CN109232481A - 高纯度紫杉醇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高纯度紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：1)建立稳定的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，接种红豆杉细胞，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养；3)收集红豆杉细胞，进行紫杉醇的粗提取；4)对粗提取物进行纯化；5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。本发明具有诱导成功率高、紫杉醇提取纯度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物的细胞培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种高纯度紫杉醇的制备方法。
背景技术
红豆杉是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的一类乔木和灌木，全世界共11种。红豆杉具有较广的分布范围，从欧亚大陆和北美的亚北极区到中美和东南亚的亚热带甚至热带地区均有分布。研究表明，红豆杉中的紫杉醇对治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多种癌症有特效，致使紫杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一。然而，现有技术中，紫杉醇来源与从红豆杉的树皮中获取，含量非常低，提取困难，提取纯度低，根本无法满足人们对对高纯度紫杉醇日益增长的需求。因此，提高紫杉醇的纯度具有重要意义。。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在红豆杉细胞悬浮培养阶段添加红豆杉内生真菌提取液能提高单位细胞中紫杉醇的含量。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种高纯度紫杉醇的制备方法，其能够提高单位细胞中紫杉醇的含量，防止红豆杉细胞在培养过程中发生变异。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7-8天继代一次，经2-3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃-26℃，人工光照条件下进行通气培养6-8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3-5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡2-3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
优选的是，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为2-4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料，控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织。
优选的是，所述培养条件为：温度23-25℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3-5小时，光照强度为1500-1800lux；红光LED灯照射1-2小时，光照强度为2200-2500Lux。
优选的是，所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8-1.2mg，苄氨基腺嘌呤0.5-0.7mg，赤霉素0.2-0.3mg和槲皮素0.6-0.8mg。
优选的是，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27-29℃，转速为80-100r/min的摇床中振挡培养4-6天，培养结束后超声波破碎5-8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，减压干燥所述萃取液，添加0.2-0.4倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液。
优选的是，往所述萃取液添加等体积的水，待溶液分层后去掉水层，进行重复萃取2-3遍。
优选的是，所述红豆杉内生真菌提取液添加量为悬浮培养的培养基质量的5-10％。
优选的是，所述忧遁草提取物的制备方法为：将忧遁草原料烘干粉碎过100-200目筛，获得筛下粉末，往筛下粉末中添加无水乙醇，在4-8℃的条件下保存24-28h，过滤，获得滤液，减压蒸馏所述滤液获得获得乙醇提物粗浸膏，往所述乙醇提物粗浸膏中添加去离子水溶解，然后添加正丁醇萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩得浸膏，再次添加去离子水溶解，获得忧遁草提取物。
本发明至少包括以下有益效果：添加红豆杉内生真菌提取液，为红豆杉的生长提供必要的活性物质，提高了红豆杉细胞的生长速度；通过设置发芽床，能使培养材料的代谢产物快速的被滤纸吸附进而扩散到液体培养基中，避免了培养材料出现生长抑制作用，大大延长了出现褐变的时间；通过使用蓝光和红光交替培养，能缩短诱导愈伤组织的培养时间和提高诱导成功率；通过添加忧遁草提取物能避免红豆杉细胞出现衰老和变异，并促进红豆杉细胞合成紫杉醇；通过添加茉莉酸甲酯能促使红豆杉细胞合成紫杉醇，提高单位细胞中紫杉醇的含量。本发明具有单位细胞紫杉醇含量高、细胞系稳定，不易衰老退化等特点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用曼地亚红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.1％。
实施例2
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料，控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.3％。
实施例3
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料进行培养，培养温度为23℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。本实施例制备的紫杉醇的纯度为98.9％。
实施例4
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料进行培养，培养温度为23℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8mg，苄氨基腺嘌呤0.5mg，赤霉素0.2mg和槲皮素0.6mg，获得所述诱导培养基；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.5％。
实施例5
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料进行培养，培养温度为23℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8mg，苄氨基腺嘌呤0.5mg，赤霉素0.2mg和槲皮素0.6mg，获得所述诱导培养基；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；其中，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27℃，转速为80r/min的摇床中振挡培养6天，培养结束后超声波破碎8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，减压干燥所述萃取液，添加0.2倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.3％。
实施例6
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料进行培养，培养温度为23℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8mg，苄氨基腺嘌呤0.5mg，赤霉素0.2mg和槲皮素0.6mg，获得所述诱导培养基；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，所述红豆杉内生真菌提取液添加量为悬浮培养的培养基质量的5％，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；其中，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27℃，转速为80r/min的摇床中振挡培养6天，培养结束后超声波破碎8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，往所述萃取液添加等体积的水，待溶液分层后去掉水层，进行重复萃取2遍，减压干燥所述萃取液，添加0.2倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.3％。
