CN113713037A - 地奥心血康治疗非酒精性脂肪肝病的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了地奥心血康的新用途，具体的是在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝病的药剂。本发明发现地奥心血康能改善非酒精性脂肪肝病大鼠和非酒精性脂肪肝炎小鼠血脂异常，降低转氨酶和肝脂质沉积，减轻肝脏肿大，明显改善肝脏脂质变性和炎症。还可改善HepG2细胞脂质代谢紊乱，改善肝功能。对非酒精性脂肪肝病患者，能明显减轻脂肪肝病变程度，改善脂肪肝患者的肝功能。本发明为非酒精性脂肪肝病患者的临床治疗提供了一种新的、疗效突出的用药选择，具有良好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及地奥心血康在制备用于治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，病变主体在肝小叶，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂肪贮积为病理特征的临床病理综合征，包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌。随着肥胖、2型糖尿病和代谢综合征的流行，NAFLD已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝生物化学指标异常的首要原因，普通成人NAFLD患病率在6.3％～45％，严重危害人民生命健康。【中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 年更新版)[J].实用肝脏病杂志，2018；21(2)：177-186.】。
肝肿大是NAFLD常见的体征，50％～75％的NAFLD患者伴肝肿大。NAFLD是健康体检肝生物化学指标异常的主要病因，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)和谷氨酰转肽酶(GGT)增高者应筛查NAFLD。肝活检是目前本病诊断和确定其分型和分期最可靠的手段，可准确判断肝组织脂肪变、炎症和纤维化程度。影像学检查是目前诊断本病常用的检查方法，其中腹部超声已作为拟诊脂肪肝的首选方法。
血脂异常是脂肪肝发生的重要血清学基础，又是加速NAFLD病程进展以及发生心脑血管事件的重要危险因素。基于“胰岛素抵抗→脂质代谢异常→肝脏脂肪沉积→氧应激及脂质过氧化→NAFLD改变”这一共识，改善血脂异常已成为防治脂肪肝的重要举措【Nassir F，Rector RS，Hammoud GM，et al.Pathogenesis and Prevention of HepaticSteatosis[J].Gastroenterol Hepatol，2015，11(3)：167-175.】。除非患者有肝衰竭或肝硬化失代偿，他汀类药物可安全用于NAFLD和NASH患者降低血清LDL-C水平以防治心血管事件，目前无证据显示他汀类可以改善NASH和肝纤维化。吡格列酮虽然可以改善NASH患者血清生物化学指标和肝组织学病变，但该药在中国患者中长期应用的疗效和安全性尚待明确，建议仅用于合并2型糖尿病的NASH患者的治疗【中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)[J].实用肝脏病杂志，2018；21(2)：177-186.】。
目前在我国广泛应用的水飞蓟素、双环醇、多烯磷脂酰胆碱、甘草酸二铵、还原型谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、熊去氧胆酸等针对肝损伤的治疗安全性良好，部分在药物性肝损伤、胆汁淤积性肝病等患者中已取得相对确切的疗效，但这些药物对NASH和肝纤维化的治疗效果仍需进一步的临床试验证实。至今尚无有效药物可推荐用于NASH患者预防肝硬化和肝细胞癌。
中西医结合治疗本病可以明显改善患者生活质量、提高临床疗效。目前推荐用于治疗NAFLD的中成药有逍遥散、护肝片、血脂康、绞股蓝总苷片、壳脂胶囊等，对临床上不同证型的脂肪肝及其证候具有一定的疗效【中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.非酒精性脂肪性肝病中西医结合诊疗共识意见(2017)[J].中国中西医结合消化杂志，2017；25(11)：805-811】。
地奥心血康为薯蓣科植物黄山药Dioscorea panthaica Prain et Burk或穿龙薯蓣 Dioscorea nipponica Makino的根茎提取物。《中华人民共和国药典》2015版(一部)公开了地奥心血康的质量标准。本品为浅黄色至棕黄色粉末，在甲醇或热乙醇中溶解，在水中略溶，在乙醚中不溶。本品按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35.0％。本品按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷(C51H82O21)计，不得少于15.0％。同时公开了以地奥心血康为主要成分的地奥心血康胶囊在预防和治疗冠心病、心绞痛以及瘀血内阻之胸痹、眩晕、气短、心悸、胸闷或痛中的用途【国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：820-821】。
中国发明专利ZL01118319.5公开了一种治疗冠心病的中药组合物及其制备方法；CN101108230B公开了地奥心血康缓释制剂及其制备方法和用途；ZL02128119.X公开了螺甾烷醇类甾体皂苷在制备用于治疗心血管疾病药物中的用途；ZL200610064577.4 公开了地奥心血康软胶囊及其制备方法和制药用途；CN101244066.B公开了甾体总皂苷提取物的新用药，具体的是在制备治疗心脏神经官能症的药物中的用途；中国发明专利201711270306.9公开了黄山药或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物在制备促进胆固醇逆转运药物中的用途。但迄今为止尚未发现地奥心血康用于治疗NAFLD的新用途。
发明内容
