CN113755634A - 一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体为一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物及其检测方法，根据鸢尾丝囊霉菌ITS序列，通过NCBI数据库的Primer‑BLAST筛选出3对扩增产物大小不同的特异引物。利用PCR技术筛选出1对引物能够特异性扩增鸢尾丝囊霉菌，灵敏度可达10‑3 ng/μL。本发明利用ITS‑PCR技术建立了特异引物Ai2‑F/Ai2‑R的鸢尾丝囊霉菌的快速分子检测体系，该方法快速、准确、灵敏度高，可应用于鸢尾丝囊霉菌的鉴定和早期预测预报。

Description

一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物及其检测方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物及其检测方法。
背景技术
丝囊霉属(Aphanomyces)属于鞭毛菌亚门真菌，是卵菌纲、水霉目、水霉科中的一属，常见的水霉科真菌还包括绵霉属、水霉属等，其中有些种类是引起稻苗绵腐病和鱼类水霉病的病原菌。由丝囊霉属真菌引起的植物病害在国内外均有报道。
1940年，Weime发现根腐丝囊霉菌（Aphanomyces euteiches）和一种镰刀属真菌（Fusarium sp.）侵染箭筈豌豆，引起根腐病。1974年，日本首次发现丝囊霉属真菌引起荷兰鸢尾基腐病，又称黄化腐败病，其病原为鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis Ichitani &Kodama）。在我国甘肃河西灌区，由黑腐丝囊霉（Aphanomyces cochlioides）引起的甜菜黑腐病是一种重要病害。另外，在我国福建、青海和甘肃地区，根腐丝囊霉（Aphanomyceseuteiches Drechs）可引起豌豆的根腐病。2017年，李小杰等初次报道了由鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis）引起的烟草漂浮苗根腐病，主要症状表现在感病烟苗生长缓慢、植株矮小、叶色发黄、根部呈现褐色变软坏死、根系少，严重的致全株萎焉。
由鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis）引起的烟草漂浮苗根腐病是烟草上的新病害，目前对该病害的认识水平有限，还不能及早诊断，导致防治效果不佳，严重影响烟苗质量，给烟草生产带来巨大威胁，造成严重的经济损失。如果能够对该病害进行早期监测，在病害尚未表现出明显症状时，及时采取措施进行有效防控，对减少病害所造成的经济损失具有重要意义。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物及其检测方法，对减少病害所造成的经济损失具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物，包括Ai2-F和Ai2-R，：所述Ai2-F为上游引物，所述Ai2-R下游引物，所述Ai2-F和所述Ai2-R的序列为：
Ai2-F：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGT；
Ai2-R：ATTCAGCGGGTAGTCTTGTCT。
一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，包括以下步骤：
S1：以鸢尾丝囊霉菌基因组DNA为模板，利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增并测序获得ITS序列；
S2：根据鸢尾丝囊霉菌ITS序列，通过NCBI数据库的Primer-BLAST筛选出3对扩增产物大小不同的引物；
S3：分别以鸢尾丝囊霉菌（Aphanomyces iridis）和烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、烟草串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、烟草交链孢菌（Alternariaalternata）、烟草立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、烟草胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）、烟草拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、烟草尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）的基因组DNA为模板，利用PCR技术筛选出能够特异性扩增鸢尾丝囊霉菌的引物对Ai2-F/Ai2-R；
S4：将鸢尾丝囊霉菌的特异性引物Ai2-F/Ai2-R与其相对应的鸢尾丝囊霉菌基因组DNA加入同一PCR反应体系中，并在PCR反应条件下进行多个循环反应；
S5：PCR反应结束后，取5μL扩增产物于琼脂糖凝胶中，并在恒压条件下电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照，若能够检测出189bp大小的片段，则可判断为鸢尾丝囊霉菌。
优选的，在S1中，鸢尾丝囊霉菌的ITS序列为：AAAAACCATCCACGTGAACGTATTCTTTATGAGGCTTGTGCTCTTTTAGGGCTAGCCGAAGGTTTCGCAAGGAACCGATGAACTTTTTAATCCCTTTAAACTATTTTACTGATTTAAACTAGCTCCAGAAATGAAGCTTGTCAATTCTATACAACTTTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGACCACAGCGAACTGTGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAACGTTGAACGCATATTGCACTTTCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGTCTGTATCAGTGTCCGTCAATACAAACTTGTTTTATCTTTTGGATAGAGCAGACTGTGAGGGTCTTGTTTTGAACAAGTCCCTTGAAAAGACAGTGCCTGTATACAAGACCAAGTATATTATATAAAGGGCTATGTGTGCTCTTCATTTCAATGTCTTATGTGATATATGGATTGAAAGTAGACTCTAAATGGCGGTAGTTTTGCTTGTGTTTCGGCACGGGTGAACAAATATTGCTTTTTAGGTCGACTGGCAAGACGTATGTTGTGTGGGATAATATTTAAAAGAGCATGTAGTTTGGTAAACTTGGCAGTATATGGAAGCAAATTGGGAAACCATCTCCAATTTGGACCTGATATCAGACAAGACTACCCGCTGAATTTAAG。
