CN113774040B - B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用。本发明首次揭示一种伏马菌素降解酶FUMDI，其能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，具有良好的生物活性，能高效地降解多种B族伏马菌素化合物，大大降低化合物毒性。本发明的FUMDI不仅能降解原型伏马菌素，还对降解隐蔽型伏马菌素(HFB1)具有良好的降解效果，其适用范围更广。

Description

B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用；本发明所述的降解酶可以降解B族伏马菌素，其降解产物比原型毒素的毒性大大降低。

背景技术

伏马菌素主要是由串珠镰刀菌(F.verticillioides)和多育镰刀菌(F.proliferatum)产生的一种水溶性代谢产物，是一类含有羟基和对称的丙三酸羧侧链基团的线性双酯化合物，分为A、B、C、P四类，其原型经过水解等作用的修饰转化为隐蔽型伏马菌素；自然界里污染经济作物的伏马菌素主要是FB类，主要类型分为FB1、FB2和FB3等，其中FB1是污染最广、毒性最强的一种伏马菌素。伏马菌素在世界范围内主要污染玉米及其制品，尤其以中国和南非的部分地区污染最为严重。蒋玉寒等报道了在中国玉米主要种植区(三北地区和西南地区)B族伏马菌素的污染率超过66.67％，西南地区的污染率甚至达到100％。程传民等还发现了中国的奶牛、家禽和猪等主要畜牧经济动物的饲料中B族伏马菌素的污染率超过50％。Regnier等的研究表明，伏马菌素能够引起多种危害，它可以引起猪患肺水肿、马患脑白质软化症以及新生儿的神经管缺陷症，还会导致啮齿类动物肝脏及肾脏形成肿瘤；还能损害人类和动物的免疫系统，造成免疫抑制，降低免疫功能；也具有生殖毒性，引起哺乳动物生殖器官的病变及生殖能力的下降；同时，也会引发肝肾损伤。更严重的是，Wang等的研究人员在对人类食管癌高发地区FB1污染情况的调查中发现，人类食管癌的发生可能与FB1的暴露有关；2002年，FB1被国际癌症研究组织(IARC)评定为2B级致癌物(IARC 2002)。随着毒理学研究的深入，隐蔽型伏马菌素HFB1的毒性也被发现。因此，采取必要的技术手段减少B族伏马菌素的污染，进而降低其危害刻不容缓。

Soriano和Hahn等研究人员发现B族伏马菌素的致毒机制主要因为它们的结构与神经鞘氨醇(Sphingosine，So)和二氢神经鞘氨醇(Shpinganine，Sa)的结构类似，在鞘脂代谢过程中它的三羧酸基团(-TCA)和氨基(-NH₂)可竞争性的抑制神经鞘氨醇N-乙酰基转移酶的活性，使神经鞘氨醇生物合成减少、复合鞘酯减少、游离的二氢神经鞘氨醇聚集增加，从而阻滞了复合鞘脂作为第二信使的信号传递，影响细胞的增殖、分化以及凋亡。因此，三羧酸基团(-TCA)和氨基(-NH₂)被认为是B族伏马菌素的致毒基团。

针对已被B族伏马菌素污染的粮食，在进入生产环节前，必须将其中的毒素含量降低至安全标准以下。由于物理、化学和微生物降解方法，容易造成粮食品质的破坏或引入新的有毒物质，限制了其推广应用。因此，开发更为有效、更为环保的生物降解酶，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种降解B族伏马菌素的方法，所述方法包括：以B族伏马菌素降解酶或含有该降解酶的组合物处理B族伏马菌素化合物，或处理含有B族伏马菌素化合物的对象(如受到B族伏马菌素化合物污染的物质)；其中，所述B族伏马菌素的降解酶包含相互连接的以下的蛋白：羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段。

在一个优选例中，所述B族伏马菌素包括伏马菌素FB1、FB2、FB3和隐蔽型伏马菌素HFB1；较佳地，所述方法的降解产物为2-keto-伏马菌素(2-keto-FBs)；较佳地，其降解效率高于90％，更佳地高于95％。

在另一优选例中，进行降解时，反应体系的pH值范围为7.2±1；较佳地7.2±0.6；更佳地7.2±0.3；如7.2±0.2或7.2±0.1。

在另一优选例中，进行降解时，反应体系的温度为25±10℃；较佳地25±5℃；如25±3℃、25±2℃、25±1℃。

在本发明的另一方面，提供一种B族伏马菌素的降解酶，包含相互连接的以下的蛋白：羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段。

在一个优选例中，所述的B族伏马菌素的降解酶从氨基端到羧基端依次包含：羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段。

在另一优选例中，所述B族伏马菌素的降解酶中，羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段通过肽键连接。

在另一优选例中，所述的B族伏马菌素的降解酶中，所述羧酸酯酶蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第1～540位所示。

在另一优选例中，所述的B族伏马菌素的降解酶中，所述氨基转移酶蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第541～961位所示。

在另一优选例中，所述的羧酸酯酶蛋白片段还包括其同功能变体。

在另一优选例中，所述的氨基转移酶蛋白片段还包括其同功能变体。

在本发明的另一方面，提供所述的B族伏马菌素的降解酶的用途，用于降解B族伏马菌素化合物；较佳地，所述的B族伏马菌素化合物包括伏马菌素FB1、FB2、FB3和隐蔽型伏马菌素HFB1。

在本发明的另一方面，提供一种核酸，所述的核酸编码所述的B族伏马菌素的降解酶。

在一个优选例中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。

在一个选例中，所述的载体以pPIC9K为骨架载体。

在本发明的另一方面，提供一种细胞，所述的细胞含有所述的载体或其基因组中整合有所述的核酸分子。

在一个优选例中，所述细胞为酵母细胞；较佳地为毕赤酵母。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的B族伏马菌素的降解酶的方法，包括：培养所述的细胞，表达和分离出所述的降解酶。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解B族伏马菌素的组合物，所述的组合物含有：(i)所述的B族伏马菌素的降解酶；和，(ii)生物学上(包括食品学上或工业学上)可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解B族伏马菌素的试剂盒，其中含有：所述的B族伏马菌素的降解酶；或，所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、FumD蛋白对FBs的降解作用。

图2、fumdi构建和表达流程图；

(A)fumdi构建的流程图；

(B)fumdi表达和效果验证的流程图。

图3、真表达载体pPIC9K-fumdi的构建示意图。

图4、真核表达载体pPIC9K-fumdi的基因重组和表达的检测结果；

(A)真核表达载体pPIC9K-fumdi的琼脂糖凝胶检测结果；

(B)所表达的FUMDI粗蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。

图5、融合蛋白FUMDI对FB1降解作用；利用液相色谱串联三重四级杆质谱LC-MS/MS检测溶液中FB1和中间产物HFB1浓度；

(A)5μg/ml FB1被融合蛋白FUMDI处理24h后，FB1和HFB1的色谱图；

(B)反应0小时以及24小时的时候，FB1和HFB1的浓度变化。

图6、融合蛋白FUMDI对FB2和FB3降解作用；利用液相色谱串联三重四级杆质谱LC-MS/MS检测溶液中FB2和FB3浓度变化。

图7、伏马菌素降解反应过程。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种伏马菌素降解酶FUMDI，该伏马菌素降解酶包含羧酸酯酶蛋白(carboxylesterase，FumD)片段，氨基转移酶蛋白(aminotransferase，FumI)片段。本发明的FUMDI能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，具有良好的生物活性，能高效地降解B族伏马菌素化合物，大大降低其毒性。本发明的FUMDI不仅能降解原型伏马菌素，还对降解隐蔽型伏马菌素(HFB1)具有良好的降解效果，其适用范围更广。

术语

如本文所用，术语“伏马菌素降解酶”、“B族伏马菌素降解酶”“本发明的降解酶”、“本发明的多功能蛋白(肽/多肽)”、“FUMDI”、“降解酶FUMDI”、“本发明的重组酶”、“本发明的功能酶”等可互换使用，都指由FumD蛋白片段、FumI蛋白片段连接而成的蛋白；较佳的它们之间通过化学键(如肽键)相连接。