本发明人在研究地奥心血康防治大鼠动脉粥样硬化的作用【章维志，等.地奥心血康对动脉粥样硬化大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的调节作用[J].中国中药杂志， 2020，45(03)：602-608.】中意外地发现地奥心血康对大鼠NAFLD有非常好的疗效，进一步观察地奥心血康对高脂饲料诱导的大鼠NAFLD和小鼠NASH的防治作用，效果非常好，进而开展地奥心血康对动脉粥样硬化伴NAFLD患者的临床疗效评估，结果地奥心血康能明显减轻脂肪肝病变程度，改善脂肪肝患者的肝功能。
本发明提供了地奥心血康在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的用途。
如上所述的地奥心血康为薯蓣科植物黄山药Dioscorea panthaica Prain etBurk或穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎提取物。
本发明提供的地奥心血康可以直接是地奥心血康胶囊的原料药地奥心血康【载于中华人民共和国药典：2015年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：820-821】，也可以是通过文献(例如ZL200580033335.2，CN20041004771.X，CN101244066B，发明专利201711270306.9等)记载的方法从中药黄山药根茎或穿龙薯蓣的根茎提取。
如上所述的地奥心血康按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35.0％。
如上所述的地奥心血康按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷计，不得少于15.0％。
如上所述的地奥心血康的制备方法为：将中药穿龙薯蓣的干燥根茎粉碎，加入75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇，加水，冷藏后离心，上清液过HPD300大孔吸附树脂柱，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得地奥心血康。
如上所述的地奥心血康的制备方法为：将中药黄山药的干燥根茎粉碎，加入95％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇，加水，冷藏后离心，上清液过大孔吸附树脂柱 HPD100/LD140＝7∶3(W/W)，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得地奥心血康。
如上所述药物为口服制剂。
如上所述药物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、缓释剂、控释剂、速释剂、丸剂或滴丸剂。
本发明还提供了地奥心血康在制备预防和/或治疗肝脏肿大、预防和/或治疗肝脏脂肪变性、预防和/或治疗非酒精性单纯性脂肪肝、和/或预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途。
本发明还提供了一种预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药剂，由有效量的地奥心血康，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
如上所述的地奥心血康为薯蓣科植物黄山药Dioscorea panthaica PrainetBurk或穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎提取物。所述的地奥心血康按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35.0％。所述的地奥心血康按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷(C51H82O21)计，不得少于15.0％。
所述药剂用于预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病、预防和/或治疗肝脏肿大、预防和/或治疗肝脏脂肪变性、预防和/或治疗非酒精性单纯性脂肪肝、预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎。
本发明人经过试验研究，首次发现地奥心血康具有显著地治疗NAFLD的作用，能明显减轻脂肪肝病变程度，改善脂肪肝患者的肝功能，为NAFLD患者的临床治疗提供了一种新的、疗效突出的用药选择，具有良好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1地奥心血康对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏大体形态和肝脏组织病理学的影响(HE染色，400×，油红O染色，400×)
A：正常组肝脏；B：模型组肝脏；C：2mg/kg阿托伐他汀组肝脏；D：100mg/kg地奥心血康组肝脏；E： 30mg/kg地奥心血康组肝脏；F：10mg/kg地奥心血康组肝脏；
A1：正常组肝脏组织HE染色；B1：模型组肝脏组织HE染色；C1：2mg/kg阿托伐他汀组肝脏组织HE 染色；D1：100mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色；E1：30mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色； F1：10mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色；
A2：正常组肝脏组织油红O染色；B2：模型组肝脏组织油红O染色；C2：2mg/kg阿托伐他汀组肝脏组织油红O染色；D2：100mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色；E2：30mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色；F2：10mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色.
