CN113755467A - 降解真菌毒素的多功能酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降解真菌毒素的多功能酶及其应用。本发明首次揭示一种多功能酶ZHDCP，其能够降解多于一种的真菌毒素，可将毒素ZEN和OTA分别转化为低毒产物，基因产物明确，毒性相对原型显著性降低。本发明的ZHDCP蛋白的制备简单，能被可溶性表达并分泌到培养基中，方便蛋白收取，适用于大规模生产。

Description

降解真菌毒素的多功能酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域；更具体地，本发明涉及一种能降解真菌毒素的多功能酶、其制备方法及其应用，所述的多功能酶可以同时降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素。

背景技术

真菌毒素(mycotoxin)是真菌(曲霉菌、青霉菌、镰刀菌等)在一定条件下产生的一类对动植物有害的小分子有毒次级代谢产物。这些毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、黄曲霉素(aflatoxins，AFs)、赭曲霉毒(ochratoxins)和伏马毒素(fumonisins，FBs)等种类。农产品、食品受到真菌毒素污染是全球性的问题，据联合国粮农组织(FAO)统计，约25％食品供应受到真菌毒素污染，2％的粮食因真菌毒素污染而不能食用，从而引起高达数十亿美元的损失。

赭曲霉毒素(OTA)是一类由曲霉属和青霉属等霉菌产生的一种重要的污染食品和饲料的免疫抑制类真菌毒素，可分为A、B和C等三种类型。曲霉毒素A(OTA)的毒性最大。在各种粮食作物及其副产品中广泛存在，造成致畸、致癌、致突变、抑制免疫等潜在毒性。OTA被国际癌症研究中心(IARC)列为2B级致癌物，给动物生产和人类健康造成极大威胁。Mally等(2007)通过对雄性F344大鼠进行攻毒实验，以21、70和210μg/kg bw攻毒2年，发现后两组大鼠的肾小管上皮细胞诱导产生腺癌和肾癌，在高剂量诱导下，OTA对肾细胞增殖具有显著增强，可能在致癌方面扮演重要作用。欧盟委员会2006/576/EC中发布了饲料原料及谷物及产品中OTA的允许量不得超过250μg/kg。国内GB 2761-2011食品安全国家标准规定谷物、豆类及其制品中OTA的允许量不得超过5μg/kg。

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是镰刀菌产生的一种酚类具有类雌激素作用的次级代谢产物，具有生殖毒性，可致人和动物中枢性早熟、不孕症和激素水平过低。ZEN主要污染麦类、玉米和谷物等，存在于整个食物链中。食品、饲料真菌毒素污染问题是一个世界性问题。Abbès等(2006)研究发现，ZEA(40mg/kg BW)可导致小鼠脾细胞肿胀，局灶性坏死，白髓萎缩和红髓扩张等病理症状，同时ZEN及其代谢产物显著降低小鼠血清中IgG、IgA或IgM水平，降低机体免疫力。欧盟委员会2006/576/EC中发布了饲料原料及谷物及产品中ZEN的允许量不得超过2000μg/kg，中国颁发的国家标准GB13078.2-2006对配合饲料玉米中的ZEN进行了限量规定不得超过500μg/kg。

目前对于食品或饲料中的真菌毒素的去除方法可归于三类：物理、化学和生物脱毒法，传统的物理、化学方法虽然取得了一定效果，但由于脱毒不彻底、营养物质流失和引入新的污染等问题，这也就限制了其应用和推广。生物吐毒法主要利用微生物或酶将真菌毒素转化为无毒或低毒产物，且多为专一性降解，不会破坏食品或饲料中其他营养物质，是真菌毒素脱毒的重要方法。国内外关于真菌毒素的生物降解已有诸多研究。

现如今已知有效的降解菌株或降解酶多用于单一毒素，关于同时降解两种及以上的多种真菌毒素的菌株等生物制剂鲜有报道。实际中粮食饲料中往往多种真菌毒素联合污染，其可能出现毒性联合作用，导致毒性更强。

因此，本领域还需开发能够有效解决两种或多种毒素联合污染的有效制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降解赤霉烯酮和赭曲霉素的多功能酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于降解真菌毒素的蛋白，包含相互连接的以下的蛋白：赤霉烯酮水解酶(ZHD)蛋白，羧肽酶(CP)蛋白片段。

在一个优选例中，所述的用于降解真菌毒素的蛋白从氨基端到羧基端依次包含：ZHD蛋白，CP蛋白片段。

在另一优选例中，所述用于降解真菌毒素的蛋白中，ZHD蛋白、CP蛋白片段通过肽键连接。

在另一优选例中，所述ZHD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第1～264位所示。

在另一优选例中，所述CP蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第265～676位所示。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白的用途，用于降解玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉素(OTA)。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白的用途，用于制备降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种核酸，所述的核酸分子编码前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白。

在一个优选例中，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。

在一个优选例中，所述的载体以pPIC9K为骨架载体。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程细胞，所述的细胞含有所述的载体或其基因组中整合有所述的核酸分子。

在一个优选例中，所述细胞为酵母细胞；较佳地为毕赤酵母。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白的方法，包括：培养所述的基因工程细胞，表达和分离出所述的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的组合物，所述的组合物含有：(i)前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白；和(ii)生物学上(包括食品学上)可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种降解玉米赤霉烯酮和/或赭曲霉素的方法，所述方法包括：以前面任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白或前面所述的组合物处理米赤霉烯酮和/或赭曲霉素，或处理含有米赤霉烯酮和/或赭曲霉素的对象。

在一个优选例中，进行降解时，反应体系的pH值范围6.5-11；温度20-40℃。

在另一优选例中，进行降解后，所述的米赤霉烯酮被降解为H-ZEN和/或D-ZEN。

在另一优选例中，进行降解后，所述的赭曲霉素被降解为OTA-α，Ota Amide和/或OTA-d5。

在本发明的另一方面，提供一种降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的试剂盒，其中含有前面所述的用于降解真菌毒素的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的试剂盒，其中含有前面所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、蛋白酶ZHDCP的基因zhdcp构建流程图。

图2、真核表达载体pPIC9K-zhdcp的构建示意图。将不含自身终止密码子的zhd基因和cp基因片段连接后经酶切连接反应插入多克隆位点后的情况。蓝色部分为表达的重组酶蛋白ZHDCP。

图3、真核表达的重组酶ZHDCP蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。泳道S：诱导上清粗蛋白(77.36kDa)，L2：菌体破碎粗蛋白(77.36kDa)。

图4、蛋白酶ZHDCP对ZEN催化作用。利用高效液相色谱HPLC-UV检测溶液中ZEN含量；

A：检测液只含有缓冲液；

B：检测液含标准品50μM ZEN；

C：ZHDCP蛋白处理50μM ZEN 30min；

D：ZEN降解率效率检测。

图5、蛋白酶ZHDCP酶活检测；

A：ZHDCP对ZEN酶活检测；

B：ZHDCP对OTA酶活检测。

图6、蛋白ZHDCP对OTA催化作用。利用高效液相色谱HPLC-UV检测溶液中OTA含量；

A：检测液只含有缓冲液；

B：检测液含标准品50μM OTA；

C：ZHDCP蛋白处理50μM OTA 30min；

D：ZEN降解率效率检测。

图7、ZEN降解产物质谱鉴定，TSQ Vantage型三重四极杆液相色谱质谱鉴定ZEN降解产物；

A：ZEN ESI(+)-MS质谱图；

B：ZEN降解中间产物H-ZEN ESI(+)-MS质谱图；

C：ZEN降解终产物D-ZEN ESI(+)-MS质谱图。

图8、OTA降解产物质谱鉴定；TSQ Vantage型三重四极杆液相色谱质谱鉴定OTA降解产物；

A：OTA ESI(+)-MS质谱图；

B：OTA降解产物ESI(+)-MS质谱图；

C：OTA降解产物ESI(+)-MS质谱图。

图9、ZHDCP酶体外破坏性实验检测。以ZEN毒素为反应底物，蛋白酶ZHDCP在37℃暴露1d、2d、3d、6d、9d、12d、16d、22d、28d后检测降解率。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种多功能酶ZHDCP，该多功能酶包含玉米赤霉烯酮水解酶蛋白(Zearalenone hydrolase，ZHD)，羧肽酶蛋白(Carboxypeptidases，CP)片段。该多功能酶能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，具有良好的生物活性，能同时降解多于一种的真菌毒素。