优选的，在S3和S4中，所述PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Taq PCR Mix12.5μL，10μM正、反向引物各1μL，50-100ng基因组DNA，超纯水补足至25μL。
优选的，在S3和S4中，所述PCR反应条件为：
95℃，5分钟；
94℃，45秒；
59℃，30秒；
72℃，45秒；
72℃，10分钟；共30个循环。
优选的，在S5中，所述琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，所述电压为120V，所述电泳时间为15min。
优选的，在S5中，所述片段大小为189bp的核苷酸序列为：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGTTTCGGCACGGGTGAACAAATATTGCTTTTTAGGTCGACTGGCAAGACGTATGTTGTGTGGGATAATATTTAAAAGAGCATGTAGTTTGGTAAACTTGGCAGTATATGGAAGCAAATTGGGAAACCATCTCCAATTTGGACCTGATATCAGACAAGACTACCCGCTGAAT。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明，首次建立了鸢尾丝囊霉菌的分子检测方法，本检测方法所需时间短、成本低且具有灵敏度高、特异性强、检测准确性高等特点，可用于苗床和田间样品的鸢尾丝囊霉菌特异分子检测及早期快速诊断。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明是引物Ai2-F/Ai2-R对供试菌株的PCR扩增电泳图，为鸢尾丝囊霉菌分子检测引物特异性验证结果图，其中M：DL2 000 DNA marker；泳道1-8分别为:Aphanomyces iridis、Phytophthora nicotianae、Thielaviopsis basicola、Alternariaalternata、Rhizoctonia solani、Colletotrichum gloeosporioides、Phomopsis sp.、Fusarium oxysporum；
图2为本发明图2是引物Ai2-F/Ai2-R对供试菌株的PCR扩增电泳图，为鸢尾丝囊霉菌特异引物灵敏度检测结果图，其中M：DL2 000 DNA marker；泳道1-8：分别是在25μL的PCR扩增体系中含有33ng、3.3ng、0.33ng、33pg、3.3pg、0.33pg、33fg和3.3fg DNA的扩增结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
请参阅图1-2，本发明提供以下技术方案：根据鸢尾丝囊霉菌ITS序列，通过NCBI数据库的Primer-BLAST筛选出鸢尾丝囊霉菌的特异上游引物和下游引物：
Ai2-F：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGT；
Ai2-R：ATTCAGCGGGTAGTCTTGTCT。
利用ITS-PCR技术建立了特异引物Ai2-F/Ai2-R的鸢尾丝囊霉菌的分子检测方法，包括以下步骤：
S1：以鸢尾丝囊霉菌基因组DNA为模板，利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增并测序获得ITS序列；
S2：根据鸢尾丝囊霉菌ITS序列，通过NCBI数据库的Primer-BLAST筛选出3对扩增产物大小不同的引物；
S3：分别以鸢尾丝囊霉菌（Aphanomyces iridis）、烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、烟草串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、烟草交链孢菌（Alternariaalternata）、烟草立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、烟草胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）、烟草拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、烟草尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）的基因组DNA为模板，利用PCR技术筛选出能够特异性扩增鸢尾丝囊霉菌的引物对Ai2-F/Ai2-R，其中，
Ai2-F：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGT；
Ai2-R：ATTCAGCGGGTAGTCTTGTCT；
S4：将鸢尾丝囊霉菌的特异性引物Ai2-F/Ai2-R与其相对应的鸢尾丝囊霉菌基因组DNA加入同一PCR反应体系中，并在PCR反应条件下进行多个循环反应。所述PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Taq PCR Mix12.5μL ，10μM正、反向引物各1μL，50-100 ng基因组DNA，超纯水补足至25μL；所述PCR反应条件为：
95℃，5分钟；
94℃，45秒；
59℃，30秒；
72℃，45秒；
72℃，10分钟；共30个循环；
S5：PCR反应结束后，取5μL扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶中，并在120 V恒压条件下电泳15min，在BIO-RAD凝胶成像系统上观察、拍照，若能够检测出189bp大小的片段，则可判断为鸢尾丝囊霉菌。
所述189bp大小的片段的核苷酸序列为：
GGCGGTAGTTTTGCTTGTGTTTCGGCACGGGTGAACAAATATTGCTTTTTAGGTCGACTGGCAAGACGTATGTTGTGTGGGATAATATTTAAAAGAGCATGTAGTTTGGTAAACTTGGCAGTATATGGAAGCAAATTGGGAAACCATCTCCAATTTGGACCTGATATCAGACAAGACTACCCGCTGAAT。
实施例二：
如图1-2所示，为验证鸢尾丝囊霉菌的分子检测引物及其检测方法的使用效果，进行以下实验：
S1：将能够引起烟草病害的鸢尾丝囊霉菌（Aphanomyces iridis）、烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、烟草串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、烟草交链孢菌（Alternaria alternata）、烟草立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、烟草胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、烟草拟茎点霉菌（Phomopsis）、烟草尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）在PDA培养基上，25℃条件下纯化培养；
S2：参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取各病原菌纯化菌株的DNA备用；