图2地奥心血康对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏大体形态和肝脏组织病理学的影响 (HE染色，400×，油红O染色，400×)
A：正常组肝脏；B：模型组肝脏；C：4mg/kg阿托伐他汀组肝脏；D：200mg/kg地奥心血康组肝脏；E： 60mg/kg地奥心血康组肝脏；F：20mg/kg地奥心血康组肝脏；
A1：正常组肝脏组织HE染色；B1：模型组肝脏组织HE染色；C1：4mg/kg阿托伐他汀组肝脏组织HE 染色；D1：200mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色；E1：60mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色； F1：20mg/kg地奥心血康组肝脏组织HE染色；
A2：正常组肝脏组织油红O染色；B2：模型组肝脏组织油红O染色；C2：4mg/kg阿托伐他汀组肝脏组织油红O染色；D2：200mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色；E2：60mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色；F2：20mg/kg地奥心血康组肝脏组织油红O染色.
图3地奥心血康对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝组织超微结构的影响(透射电镜，1μm) A：正常组；B：模型组；C：4mg/kg阿托伐他汀组；D：200mg/kg地奥心血康组；E：60mg/kg地奥心血康组；F：20mg/kg地奥心血康组。
图4地奥心血康对油酸-棕榈酸共刺激HepG2细胞脂质蓄积的影响(油红O染色，×200) A：正常组；B：模型组；C：0.5μg/mL阿托伐他汀组；D：10μg/mL地奥心血康组；E：3μg/mL地奥心血康组；F：1μg/mL地奥心血康组.
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述发明内容做进一步详细说明，但不应理解为本发明的发明内容仅限于以下实施例，凡是基于本发明上述内容所做出的发明均属于本发明的范围。
具体实施例
实施例1 地奥心血康的制备及含量测定
称取中药穿龙薯蓣的干燥根茎10kg，粉碎，加入8倍体积量的75％乙醇回流提取3次，第一次3小时，第二、三次各2小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，加水至2g生药/mL，冷藏24小时，离心，上清液过HPD300大孔吸附树脂柱，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩至浸膏，真空干燥，即得地奥心血康。
甾体总皂苷含量测定：取本品约0.3g，精密称定，置150mL圆底烧瓶中，加硫酸40％乙醇溶液(取硫酸60mL，缓缓注入适量的40％乙醇溶液中，放冷，加40％乙醇至1000mL，摇匀)50mL，置沸水浴中回流5小时，放冷，加水100mL，摇匀，用105℃干燥至恒重的4号垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀用水洗涤至滤液不显酸性，在105℃干燥至恒重，计算，即得。本品按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计40.3％。
伪原薯蓣皂苷含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(30∶70)为流动相；检测波长为210nm。理论板数按伪原薯蓣皂苷峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备：取伪原薯蓣皂苷对照品适量，加75％乙醇制成每1mL含0.3mg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品约0.2g，精密称定，置100mL量瓶中，加75％乙醇70mL，超声处理(功率250W，频率59kHz)10分钟，放冷，加75％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷(C51H82O21)16.8％。
实施例2 地奥心血康的制备及含量测定
称取中药黄山药的干燥根茎10kg，粉碎，加入10倍体积量的95％乙醇回流提取3次，第一次3小时，第二、三次各2小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，和水至2g生药/mL，冷藏24小时，离心，上清液过大孔吸附树脂柱HPD100/LD140＝7∶3(W/W)，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩至浸膏，真空干燥，即得地奥心血康。
按照实施例1方法测定甾体总皂苷含量，本品按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计46.2％。按照实施例1方法测定伪原薯蓣皂苷量，本品按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷(C51H82O21)18.4％。