术语

如本文所用，术语“本发明的多功能酶”、“本发明的多功能蛋白(肽/多肽)”、“ZHDCP”、“多功能酶ZHDCP”、“蛋白酶ZHDCP”等可互换使用，都指由ZHD蛋白、CP蛋白片段连接而成的蛋白；较佳的它们之间通过化学键(如肽键)相连接。

如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的ZHDCP传送给需要处理的对象(包括食品、饲料)的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的ZHDCP的生物活性的载体。

ZHDCP

本发明提供一种多功能酶ZHDCP，其包含ZHD蛋白和CP蛋白片段，两者操作性连接。较佳的，所述的ZHDCP是一种分离的蛋白，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物；所述的ZHDCP也可存在于混合物中，如存在于一种细胞裂解物或粗提物中。

本发明包括所述ZHD蛋白或CP蛋白片段的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ZHD蛋白或CP蛋白片段相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。

在本发明中，术语“ZHD蛋白”是包括SEQ ID NO:6中第1～264位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述ZHD蛋白相同功能的、SEQ ID NO:6中第1～264位所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述ZHD蛋白的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:6中第1～264位所示氨基酸序列的多肽的保守功能域(降解毒素的功能域)之外。

在本发明中，术语“CP蛋白片段”是包括SEQ ID NO:6中第265～676位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述CP蛋白片段相同功能的、SEQ ID NO:6中第265～676所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述ZHD蛋白的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:6中第265～676所示氨基酸序列的多肽的保守功能域(降解毒素的功能域)之外。

本发明的ZHDCP中，不包括全长的CP蛋白。本发明所述的“CP蛋白片段”为天然CP蛋白基础上、经改造的蛋白片段，为了实现理想的表达以及与所述ZHD蛋白良好地兼容和发挥活性，本发明人截去CP蛋白的N端的部分序列。

应理解，本发明也包括与所述ZHD蛋白或CP蛋白片段的具有较高同源性的蛋白，如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明所述的ZHD蛋白与CP蛋白片段之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。作为本发明的优选方式，所述的ZHD蛋白、CP蛋白片段之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

作为本发明的优选方式，所述的ZHDCP从氨基端到羧基端依次包含：ZHD蛋白、CP蛋白片段。

所述的ZHD蛋白与CP蛋白片段之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-50个氨基酸；较佳地包括1-30个或包括2～20个氨基酸。作为本发明的优选方式，所述的ZHD蛋白、CP蛋白片段之间进行直接相连接。本发明人发现，即使不使用一些柔性连接肽的辅助，所述的ZHD蛋白、CP蛋白片段之间也能实现兼容且发挥良好的生物活性。

另一方面，本发明还提供了编码所述的ZHDCP的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的ZHDCP的核酸都适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

编码本发明ZHDCP的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码ZHD蛋白、CP蛋白片段氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明ZHDCP的DNA序列。

本发明还提供了包含编码所述ZHDCP的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述ZHDCP的表达。

多种合适的载体可被应用于本发明中，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，例如可参考Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。较佳地，所述的表达载体为酵母细胞适用的表达载体。

此外，含有编码所述ZHDCP的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明的优选方式中，采用真核细胞作为宿主细胞。作为本发明的最优选的方式，所述的真核细胞为毕赤酵母细胞。

生产本发明的ZHDCP的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有ZHDCP编码核酸的重组细胞。所述方法还可包括ZHDCP的分离和/或纯化。

可将上述制备获得的ZHDCP纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

在本发明的具体实施例中，通过融合PCR技术将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行融合，以pPIC9K为载体构建重组质粒pPICK-zhdcp，转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达处本发明的新型双功能重组酶ZHDCP。体外实验证实该ZHDCP可同时氧化水解玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉素(OTA)，ZEN最终形成D-ZEN，OTA最终形成的产物可能是OTA-a，Ota-Amide和OTA-d5。体外破坏实验表明该重组酶在37℃条件下可以稳定保存6天以上。毕赤酵母表达系统操作简单，安全、高效且生产成本低廉，适用于大规模发酵制备，可直接应用于农作物或饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的脱除。

在本发明的具体实施例中，进行酵母细胞表达时，将含有重组质粒pPIC9K-zhdcp的P.pastoris GS115菌株接种在BMGY培养基中，于30℃，220rpm/min摇至OD600＝6(对数生长，约16-18h)，室温去除上清，离心收集细胞，去上清，用BMMY重悬细胞至OD600＝1，每隔24h加入甲醇终浓度为0.5％进行诱导。直至加入甲醇后，DO开始下降并不再利用甲醇，4℃离心收集离心收取上清，上清液过滤除菌后直接冷冻干燥收集粗蛋白，粗蛋白用SDS-PAGE检测，再用考马斯亮蓝染色，检测蛋白表达量。

ZHDCP的应用

本发明获得ZHDCP酶活性理想，选择性好。其能够适于在酵母细胞表达的条件下被重组表达，有着广泛的应用潜力。根据本发明人的新发现，本发明所述的ZHDCP的用途包括：降解玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉素(OTA)；或制备降解ZEN和OTA的组合物。ZHDCP蛋白对于至少以上两种真菌毒素具有降解作用，去除或减轻其毒性；同时应理解，本发明的ZHDCP蛋白也可被应用于降解与ZEN和OTA在化学结构上具有相似性的其它毒素，此类应用也应被涵盖在本发明中。

本发明中，所述的ZEN及其降解产物H-ZEN、D-ZEN的结构式分别如下：

本发明中，所述的OTA及其降解产物OTA-α、Ota Amide、OTA-d5的结构式分别如下：

在本发明的具体实施例中，通过毕赤酵母表达获得ZHDCP蛋白，将已纯化的ZHDCP蛋白与ZEN和OTA在合适的缓冲液中进行反应，利用高效液相色谱(HPLC)和LC-MS检测溶液中的ZEN和OTA含量。结果表明，重组蛋白ZHDCP能同时水解ZEN和OTA，反应体系的pH值范围6.5-11，最适pH值7.5，反应温度20-40℃，最佳温度37℃。

在获得了本发明的ZHDCP后，根据本发明的教导，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥降解真菌毒素的作用。在一种方式中，提供了一种降解真菌毒素的方法，包括：利用本发明所述的ZHDCP或所述的组合物进行抑制。在另一种方式中，提供了一种降解真菌毒素的方法，包括：将编码本发明所述的ZHDCP多肽的多核苷酸引入到基因工程细胞中，所述基因工程细胞可大规模地被扩繁，将所述的基因工程细胞或其加工产物施用于需要解毒处理的对象(例如但不限于：品、饮料或饲料)、用具(如食物或饲料的容器)或场所(如一些食物存储、食物加工、饲料加工、动物养殖或植物培育场所)，从而发挥抑制作用。