实施例7
一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10分钟后，置于75％酒精中处理10秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7天继代一次，经2个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；其中，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料进行培养，培养温度为23℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8mg，苄氨基腺嘌呤0.5mg，赤霉素0.2mg和槲皮素0.6mg，获得所述诱导培养基；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，所述红豆杉内生真菌提取液添加量为悬浮培养的培养基质量的5％，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为26℃，人工光照条件下进行通气培养8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；其中，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27℃，转速为80r/min的摇床中振挡培养6天，培养结束后超声波破碎8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，往所述萃取液添加等体积的水，待溶液分层后去掉水层，进行重复萃取2遍，减压干燥所述萃取液，添加0.2倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液；所述忧遁草提取物的制备方法为：将忧遁草原料烘干粉碎过100目筛，获得筛下粉末，往筛下粉末中添加无水乙醇，在4℃的条件下保存24h，过滤，获得滤液，减压蒸馏所述滤液获得获得乙醇提物粗浸膏，往所述乙醇提物粗浸膏中添加去离子水溶解，然后添加正丁醇萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩得浸膏，再次添加去离子水溶解，获得忧遁草提取物；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
本实施例制备的紫杉醇的纯度为99.1％。
比较例1
组1-1：悬浮培养的培养基中未添加红豆杉内生真菌提取液，对红豆杉细胞进行培养，检测红豆杉细胞的生长速度，结果如表1所示。
组1-2：悬浮培养的培养基中未添加红豆杉内生真菌提取液，对红豆杉细胞进行培养，检测红豆杉细胞的生长速度，结果如表1所示。
表1
| 细胞生长速度(g(dw)/g.d) | |
| 组1-1 | 0.53 |
| 组1-2 | 0.86 |
从表1结果可知，添加红豆杉内生真菌提取液能促进红豆杉细胞的生长速度。
比较例2
组2-1：培养液中不添加茉莉酸甲酯和忧遁草提取物，其他培养过程与实施例7完全相同，检测培养液中紫杉醇的含量和红豆杉细胞中紫杉醇的含量，结果如表2所示。
组2-2：培养液中不添加茉莉酸甲酯，其他培养过程与实施例7完全相同，检测培养液中紫杉醇的含量和红豆杉细胞中紫杉醇的含量，结果如表2所示。
组2-3：培养液中不添忧遁草提取物，其他培养过程与实施例7完全相同，检测培养液中紫杉醇的含量和红豆杉细胞中紫杉醇的含量，结果如表2所示。
表2
| 胞外紫杉醇含量(mg/L) | 胞内紫杉醇含量(％) | |
| 组2-1 | 18.3 | 0.031 |
| 组2-2 | 20.7 | 0.046 |
| 组2-3 | 19.4 | 0.041 |
| 实施例7 | 27.4 | 0.075 |
从表2结果可知，添加茉莉酸甲酯和忧遁草提取物都能在一定的程度上提高红豆杉细胞合成，而共同添加茉莉酸甲酯和忧遁草提取物对于提高红豆杉细胞的含量则更为显著。
比较例3
组3-1：在培养过程中使用白色的光源替代本申请的红色LED灯和蓝色LED灯进行光照和黑暗交替培养，光照培养3小时，黑暗培养3小时，光照强度为1500lux，统计愈伤组织的平均诱导时间和诱导率，结果如表3所示。
组3-2：在培养过程中交替给予红色LED灯和蓝色LED灯照射，蓝光LED灯照射3小时，光照强度为1500lux；红光LED灯照射2小时，光照强度为2500Lux控制培养条件，进行诱导培养，统计愈伤组织的平均诱导时间和诱导率，结果如表3所示。
组3-3：在培养过程中全程给予白光照射，统计愈伤组织的平均诱导时间和诱导率，结果如表3所示。
表3
| 诱导时间(d) | 诱导率(％) | |
| 组3-1 | 30 | 91 |
| 组3-2 | 19 | 100 |
| 组3-3 | 35 | 80 |
从表3结果可知，使用红色LED灯和蓝色LED灯交替培养，能缩短诱导时间和提高诱导成功率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (8)
1.一种高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7-8天继代一次，经2-3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；
2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃-26℃，人工光照条件下进行通气培养6-8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；
3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3-5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡2-3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；
4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；
5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。
2.根据权利要求1所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为2-4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料，控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织。
3.根据权利要求2所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，所述培养条件为：温度23-25℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3-5小时，光照强度为1500-1800lux；红光LED灯照射1-2小时，光照强度为2200-2500Lux。
4.根据权利要求2所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8-1.2mg，苄氨基腺嘌呤0.5-0.7mg，赤霉素0.2-0.3mg和槲皮素0.6-0.8mg。
5.根据权利要求1所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27-29℃，转速为80-100r/min的摇床中振挡培养4-6天，培养结束后超声波破碎5-8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，减压干燥所述萃取液，添加0.2-0.4倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液。
6.根据权利要求5所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，往所述萃取液添加等体积的水，待溶液分层后去掉水层，进行重复萃取2-3遍。
7.根据权利要求1所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，所述红豆杉内生真菌提取液添加量为悬浮培养的培养基质量的5-10％。
8.根据权利要求1所述的高纯度紫杉醇的制备方法，其特征在于，所述忧遁草提取物的制备方法为：将忧遁草原料烘干粉碎过100-200目筛，获得筛下粉末，往筛下粉末中添加无水乙醇，在4-8℃的条件下保存24-28h，过滤，获得滤液，减压蒸馏所述滤液获得获得乙醇提物粗浸膏，往所述乙醇提物粗浸膏中添加去离子水溶解，然后添加正丁醇萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩得浸膏，再次添加去离子水溶解，获得忧遁草提取物。
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