实施例3 地奥心血康100mg制剂
(1)片剂：取地奥心血康100g、微晶纤维素40g、淀粉40g，混合均匀，加乙醇适量制成颗粒，加入硬脂酸镁2g或微粉硅胶2g，混合均匀，压制成1000片，包薄膜衣，即得。本品每片含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35mg，每片含伪薯蓣皂苷元 (C51H82O21)不得少于15.0mg。
(2)胶囊剂：取地奥心血康100g、微晶纤维素40g、淀粉40g，混合均匀，加乙醇适量制成颗粒，加入硬脂酸镁2g或微粉硅胶2g，装入胶囊，制成1000粒，即得。本品每粒含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35mg，每粒含伪薯蓣皂苷元(C51H82O21) 不得少于15.0mg。
(3)颗粒剂：取地奥心血康50g、糊精300g、蔗糖粉640g，混合均匀，加乙醇适量制成颗粒，制成1000g，包装，每袋装2g，即得。本品每袋含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35mg，每袋含伪薯蓣皂苷元(C51H82O21)不得少于15.0mg。
(4)软胶囊剂：取地奥心血康100g、大豆色拉油280g、蜂蜡3g，将大豆色拉油加热至85℃左右，加入蜂蜡使熔化，搅拌使混合均匀；待温度降至25～35℃时，将微粉化的地奥心血康加至混合溶液中，搅拌均匀使降至室温，过胶体磨，放置使脱气，旋转模压法压制成1000粒，即得。本品每粒含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于 35mg，每粒含伪薯蓣皂苷元(C51H82O21)不得少于15.0mg。
实施例4 地奥心血康对大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的治疗作用
采用实施例3制备的地奥心血康胶囊作为实验药物进行实验。
高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型在发病机制上与人类NAFLD饮食习惯相似，能够模拟人类NAFLD的特征，是最经典且常用的造模方法。血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是判断血脂异常与否的指标。血脂异常是NAFLD进展的重要危险因素，也是监测NAFLD造模因素的指标。NAFLD患者常伴有肝脏肿大，转氨酶升高，肝细胞脂肪变性和脂肪贮积，故本实施例除了测定大鼠血脂水平外，同时还检测血清转氨酶、肝指数、肝组织游离脂肪酸(FFA)、TC、TG含量及肝脏组织病理学变化。
52只雄性SD大鼠，8周龄，体质量180g±20g，适应性饲养1周后随机分为正常组(n＝8)和高脂饲料组(n＝44)。高脂饲料配方为81.8％基础饲料+10％蛋黄粉+6％猪油 +2％胆固醇+0.2％胆盐【霍琴琴.利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠模型疗效评价和作用机制研究[D].安徽医科大学，2017】。8周后从高脂饲料组随机抽取4只大鼠，分离肝脏，制成石蜡切片，HE染色，镜下观察肝脏组织病理学，结果4只大鼠5个以上视野肝脏脂肪变面积均超过1/3，提示NAFLD大鼠模型复制成功。将成模的40只大鼠随机分为模型组、地奥心血康高剂量组(100mg/kg·d)、中剂量组(30mg/kg·d)、低剂量组(10mg/kg·d)及阿托伐他汀组(2mg/kg·d)，n＝8，以上5组继续给予高脂饲料喂养的同时灌胃给药，正常组和模型组给予等容量溶媒，每周称重1次以调整给药剂量，连续灌胃8周。
末次给药后，大鼠禁食12h，用1％戊巴比妥钠进行麻醉，按照文献方法【WardaniHA，et.al.Development of nonalcoholic fatty liver disease model by high-fatdiet in rats[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol.2019；30(6)：1-7.】行以下指标检测及病理学观察：(1)血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量；(2)血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)； (3)肝组织TC、TG、FFA含量；(4)肝脏指数【肝脏指数(％)＝(肝湿重/体质量)×100％】； (5)肝脏大体观察与肝组织病理变化。
采用SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料均采用
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
(1)地奥心血康对NAFLD大鼠血脂和肝脂质的影响
与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C和肝脏FFA、TC、TG水平显著升高，血清HDL-C水平显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，地奥心血康不同剂量组和阿托伐他汀组血清TC、TG、LDL-C和肝脏FFA、TC、TG水平降低，血清HDL-C水平升高(P＜0.05，P＜0.01)。表明地奥心血康可改善NAFLD大鼠脂质代谢紊乱，减轻肝脏脂肪变性。见表1、表2。
