充效果显现，14天评估效果，苹果肌下垂消失，面颊光滑富有弹性；太阳穴形态饱满，与术前对比面部整体立体感增强。
180天后进行回访，填充效果保持良好，且更加自然饱满。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.获取自体血清
a.取自体外周血与洗液混合均匀，静置10-15min；
b.向含有Ficoll淋巴细胞分离液中加入稀释后的血液，400g-600g离心20-30min；
c.离心结束后，取上层血浆在55-56℃下补体灭活30-35min，2000g-3000g离心5-8min，取上层血清；
S2. 分离脂肪组织
将脂肪采集袋中的脂肪组织与脂肪组织清洗液混合，静置3-5min，吸弃下层清洗液，得到脂肪组织；
S3.脂肪干细胞分离培养
a.取步骤S2分离得到的脂肪组织与消化液混合，在37℃，振荡频率为100-150rpm的条件下，震荡消化40-60min；
b.消化完成后，加入基础培养基混合均匀，300-500g离心5-10min；
c.离心结束后吸弃上层漂浮组织及上清液，加入培养基重悬并用100um滤网进行过滤，将过滤后的细胞悬液接种至培养基中进行培养；
S4.制备复合脂肪胶：
Ⅰ. 脂肪胶分离
a.取步骤S2中分离得到的脂肪组织至螺口注射器中；
b.将含有脂肪组织的螺口注射器和另一只注射器与三通管连接；
c.推动含脂肪组织的注射器推杆，使全部脂肪组织通过三通管进入另一只注射器中后，再将全部组织推回原注射器，此过程重复10-15次；
d.将获得的脂肪组织在400g-600g下离心5-10min，离心后去除油滴层，获取脂肪胶；
Ⅱ.细胞消化
待步骤S3c培养的脂肪干细胞融合度达到80%-95%，对细胞进行消化回收，取5×106-1×107个细胞进行洗涤并离心；
Ⅲ.混合
取步骤S1c制备的自体血清将细胞沉淀进行重悬，经100um滤网过滤后加入步骤S4Ⅰ制备的脂肪胶混合均匀，得到复合脂肪胶。
2.根据权利要求1所述的一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，其特征在于：步骤S1a中，洗液为含有25IU/ml肝素钠的氯化钠注射液。
3.根据权利要求1所述的一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，其特征在于：步骤S2中，脂肪组织清洗液为含庆大霉素10-50IU/ml的氯化钠注射液。
4.根据权利要求1所述的一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，其特征在于：步骤S3c中，所述培养基为含有10-20 v%自体血清的基础培养基。
5.根据权利要求1所述的一种用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法，其特征在于：步骤S4Ⅲ中，自体血清与脂肪胶的体积比为1:（2-8）。
6.一种权利要求1-5任一所述用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶的制备方法制备得到的复合脂肪胶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306745A (zh) * 2021-12-16 2022-04-12 优赛医疗科技(天津)有限公司 用于注射填充的含有自体血清和高浓度脂肪干细胞的复合脂肪胶及其制备方法

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