CN113717131A - 一种紫杉醇的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种紫杉醇的分离纯化方法。本发明的紫杉醇的分离纯化方法，包括如下步骤：1)将紫杉醇粗品进行溶解、过滤，得到紫杉醇溶液；2)将步骤1)得到的紫杉醇溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析，采用纯水和有机溶剂作为流动相对紫杉醇溶液进行洗脱；3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的紫杉醇溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的紫杉醇。本发明的紫杉醇的分离纯化方法，仅需一步层析分离纯化紫杉醇，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量少节约，大大降低了成本。

Description

一种紫杉醇的分离纯化方法

技术领域

本发明属于药物纯化技术领域，涉及一种紫杉醇的分离纯化方法。

背景技术

紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一，其结构式如下：

近年来地球人口和癌发率呈爆发性增长，对紫杉醇的需求量亦明显增大。临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取，由于紫杉醇在植物体中的含量相当低(公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0.069％)，大约13.6kg的树皮才能提出1g的紫杉醇，治疗一个卵巢癌患者需要3-12棵百年以上的红豆杉树，也因此造成了对红豆杉的大量砍伐，致使这种珍贵树种已濒临灭绝。加之紫杉本身资源很贫乏，而且红豆杉属植物生长缓慢，这对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。

紫杉醇的化学合成尽管已完成，但由于需要的条件严格，产量低，经费高，不具有产业意义。现在紫杉醇的半合成方法已比较成熟，被认为是除人工种植外，扩大紫杉醇来源的有效途径。半合成法可以更大限度地利用植物资源，但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别，需要消耗大量红豆杉树木，仍然不能从根本上解决植物源匮乏的问题。显然从红豆杉植物组织中提取紫杉醇受到极大限制。

CN103819430A公开了一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法，属化合物纯化领域。该发明采用结晶析出法和正相柱层析法相结合的方法纯化紫杉醇。首先，将红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品溶解在极性较大的有机溶媒中，然后逐滴加入反向有机溶媒，得到纯度85.0％以上的紫杉醇。然后再采用柱层析法进一步分离纯化紫杉醇，固定相为200目～300目硅胶，流动相为二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的二元梯度混合溶剂。两种方法相结合，解决以往分离方法中不能有效分离紫杉醇与三尖杉宁碱的不足，同时又可以去除难以分离的未知物杂质，最终可得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。该方法重复性好、工艺合理、操作简单、绿色安全。但是该方法需要经过结晶析出和层析两步，工艺复杂。

CN1526708A公开了一种从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，该方法采用大孔吸附树脂如AB-8、D101、D201、AK-9作固定相，40-70％极性溶剂如乙醇、丙酮的水溶液为流动相，柱层析法分离纯化紫杉醇，流出液流速为0.6-1.5升/小时，每小时收集1份，至紫杉醇浓度低于0.2毫克/毫升时终止，按时间分段收集流出液；流出液中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A；流出液中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B。本法便于将9-20％的紫杉醇粗产品分离纯化为40-60％的紫杉醇中间产品；一次性收率高达80％；操作安全，不使用易燃、易爆或有毒溶剂；上样量大，大孔吸附树脂与样品的重量比高达10比0.9-1.5，是一般层析上样量的15倍；可除去粗产品中的水溶性杂质。但是该方法的收率有待进一步提高。

因此，寻找获取一种纯度高、收率高的紫杉醇的分离纯化方法新途径具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种紫杉醇的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足纯度>99.5％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种紫杉醇的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)将紫杉醇粗品进行溶解、过滤，得到紫杉醇溶液；

2)将步骤1)得到的紫杉醇溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析，采用纯水和有机溶剂作为流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，其中，所述流动相中有机溶剂的体积百分比为93-97％；

3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的紫杉醇溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的紫杉醇。

所述UniSil微球的型号是C18UniSil微球或C8UniSil微球或PSUniSil微球，优选为PSUniSil微球。PSUniSil微球为粒径为10μm、孔径

的高分子微球，该微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球，使其作为色谱填料时具有很好的针对性。本发明采用单分散的PSUniSil微球作为固定相，仅需一步层析即可使紫杉醇纯度高于99.5％，收率可达95％。

步骤1)中，所述紫杉醇粗品的纯度为95-98％，例如纯度为95％、96％、97％、98％等；所述紫杉醇溶液的浓度为40mg/mL。

步骤2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种，优选为甲醇。

步骤2)中，所述流动相中，所述纯水与所述有机溶剂的质量比为(3-7):(93-97)。

步骤2)中，以层析柱中所装填料的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为8-10个柱体积。其中，本发明中填料的体积为490mL，即一个柱体积为490mL。

步骤2)中，所述洗脱的具体过程为：采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，例如洗脱的时间为50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min、66min、67min、68min、69min或70min等；所述流动相的流速为50-70mL/min，例如为50mL/min、51mL/min、52mL/min、53mL/min、54mL/min、55mL/min、56mL/min、57mL/min、58mL/min、59mL/min、60mL/min、61mL/min、62mL/min、63mL/min、64mL/min、65mL/min、66mL/min、67mL/min、68mL/min、69mL/min或70mL/min等。

步骤2)上样前还包括对层析柱进行柱前处理的步骤。

所述柱前处理的具体过程为：采用甲醇对层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡。

步骤1)中，所述过滤采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，例如滤膜的孔径为0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm等。