表1 地奥心血康对NAFLD大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表2 地奥心血康对NAFLD大鼠肝脏FFA、TC、TG的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(2)地奥心血康对NAFLD大鼠转氨酶的影响
与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平显著升高；与模型组比较，地奥心血康不同剂量组和阿托伐他汀组大鼠血清ALT、AST水平显著降低。表明地奥心血康可改善NAFLD大鼠肝功能。见表3。
(3)地奥心血康对NAFLD大鼠肝湿重、体质量及肝指数的影响
与正常组比较，模型组大鼠体质量明显降低，肝湿重增加，肝指数显著升高 (P＜0.01，P＜0.05)；地奥心血康和阿托伐他汀组大鼠体质量增加，肝指数降低(P＜0.01)，肝湿重有降低趋势，提示地奥心血康可改善肝脏肿大。见表4。
表3 地奥心血康对NAFLD大鼠血清ALT、AST的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
表4 地奥心血康对NAFLD大鼠肝湿重、体质量及肝指数的影响
注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
(4)地奥心血康对NAFLD大鼠肝脏大体形态与病理组织学变化的影响
对大鼠肝脏大体形态的影响：正常组大鼠肝脏形态大小正常，呈红褐色，被膜光滑，质软柔韧，边缘薄而锐利，切面无油腻感，表面颗粒细小；模型组大鼠肝脏肿胀明显，呈淡黄色或土黄色，被膜紧张，质地偏硬脆，边缘厚而圆钝，切面有明显油腻感，表面颗粒粗糙；各药物干预组大鼠肝脏在体积、色泽、被膜、质地、边缘及切面等方面较模型组均有不同程度的改善。见图1。
对大鼠肝脏组织病理学影响：模型组肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，肝细胞明显肿胀，细胞核被挤压变形，可见弥漫性大小不一的圆形脂肪空泡。各药物干预组大鼠肝组织在肝小叶结构、轮廓、肝细胞形态等方面较模型组均有所改善。见图1。根据文献对大鼠肝脏脂肪变性进行评分，0分：脂肪变性＜5％，1分：脂肪变性5％-33％， 2分：脂肪变性＞33％-66％，3分：脂肪变性＞66％。模型组脂肪变性评分明显高于正常组，地奥心血康高、中剂量组和阿托伐他汀组脂肪变性评分均显著降低，表明地奥心血康可显著改善大鼠非酒精性脂肪肝病变。见表5。
表5 地奥心血康对NAFLD大鼠肝组织脂肪变性程度分级及评分
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
对大鼠肝脏组织油红O染色的影响：光学显微镜下观察到正常组大鼠肝细胞未见红染，肝细胞索排列整齐。模型组大鼠肝细胞胞浆内脂滴被染成红色，大小不一，广泛分布在胞质中，提示大量肝细胞内存在脂质沉积。各药物干预组大鼠肝细胞脂质含量较模型组均有所改善。见图1。应用Image J图像分析软件测定染色面积和肝脏总面积，计算脂质蓄积面积与肝脏总面积比值。见表6
表6 NAFLD大鼠肝组织油红O染色定量分析
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
小结：采用高脂饲料饲喂8周，可以成功复制大鼠NAFLD模型，表现为脂质代谢紊乱、转氨酶升高、肝脏肿大、脂质沉积，肝脏出现明显的脂肪变性和气球样变。地奥心血康和阿托伐他汀可以显著改善上述病变。
实施例5 地奥心血康对小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗作用
C57BL/6J小鼠对肥胖饮食表现出高度敏感性，因此是实验性NASH中最常见的小鼠品系。胆固醇和胆酸可分别诱导小鼠肝脏炎症和胶原基因表达。
65只5周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体质量20g±2g，适应性饲养1周后随机分为正常组(n＝12)和高脂饲料组(n＝53)。高脂饲料配方为78.5％普通饲料+10％猪油 +1％胆固醇+5％蛋黄粉+5％全脂奶粉+0.5％胆酸钠【俞建顺，等.胡柚皮黄酮对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏NLRP3炎症小体的影响[J].中国药学杂志，2019，54(24)：2076- 2081】。16周后从正常组随机取2只小鼠，高脂饲料组随机取3只小鼠，分离肝脏，制成石蜡切片，HE染色，镜下观察肝脏组织病理学，结果与正常组2只小鼠肝脏切片比较，高脂饲料组3只小鼠肝脏出现5％以上的肝细胞脂肪变合并小叶内炎症和肝细胞气球样变，提示NASH小鼠模型复制成功。将成模的50只小鼠随机分为模型组、地奥心血康高剂量组(200mg/kg·d)、中剂量组(60mg/kg·d)、低剂量组(20mg/kg·d)及阿托伐他汀组(4mg/kg·d)，n＝10，以上5组继续给予高脂饲料喂养的同时灌胃给药，正常组和模型组给予等容量溶媒，每周称重1次以调整给药剂量，连续灌胃8周。