本发明人首次利用毕赤酵母表达系统表达能同时降解ZEN和OTA两种真菌毒素的ZHDCP，相比只降解单一毒素的单一酶，ZHDCP具有更好的应用前景。多种蛋白的连接使用，一般会由于空间结构的变化而导致无法实现良好的活性，特别是对于一些相对较长的蛋白；而本发明的ZHDCP，则其解毒效果非常理想。

应理解，在本发明的教导下，还存在本发明ZHDCP的多种多样的应用模式，这些均应被涵盖在本发明中。

组合物/制剂/试剂盒

本发明提供了一种组合物，其中含有有效量的ZHDCP，以及余量的生物学上可接受的载体。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

应理解，只要能够将本发明所述的ZHDCP在保持全部或部分活性的前提递送到需要解毒处理的对象(例如但不限于：品、饮料或饲料)、用具(如食物或饲料的容器)或场所(如一些食物存储、食物加工、饲料加工、动物养殖或植物培育场所)的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体剂、喷洒剂或喷雾剂。

浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有占比6-90％或10-90％的ZHDCP含量，而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以为0.00005-5％。此外，还可以包含其他合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。

在一些需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它活性毒素降解成分，以实现通过一次使用而将多种毒素进行共同降解或减毒。

本发明的ZHDCP、含有其的载体或宿主细胞、含有其或其宿主细胞的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。

本发明的主要优点在于：

本发明的ZHDCP能够降解多于一种的真菌毒素，包括毒素ZEN和OTA，分别转化为低毒产物，基因产物明确，毒性相对原型显著性降低，ZHDCP具有很好的应用前景。

本发明中，经过表达优化的ZHDCP蛋白的制备简单，能在毕赤酵母中可溶性表达并分泌到培养基中，方便蛋白收取，适用于大规模生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

序列信息

SEQ ID NO:1(zhd)

ATGCGCACTCGCAGCACAATCTCGACCCCGAATGGCATCACCTGGTACTATGAGCAGGAGGGTACTGGACCCGACGTTGTCCTCGTTCCCGATGGCCTCGGAGAATGCCAGATGTTTGACAGCTCCGTGTCGCAGATTGCTGCTCAAGGCTTCAGGGTCACTACGTTTGATATGCCCGGAATGTCCCGGTCTGCCAAGGCACCACCCGAGACCTACACTGAGGTCACGGCCCAGAAGCTGGCTTCCTATGTCATCTCCGTCCTGGATGCTCTTGACATCAAGCACGCTACTGTCTGGGGCTGCAGCTCAGGAGCTTCCACCGTCGTGGCGCTGTTGCTCGGTTACCCCGACAGGATACGCAACGCCATGTGCCACGAACTGCCAACAAAGCTACTGGACCACCTTTCAAACACCGCTGTGCTCGAAGACGAGGAAATCTCAAAGATCCTGGCCAATGTAATGTTGAACGACGTGTCTGGAGGCTCGGAGGCGTGGCAAGCCATGGGGGACGAGGTGCACGCGAGACTGCACAAGAACTACCCGGTTTGGGCTCGAGGATACCCTCGGACTATTCCTCCCTCAGCTCCGGTTAAGGATCTGGAGGCTCTGCGTGGGAAGCCCCTGGACTGGACTGTCGGCGCTGCGACACCAACCGAGTCTTTCTTTGACAACATTGTTACCGCTACCAAGGCTGGTGTCAACATTGGGTTGCTTCCAGGGATGCATTTCCCTTATGTTTCCCACCCGGACGTTTTCGCTAAATATGTTGTGGAAACTACGCAGAAGCATCTTTGA

SEQ ID NO:2(zhd优化)

ATGCGCACCCGTAGTACCATTAGCACCCCGAACGGTATCACCTGGTACTATGAGCAGGAAGGCACCGGCCCTGATGTTGTGCTGGTGCCGGATGGTCTGGGCGAGTGTCAGATGTTTGACAGCAGCGTGAGCCAGATTGCCGCCCAGGGCTTTCGCGTGACAACCTTTGATATGCCGGGTATGAGCCGCAGTGCAAAAGCCCCGCCGGAGACCTATACCGAAGTGACCGCCCAGAAACTGGCCAGCTACGTGATTAGCGTGCTGGATGCACTGGACATCAAACATGCCACCGTTTGGGGCTGTAGCAGCGGCGCAAGTACCGTGGTTGCCCTGCTGCTGGGTTATCCGGACCGCATTCGCAATGCCATGTGCCATGAACTGCCGACCAAACTGCTGGATCATCTGAGCAACACCGCCGTGCTGGAGGATGAAGAAATCAGCAAAATCCTGGCCAACGTGATGCTGAACGATGTTAGCGGCGGTAGTGAAGCCTGGCAGGCAATGGGTGACGAAGTGCATGCCCGCCTGCATAAGAACTATCCGGTTTGGGCCCGCGGTTATCCGCGCACAATTCCGCCGAGCGCACCGGTTAAAGATCTGGAAGCCCTGCGCGGCAAACCGCTGGATTGGACCGTTGGTGCCGCCACCCCTACCGAGAGCTTCTTCGACAATATCGTGACCGCCACCAAAGCCGGTGTGAATATTGGTCTGCTGCCGGGCATGCACTTTCCGTATGTGAGCCATCCGGATGTTTTCGCCAAGTATGTGGTTGAGACCACCCAGAAACACCTGTAA

SEQ ID NO:3(cp)

ATGAACATCACGAAATGGAAACAGCTGTTGGTGTCATTAGTGGTACTGGCACTGGCCGCAACTTGCTTTGTTCCGATGTCTAAAGCGGAGGCAGCCGGCAATGACCCGATTGATGTCAACGCATCAGCTGCGATAATGATTGAGGCTTCATCGGGAAAAATTTTATACAGTAAAAATGCAGACAAAAGACTGCCGATTGCCAGCATGACAAAAATGATGACTGAATATCTGCTTCTGGAAGCCATTCAAGAAGGAAAAGTGAAATGGGATCAAACGTATACTCCTGATGATTATGTCTATGAAATTTCTCAAGACAACAGTTTATCAAACGTCCCCCTTCGAAAAGACGGCAAATACACGGTTAAAGAACTGTATCAGGCTATGGCGATTTACTCTGCCAACGGAGCCGCGATTGCAGTTGCCGAAATTCTTGCCGGAACTGAAACGAAATTTGTCGCTGAAATGAATGCGAAAGCCAAAGAATTAGGCATGACAAACTATGATTTTGAAAATGCCACAGGGCTTGTGAATGAAGACCTTCACGGCAAGCAGCCGCAAGGAGAAGGCGTTAAAGAAGAGAGTGAAGTTTCTGCTAAAGACATGGCGCTTCTTGCAGACCGCCTGATCACTGATTATCCGGAAGTTCTCAAAACAACAAGCATCGCTAAGACGAAATTCAGAGCCGGCACTGATGATGAAATGGACATGCCGAACTGGAACTTCATGTTAAAAGGTCTTGTTTCTGAATACCCTGGCGTTGACGGCTTAAAAACGGGTTCTACTGATTCTGCGGGATCTTGTTTTACAAGCACAGCACAGCGGAACGGAATGCGGGTCATCACCGTTGTATTAAACGCAAAAGGCAACCTGCATACCGGACGTTTTGATGAAACGAAAAAAATGCTCGATTACGCATTTAACAGCAATTTCTCAATGAAAGATCTTTACCCTGAAGGCTCTCAAGTAAAAGGGCACAAAACGATTGACGTTGAAAAAGGGAAAGACAAGCAAGTCGATATTGTTACTGACAAGGCGCTTTCTATTCCTGTGAAAAGCGGCGATGAAAAGAACTATAAAGCCGAAGTGACTTTAGATAAAAAAGAAATCACGGCTCCTGTGAAAAAGGGAACGAAAGTCGGAACGCTGACAGTTACATACAAAGGCAGTGACAAAGACTATGGCTTCCTCAAATCCAAAGAGTTCAGCGTGAATCTTGTAACGAAAAATGATGTAGATAAAGCAAACTGGTTTGTTCAGATGATGCGCGGCATCGGCGGATTCTTCTCCGGTATCTGGAACAGCGCCGTTGACACGGTAACAGGCTGGTTTTAA