作为本发明的优选方案，所述紫杉醇的分离纯化方法包括如下步骤：

1)将纯度为95-98％的紫杉醇粗品进行溶解，采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，得到浓度为40mg/mL的紫杉醇溶液；

2)采用高浓度有机相对装有PSUniSil微球的层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡，将步骤1)得到的紫杉醇溶液上样到经平衡处理的层析柱中进行层析，采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，所述流动相的流速为50-70mL/min；

3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的紫杉醇溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的紫杉醇。

本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的分离纯化方法得到的紫杉醇。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的紫杉醇的分离纯化方法，仅需一步层析分离纯化紫杉醇，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量少节约，采用有机溶剂和纯化水作为流动相，仅用8-10个柱体积就可完成紫杉醇的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短，大大降低了成本。具体的，仅需一步层析纯化即可满足纯度>99.5％的要求，纯化收率>95％。

附图说明

图1为本发明的实施例1使用的PSUniSil微球的扫描电镜照片；

图2为本发明的实施例1纯化前的紫杉醇的高效液相色谱分析；

图3为本发明的实施例1纯化后的紫杉醇的高效液相色谱分析。

具体实施方式

下面结合附图1-3，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。

实施例1

1)取紫杉醇纯度为97％的紫杉醇粗品，加入95％甲醇(其中95％为体积分数，余量5％为水)溶解；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到浓度为40mg/mL的紫杉醇溶液，收集滤液待用；

2)采用50×250mm的色谱柱，UniSil PS(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用纯甲醇除杂再生，后用甲醇体积百分比为95％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用甲醇体积百分比为95％的流动相进行洗脱60min，流速控制在60mL/min；

3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.91％，收率为97.6％。

图1为本发明的实施例1使用的PSUniSil微球的扫描电镜照片，可以看出PSUniSil微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球。图2是纯化前的紫杉醇高效液相色谱分析，可见有一定的杂质。图3是纯化后的紫杉醇高效液相色谱分析，可见杂质非常少，杂峰非常小。

实施例2

1)取紫杉醇纯度为97％的紫杉醇粗品，加入95％甲醇溶解；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到浓度为40mg/mL的紫杉醇溶液，收集滤液待用；

2)采用50×250mm的色谱柱，UniSil C18(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用纯甲醇有机相进行除杂，后用甲醇体积百分比为95％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用甲醇体积百分比为95％的流动相进行洗脱60min，流速控制在60mL/min；

3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.52％，收率为95.5％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别之处在于，未进行柱前处理，即未对层析柱进行除杂和平衡，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.76％，收率为96.8％。

实施例4

本实施例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相中的有机溶剂为乙醇，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.89％，收率为97.2％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相中的有机溶剂为丙酮，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.91％，收率为96.6％。

对比例1

本对比例与实施例1的区别之处在于，层析柱中的填充相为漂莱特1200M，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为99.06％，收率为94.6％。

对比例2

本对比例为常规的紫杉醇的纯化方法，直接采用常规的结晶法，成品中紫杉醇的纯度为98.4％。

对比例3

本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为不含纯水，全为有机溶剂甲醇，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为98.92％，收率为98.6％。

对比例4

本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为中有机溶剂的体积百分比为50％，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为98.01％，收率为95.1％。

对比例5

本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为有机溶剂的体积百分比为98％，其他的与实施例1的均相同。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中紫杉醇的纯度为98.54％，收率为97％。

本发明用于紫杉醇的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足紫杉醇纯度>99.5％的要求，纯化收率>95％而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种紫杉醇的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：

1)将紫杉醇粗品进行溶解、过滤，得到浓度为30-50mg/mL的紫杉醇溶液；

2)将步骤1)得到的紫杉醇溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析，采用纯水和有机溶剂作为流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，其中，所述流动相中有机溶剂的体积百分比为93-97％；

3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的紫杉醇溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的紫杉醇。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述UniSil微球的型号是C18UniSil微球或C8UniSil微球或PS，优选为PS。

3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种。

4.根据权利要求1-3之一所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述紫杉醇粗品的纯度为95-98％；

优选地，步骤2)中，以层析柱中所装填料的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为8-10个柱体积。

5.根据权利要求1-4之一所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述洗脱的具体过程为：采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，所述流动相的流速为50-70mL/min。

6.根据权利要求1-5之一所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)上样前还包括对层析柱进行柱前处理的步骤。

7.根据权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述柱前处理的具体过程为：采用甲醇对层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡。

8.根据权利要求1-7之一所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述过滤采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤。

9.根据权利要求1-8之一所述的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：

1)将纯度为95-98％的紫杉醇粗品用体积百分比为93-97％的甲醇进行溶解，采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，得到浓度为30-50mg/mL的紫杉醇溶液；

2)采用甲醇对装有PSUniSil微球的层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡，将步骤1)得到的紫杉醇溶液上样到经平衡处理的层析柱中进行层析，采用有机溶剂体积百分比为93-97％的流动相对紫杉醇溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，所述流动相的流速为50-70mL/min；以层析柱中所装填料的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为8-10个柱体积；

3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的紫杉醇溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的紫杉醇。

10.一种采用权利要求1-9任一项所述的分离纯化方法得到的紫杉醇。

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