第24周末次给药后，小鼠禁食不禁水12h，摘眼球取血，分离血清备用；颈脱位法处死小鼠，摘取肝脏并称重，分别置于4％多聚甲醛浸泡保存和-80℃冻存备用，按照文献方法【Zhang X，et al.The role of AMPKα2 in the HFD-induced nonalcoholicsteatohepatitis[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.2020；1866(10)：165854.】行以下指标检测及病理学观察：(1)血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量；(2)血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)含量；(3)血清炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；(4)肝组织FFA、TC、TG含量；(5)肝脏指数【肝脏指数(％)＝(肝湿重/体质量)×100％】；(6)肝组织病理变化及NAS评分(评分标准见表7)和肝脏脂质蓄积；(7)透射电镜观察肝脏超微结构。【Kleiner DE，et al.Design and validation of a histologicalscoring system for nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology. 2005；41(6)：1313-1321.】。
表7 非酒精性脂肪性肝病活动度积分(NAS)
采用SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料均采用
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
(1)地奥心血康对NASH小鼠血脂和肝脂质的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C和肝脏FFA、TC、TG显著升高，血清HDL-C显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组和地奥心血康不同剂量组TC、TG、LDL-C和肝FFA、TC、TG降低，血清HDL-C升高(P＜0.05，P＜0.01)。表明地奥心血康可改善NASH小鼠血液和肝脏脂质代谢紊乱。见表8、表9。
表8 地奥心血康对NASH小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
表9 地奥心血康对NASH小鼠肝脂质的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(2)地奥心血康对NASH小鼠转氨酶的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清ALT、AST水平显著升高；与模型组比较，地奥心血康不同剂量组和阿托伐他汀组小鼠血清ALT、AST水平显著降低。表明地奥心血康可改善NASH小鼠肝功能。见表10。
(3)地奥心血康对NASH小鼠血清IL-1β、TNF-α的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平显著升高；与模型组比较，地奥心血康不同剂量组和阿托伐他汀组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平显著降低。表明地奥心血康可减轻NASH小鼠慢性炎症反应。见表10。
表10 地奥心血康对NASH小鼠血清ALT、AST和IL-1β、TNF-α水平的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(4)地奥心血康对NASH小鼠肝湿重、体质量及肝指数的影响
与正常组比较，模型组小鼠体质量明显降低，肝湿重增加，肝指数显著升高 (P＜0.01)；与模型组比较，地奥心血康高剂量组和阿托伐他汀组小鼠肝湿重降低，肝指数降低(P＜0.01)，提示地奥心血康可改善肝脏肿大。见表11。
表11 地奥心血康对NASH小鼠肝湿重、体质量及肝指数的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(5)地奥心血康对NASH小鼠肝脏大体形态与病理组织学变化的影响
对小鼠肝脏大体形态的影响：正常组小鼠肝脏表面颜色普遍鲜红，色泽鲜亮，质地柔软，边缘锐利，无油腻感；模型组小鼠肝脏明显肿大，颜色稍黄，质地较硬，边缘较圆钝，切面有油腻感，表面有明显的颗粒感；各药物干预组小鼠肝脏在体积、色泽、质地、边缘及切面等方面较模型组均有不同程度的改善。见图2。