SEQ ID NO:4(cp优化)

ATGAATATTACCAAATGGAAACAGCTGCTGGTGAGCCTGGTGGTGCTGGCACTGGCAGCAACCTGTTTTGTGCCGATGAGCAAAGCCGAAGCCGCCGGCAATGATCCGATTGACGTTAACGCAAGCGCCGCCATTATGATCGAAGCCAGCAGCGGCAAGATCCTGTACAGTAAAAACGCCGACAAACGCCTGCCGATTGCAAGCATGACCAAAATGATGACCGAATATCTGCTGCTGGAAGCCATCCAAGAAGGCAAGGTGAAATGGGACCAGACCTACACCCCGGATGATTATGTTTACGAAATCAGCCAGGACAACAGCCTGAGCAATGTGCCGCTGCGCAAGGACGGCAAATACACCGTGAAAGAGCTGTACCAGGCCATGGCCATCTATAGCGCAAATGGCGCCGCCATTGCCGTTGCAGAAATTCTGGCCGGCACCGAGACCAAATTCGTGGCCGAGATGAATGCAAAGGCCAAGGAGCTGGGCATGACCAACTATGACTTCGAGAATGCCACCGGCCTGGTGAATGAAGATCTGCATGGCAAACAGCCGCAGGGTGAGGGTGTGAAAGAGGAGAGCGAAGTGAGCGCAAAAGATATGGCACTGCTGGCAGACCGCCTGATTACCGATTATCCGGAAGTGCTGAAAACCACCAGCATTGCCAAGACCAAGTTTCGTGCCGGTACAGACGACGAGATGGACATGCCTAACTGGAACTTCATGCTGAAAGGCCTGGTGAGTGAGTATCCGGGCGTGGATGGTCTGAAAACCGGCAGTACCGATAGTGCCGGCAGCTGTTTTACCAGCACCGCCCAGCGCAACGGCATGCGTGTGATCACCGTGGTGCTGAATGCCAAGGGCAATCTGCATACAGGTCGCTTCGACGAGACAAAGAAAATGCTGGATTATGCCTTTAACAGCAATTTTAGTATGAAAGATCTGTACCCGGAAGGCAGCCAGGTGAAAGGCCACAAAACCATCGATGTGGAAAAGGGTAAGGACAAGCAGGTGGACATCGTTACCGATAAAGCCCTGAGCATCCCGGTGAAAAGTGGCGACGAGAAAAATTACAAGGCCGAGGTGACCCTGGACAAAAAGGAAATCACCGCCCCTGTTAAGAAAGGCACAAAGGTGGGTACCCTGACCGTGACCTACAAGGGCAGCGACAAAGACTATGGCTTCCTGAAAAGTAAGGAGTTTAGCGTGAACCTGGTGACCAAAAACGACGTGGACAAGGCCAATTGGTTCGTGCAGATGATGCGCGGCATTGGCGGCTTCTTTAGCGGCATCTGGAATAGCGCCGTTGACACCGTGACCGGCTGGTTCTAA

SEQ ID NO:5(zhdcp)

ATGCGCACCCGTAGTACCATTAGCACCCCGAACGGTATCACCTGGTACTATGAGCAGGAAGGCACCGGCCCTGATGTTGTGCTGGTGCCGGATGGTCTGGGCGAGTGTCAGATGTTTGACAGCAGCGTGAGCCAGATTGCCGCCCAGGGCTTTCGCGTGACAACCTTTGATATGCCGGGTATGAGCCGCAGTGCAAAAGCCCCGCCGGAGACCTATACCGAAGTGACCGCCCAGAAACTGGCCAGCTACGTGATTAGCGTGCTGGATGCACTGGACATCAAACATGCCACCGTTTGGGGCTGTAGCAGCGGCGCAAGTACCGTGGTTGCCCTGCTGCTGGGTTATCCGGACCGCATTCGCAATGCCATGTGCCATGAACTGCCGACCAAACTGCTGGATCATCTGAGCAACACCGCCGTGCTGGAGGATGAAGAAATCAGCAAAATCCTGGCCAACGTGATGCTGAACGATGTTAGCGGCGGTAGTGAAGCCTGGCAGGCAATGGGTGACGAAGTGCATGCCCGCCTGCATAAGAACTATCCGGTTTGGGCCCGCGGTTATCCGCGCACAATTCCGCCGAGCGCACCGGTTAAAGATCTGGAAGCCCTGCGCGGCAAACCGCTGGATTGGACCGTTGGTGCCGCCACCCCTACCGAGAGCTTCTTCGACAATATCGTGACCGCCACCAAAGCCGGTGTGAATATTGGTCTGCTGCCGGGCATGCACTTTCCGTATGTGAGCCATCCGGATGTTTTCGCCAAGTATGTGGTTGAGACCACCCAGAAACACCTGGCCGGCAATGATCCGATTGACGTTAACGCAAGCGCCGCCATTATGATCGAAGCCAGCAGCGGCAAGATCCTGTACAGTAAAAACGCCGACAAACGCCTGCCGATTGCAAGCATGACCAAAATGATGACCGAATATCTGCTGCTGGAAGCCATCCAAGAAGGCAAGGTGAAATGGGACCAGACCTACACCCCGGATGATTATGTTTACGAAATCAGCCAGGACAACAGCCTGAGCAATGTGCCGCTGCGCAAGGACGGCAAATACACCGTGAAAGAGCTGTACCAGGCCATGGCCATCTATAGCGCAAATGGCGCCGCCATTGCCGTTGCAGAAATTCTGGCCGGCACCGAGACCAAATTCGTGGCCGAGATGAATGCAAAGGCCAAGGAGCTGGGCATGACCAACTATGACTTCGAGAATGCCACCGGCCTGGTGAATGAAGATCTGCATGGCAAACAGCCGCAGGGTGAGGGTGTGAAAGAGGAGAGCGAAGTGAGCGCAAAAGATATGGCACTGCTGGCAGACCGCCTGATTACCGATTATCCGGAAGTGCTGAAAACCACCAGCATTGCCAAGACCAAGTTTCGTGCCGGTACAGACGACGAGATGGACATGCCTAACTGGAACTTCATGCTGAAAGGCCTGGTGAGTGAGTATCCGGGCGTGGATGGTCTGAAAACCGGCAGTACCGATAGTGCCGGCAGCTGTTTTACCAGCACCGCCCAGCGCAACGGCATGCGTGTGATCACCGTGGTGCTGAATGCCAAGGGCAATCTGCATACAGGTCGCTTCGACGAGACAAAGAAAATGCTGGATTATGCCTTTAACAGCAATTTTAGTATGAAAGATCTGTACCCGGAAGGCAGCCAGGTGAAAGGCCACAAAACCATCGATGTGGAAAAGGGTAAGGACAAGCAGGTGGACATCGTTACCGATAAAGCCCTGAGCATCCCGGTGAAAAGTGGCGACGAGAAAAATTACAAGGCCGAGGTGACCCTGGACAAAAAGGAAATCACCGCCCCTGTTAAGAAAGGCACAAAGGTGGGTACCCTGACCGTGACCTACAAGGGCAGCGACAAAGACTATGGCTTCCTGAAAAGTAAGGAGTTTAGCGTGAACCTGGTGACCAAAAACGACGTGGACAAGGCCAATTGGTTCGTGCAGATGATGCGCGGCATTGGCGGCTTCTTTAGCGGCATCTGGAATAGCGCCGTTGACACCGTGACCGGCTGGTTCTAA