如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的FUMDI传送给需要处理的对象(包括食品、饲料)的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的FUMDI的生物活性的载体。

FUMDI

本发明提供一种降解酶FUMDI，其包含FumD蛋白片段和FumI蛋白片段，两者操作性连接。较佳的，所述的FUMDI是一种分离的蛋白，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物；所述的FUMDI也可存在于混合物中，如存在于一种细胞裂解物或粗提物中。

本发明包括所述FumD蛋白片段或FumI蛋白片段的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的FumD蛋白片段或FumI蛋白片段相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。

在本发明中，术语“FumD蛋白片段”是包括SEQ ID NO:6中第1～540位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述FumD蛋白片段相同功能的、SEQ ID NO:6中第1～540位所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述FumD蛋白片段的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:6中第1～540位所示氨基酸序列的多肽的保守功能域(降解毒素的功能域)之外。

在本发明中，术语“FumI蛋白片段”是包括SEQ ID NO:6中第541～961位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述FumI蛋白片段相同功能的、SEQ ID NO:6中第541～961所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述FumD蛋白片段的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:6中第541～961所示氨基酸序列的多肽的保守功能域(降解毒素的功能域)之外。

本发明的FUMDI中，不包括全长的FumI蛋白。本发明所述的“FumI蛋白片段”为天然FumI蛋白基础上、经改造的蛋白片段。

应理解，本发明也包括与所述FumD蛋白片段或FumI蛋白片段的具有较高同源性的蛋白，如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明所述的FumD蛋白片段与FumI蛋白片段之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。作为本发明的优选方式，所述的FumD蛋白片段、FumI蛋白片段之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

作为本发明的优选方式，所述的FUMDI从氨基端到羧基端依次包含：FumD蛋白片段、FumI蛋白片段。

所述的FumD蛋白片段与FumI蛋白片段之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-50个氨基酸；较佳地包括1-30个或包括2～20个氨基酸。作为本发明的优选方式，所述的FumD蛋白片段、FumI蛋白片段之间进行直接相连接。本发明人发现，即使不使用一些柔性连接肽的辅助，所述的FumD蛋白片段、FumI蛋白片段之间也能实现兼容且发挥良好的生物活性。

另一方面，本发明还提供了编码所述的FUMDI的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的FUMDI的核酸都适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

编码本发明FUMDI的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码FumD蛋白片段、FumI蛋白片段氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明FUMDI的DNA序列。

本发明还提供了包含编码所述FUMDI的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述FUMDI的表达。

多种合适的载体可被应用于本发明中，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，例如可参考Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。较佳地，所述的表达载体为酵母细胞适用的表达载体。

此外，含有编码所述FUMDI的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明的优选方式中，采用真核细胞作为宿主细胞。作为本发明的最优选的方式，所述的真核细胞为毕赤酵母细胞。

生产本发明的FUMDI的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有FUMDI编码核酸的重组细胞。所述方法还可包括FUMDI的分离和/或纯化。

可将上述制备获得的FUMDI纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

FUMDI的应用

本发明获得FUMDI酶活性理想，选择性好。其能够适于在酵母细胞表达的条件下被重组表达，有着广泛的应用潜力。根据本发明人的新发现，本发明所述的FUMDI的用途包括：降解伏马菌素FB1、FB2、FB3或隐蔽型伏马菌素HFB1，或降解这些化合物的组合。FUMDI蛋白对于多种化合物具有降解作用，去除或减轻其毒性；同时应理解，本发明的FUMDI蛋白也可被应用于降解与FB1、FB2、FB3或HFB1在化学结构上具有相似性的其它毒素，此类应用也应被涵盖在本发明中。

在获得了本发明的FUMDI后，根据本发明的教导，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥降解B族伏马菌素的作用。在一种方式中，提供了一种降解B族伏马菌素的方法，包括：利用本发明所述的FUMDI或所述的组合物进行抑制。在另一种方式中，提供了一种降解B族伏马菌素的方法，包括：将编码本发明所述的FUMDI多肽的多核苷酸引入到基因工程细胞中，所述基因工程细胞可大规模地被扩繁，将所述的基因工程细胞或其加工产物施用于需要解毒处理的对象(例如但不限于：饲料、粮食加工制品、如与制品)、用具(如食物或饲料的容器)或场所(如一些食物存储、食物加工、饲料加工、动物养殖或植物培育场所)，从而发挥抑制作用。

本发明人首次利用毕赤酵母表达系统表达能同时降解多种B族伏马菌素化合物的FUMDI，具有良好的应用前景。

应理解，在本发明的教导下，还存在本发明FUMDI的多种多样的应用模式，这些均应被涵盖在本发明中。

在本发明的具体实施例中，通过融合PCR技术将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列进行融合，以pPIC9K为载体构建重组质粒pPICK-FUMDI，转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达处本发明的新型双功能重组酶FUMDI。体外实验证实该FUMDI可高效降解B族伏马菌素，获得毒性大大降低的产物2-keto-伏马菌素(2-keto-FBs)；其降解效率可达到高于95％，本发明也不排除其在更优的反应条件下能达到更高的降解效率。毕赤酵母表达系统操作简单，安全、高效且生产成本低廉，适用于大规模发酵制备，可直接应用于工业或农业的领域中，环境友好。

在本发明的具体实施例中，首先获得fumd核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，经过序列优化后得到SEQ ID NO:2所示序列；获得fumi核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，经过优化后序列得到如SEQ ID NO:4所示序列。将两条优化的序列进行操作性连接。之后，本发明人通过真核表达获得fumdi的编码蛋白，具体地，本发明人以pPIC9K为载体构建重组质粒pPIC9K-fumdi，转化到毕赤酵母(GS115)中表达一种新型可溶性重组酶FUMDI。

本发明人将FUMDI粗蛋白与FBs在合适的缓冲液中进行反应，利用液相色谱仪-质谱仪联用方法(LC-MS/MS)检测溶液中的FBs含量。检测结果表明，本发明建立的重组蛋白FUMDI具有非常显著的降解B族伏马菌素的活性，且降解率很高。更具体地，本发明人在25℃pH 7.2条件下检测，重组酶FUMDI对伏马菌素FB1、FB2和FB3及隐蔽型伏马菌素HFB1的降解效率达到95％以上，且降解产物相比原型毒素毒性显著降低。因此，本发明的重组酶具有高效、安全和成本廉价等优点，适用于大规模发酵制备，可直接应用于农作物或饲料中B族伏马菌素的削减。

组合物/制剂/试剂盒

本发明提供了一种组合物，其中含有有效量的FUMDI，以及余量的生物学上可接受的载体。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

应理解，只要能够将本发明所述的FUMDI在保持全部或部分活性的前提递送到需要解毒处理的对象(例如但不限于：饲料、粮食加工制品、如与制品)、用具(如食物或饲料的容器)或场所(如一些食物存储、食物加工、饲料加工、动物养殖或植物培育场所)的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体剂、喷洒剂或喷雾剂。

浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有占比6-90％或10-90％的FUMDI含量，而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以为0.00005-5％。此外，还可以包含其他合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。

在一些需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它活性毒素降解成分，以实现通过一次使用而将多种毒素进行共同降解或减毒。

本发明的FUMDI、含有其的载体或宿主细胞、含有其或其宿主细胞的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、首次通过基因工程手段获得能同时降解B族伏马菌素(FB1、FB2、FB3)两个致毒基团(三羧酸基团(-TCA)和氨基(-NH₂))的功能酶，其产物安全性高，具有更好的应用前景。

2、本发明的功能酶不仅能降解原型伏马菌素，还对降解隐蔽型伏马菌素(HFB1)具有良好的降解效果，其适用范围更广。

3、本发明的功能酶具有高效、特异、安全、绿色环保的特点，其可以专一性地转化毒素分子，将其转化为无毒或低毒的形式。

4、本发明的功能酶的制备简单，在毕赤酵母真核表达中易于表达，可溶性好，易于纯化，基因产物明确，方便蛋白收取，适用于大规模生产。本发明改变了本领域以往难以获得高活性多功能酶的状况，利用真核表达系统对其进行蛋白表达，具有良好的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