对小鼠肝脏组织病理学影响：正常组小鼠肝细胞核蓝染，胞浆均匀红染，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞无明显肿胀及空泡变性，细胞核居于中央，肝细胞未见明显脂肪变性和坏死。模型组肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，肝细胞明显肿胀，细胞核被挤压变形，可见弥漫性大小不一的圆形脂肪空泡，伴炎症细胞浸润和气球样变性。各药物干预组小鼠肝组织在肝小叶结构、轮廓、肝细胞形态、炎性细胞浸润等方面较模型组均有所改善。见图2。光学显微镜下观察各组小鼠肝组织病理切片中肝细胞脂肪变、小叶内炎症及气球样变程度，每张切片于光镜下随机观察10 个高倍镜下视野，对小鼠肝脏病变进行评分。模型组NAS评分明显高于正常组，且评分大于5分，可判定为NASH，地奥心血康高中低剂量组和阿托伐他汀组NAS评分均显著降低(P＜0.01)，表明地奥心血康可显著改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎病变。见表12。
对小鼠肝脏组织油红O染色的影响：光学显微镜下观察到正常组小鼠肝细胞未见红染，肝细胞索排列整齐。模型组小鼠肝细胞胞浆内脂滴被染成红色，大小不一，广泛分布在胞质中，提示肝细胞内存在大量脂质沉积。各药物干预组小鼠肝细胞脂质含量较模型组均有所改善。见图2。应用ImageJ图像分析软件测定染色面积和肝脏总面积，计算脂质蓄积面积与肝脏总面积比值。见表13。
表12 地奥心血康对NASH小鼠肝组织NAS评分
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表13 NASH小鼠肝组织油红O染色定量分析
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
对小鼠肝组织超微结构的影响：透射电镜下观察到正常组小鼠肝细胞形态正常，膜界清晰，可见微绒毛，细胞质中可见数量较多且形态正常的线粒体、内质网、高尔基复合体、核糖体以及糖原颗粒、微小脂滴等内容物，细胞核形态规则且居中；模型组肝细胞胞浆中弥散数量众多且大小不一的脂质空泡，部分细胞中的线粒体轻度肿胀，内质网扩张；各药物干预组小鼠肝细胞内脂滴空泡均有不同程度的减少，多种细胞器及细胞内含物未出现异常现象。见图3。
小结：用高脂饲料饲喂16周，可以成功复制小鼠NASH模型，表现为脂质代谢紊乱、转氨酶升高、肝脏肿大、脂质沉积，肝脏出现明显的脂肪变性和炎症反应。地奥心血康和阿托伐他汀可以显著改善上述病变。
实施例6 地奥心血康对油酸-棕榈酸诱导HepG2细胞脂肪变模型的改善作用
取对数生长期HepG2细胞接种于6孔板，分别给予不同浓度地奥心血康(1、3、 10μg/mL)和阳性对照药阿托伐他汀(0.5μg/mL)，加入1mmol/L油酸∶棕榈酸(2∶1)共刺激 24h，正常组和模型组加入等量的培养基补齐，于37℃、5％CO2培养箱共培养24h，收集细胞沉淀。行以下指标检测：(1)油红O染色观察脂质蓄积情况；(2)细胞内TC、TG、ALT和AST水平。
结果：
(1)地奥心血康改善油酸-棕榈酸诱导HepG2细胞脂肪变性
油红O染色结果表明，油酸∶棕榈酸(2∶1)共刺激后，HepG2细胞内出现大量的红色脂滴聚集，环绕细胞膜一周呈圆形分布。地奥心血康不同浓度组和阿托伐他汀组可减轻细胞脂质蓄积(P＜0.05，P＜0.01)。见图4，表14。
表14 地奥心血康对油酸-棕榈酸共刺激HepG2细胞脂质蓄积OD值影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(2)地奥心血康对油酸-棕榈酸诱导HepG2细胞胞内脂质和转氨酶的影响
与正常组比较，模型组细胞胞内TC、TG、ALT和AST水平显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，地奥心血康高、中浓度组TC、TG、ALT和AST水平降低(P＜0.05，P＜0.01)。表明地奥心血康可改善HepG2细胞脂质代谢紊乱，改善肝功能。见表15。
表15 地奥心血康对油酸-棕榈酸共刺激HepG2细胞TG、TC、ALT和AST 水平的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
小结：油酸-棕榈酸诱导HepG2细胞24h，油红O染色结果表明成功复制体外 NAFLD模型，伴有细胞内脂质代谢紊乱、转氨酶升高。地奥心血康不同浓度组和阿托伐他汀组可显著改善脂质代谢水平，降低转氨酶，减轻肝损伤。
实施例7 地奥心血康对动脉粥样硬化伴NAFLD患者的疗效和安全性临床试验
入选标准：受试者满足如下所有标准，并无排除标准所规定的任一项者可被入选。
(1)年龄在40～75岁的患者；
(2)经X线、多普勒超声、CT血管造影、磁共振显像血管造影任一项诊断为动脉粥样硬化；
(3)超声检查明确有中度-重度脂肪肝；
(4)肝功能正常或者肝功能(ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL)检查任何一项不高于正常值上限的2倍；
(5)无饮酒史或饮酒但男性每周平均饮酒折合乙醇量＜140g，女性＜70g；
(6)自愿参加并签署知情同意书。
排除标准：排除符合以下任一项者。
(1)妊娠和哺乳期妇女；
(2)对药物中成分有过敏史者；
(3)有明确过敏体质者；
(4)服药依从性差者；
(5)已知患严重的内科疾病：脑卒中、心肌梗死、心力衰竭、心脑肾血运重建术后及其他大动脉支架置入术后、正在接受透析，或医师诊断为慢性肾病4-5期，或估算肾小球滤过率(eGFR)＜30mL/min/1.73m2、已知患有先天(如主动脉狭窄)或后天性器质性心脏病、胃大部切除并胃空肠吻合术后、既往存在医师诊断明确的肺源性心脏病和/ 或慢性阻塞性肺病者、恶性肿瘤等其它严重疾病患者、双侧颈动脉狭窄程度≥75％患者、既往诊断有各种类型的病毒性肝炎而且当前仍处于活动期、入组前肝功能检查异常(ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL中有一项高于正常值的2倍)；