SEQ ID NO:6(ZHDCP)

MRTRSTISTPNGITWYYEQEGTGPDVVLVPDGLGECQMFDSSVSQIAAQGFRVTTFDMPGMSRSAKAPPETYTEVTAQKLASYVISVLDALDIKHATVWGCSSGASTVVALLLGYPDRIRNAMCHELPTKLLDHLSNTAVLEDEEISKILANVMLNDVSGGSEAWQAMGDEVHARLHKNYPVWARGYPRTIPPSAPVKDLEALRGKPLDWTVGAATPTESFFDNIVTATKAGVNIGLLPGMHFPYVSHPDVFAKYVVETTQKHLAGNDPIDVNASAAIMIEASSGKILYSKNADKRLPIASMTKMMTEYLLLEAIQEGKVKWDQTYTPDDYVYEISQDNSLSNVPLRKDGKYTVKELYQAMAIYSANGAAIAVAEILAGTETKFVAEMNAKAKELGMTNYDFENATGLVNEDLHGKQPQGEGVKEESEVSAKDMALLADRLITDYPEVLKTTSIAKTKFRAGTDDEMDMPNWNFMLKGLVSEYPGVDGLKTGSTDSAGSCFTSTAQRNGMRVITVVLNAKGNLHTGRFDETKKMLDYAFNSNFSMKDLYPEGSQVKGHKTIDVEKGKDKQVDIVTDKALSIPVKSGDEKNYKAEVTLDKKEITAPVKKGTKVGTLTVTYKGSDKDYGFLKSKEFSVNLVTKNDVDKANWFVQMMRGIGGFFSGIWNSAVDTVTGWF

实施例1、ZHDCP编码基因克隆和真核表达载体的构建及转化

1、ZHDCP编码基因克隆

zhd和cp基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示。为了优化表达，本发明人进行了反复试验研究，设计了密码子优化的序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。

进一步地，为了优化表达，本发明人改造了CP蛋白的编码序列，截去了编码CP蛋白N端2-31号氨基酸的编码序列。同时，为了避免编码提前结束，去掉了zhd编码基因的终止子TAA。

以优化过的zhd和cp为扩增模板，高保真酶

Max DNA Polymerase扩增目的基因片段(购自Takara公司，日本)。

Zhd的扩增引物如下：

zhd-F：5’-ggaattcatgcgcacccgtagtacca-3’(SEQ ID NO:7)，

zhd-R：5’-caatcggatcattgccggccaggtgtttctgggtggtctc-3’(SEQ ID NO:8)；

cp的扩增引物如下：

cp-F：5’-gagaccacccagaaacacctggccggcaatgatccgattg-3’(SEQ ID NO:9)，cp-R：5’-tatattgcggccgcttagaaccagccggtcacg-3’(SEQ ID NO:10)。

50μl反应体系：2×PrimerSTAR Max Premix 25μl，10μmol/L primer各1μl，模板1μl，补ddH₂O至总体积50μl。PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，循环数30～35个，72℃延伸10min。以上述获得zhd和cp为模板，zhd-F和cp-R为引物，通过融合PCR获得zhdcp片段(图1)，反应体系和PCR反应程序同上。对上述获得的融合片段zhdcp测序后进行序列分析，zhd、cp和zhdcp序列如SEQ ID NO:2，4，5所示，融合片段zhdcp编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2、表达载体构建测序

用EcoR I和Not I(购自Takara公司，日本)对真核表达载体pPIC9K和融合片段zhdcp进行双酶切。50μl反应体系：10×M buffer 5μl，质粒DNA或基因片段2-4μg，EcoR I1.5ul，Not I 1.5μl，补ddH₂O至总体积50μl，37℃酶切6-8h。凝胶电泳检测酶切效果并回收所需的片段。用T4 DNA连接酶(购自Takara公司，日本)连接回收的pPIC9K和基因片段，连接体系：10×T4 buffer1μl，T4连接酶1μl，酶切基因片段3～5μl，酶切的pPIC9K质粒1μl，补ddH₂O至总体积10μl，16℃过夜连接。构建后的原核表达载体如图2所示。测序表明pPIC9K-zhdcp构建正确。

转化P.pastoris GS115感受态细胞：将重组质粒pPIC9K-zhdcp线性化通过LiCl转化方法转化GS115细胞：

从制备好的感受态细胞中吸50μl到2ml的无菌离心管中，微离，弃上清，加入片段的顺利如下：

在振荡仪上剧烈振荡1min，使片段载体和感受态能充分混匀接触。然后放入30℃，静置30min后转入42℃，静置40min。10000rpm离心1min，弃上清，加入600μl无菌水，和酵母细胞混匀，加200μl涂SD-His营养缺陷型平板。培养2-3天后，PCR检测阳性转化子。

实施例2、ZHDCP酶蛋白发酵

一、发酵准备(第一天)

种子培养基：200mL YPD培养基

甘油补料培养基：200mL 50％甘油

消泡剂(聚醚类)

发酵液：2L BMGY培养基

向发酵液中滴加500μl消泡剂倒入罐中一起离位灭菌。灭菌前校正pH电极。灭菌后连接好各电极和管路，溶氧调零，降温至30℃时加入4mL 500X生物素、200mL 10XYNB，转速调至50rpm，空气流量计调至2L/min，过夜。

种子液在16:30培养，挑取单菌落至每瓶50mL的YPD培养基中(共4瓶)28℃、200rpm摇床培养。

二、发酵上罐(第二天)

1、初始甘油培养

将200mL YPD种子液无菌条件下接种至发酵罐，接种量为10％，200mL磷酸缓冲液(BMGY中)加入罐中，转速调至250rpm，空气流量计调至5L/min，然后DO校正至100％，观察DO变化，接种时间为早上9:10，测得种子液OD为3.7。下午17:11发现DO低于30％，此时增加转速至300rpm，此后每次DO降至30％以下增加50rpm。

2、甘油补料培养

当发酵液中甘油消耗完全，DO上升至80％，取样，开始补料甘油，此时为晚上23:45，约接种后14.5h，转速为900rpm，补料速率控制为20mL/h，此时菌体OD为103，pH6.5左右。

3、甲醇诱导阶段

第三天早上9:00，停止补料甘油，取样，pH显示5.14，OD测得为181，开始饥饿，当DO上升至95％时开始补料100％的甲醇，补料速率5ml/h，当补料总计至10ml时停止补料，在开始补料到停止这2h期间未观察到DO下降，转速降低至800rpm，此时DO长时间维持在92％附近，隔4h添加一次甲醇5ml/h，补料2h。下午17:00再次添加10ml甲醇。