序列信息

天然fumd核苷酸序列(SEQ ID NO:1)

ATGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGCCGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCGCGGATCAGCGTTTCCCGGGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTTCATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGCTCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCGTCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCTCCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGGCCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTTTGCGCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCTTAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATCTGAATATCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGGGGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCTGGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCTGCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGATTCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCTTTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGCTCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACAACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGGCGATACTGCAAAGTCCGGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCTTTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTACGGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGAAGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCGATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCTTCCGCAAGATACCCGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGAAGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAGCCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACGAGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCCGCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCGAACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCTATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCGTCGGACATCAAACTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTCGCGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCCGCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG

优化后fumd核苷酸序列(SEQ ID NO:2)

ATGAAAGAACACCAATGTAGAGGTGGTAGAGCTTCTCCTGCTGCACCTGCTACCTGGCTGGCTAGAATTTCCGTTAGTAGAGGCGCTTCTGCTATCGCTTGGACTTTCATGCTGGGTGCTACTGCAATTCCCGTGGCCGCCCAAACCGATGATCCAAAGTTAGTCAGGCACACTCAATCTGGTGCTGTCGAAGGTGTCGAAGGAGATGTTGAAACCTTCCTTGGCATCCCATTTGCAGCCCCACCTGTTGGTGACCTAAGATGGAGACCTCCCGCTCCTCCAAGAGCTTGGGCAGGTACAAGAGACGGAAGAAGATTCGCCCCCGATTGTATTGGAAACGAACGTTTGAGAGAAGGAAGTAGAGCCGCCGGTACCAGTGAGGACTGTCTATATCTAAATATCTGGAGTCCTAAACAGGTCGGAAAAGGTGGCCTTCCTGTGATGATCTGGGTCTACGGCGGTGGCTTTTCTGGAGGTTCTGGAGCTGTTCCATACTATGATGGTTCTGCTCTAGCTCAAAAGGGTGTTGTCGTTGTTACATTCAATTATAGAGCTGGCATTCTGGGCTTTCTAGCACACCCTGCCTTGTCAAAGGAATCCCCAAATGGTGTGTCCGGCAACTACGGCCTACTAGATATGTTAGCTGCATTTAAGTGGGTTCAAAACAATATCCGTGAGTTTGGTGGTGACCCAAACAGAGTAACCGTCTTTGGTGAGTCCGCCGGTGCTTCCGCTTTAGGTTTGTTGTTGACTTCCCCCTTGTCTGAATCAGCTTTTAATCAAGCTATTCTTCAATCTCCAGGATTGGCTAGGCCATTGGCTACCTTGTCAGAATCTGAAGCTAATGGATTGGAACTTGGTGCTGACATCTCTGCTCTGAGGAGAGCCGATGCAGGAGAATTAACTAAGATTGCTCAATCAAGAATCCCCATGTCTAGACAATTTACGAAGCCAAGACCTATGGGTCCAATCCTTGACGGATACGTTTTGAGAACTCTTGACGTTGACGCATTTGCTAAAGGTGCTTTTAGAAAAATACCAGTTCTTGTTGGTGGTAATGCCGATGAGGGCAGAGCTTTCACTGACAGATTGCCAGTGAAGACCGTTTTAGAATATAGAGCCTACCTGACTGAACAATTTGGTGATGAAGCAGACGCTTGGGAAAGGTGTTATCCAGCAAACAGTGATGCAGATGTTCCAGCTGCTGTAGCTAGACTATTCGGAGATTCACAGTTTAATAACGGAATCGAGCTTCTTTCTGCAGCATTTGCAAAGTGGAGAACTCCTTTGTGGAGATATAGATTCACTGGTATCCCAGGAGCTGGTAGAAGACCAGCTACTCATGGAGACGAAATTCCATATGTTTTTGCAAATCTGGGACCTTCCAGTGTAAGTATGTTTGGCTCACTTGAAGGAGGAGCCGGAGCTTCCGACATTAAGTTAGCCACAGAGATGTCCGCTGCATGGGTCAGTTTTGCTGTCCATGGAGTACCAGATCAAGGTACTAAGTCTCATTGGCCACGATTTGAACGAAGAGGCGAAATTATGACTTTCGGTTCCCAAGTCGGTTCTGGAGAGGGATTAGGAGTTAGTCCCTCTAAAGCATGTCAACCATCTAAGTAG

天然fumi核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

ATGGCGAACGGAACAAGGCAGAAAGATCTCAGAGAACGCGCCGAACGGGTCATTCCGGGCGGGATGTACGGCCACGAGTCGACACGGTTGCTGCCGCCAGAGTTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCGCGCTGGGGGCACGAATTTGGGACGCCGACGAGCAGCCCTATATCGACTATATGTGCGCGTATGGGCCAAATTTGCTCGGTTACCGGCAATCCGAAATCGAAGCCGCGGCTGATGCGCAGCGACTTCTCGGCGACACCATGACCGGTCCTTCGGAGATCATGGTCAACCTCGCCGAAGCCTTTGTGGGCATGGTCCGTCATGCGGATTGGGCGATGTTCTGCAAAAATGGCAGCGATGCCACCTCAACGGCGATGGTTCTCGCGCGTGCCCATACGGGGCGCAAAACCATATTATGCGCCAAAGGCGCCTATCATGGCGCTTCCCCGTGGAACACTCCGCATACTGCCGGGATTCTCGCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGACGCCCAAAGCTTATCGGACGCGTTCAAGGCGCACGATGGCGATATTGCGGCTGTCTTTGCCACACCTTTCCGACACGAAGTATTTGAGGACCAGGCCCTCGCCCAGCTTGAGTTCGCGCGCACCGCTCGAAAATGTTGTGACGAGACCGGTGCGCTTCTGGTCGTTGACGATGTGCGCGCAGGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCATTTGGGTATCGAACCCGATCTCAGTTGCTGGGGAAAATGCTTTGCGAATGGCTATCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACAAGGCGCGCGATGCGGCGCGGGATATATTTGTGACCGGCTCCTTCTGGTTCTCTGCGGTACCGATGGCGGCGGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGAGAGACGCCTTATCTCGAAACGCTGATCGCCAGCGGCGCCGCCCTGCGGGCAGGCCTGGAGGCACAGTCTCAGCGCCATGGTCTTGAGTTGAAGCAGACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTCTTTGCGGACGATCCCGATTTTCGGATCGGCTATGCGTGGGCCGCGGCGTGCCTGAAGGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAATATGTTTCTCTCTGCGGCCCATACAGTTGACGATGTAACGGAGACCCTCGAGGCGACGGATCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTCAGAGATTTTGCGTCTCTCCAGCCTCATCCCATTTTAATGCAACTCGCCGGTGCTTGA

优化后fumi核苷酸序列(SEQ ID NO:4)