S3：检测引物Ai2-F/Ai2-R的特异性，以S2步骤中的各病原菌纯化菌株的DNA为模板，在PCR反应条件下进行多个循环反应。所述PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Taq PCRMix 12.5μL ，10μM正、反向引物各1μL，50-100ng基因组DNA，超纯水补足至25μL。所述PCR反应条件为：
95℃，5分钟；
94℃，45秒；
59℃，30秒；
72℃，45秒；
72℃，10分钟；共30个循环；
S4：检测体系的灵敏度验证，将鸢尾丝囊霉菌基因组DNA从33 ng/μL开始依次10倍稀释至3.3 fg/μL，各浓度取1μL为模板利用优化的体系进行扩增。
结果分析：
检测引物特异性的验证结果如图1所示，仅鸢尾丝囊霉菌（Aphanomyces iridis）的泳道扩增出189 bp的目的条带，表明引物Ai2-F/Ai2-R是鸢尾丝囊霉菌的特异性引物，能够从多种烟草病原菌中检测出鸢尾丝囊霉菌。
检测体系的灵敏度验证结果如图2所示，特异性引物Ai2-F/Ai2-R能从质量浓度为33 pg/μL及以上的模板中扩增出相应大小的特异性条带，而未能在稀释至33 pg/μL以下的模板DNA中扩增到特异性条带。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物，包括Ai2-F/Ai2-R，其特征在于：
Ai2-F：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGT；
Ai2-R：ATTCAGCGGGTAGTCTTGTCT。
2.根据权利要求1所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：以鸢尾丝囊霉菌基因组DNA为模板，利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增并测序获得ITS序列；
S2：根据鸢尾丝囊霉菌ITS序列，通过NCBI数据库的Primer-BLAST筛选出3对扩增产物大小不同的引物；
S3：分别以鸢尾丝囊霉菌（Aphanomyces iridis）和烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、烟草串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、烟草交链孢菌（Alternariaalternata）、烟草立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、烟草胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）、烟草拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、烟草尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）的基因组DNA为模板，利用PCR技术筛选出能够特异性扩增鸢尾丝囊霉菌的引物对Ai2-F/Ai2-R；
S4：将鸢尾丝囊霉菌的特异性引物Ai2-F/Ai2-R与其相对应的鸢尾丝囊霉菌基因组DNA加入同一PCR反应体系中，并在PCR反应条件下进行多个循环反应；
S5：PCR反应结束后，取5μL扩增产物于琼脂糖凝胶中，并在恒压条件下电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照，若能够检测出189bp大小的片段，则可判断为鸢尾丝囊霉菌。
3.根据权利要求2所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：在S1中，鸢尾丝囊霉菌的ITS序列为：AAAAACCATCCACGTGAACGTATTCTTTATGAGGCTTGTGCTCTTTTAGGGCTAGCCGAAGGTTTCGCAAGGAACCGATGAACTTTTTAATCCCTTTAAACTATTTTACTGATTTAAACTAGCTCCAGAAATGAAGCTTGTCAATTCTATACAACTTTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGACCACAGCGAACTGTGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAACGTTGAACGCATATTGCACTTTCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGTCTGTATCAGTGTCCGTCAATACAAACTTGTTTTATCTTTTGGATAGAGCAGACTGTGAGGGTCTTGTTTTGAACAAGTCCCTTGAAAAGACAGTGCCTGTATACAAGACCAAGTATATTATATAAAGGGCTATGTGTGCTCTTCATTTCAATGTCTTATGTGATATATGGATTGAAAGTAGACTCTAAATGGCGGTAGTTTTGCTTGTGTTTCGGCACGGGTGAACAAATATTGCTTTTTAGGTCGACTGGCAAGACGTATGTTGTGTGGGATAATATTTAAAAGAGCATGTAGTTTGGTAAACTTGGCAGTATATGGAAGCAAATTGGGAAACCATCTCCAATTTGGACCTGATATCAGACAAGACTACCCGCTGAATTTAAG。
4.根据权利要求2所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：在S3和S4中，所述PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Taq PCR Mix12.5μL，10μM正、反向引物各1μL，50-100ng基因组DNA，超纯水补足至25μL。
5.根据权利要求2所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：在S3和S4中，所述PCR反应条件为：
95℃，5分钟；
94℃，45秒；
59℃，30秒；
72℃，45秒；
72℃，10分钟；共30个循环。
6.根据权利要求2所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：在S5中，所述琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，所述电压为120 V，所述电泳时间为15 min。
7.根据权利要求2所述的一种鸢尾丝囊霉菌分子检测的特异引物的检测方法，其特征在于：在S5中，所述片段大小为189bp的核苷酸序列为：GGCGGTAGTTTTGCTTGTGTTTCGGCACGGGTGAACAAATATTGCTTTTTAGGTCGACTGGCAAGACGTATGTTGTGTGGGATAATATTTAAAAGAGCATGTAGTTTGGTAAACTTGGCAGTATATGGAAGCAAATTGGGAAACCATCTCCAATTTGGACCTGATATCAGACAAGACTACCCGCTGAAT。
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