第四天上午8:30，DO上升至137.2％，加入少量甲醇后，发现DO下降至115％，此时pH为5.40，OD＝130，DO到115％后再加甲醇未见下降，每隔4h加入10mL甲醇，下午17:00pH显示5.35，DO为116％，OD＝160第四天发现酵母利用了少量甲醇。

第五天8:30，DO显示142％，长期不变，加甲醇未见下降，此时下罐取样，DO＝150，4℃离心收集收取上清，上清液过滤除菌后直接冷冻干燥收集粗蛋白，粗蛋白用SDS-PAGE检测，再用考马斯亮蓝染色，检测蛋白表达量。

结果如图3，本发明的ZHDCP可被高效表达。

实施例3、重组酶ZHDCP对ZEN的降解作用

实验组：1.5mL EP管中加入15μg ZEN，5μg的重组酶ZHDCP，用缓冲液(Tris-HCl缓冲液，含150mmol/L NaCl：25mmol/L，pH＝7.0)定容至1mL，震荡混匀。

对照组：1.5mL EP管中加入15μg ZEN，用缓冲液(Tris-HCl缓冲液，含150mmol/LNaCl：25mmol/L，pH＝7.0)定容至1mL，震荡混匀。

将对照组和实验组放入35℃的水浴锅中反应2h，反应完毕后再将离心管放入98℃的水浴锅中灭活2分钟，取出冷却至室温，用水系滤膜过滤。

对照组用一级水配制标准曲线，标曲浓度为20、50、100、200、500ng/mL，实验组溶液，用一级水适当稀释，上机检测ZEN，计算降解率。利用高效液相色谱(HPLC-UV)检测溶液中的ZEN和降解产物。液相色谱系统为Thermo Scientific Accela 1250UPLC系统(ThermoFisher Scientific，USA)，色谱柱为：Agilent Zorbax Extend-C18柱(100mm×3mm，3.5μm)。色谱柱温度为30℃，样品盘温度为4℃，样品进样体积为50μL。用流动相甲醇/水/甲酸(10/90/0.1，v/v/v)，流动相流速为0.2mL/min。运行时间15min，紫外检测波长274nm。HPLC检测结果显示，ZEN保留时间在8.15min，随着反应，ZEN色谱峰高不断降低(图4)。

本发明人以ZEN毒素为反应底物，通过稀释酶液检测了ZHDCP蛋白酶活为8.1×10⁴U/mg(图5A)，解毒活性高。

实施例4、重组酶ZHDCP对OTA的降解作用

实验组：1.5mL EP管中加入20μg OTA，5μg的重组酶ZHDCP，用缓冲液(Tris-HCl缓冲液，含150mmol/L NaCl：25mmol/L，pH＝7.0)定容至1mL，震荡混匀。

对照组：1.5mL EP管中加入20μg OTA，用缓冲液(Tris-HCl缓冲液，含150mmol/LNaCl：25mmol/L，pH＝7.5)定容至1mL，震荡混匀。

将对照组和实验组放入35℃的水浴锅中反应2h，反应完毕后再将离心管放入98℃的水浴锅中灭活2分钟，取出冷却至室温，用水系滤膜过滤。

利用高效液相色谱(HPLC-UV)检测溶液中的OTA和降解产物。HPLC分析系统组成同实施例3所述，用流动相甲醇/水/乙酸(60/50/2，v/v/v)，流动相流速为1mL/min。运行时间15min，紫外检测波长214nm。HPLC检测结果显示，OTA保留时间在4.13min，随着反应，OTA色谱峰高不断降低(图6)。

本发明人以OTA毒素为反应底物，通过稀释酶液检测了ZHDCP蛋白酶活为3.2×10⁵U/mg(图5B)，解毒活性优异。

实施例5、ZEN和OTA降解产物质谱鉴定

利用赛默飞世尔的TSQ Vantage型三重四极杆液相色谱质谱联用仪鉴定ZEN和OTA降解产物的结构。数据采集使用SP2(2.2)软件进行分析。质谱条件：ESI正负离子模式，喷雾电压3.5KV，鞘气：10arb，辅助气：5arb，管透镜：55v，毛细管电压：14v，毛细管温度：225℃，汽化器温度：50℃，碰撞室被用在65％的最佳相对能量下，测定范围从10到70％。质量分辨率设置为30000，最大离子注入时间设置为100ms。

ZEN及其降解产物ESI-MS光谱图如图7所示，OTA及其降解产物ESI-MS光谱图如图8所示。可见，本发明的ZHDCP对于ZEN和OTA能够实现有效地降解，高效地解除或减低其毒性。

本发明人也试验了所述ZHDCP蛋白酶对于含有ZEN毒素与OTA毒素的混合物的解毒作用，结果其能高效地同时降解混合物中的两种毒素。

本发明人试验了重组蛋白ZHDCP适合的反应体系，其能同时水解ZEN和OTA，反应体系的pH值范围6.5-11，最适pH值7.5，反应温度20-40℃，最佳温度37℃。

实施例6、重组酶ZHDCP体外破坏实验

将5μg的ZHDCP降解酶置于37℃环境中分别放置暴露1d、2d、3d、6d、9d、12d、16d、22d、28d后，加入含5μg的ZEN的缓冲液(Tris-HCl缓冲液，含150mmol/L NaCl：25mmol/L，pH＝7.0)定容至1mL，震荡混匀，放入35℃的水浴锅中反应2h，反应完毕后再将离心管放入98℃的水浴锅中灭活2分钟，取出冷却至室温，用水系滤膜过滤，检测降解率。

实验表明，重组酶ZHDCP在不添加保护剂条件下，能够长期维持较高的活性。在37℃条件下保存6天，活性还能稳定在较高的88.9％的水平(图9)。因此，本发明的ZHDCP具有优异的稳定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> 降解真菌毒素的多功能酶及其应用

<130> 207806

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays )

<400> 1

atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag 60

ggtactggac ccgacgttgt cctcgttccc gatggcctcg gagaatgcca gatgtttgac 120

agctccgtgt cgcagattgc tgctcaaggc ttcagggtca ctacgtttga tatgcccgga 180

atgtcccggt ctgccaaggc accacccgag acctacactg aggtcacggc ccagaagctg 240

gcttcctatg tcatctccgt cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc 300

tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc 360

aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg 420

ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga 480

ggctcggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac 540

ccggtttggg ctcgaggata ccctcggact attcctccct cagctccggt taaggatctg 600

gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct 660

ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg 720

atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaaactacg 780

cagaagcatc tttga 795

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgcaccc gtagtaccat tagcaccccg aacggtatca cctggtacta tgagcaggaa 60

ggcaccggcc ctgatgttgt gctggtgccg gatggtctgg gcgagtgtca gatgtttgac 120

agcagcgtga gccagattgc cgcccagggc tttcgcgtga caacctttga tatgccgggt 180

atgagccgca gtgcaaaagc cccgccggag acctataccg aagtgaccgc ccagaaactg 240

gccagctacg tgattagcgt gctggatgca ctggacatca aacatgccac cgtttggggc 300

tgtagcagcg gcgcaagtac cgtggttgcc ctgctgctgg gttatccgga ccgcattcgc 360

aatgccatgt gccatgaact gccgaccaaa ctgctggatc atctgagcaa caccgccgtg 420

ctggaggatg aagaaatcag caaaatcctg gccaacgtga tgctgaacga tgttagcggc 480

ggtagtgaag cctggcaggc aatgggtgac gaagtgcatg cccgcctgca taagaactat 540

ccggtttggg cccgcggtta tccgcgcaca attccgccga gcgcaccggt taaagatctg 600

gaagccctgc gcggcaaacc gctggattgg accgttggtg ccgccacccc taccgagagc 660

ttcttcgaca atatcgtgac cgccaccaaa gccggtgtga atattggtct gctgccgggc 720

atgcactttc cgtatgtgag ccatccggat gttttcgcca agtatgtggt tgagaccacc 780

cagaaacacc tgtaa 795

<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus)