ATGGCCAATGGTACGAGACAAAAAGACCTTAGAGAGCGTGCCGAACGAGTTATCCCAGGAGGAATGTATGGTCACGAGTCAACTCGTCTGTTGCCACCAGAGTTTCCCCAGTTTTTTAGGAGAGCTCTTGGCGCCAGAATTTGGGATGCTGACGAACAGCCTTATATAGATTATATGTGTGCTTATGGACCAAACCTGCTAGGATACAGACAATCTGAAATTGAAGCTGCCGCCGACGCTCAGAGATTACTGGGAGACACCATGACCGGACCCTCTGAAATCATGGTTAATCTTGCTGAGGCTTTTGTTGGAATGGTCCGTCATGCCGATTGGGCTATGTTTTGCAAAAATGGATCTGATGCTACATCTACAGCAATGGTTCTTGCAAGAGCTCATACAGGTAGAAAAACCATTTTATGCGCAAAGGGCGCTTATCATGGAGCCTCCCCTTGGAACACCCCACATACCGCTGGAATCCTGGCCTCTGACAGGGTTCACGTCGCTTACTACACCTACAATGATGCTCAATCCCTTTCCGATGCTTTTAAGGCCCATGATGGTGATATCGCAGCCGTCTTTGCCACTCCATTTAGACATGAGGTTTTTGAAGATCAGGCCTTGGCCCAACTTGAGTTTGCAAGAACTGCTAGAAAGTGTTGCGACGAGACTGGTGCATTGTTGGTTGTCGACGATGTTAGAGCAGGATTTAGGGTCGCCAGAGATTGCTCATGGACTCATTTAGGAATCGAACCAGACTTGTCTTGTTGGGGAAAATGTTTCGCTAATGGATACCCTATTTCAGCTCTTCTTGGTAGTAATAAAGCTCGAGACGCTGCCAGAGACATATTCGTAACAGGAAGTTTTTGGTTTTCTGCAGTGCCAATGGCCGCTGCTATTGAAACATTAAGAATAATTAGAGAGACTCCTTACTTGGAGACCTTGATTGCCTCAGGTGCAGCATTGCGTGCTGGACTGGAGGCTCAATCTCAAAGGCACGGCTTGGAGCTTAAGCAGACAGGACCAGCTCAGATGCCTCAGATCTTTTTCGCAGATGATCCAGATTTCAGGATCGGATATGCTTGGGCTGCCGCCTGTCTGAAGGGCGGCGTATACGTACATCCATACCACAACATGTTCTTATCTGCCGCACACACCGTTGACGATGTCACTGAGACTCTGGAAGCCACAGATCGTGCCTTTTCTGCTGTACTGAGGGACTTCGCCTCCCTGCAACCCCACCCAATTTTGATGCAACTTGCTGGTGCTTGA

重组fumdi核苷酸序列(SEQ ID NO:5)

ATGAAAGAACACCAATGTAGAGGTGGTAGAGCTTCTCCTGCTGCACCTGCTACCTGGCTGGCTAGAATTTCCGTTAGTAGAGGCGCTTCTGCTATCGCTTGGACTTTCATGCTGGGTGCTACTGCAATTCCCGTGGCCGCCCAAACCGATGATCCAAAGTTAGTCAGGCACACTCAATCTGGTGCTGTCGAAGGTGTCGAAGGAGATGTTGAAACCTTCCTTGGCATCCCATTTGCAGCCCCACCTGTTGGTGACCTAAGATGGAGACCTCCCGCTCCTCCAAGAGCTTGGGCAGGTACAAGAGACGGAAGAAGATTCGCCCCCGATTGTATTGGAAACGAACGTTTGAGAGAAGGAAGTAGAGCCGCCGGTACCAGTGAGGACTGTCTATATCTAAATATCTGGAGTCCTAAACAGGTCGGAAAAGGTGGCCTTCCTGTGATGATCTGGGTCTACGGCGGTGGCTTTTCTGGAGGTTCTGGAGCTGTTCCATACTATGATGGTTCTGCTCTAGCTCAAAAGGGTGTTGTCGTTGTTACATTCAATTATAGAGCTGGCATTCTGGGCTTTCTAGCACACCCTGCCTTGTCAAAGGAATCCCCAAATGGTGTGTCCGGCAACTACGGCCTACTAGATATGTTAGCTGCATTTAAGTGGGTTCAAAACAATATCCGTGAGTTTGGTGGTGACCCAAACAGAGTAACCGTCTTTGGTGAGTCCGCCGGTGCTTCCGCTTTAGGTTTGTTGTTGACTTCCCCCTTGTCTGAATCAGCTTTTAATCAAGCTATTCTTCAATCTCCAGGATTGGCTAGGCCATTGGCTACCTTGTCAGAATCTGAAGCTAATGGATTGGAACTTGGTGCTGACATCTCTGCTCTGAGGAGAGCCGATGCAGGAGAATTAACTAAGATTGCTCAATCAAGAATCCCCATGTCTAGACAATTTACGAAGCCAAGACCTATGGGTCCAATCCTTGACGGATACGTTTTGAGAACTCTTGACGTTGACGCATTTGCTAAAGGTGCTTTTAGAAAAATACCAGTTCTTGTTGGTGGTAATGCCGATGAGGGCAGAGCTTTCACTGACAGATTGCCAGTGAAGACCGTTTTAGAATATAGAGCCTACCTGACTGAACAATTTGGTGATGAAGCAGACGCTTGGGAAAGGTGTTATCCAGCAAACAGTGATGCAGATGTTCCAGCTGCTGTAGCTAGACTATTCGGAGATTCACAGTTTAATAACGGAATCGAGCTTCTTTCTGCAGCATTTGCAAAGTGGAGAACTCCTTTGTGGAGATATAGATTCACTGGTATCCCAGGAGCTGGTAGAAGACCAGCTACTCATGGAGACGAAATTCCATATGTTTTTGCAAATCTGGGACCTTCCAGTGTAAGTATGTTTGGCTCACTTGAAGGAGGAGCCGGAGCTTCCGACATTAAGTTAGCCACAGAGATGTCCGCTGCATGGGTCAGTTTTGCTGTCCATGGAGTACCAGATCAAGGTACTAAGTCTCATTGGCCACGATTTGAACGAAGAGGCGAAATTATGACTTTCGGTTCCCAAGTCGGTTCTGGAGAGGGATTAGGAGTTAGTCCCTCTAAAGCATGTCAACCATCTAAGGCCAATGGTACGAGACAAAAAGACCTTAGAGAGCGTGCCGAACGAGTTATCCCAGGAGGAATGTATGGTCACGAGTCAACTCGTCTGTTGCCACCAGAGTTTCCCCAGTTTTTTAGGAGAGCTCTTGGCGCCAGAATTTGGGATGCTGACGAACAGCCTTATATAGATTATATGTGTGCTTATGGACCAAACCTGCTAGGATACAGACAATCTGAAATTGAAGCTGCCGCCGACGCTCAGAGATTACTGGGAGACACCATGACCGGACCCTCTGAAATCATGGTTAATCTTGCTGAGGCTTTTGTTGGAATGGTCCGTCATGCCGATTGGGCTATGTTTTGCAAAAATGGATCTGATGCTACATCTACAGCAATGGTTCTTGCAAGAGCTCATACAGGTAGAAAAACCATTTTATGCGCAAAGGGCGCTTATCATGGAGCCTCCCCTTGGAACACCCCACATACCGCTGGAATCCTGGCCTCTGACAGGGTTCACGTCGCTTACTACACCTACAATGATGCTCAATCCCTTTCCGATGCTTTTAAGGCCCATGATGGTGATATCGCAGCCGTCTTTGCCACTCCATTTAGACATGAGGTTTTTGAAGATCAGGCCTTGGCCCAACTTGAGTTTGCAAGAACTGCTAGAAAGTGTTGCGACGAGACTGGTGCATTGTTGGTTGTCGACGATGTTAGAGCAGGATTTAGGGTCGCCAGAGATTGCTCATGGACTCATTTAGGAATCGAACCAGACTTGTCTTGTTGGGGAAAATGTTTCGCTAATGGATACCCTATTTCAGCTCTTCTTGGTAGTAATAAAGCTCGAGACGCTGCCAGAGACATATTCGTAACAGGAAGTTTTTGGTTTTCTGCAGTGCCAATGGCCGCTGCTATTGAAACATTAAGAATAATTAGAGAGACTCCTTACTTGGAGACCTTGATTGCCTCAGGTGCAGCATTGCGTGCTGGACTGGAGGCTCAATCTCAAAGGCACGGCTTGGAGCTTAAGCAGACAGGACCAGCTCAGATGCCTCAGATCTTTTTCGCAGATGATCCAGATTTCAGGATCGGATATGCTTGGGCTGCCGCCTGTCTGAAGGGCGGCGTATACGTACATCCATACCACAACATGTTCTTATCTGCCGCACACACCGTTGACGATGTCACTGAGACTCTGGAAGCCACAGATCGTGCCTTTTCTGCTGTACTGAGGGACTTCGCCTCCCTGCAACCCCACCCAATTTTGATGCAACTTGCTGGTGCTTGA

重组FUMDI核苷酸序列(SEQ ID NO:6)

MKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSKANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYIDYMCAYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSDATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGILASDRVHVAYYTYNDAQSLSDAFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCCDETGALLVVDDVRAGFRVARDCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIETLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYAWAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQLAGA*