(6)过量饮酒：男性每周平均饮酒折合乙醇量＞140g，女性＞70g；
(7)基因3型HCV感染、自身免疫性肝炎、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定肝病；
(8)药物(他莫昔芬、乙胺碘呋酮、丙戊酸钠、甲氨蝶呤、糖皮质激素等)、全胃肠外营养、炎症性肠病、乳糜泻、甲状腺功能减退症、库欣综合征、β-脂蛋白缺乏血症、脂质萎缩性糖尿病、Mauriac综合征等导致脂肪肝的特殊情况；
(9)根据研究者的判断，有可能影响对药物疗效或不良事件的观察和评价，不适合参加者；
(10)既往服用地奥心血康胶囊或多烯磷脂酰胆碱胶囊出现明显不能耐受的不良反应者；
(11)不愿参加，不愿或不能更改已有服药方案者。
将合格受试者随机分为3组，每组65例，在生活方式干预的基础上，A组给予地奥心血康胶囊(成都地奥制药集团有限公司)，每次2粒，每日3次，B组给予多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复，萨诺菲(北京)制药有限公司)，1粒/次，每日3次，C组给予安慰剂胶囊，每次1粒，每日3次。于第6个月末检查肝功能和肝脏超声，以肝功能(ALT、AST、 GGT、TBIL、DBIL)改善率【上述指标恢复正常，或者下降幅度＞25％且其他指标不升高或者升高幅度小于10％】及脂肪肝改善率【超声检查：脂肪肝恢复正常，或者由中度变为轻度，或者由重度变为轻度或中度】为评价指标。安全性指标包括：血、尿常规，心电图，肝肾功能，不良事件。
采用SPSS 23.0进行统计学分析，组间比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：经过生活方式干预，安慰剂组患者肝功能和脂肪肝均有一定程度改善，与安慰剂相比，地奥心血康胶囊和多烯磷脂酰胆碱胶囊组患者肝功能和脂肪肝改善率均明显提高，差异有显著性(P＜0.01)。而不良事件发生率三组之间未见显著性差异 (P＞0.05)。见表16。
表16 地奥心血康对动脉粥样硬化伴NAFLD患者的疗效和安全性临床试验
与C组比较，**P＜0.01。
Claims (10)
1.地奥心血康在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的地奥心血康为薯蓣科植物黄山药Dioscorea panthaica Prain et Burk或穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎提取物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的地奥心血康按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于35.0％。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的地奥心血康按干燥品计算，含伪原薯蓣皂苷计，不得少于15.0％。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的地奥心血康的制备方法为：将中药穿龙薯蓣的干燥根茎粉碎，加入75％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇，加水，冷藏后离心，上清液过HPD300大孔吸附树脂柱，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得地奥心血康。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的地奥心血康的制备方法为：将中药黄山药的干燥根茎粉碎，加入95％乙醇回流提取，滤过，回收乙醇，加水，冷藏后离心，上清液过大孔吸附树脂柱HPD100/LD140＝7∶3(W/W)，先用水洗，然后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得地奥心血康。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物为口服制剂。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、缓释剂、控释剂、速释剂、丸剂或滴丸剂。
9.地奥心血康在制备预防和/或治疗肝脏肿大、预防和/或治疗肝脏脂肪变性、预防和/或治疗非酒精性单纯性脂肪肝、预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途。
10.一种预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药剂，由有效量的地奥心血康，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
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