<400> 3

atgaacatca cgaaatggaa acagctgttg gtgtcattag tggtactggc actggccgca 60

acttgctttg ttccgatgtc taaagcggag gcagccggca atgacccgat tgatgtcaac 120

gcatcagctg cgataatgat tgaggcttca tcgggaaaaa ttttatacag taaaaatgca 180

gacaaaagac tgccgattgc cagcatgaca aaaatgatga ctgaatatct gcttctggaa 240

gccattcaag aaggaaaagt gaaatgggat caaacgtata ctcctgatga ttatgtctat 300

gaaatttctc aagacaacag tttatcaaac gtcccccttc gaaaagacgg caaatacacg 360

gttaaagaac tgtatcaggc tatggcgatt tactctgcca acggagccgc gattgcagtt 420

gccgaaattc ttgccggaac tgaaacgaaa tttgtcgctg aaatgaatgc gaaagccaaa 480

gaattaggca tgacaaacta tgattttgaa aatgccacag ggcttgtgaa tgaagacctt 540

cacggcaagc agccgcaagg agaaggcgtt aaagaagaga gtgaagtttc tgctaaagac 600

atggcgcttc ttgcagaccg cctgatcact gattatccgg aagttctcaa aacaacaagc 660

atcgctaaga cgaaattcag agccggcact gatgatgaaa tggacatgcc gaactggaac 720

ttcatgttaa aaggtcttgt ttctgaatac cctggcgttg acggcttaaa aacgggttct 780

actgattctg cgggatcttg ttttacaagc acagcacagc ggaacggaat gcgggtcatc 840

accgttgtat taaacgcaaa aggcaacctg cataccggac gttttgatga aacgaaaaaa 900

atgctcgatt acgcatttaa cagcaatttc tcaatgaaag atctttaccc tgaaggctct 960

caagtaaaag ggcacaaaac gattgacgtt gaaaaaggga aagacaagca agtcgatatt 1020

gttactgaca aggcgctttc tattcctgtg aaaagcggcg atgaaaagaa ctataaagcc 1080

gaagtgactt tagataaaaa agaaatcacg gctcctgtga aaaagggaac gaaagtcgga 1140

acgctgacag ttacatacaa aggcagtgac aaagactatg gcttcctcaa atccaaagag 1200

ttcagcgtga atcttgtaac gaaaaatgat gtagataaag caaactggtt tgttcagatg 1260

atgcgcggca tcggcggatt cttctccggt atctggaaca gcgccgttga cacggtaaca 1320

ggctggtttt aa 1332

<210> 4

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaatatta ccaaatggaa acagctgctg gtgagcctgg tggtgctggc actggcagca 60

acctgttttg tgccgatgag caaagccgaa gccgccggca atgatccgat tgacgttaac 120

gcaagcgccg ccattatgat cgaagccagc agcggcaaga tcctgtacag taaaaacgcc 180

gacaaacgcc tgccgattgc aagcatgacc aaaatgatga ccgaatatct gctgctggaa 240

gccatccaag aaggcaaggt gaaatgggac cagacctaca ccccggatga ttatgtttac 300

gaaatcagcc aggacaacag cctgagcaat gtgccgctgc gcaaggacgg caaatacacc 360

gtgaaagagc tgtaccaggc catggccatc tatagcgcaa atggcgccgc cattgccgtt 420

gcagaaattc tggccggcac cgagaccaaa ttcgtggccg agatgaatgc aaaggccaag 480

gagctgggca tgaccaacta tgacttcgag aatgccaccg gcctggtgaa tgaagatctg 540

catggcaaac agccgcaggg tgagggtgtg aaagaggaga gcgaagtgag cgcaaaagat 600

atggcactgc tggcagaccg cctgattacc gattatccgg aagtgctgaa aaccaccagc 660

attgccaaga ccaagtttcg tgccggtaca gacgacgaga tggacatgcc taactggaac 720

ttcatgctga aaggcctggt gagtgagtat ccgggcgtgg atggtctgaa aaccggcagt 780

accgatagtg ccggcagctg ttttaccagc accgcccagc gcaacggcat gcgtgtgatc 840

accgtggtgc tgaatgccaa gggcaatctg catacaggtc gcttcgacga gacaaagaaa 900

atgctggatt atgcctttaa cagcaatttt agtatgaaag atctgtaccc ggaaggcagc 960

caggtgaaag gccacaaaac catcgatgtg gaaaagggta aggacaagca ggtggacatc 1020

gttaccgata aagccctgag catcccggtg aaaagtggcg acgagaaaaa ttacaaggcc 1080

gaggtgaccc tggacaaaaa ggaaatcacc gcccctgtta agaaaggcac aaaggtgggt 1140

accctgaccg tgacctacaa gggcagcgac aaagactatg gcttcctgaa aagtaaggag 1200

tttagcgtga acctggtgac caaaaacgac gtggacaagg ccaattggtt cgtgcagatg 1260

atgcgcggca ttggcggctt ctttagcggc atctggaata gcgccgttga caccgtgacc 1320

ggctggttct aa 1332

<210> 5

<211> 2031

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcgcaccc gtagtaccat tagcaccccg aacggtatca cctggtacta tgagcaggaa 60