实施例1、FumD蛋白对FBs的降解作用

以人源正常的胃上皮细胞系(GES-1)为毒性评估模型，评估FB1和FumD蛋白单独反应后产物的细胞毒性。GES-1细胞被处理48h后，使用CCK-8试剂盒(日本同仁化学公司)，检测细胞活性的变化。

结果表明，FB1可以显著降低细胞活性，然而，FumD蛋白处理后，FB1的细胞毒性虽然有缓解，但是，其降解产物仍然具有毒性(图1)。

这一现象说明，针对B族伏马菌素，还需要进一步地研究更好的解毒试剂和解毒方法。

实施例2、降解酶FUMDI编码基因克隆和真核表达载体的构建及转化

1、FumDI编码基因克隆

首先，本发明人分别优化fumd基因(SEQ ID NO:1)和fumi基因(SEQ ID NO:3)序列。经过反复研究、分析和实验，对它们的编码序列进行了分别优化，分别获得优化的fumd基因序列(SEQ ID NO:2)和fumi基因序列(SEQ ID NO:4)。

其次，本发明人分别以优化过的fumd和fumi为扩增模板，高保真酶

Max DNA Polymerase扩增目的基因片段(购自Takara公司，日本)。

fumd的扩增引物：

正向引物fumd-F：5’-gcgaattcatgcatcatcaccatcaccataaagaacaccaatgtaga-3’(SEQ ID NO:7)；

反向引物fumd-R：5’-gtctcgtaccattggccttagatggttgacatgctt-3’(SEQ ID NO:8)；

fumi的扩增引物：

正向引物为fumi-F：5’-aagcatgtcaaccatctaaggccaatggtacgagac-3’(SEQ IDNO:9)；

反向引物fumi-R：5’-gccctaggtcaagcaccagcaagttgcatc-3’(SEQ ID NO:10)。

50μl反应体系：2×PrimerSTAR Max Premix 25μl，10μmol/L引物各1μl，模板1μl，补ddH₂O至总体积50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；98℃10s，55℃5s，72℃1min，循环数32个，72℃延伸5min。以上述获得fumd和fumi为模板，fumd-F和fumi-R为引物，通过融合PCR获得fumdi片段，反应体系和PCR反应程序同上(图2A)。

对上述获得的fumdi测序后进行序列分析，fumd、fumi和fumdi的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5所示，fumdi编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:6所示。

2、表达载体的建立和转化

pPIC9K-fumdi构建：用EcoR I和Avr II(购自Takara公司，日本)对真核表达载体pPIC9K(购自Novagen公司，美国)和以及fumdi片段进行双酶切。50μl反应体系：10×Mbuffer 5μl，质粒DNA或基因片段5μg，QuickCut EcoR I 2μl，QuickCut Avr II 2μl，补ddH₂O至总体积50μl，37℃酶切1.5h。经琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并使用胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司，中国)回收所需的酶切片段。用T4 DNA连接酶(购自Takara公司，日本)连接回收的pPIC9K和基因片段，连接体系：10×T4 buffer 1μl，T4连接酶1μl，酶切基因片段3-5μl，酶切的pPIC9K质粒1μl，补充ddH₂O至总体积10μl，16℃过夜连接。构建后的真核表达载体如图3所示。测序表明pPIC9K-fumdi构建正确。

表达载体的单酶切：使用SacI(购自Takara公司，日本)对表达载体进行单酶切。50μl反应体系：表达载体DNA 5μg，10×M buffer 5μl，SacI 1μl，加入ddH₂O至50μl，37℃条件下，反应5-6h，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并使用乙酸钠浓缩DNA。

表达载体的转化：将浓缩后的真核表达质粒pPIC9K-fumdi通过电击转化法转化至毕赤酵母(GS115)感受态细胞，琼脂糖凝胶电泳结果表明转入序列大小正确(图4A)，测序检测结果表明序列正确，将该转化子用于FUMDI蛋白表达。

实施例3、本发明的FUMDI蛋白的表达

蛋白的诱导表达：挑取GS115/pPIC9K-fumdi单克隆至10ml YPED液体培养基中，于28℃，220rpm/min培养8-12h后，按1：20接种量接入到新鲜的BMGY液体培养中，于28℃，220rpm/min培养至菌浓度OD₆₀₀达到1.0-1.5后，全部接种到新鲜的BMMY液体培养基中(含1％的甲醇)，于28℃，220rpm/min诱导96h(每隔24h补充1％甲醇)，将培养体系经4℃4000rpm/min离心收获上清，即为粗酶液(图2B)。

收集到的粗酶液经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色，脱色液脱色后分析蛋白条带是否含有目的蛋白。

结果表明，FUMDI蛋白在毕赤酵母(GS115)中实现了可溶性表达，且具有高的表达效率(图4B)。

实施例4、本发明的FUMDI蛋白对FBs的降解作用

在1ml反应体系中加入900μl粗酶液，FBs 5μg/ml，加反应缓冲液(1mM Tris-HCl，pH＝8.0；100μg/ml BSA；3mM丙酮酸；20μM磷酸吡哆醛)至总体积1ml，在25℃pH＝7.2条件下，反应24h后，于95℃加热5min终止反应。利用液相色谱串联三重四级杆质谱LC-MS/MS检测溶液中的FBs。液相色谱系统为Thermo Scientific Accela 1250UPLC系统(ThermoFisher Scientific，USA)，色谱柱为：Agilent Zorbax Extend-C18柱(100mm×4.6mm，3.5μg/ml)。A相流动相为含有0.1％甲酸的水溶液，B相流动相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液，流速350μl/min。蒸发器温度300℃；毛细管温度300℃；护套气体压力10psi；辅助气体压力15psi。质谱分析采用选择反应监测模式(SRM)。

结果表明，本发明的FUMDI蛋白具有清除FB1两个致毒基团的能力，只有少量的中间产物HFB1的形成，FB1几乎被完全降解(图5)。

结果表明，FUMDI蛋白也具有清除FB2的降解效果(图6)。

结果表明，FUMDI蛋白也具有清除FB3的降解效果(图6)。

利用本发明的FUMDI蛋白进行伏马菌素降解反应过程如图7所示。伏马菌素的致毒基团是氨基和羧基，本发明的功能酶可高效率地同时脱去该两个致毒基团，从而使伏马菌素的毒性大大降低。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> B族伏马菌素降解酶、其构建方法及其应用

<130> 209068

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA

<213> 鞘氨醇呆生菌(Sphingopyxis macrogoltabida)