ggcaccggcc ctgatgttgt gctggtgccg gatggtctgg gcgagtgtca gatgtttgac 120

agcagcgtga gccagattgc cgcccagggc tttcgcgtga caacctttga tatgccgggt 180

atgagccgca gtgcaaaagc cccgccggag acctataccg aagtgaccgc ccagaaactg 240

gccagctacg tgattagcgt gctggatgca ctggacatca aacatgccac cgtttggggc 300

tgtagcagcg gcgcaagtac cgtggttgcc ctgctgctgg gttatccgga ccgcattcgc 360

aatgccatgt gccatgaact gccgaccaaa ctgctggatc atctgagcaa caccgccgtg 420

ctggaggatg aagaaatcag caaaatcctg gccaacgtga tgctgaacga tgttagcggc 480

ggtagtgaag cctggcaggc aatgggtgac gaagtgcatg cccgcctgca taagaactat 540

ccggtttggg cccgcggtta tccgcgcaca attccgccga gcgcaccggt taaagatctg 600

gaagccctgc gcggcaaacc gctggattgg accgttggtg ccgccacccc taccgagagc 660

ttcttcgaca atatcgtgac cgccaccaaa gccggtgtga atattggtct gctgccgggc 720

atgcactttc cgtatgtgag ccatccggat gttttcgcca agtatgtggt tgagaccacc 780

cagaaacacc tggccggcaa tgatccgatt gacgttaacg caagcgccgc cattatgatc 840

gaagccagca gcggcaagat cctgtacagt aaaaacgccg acaaacgcct gccgattgca 900

agcatgacca aaatgatgac cgaatatctg ctgctggaag ccatccaaga aggcaaggtg 960

aaatgggacc agacctacac cccggatgat tatgtttacg aaatcagcca ggacaacagc 1020

ctgagcaatg tgccgctgcg caaggacggc aaatacaccg tgaaagagct gtaccaggcc 1080

atggccatct atagcgcaaa tggcgccgcc attgccgttg cagaaattct ggccggcacc 1140

gagaccaaat tcgtggccga gatgaatgca aaggccaagg agctgggcat gaccaactat 1200

gacttcgaga atgccaccgg cctggtgaat gaagatctgc atggcaaaca gccgcagggt 1260

gagggtgtga aagaggagag cgaagtgagc gcaaaagata tggcactgct ggcagaccgc 1320

ctgattaccg attatccgga agtgctgaaa accaccagca ttgccaagac caagtttcgt 1380

gccggtacag acgacgagat ggacatgcct aactggaact tcatgctgaa aggcctggtg 1440

agtgagtatc cgggcgtgga tggtctgaaa accggcagta ccgatagtgc cggcagctgt 1500

tttaccagca ccgcccagcg caacggcatg cgtgtgatca ccgtggtgct gaatgccaag 1560

ggcaatctgc atacaggtcg cttcgacgag acaaagaaaa tgctggatta tgcctttaac 1620

agcaatttta gtatgaaaga tctgtacccg gaaggcagcc aggtgaaagg ccacaaaacc 1680

atcgatgtgg aaaagggtaa ggacaagcag gtggacatcg ttaccgataa agccctgagc 1740

atcccggtga aaagtggcga cgagaaaaat tacaaggccg aggtgaccct ggacaaaaag 1800

gaaatcaccg cccctgttaa gaaaggcaca aaggtgggta ccctgaccgt gacctacaag 1860

ggcagcgaca aagactatgg cttcctgaaa agtaaggagt ttagcgtgaa cctggtgacc 1920

aaaaacgacg tggacaaggc caattggttc gtgcagatga tgcgcggcat tggcggcttc 1980

tttagcggca tctggaatag cgccgttgac accgtgaccg gctggttcta a 2031

<210> 6

<211> 676

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu Ala Gly Asn Asp Pro Ile Asp Val

260 265 270

Asn Ala Ser Ala Ala Ile Met Ile Glu Ala Ser Ser Gly Lys Ile Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Asn Ala Asp Lys Arg Leu Pro Ile Ala Ser Met Thr Lys

290 295 300

Met Met Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Glu Ala Ile Gln Glu Gly Lys Val

305 310 315 320

Lys Trp Asp Gln Thr Tyr Thr Pro Asp Asp Tyr Val Tyr Glu Ile Ser

325 330 335

Gln Asp Asn Ser Leu Ser Asn Val Pro Leu Arg Lys Asp Gly Lys Tyr

340 345 350

Thr Val Lys Glu Leu Tyr Gln Ala Met Ala Ile Tyr Ser Ala Asn Gly

355 360 365

Ala Ala Ile Ala Val Ala Glu Ile Leu Ala Gly Thr Glu Thr Lys Phe

370 375 380

Val Ala Glu Met Asn Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr

385 390 395 400

Asp Phe Glu Asn Ala Thr Gly Leu Val Asn Glu Asp Leu His Gly Lys

405 410 415

Gln Pro Gln Gly Glu Gly Val Lys Glu Glu Ser Glu Val Ser Ala Lys

420 425 430

Asp Met Ala Leu Leu Ala Asp Arg Leu Ile Thr Asp Tyr Pro Glu Val

435 440 445

Leu Lys Thr Thr Ser Ile Ala Lys Thr Lys Phe Arg Ala Gly Thr Asp

450 455 460

Asp Glu Met Asp Met Pro Asn Trp Asn Phe Met Leu Lys Gly Leu Val

465 470 475 480

Ser Glu Tyr Pro Gly Val Asp Gly Leu Lys Thr Gly Ser Thr Asp Ser

485 490 495

Ala Gly Ser Cys Phe Thr Ser Thr Ala Gln Arg Asn Gly Met Arg Val

500 505 510

Ile Thr Val Val Leu Asn Ala Lys Gly Asn Leu His Thr Gly Arg Phe

515 520 525

Asp Glu Thr Lys Lys Met Leu Asp Tyr Ala Phe Asn Ser Asn Phe Ser

530 535 540

Met Lys Asp Leu Tyr Pro Glu Gly Ser Gln Val Lys Gly His Lys Thr

545 550 555 560

Ile Asp Val Glu Lys Gly Lys Asp Lys Gln Val Asp Ile Val Thr Asp

565 570 575

Lys Ala Leu Ser Ile Pro Val Lys Ser Gly Asp Glu Lys Asn Tyr Lys

580 585 590

Ala Glu Val Thr Leu Asp Lys Lys Glu Ile Thr Ala Pro Val Lys Lys

595 600 605

Gly Thr Lys Val Gly Thr Leu Thr Val Thr Tyr Lys Gly Ser Asp Lys

610 615 620

Asp Tyr Gly Phe Leu Lys Ser Lys Glu Phe Ser Val Asn Leu Val Thr

625 630 635 640

Lys Asn Asp Val Asp Lys Ala Asn Trp Phe Val Gln Met Met Arg Gly

645 650 655

Ile Gly Gly Phe Phe Ser Gly Ile Trp Asn Ser Ala Val Asp Thr Val

660 665 670

Thr Gly Trp Phe

675

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ggaattcatg cgcacccgta gtacca 26

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

caatcggatc attgccggcc aggtgtttct gggtggtctc 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gagaccaccc agaaacacct ggccggcaat gatccgattg 40

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tatattgcgg ccgcttagaa ccagccggtc acg 33

Claims (15)

1.一种用于降解真菌毒素的蛋白，包含相互连接的以下的蛋白：赤霉烯酮水解酶蛋白，羧肽酶蛋白片段。

2.如权利要求1所述的用于降解真菌毒素的蛋白，其特征在于，其从氨基端到羧基端依次包含：赤霉烯酮水解酶蛋白，羧肽酶蛋白片段。

3.如权利要求1所述的用于降解真菌毒素的蛋白，其特征在于，所述赤霉烯酮水解酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第1～264位所示；或

所述羧肽酶蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第265～676位所示。

4.权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白的用途，用于：

降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素；或

制备降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的组合物。

5.一种核酸，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白。

6.如权利要求5所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求5所述的核酸。

8.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求6所述的载体或其基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子。

9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母细胞；较佳地为毕赤酵母。

10.一种制备权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白的方法，包括：培养权利要求7所述的细胞，表达和分离出所述的蛋白。

11.一种用于降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(i)权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白；和

(ii)生物学上可接受的载体。

12.一种降解玉米赤霉烯酮和/或赭曲霉素的方法，所述方法包括：以权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白或权利要求11所述的组合物处理米赤霉烯酮和/或赭曲霉素，或处理含有米赤霉烯酮和/或赭曲霉素的对象。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，进行降解时，反应体系的pH值范围6.5-11；温度20-40℃。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，进行降解后，所述的米赤霉烯酮被降解为H-ZEN和/或D-ZEN；或

所述的赭曲霉素被降解为OTA-α，Ota Amide和/或OTA-d5。

15.一种降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉素的试剂盒，其特征在于，其中含有：

权利要求1～3任一所述的用于降解真菌毒素的蛋白；或

权利要求11所述的组合物。

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