<400> 1

atgaaagagc accaatgccg tggcggccgg gcgtcccccg ctgcgcccgc cacgtggctt 60

gcgcggatca gcgtttcccg gggggcctcc gccatcgcct ggaccttcat gcttggcgca 120

actgccattc ccgtggctgc gcaaactgac gatccgaagc tcgttcgtca tacccagtcg 180

ggcgccgtcg agggcgtcga gggcgacgtc gagacttttt tgggaatacc cttcgcggct 240

ccgccggtcg gcgacctgcg atggcggccg ccggctccgc cgagggcgtg ggcgggcacc 300

agggacggcc gccgctttgc gcccgattgc atcgggaacg agcggcttag agaggggagc 360

cgggctgccg ggacgagcga agactgcctc tatctgaata tctggtctcc caaacaggtc 420

ggtaaggggg ggctccccgt catgatctgg gtttacggcg gtgggtttag cggcggttct 480

ggcgcggtgc catattatga cggctctgcg ctcgcgcaga agggcgtggt ggtcgtcacg 540

ttcaactatc gcgccgggat tctgggcttt cttgcccatc cggcgctttc aaaggaaagt 600

ccgaatggcg tgtcgggcaa ctatggtctt ctcgacatgc tcgcggcgtt caaatgggtt 660

cagaacaaca taagggagtt cggcggagac ccgaaccgtg tcacggtctt tggcgagtcc 720

gccggcgcga gcgcgctcgg actgctcctg acctcgccgc tcagtgagag cgccttcaat 780

caggcgatac tgcaaagtcc gggtctggcc aggccgctcg ccacgctttc tgaaagcgaa 840

gcgaatgggc tggagctggg agccgatatt tctgctctac ggcgtgccga tgcgggcgaa 900

ttgacgaaga tcgcgcaatc gcgaataccc atgtcgcgcc agttcaccaa gccgcggccg 960

atgggtccga ttctggacgg ctatgttttg cgcacccttg acgtcgatgc cttcgccaag 1020

ggggccttcc gcaagatacc cgttctggtc ggcggaaacg ccgacgaagg gcgcgctttt 1080

acggatcgcc tgccggtcaa aacggtcctt gaatatcgag cctatctcac agaacaattt 1140

ggtgacgagg cggacgcatg ggagcgttgt tatcccgcga actccgacgc cgacgtcccc 1200

gccgccgttg cccgtctttt tggggatagt cagttcaaca acgggatcga gctgctctcg 1260

gcagccttcg cgaaatggcg aacgccgctt tggagatatc gctttacggg cattccagga 1320

gccggccgtc gccccgccac gcatggagac gaaattccct atgtcttcgc aaatctgggg 1380

ccgtcgtccg tatctatgtt tgggtcgctc gaaggcggcg ccggggcgtc ggacatcaaa 1440

cttgcgaccg aaatgtccgc ggcctgggtg agcttcgcgg tgcacggggt ccccgatcag 1500

ggcacgaaat cgcactggcc gcgcttcgag cggcgagggg agatcatgac ttttggttcg 1560

caggttggct ctggggaagg tcttggagtt tcgccgagca aagcctgcca accctcaaaa 1620

tag 1623

<210> 2

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaagaac accaatgtag aggtggtaga gcttctcctg ctgcacctgc tacctggctg 60

gctagaattt ccgttagtag aggcgcttct gctatcgctt ggactttcat gctgggtgct 120

actgcaattc ccgtggccgc ccaaaccgat gatccaaagt tagtcaggca cactcaatct 180

ggtgctgtcg aaggtgtcga aggagatgtt gaaaccttcc ttggcatccc atttgcagcc 240

ccacctgttg gtgacctaag atggagacct cccgctcctc caagagcttg ggcaggtaca 300

agagacggaa gaagattcgc ccccgattgt attggaaacg aacgtttgag agaaggaagt 360

agagccgccg gtaccagtga ggactgtcta tatctaaata tctggagtcc taaacaggtc 420

ggaaaaggtg gccttcctgt gatgatctgg gtctacggcg gtggcttttc tggaggttct 480

ggagctgttc catactatga tggttctgct ctagctcaaa agggtgttgt cgttgttaca 540

ttcaattata gagctggcat tctgggcttt ctagcacacc ctgccttgtc aaaggaatcc 600

ccaaatggtg tgtccggcaa ctacggccta ctagatatgt tagctgcatt taagtgggtt 660

caaaacaata tccgtgagtt tggtggtgac ccaaacagag taaccgtctt tggtgagtcc 720

gccggtgctt ccgctttagg tttgttgttg acttccccct tgtctgaatc agcttttaat 780

caagctattc ttcaatctcc aggattggct aggccattgg ctaccttgtc agaatctgaa 840

gctaatggat tggaacttgg tgctgacatc tctgctctga ggagagccga tgcaggagaa 900

ttaactaaga ttgctcaatc aagaatcccc atgtctagac aatttacgaa gccaagacct 960

atgggtccaa tccttgacgg atacgttttg agaactcttg acgttgacgc atttgctaaa 1020

ggtgctttta gaaaaatacc agttcttgtt ggtggtaatg ccgatgaggg cagagctttc 1080

actgacagat tgccagtgaa gaccgtttta gaatatagag cctacctgac tgaacaattt 1140

ggtgatgaag cagacgcttg ggaaaggtgt tatccagcaa acagtgatgc agatgttcca 1200

gctgctgtag ctagactatt cggagattca cagtttaata acggaatcga gcttctttct 1260

gcagcatttg caaagtggag aactcctttg tggagatata gattcactgg tatcccagga 1320

gctggtagaa gaccagctac tcatggagac gaaattccat atgtttttgc aaatctggga 1380

ccttccagtg taagtatgtt tggctcactt gaaggaggag ccggagcttc cgacattaag 1440

ttagccacag agatgtccgc tgcatgggtc agttttgctg tccatggagt accagatcaa 1500

ggtactaagt ctcattggcc acgatttgaa cgaagaggcg aaattatgac tttcggttcc 1560

caagtcggtt ctggagaggg attaggagtt agtccctcta aagcatgtca accatctaag 1620

tag 1623

<210> 3

<211> 1269

<212> DNA

<213> 鞘氨醇呆生菌(Sphingopyxis macrogoltabida)

<400> 3

atggcgaacg gaacaaggca gaaagatctc agagaacgcg ccgaacgggt cattccgggc 60

gggatgtacg gccacgagtc gacacggttg ctgccgccag agttccccca gttcttcagg 120

cgcgcgctgg gggcacgaat ttgggacgcc gacgagcagc cctatatcga ctatatgtgc 180

gcgtatgggc caaatttgct cggttaccgg caatccgaaa tcgaagccgc ggctgatgcg 240

cagcgacttc tcggcgacac catgaccggt ccttcggaga tcatggtcaa cctcgccgaa 300

gcctttgtgg gcatggtccg tcatgcggat tgggcgatgt tctgcaaaaa tggcagcgat 360

gccacctcaa cggcgatggt tctcgcgcgt gcccatacgg ggcgcaaaac catattatgc 420

gccaaaggcg cctatcatgg cgcttccccg tggaacactc cgcatactgc cgggattctc 480

gcttccgatc gcgtgcatgt cgcatattat acctataacg acgcccaaag cttatcggac 540

gcgttcaagg cgcacgatgg cgatattgcg gctgtctttg ccacaccttt ccgacacgaa 600

gtatttgagg accaggccct cgcccagctt gagttcgcgc gcaccgctcg aaaatgttgt 660

gacgagaccg gtgcgcttct ggtcgttgac gatgtgcgcg caggtttccg ggtggcgcgc 720

gattgcagct ggacgcattt gggtatcgaa cccgatctca gttgctgggg aaaatgcttt 780

gcgaatggct atccgatctc cgccctgctg ggctcgaaca aggcgcgcga tgcggcgcgg 840

gatatatttg tgaccggctc cttctggttc tctgcggtac cgatggcggc ggcgatcgaa 900

accctcagga tcattcgaga gacgccttat ctcgaaacgc tgatcgccag cggcgccgcc 960

ctgcgggcag gcctggaggc acagtctcag cgccatggtc ttgagttgaa gcagacgggc 1020

ccggcgcaga tgccgcaaat attctttgcg gacgatcccg attttcggat cggctatgcg 1080

tgggccgcgg cgtgcctgaa gggcggcgtc tatgttcatc cctatcacaa tatgtttctc 1140

tctgcggccc atacagttga cgatgtaacg gagaccctcg aggcgacgga tcgcgcgttc 1200

agcgcggtcc tcagagattt tgcgtctctc cagcctcatc ccattttaat gcaactcgcc 1260

ggtgcttga 1269

<210> 4

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggccaatg gtacgagaca aaaagacctt agagagcgtg ccgaacgagt tatcccagga 60

ggaatgtatg gtcacgagtc aactcgtctg ttgccaccag agtttcccca gttttttagg 120

agagctcttg gcgccagaat ttgggatgct gacgaacagc cttatataga ttatatgtgt 180

gcttatggac caaacctgct aggatacaga caatctgaaa ttgaagctgc cgccgacgct 240

cagagattac tgggagacac catgaccgga ccctctgaaa tcatggttaa tcttgctgag 300

gcttttgttg gaatggtccg tcatgccgat tgggctatgt tttgcaaaaa tggatctgat 360

gctacatcta cagcaatggt tcttgcaaga gctcatacag gtagaaaaac cattttatgc 420

gcaaagggcg cttatcatgg agcctcccct tggaacaccc cacataccgc tggaatcctg 480

gcctctgaca gggttcacgt cgcttactac acctacaatg atgctcaatc cctttccgat 540

gcttttaagg cccatgatgg tgatatcgca gccgtctttg ccactccatt tagacatgag 600

gtttttgaag atcaggcctt ggcccaactt gagtttgcaa gaactgctag aaagtgttgc 660

gacgagactg gtgcattgtt ggttgtcgac gatgttagag caggatttag ggtcgccaga 720

gattgctcat ggactcattt aggaatcgaa ccagacttgt cttgttgggg aaaatgtttc 780

gctaatggat accctatttc agctcttctt ggtagtaata aagctcgaga cgctgccaga 840

gacatattcg taacaggaag tttttggttt tctgcagtgc caatggccgc tgctattgaa 900

acattaagaa taattagaga gactccttac ttggagacct tgattgcctc aggtgcagca 960

ttgcgtgctg gactggaggc tcaatctcaa aggcacggct tggagcttaa gcagacagga 1020

ccagctcaga tgcctcagat ctttttcgca gatgatccag atttcaggat cggatatgct 1080

tgggctgccg cctgtctgaa gggcggcgta tacgtacatc cataccacaa catgttctta 1140

tctgccgcac acaccgttga cgatgtcact gagactctgg aagccacaga tcgtgccttt 1200

tctgctgtac tgagggactt cgcctccctg caaccccacc caattttgat gcaacttgct 1260

ggtgcttga 1269

<210> 5

<211> 2886

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaagaac accaatgtag aggtggtaga gcttctcctg ctgcacctgc tacctggctg 60

gctagaattt ccgttagtag aggcgcttct gctatcgctt ggactttcat gctgggtgct 120

actgcaattc ccgtggccgc ccaaaccgat gatccaaagt tagtcaggca cactcaatct 180

ggtgctgtcg aaggtgtcga aggagatgtt gaaaccttcc ttggcatccc atttgcagcc 240

ccacctgttg gtgacctaag atggagacct cccgctcctc caagagcttg ggcaggtaca 300

agagacggaa gaagattcgc ccccgattgt attggaaacg aacgtttgag agaaggaagt 360

agagccgccg gtaccagtga ggactgtcta tatctaaata tctggagtcc taaacaggtc 420

ggaaaaggtg gccttcctgt gatgatctgg gtctacggcg gtggcttttc tggaggttct 480

ggagctgttc catactatga tggttctgct ctagctcaaa agggtgttgt cgttgttaca 540

ttcaattata gagctggcat tctgggcttt ctagcacacc ctgccttgtc aaaggaatcc 600

ccaaatggtg tgtccggcaa ctacggccta ctagatatgt tagctgcatt taagtgggtt 660

caaaacaata tccgtgagtt tggtggtgac ccaaacagag taaccgtctt tggtgagtcc 720

gccggtgctt ccgctttagg tttgttgttg acttccccct tgtctgaatc agcttttaat 780

caagctattc ttcaatctcc aggattggct aggccattgg ctaccttgtc agaatctgaa 840

gctaatggat tggaacttgg tgctgacatc tctgctctga ggagagccga tgcaggagaa 900

ttaactaaga ttgctcaatc aagaatcccc atgtctagac aatttacgaa gccaagacct 960

atgggtccaa tccttgacgg atacgttttg agaactcttg acgttgacgc atttgctaaa 1020

ggtgctttta gaaaaatacc agttcttgtt ggtggtaatg ccgatgaggg cagagctttc 1080

actgacagat tgccagtgaa gaccgtttta gaatatagag cctacctgac tgaacaattt 1140

ggtgatgaag cagacgcttg ggaaaggtgt tatccagcaa acagtgatgc agatgttcca 1200

gctgctgtag ctagactatt cggagattca cagtttaata acggaatcga gcttctttct 1260

gcagcatttg caaagtggag aactcctttg tggagatata gattcactgg tatcccagga 1320

gctggtagaa gaccagctac tcatggagac gaaattccat atgtttttgc aaatctggga 1380

ccttccagtg taagtatgtt tggctcactt gaaggaggag ccggagcttc cgacattaag 1440

ttagccacag agatgtccgc tgcatgggtc agttttgctg tccatggagt accagatcaa 1500

ggtactaagt ctcattggcc acgatttgaa cgaagaggcg aaattatgac tttcggttcc 1560

caagtcggtt ctggagaggg attaggagtt agtccctcta aagcatgtca accatctaag 1620

gccaatggta cgagacaaaa agaccttaga gagcgtgccg aacgagttat cccaggagga 1680

atgtatggtc acgagtcaac tcgtctgttg ccaccagagt ttccccagtt ttttaggaga 1740

gctcttggcg ccagaatttg ggatgctgac gaacagcctt atatagatta tatgtgtgct 1800

tatggaccaa acctgctagg atacagacaa tctgaaattg aagctgccgc cgacgctcag 1860

agattactgg gagacaccat gaccggaccc tctgaaatca tggttaatct tgctgaggct 1920

tttgttggaa tggtccgtca tgccgattgg gctatgtttt gcaaaaatgg atctgatgct 1980

acatctacag caatggttct tgcaagagct catacaggta gaaaaaccat tttatgcgca 2040

aagggcgctt atcatggagc ctccccttgg aacaccccac ataccgctgg aatcctggcc 2100

tctgacaggg ttcacgtcgc ttactacacc tacaatgatg ctcaatccct ttccgatgct 2160

tttaaggccc atgatggtga tatcgcagcc gtctttgcca ctccatttag acatgaggtt 2220

tttgaagatc aggccttggc ccaacttgag tttgcaagaa ctgctagaaa gtgttgcgac 2280

gagactggtg cattgttggt tgtcgacgat gttagagcag gatttagggt cgccagagat 2340

tgctcatgga ctcatttagg aatcgaacca gacttgtctt gttggggaaa atgtttcgct 2400

aatggatacc ctatttcagc tcttcttggt agtaataaag ctcgagacgc tgccagagac 2460

atattcgtaa caggaagttt ttggttttct gcagtgccaa tggccgctgc tattgaaaca 2520

ttaagaataa ttagagagac tccttacttg gagaccttga ttgcctcagg tgcagcattg 2580

cgtgctggac tggaggctca atctcaaagg cacggcttgg agcttaagca gacaggacca 2640

gctcagatgc ctcagatctt tttcgcagat gatccagatt tcaggatcgg atatgcttgg 2700

gctgccgcct gtctgaaggg cggcgtatac gtacatccat accacaacat gttcttatct 2760

gccgcacaca ccgttgacga tgtcactgag actctggaag ccacagatcg tgccttttct 2820

gctgtactga gggacttcgc ctccctgcaa ccccacccaa ttttgatgca acttgctggt 2880

gcttga 2886

<210> 6

<211> 961

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Glu His Gln Cys Arg Gly Gly Arg Ala Ser Pro Ala Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Trp Leu Ala Arg Ile Ser Val Ser Arg Gly Ala Ser Ala Ile

20 25 30

Ala Trp Thr Phe Met Leu Gly Ala Thr Ala Ile Pro Val Ala Ala Gln

35 40 45

Thr Asp Asp Pro Lys Leu Val Arg His Thr Gln Ser Gly Ala Val Glu

50 55 60

Gly Val Glu Gly Asp Val Glu Thr Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Ala

65 70 75 80

Pro Pro Val Gly Asp Leu Arg Trp Arg Pro Pro Ala Pro Pro Arg Ala

85 90 95

Trp Ala Gly Thr Arg Asp Gly Arg Arg Phe Ala Pro Asp Cys Ile Gly

100 105 110

Asn Glu Arg Leu Arg Glu Gly Ser Arg Ala Ala Gly Thr Ser Glu Asp

115 120 125

Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Ser Pro Lys Gln Val Gly Lys Gly Gly

130 135 140

Leu Pro Val Met Ile Trp Val Tyr Gly Gly Gly Phe Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ala Val Pro Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Leu Ala Gln Lys Gly Val

165 170 175

Val Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Ala Gly Ile Leu Gly Phe Leu Ala

180 185 190

His Pro Ala Leu Ser Lys Glu Ser Pro Asn Gly Val Ser Gly Asn Tyr

195 200 205

Gly Leu Leu Asp Met Leu Ala Ala Phe Lys Trp Val Gln Asn Asn Ile

210 215 220

Arg Glu Phe Gly Gly Asp Pro Asn Arg Val Thr Val Phe Gly Glu Ser

225 230 235 240

Ala Gly Ala Ser Ala Leu Gly Leu Leu Leu Thr Ser Pro Leu Ser Glu

245 250 255

Ser Ala Phe Asn Gln Ala Ile Leu Gln Ser Pro Gly Leu Ala Arg Pro

260 265 270

Leu Ala Thr Leu Ser Glu Ser Glu Ala Asn Gly Leu Glu Leu Gly Ala

275 280 285

Asp Ile Ser Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Leu Thr Lys Ile

290 295 300

Ala Gln Ser Arg Ile Pro Met Ser Arg Gln Phe Thr Lys Pro Arg Pro

305 310 315 320

Met Gly Pro Ile Leu Asp Gly Tyr Val Leu Arg Thr Leu Asp Val Asp

325 330 335

Ala Phe Ala Lys Gly Ala Phe Arg Lys Ile Pro Val Leu Val Gly Gly

340 345 350

Asn Ala Asp Glu Gly Arg Ala Phe Thr Asp Arg Leu Pro Val Lys Thr

355 360 365

Val Leu Glu Tyr Arg Ala Tyr Leu Thr Glu Gln Phe Gly Asp Glu Ala

370 375 380

Asp Ala Trp Glu Arg Cys Tyr Pro Ala Asn Ser Asp Ala Asp Val Pro

385 390 395 400

Ala Ala Val Ala Arg Leu Phe Gly Asp Ser Gln Phe Asn Asn Gly Ile

405 410 415

Glu Leu Leu Ser Ala Ala Phe Ala Lys Trp Arg Thr Pro Leu Trp Arg

420 425 430

Tyr Arg Phe Thr Gly Ile Pro Gly Ala Gly Arg Arg Pro Ala Thr His

435 440 445

Gly Asp Glu Ile Pro Tyr Val Phe Ala Asn Leu Gly Pro Ser Ser Val

450 455 460

Ser Met Phe Gly Ser Leu Glu Gly Gly Ala Gly Ala Ser Asp Ile Lys

465 470 475 480

Leu Ala Thr Glu Met Ser Ala Ala Trp Val Ser Phe Ala Val His Gly

485 490 495

Val Pro Asp Gln Gly Thr Lys Ser His Trp Pro Arg Phe Glu Arg Arg

500 505 510

Gly Glu Ile Met Thr Phe Gly Ser Gln Val Gly Ser Gly Glu Gly Leu

515 520 525

Gly Val Ser Pro Ser Lys Ala Cys Gln Pro Ser Lys Ala Asn Gly Thr

530 535 540

Arg Gln Lys Asp Leu Arg Glu Arg Ala Glu Arg Val Ile Pro Gly Gly

545 550 555 560

Met Tyr Gly His Glu Ser Thr Arg Leu Leu Pro Pro Glu Phe Pro Gln

565 570 575

Phe Phe Arg Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile Trp Asp Ala Asp Glu Gln

580 585 590

Pro Tyr Ile Asp Tyr Met Cys Ala Tyr Gly Pro Asn Leu Leu Gly Tyr

595 600 605

Arg Gln Ser Glu Ile Glu Ala Ala Ala Asp Ala Gln Arg Leu Leu Gly

610 615 620

Asp Thr Met Thr Gly Pro Ser Glu Ile Met Val Asn Leu Ala Glu Ala

625 630 635 640

Phe Val Gly Met Val Arg His Ala Asp Trp Ala Met Phe Cys Lys Asn

645 650 655

Gly Ser Asp Ala Thr Ser Thr Ala Met Val Leu Ala Arg Ala His Thr

660 665 670

Gly Arg Lys Thr Ile Leu Cys Ala Lys Gly Ala Tyr His Gly Ala Ser

675 680 685

Pro Trp Asn Thr Pro His Thr Ala Gly Ile Leu Ala Ser Asp Arg Val

690 695 700

His Val Ala Tyr Tyr Thr Tyr Asn Asp Ala Gln Ser Leu Ser Asp Ala

705 710 715 720

Phe Lys Ala His Asp Gly Asp Ile Ala Ala Val Phe Ala Thr Pro Phe

725 730 735

Arg His Glu Val Phe Glu Asp Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Phe Ala

740 745 750

Arg Thr Ala Arg Lys Cys Cys Asp Glu Thr Gly Ala Leu Leu Val Val

755 760 765

Asp Asp Val Arg Ala Gly Phe Arg Val Ala Arg Asp Cys Ser Trp Thr

770 775 780

His Leu Gly Ile Glu Pro Asp Leu Ser Cys Trp Gly Lys Cys Phe Ala

785 790 795 800

Asn Gly Tyr Pro Ile Ser Ala Leu Leu Gly Ser Asn Lys Ala Arg Asp

805 810 815

Ala Ala Arg Asp Ile Phe Val Thr Gly Ser Phe Trp Phe Ser Ala Val

820 825 830

Pro Met Ala Ala Ala Ile Glu Thr Leu Arg Ile Ile Arg Glu Thr Pro

835 840 845

Tyr Leu Glu Thr Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ala Leu Arg Ala Gly Leu

850 855 860

Glu Ala Gln Ser Gln Arg His Gly Leu Glu Leu Lys Gln Thr Gly Pro

865 870 875 880

Ala Gln Met Pro Gln Ile Phe Phe Ala Asp Asp Pro Asp Phe Arg Ile

885 890 895

Gly Tyr Ala Trp Ala Ala Ala Cys Leu Lys Gly Gly Val Tyr Val His

900 905 910

Pro Tyr His Asn Met Phe Leu Ser Ala Ala His Thr Val Asp Asp Val

915 920 925

Thr Glu Thr Leu Glu Ala Thr Asp Arg Ala Phe Ser Ala Val Leu Arg

930 935 940

Asp Phe Ala Ser Leu Gln Pro His Pro Ile Leu Met Gln Leu Ala Gly

945 950 955 960

Ala

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gcgaattcat gcatcatcac catcaccata aagaacacca atgtaga 47

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gtctcgtacc attggcctta gatggttgac atgctt 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

aagcatgtca accatctaag gccaatggta cgagac 36

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gccctaggtc aagcaccagc aagttgcatc 30

Claims (15)

1.一种降解B族伏马菌素的方法，所述方法包括：以B族伏马菌素降解酶或含有该降解酶的组合物处理B族伏马菌素化合物，或处理含有B族伏马菌素化合物的对象，所述B族伏马菌素为伏马菌素FB1、FB2、FB3和隐蔽型伏马菌素HFB1；其中，所述B族伏马菌素的降解酶为SEQ ID NO: 6所示序列的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的降解产物为2-keto-伏马菌素，其降解效率高于90%。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的降解效率高于95%。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行降解时，反应体系的pH值范围为7.2±1，温度为25±10℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述B族伏马菌素的降解酶从氨基端到羧基端依次包含：羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的B族伏马菌素的降解酶由核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示的核酸分子编码。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的核酸分子包含在载体中。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包含所述核酸分子的载体被包含在毕赤酵母细胞中，表达所述的B族伏马菌素的降解酶。

9. B族伏马菌素的降解酶的用途，用于降解B族伏马菌素化合物，所述的B族伏马菌素化合物为伏马菌素FB1、FB2、FB3和隐蔽型伏马菌素HFB1，所述B族伏马菌素的降解酶为SEQID NO: 6所示序列的蛋白。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述B族伏马菌素的降解酶从氨基端到羧基端依次包含：羧酸酯酶蛋白片段，氨基转移酶蛋白片段。

11. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的B族伏马菌素的降解酶由核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示的核酸分子编码。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的核酸分子包含在载体中。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，包含所述核酸分子的载体被包含在毕赤酵母细胞中，表达所述的B族伏马菌素的降解酶。

14. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述B族伏马菌素的降解酶包含于降解B族伏马菌素的组合物中，所述的组合物含有：(i) 所述的B族伏马菌素的降解酶；和(ii) 生物学上可接受的载体。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的降解B族伏马菌素的组合物包含于试剂盒中。

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