CN1136777A

CN1136777A - 得自胆汁的免疫调节组合物

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Publication number: CN1136777A
Application number: CN94194002A
Authority: CN
Inventors: R·兰格
Original assignee: Imutec
Current assignee: Ailin Mir Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1994-09-09
Publication date: 1996-11-27
Anticipated expiration: 2014-09-09
Also published as: AU7648994A; DE69432930T2; CN1132586C; EP0717631B1; FI961109A0; US6280774B1; NO960907L; CA2171281C; ATE244570T1; KR100260110B1; DE69432930D1; JP4708511B2; WO1995007089A1; JPH09502706A; ES2207639T3; NZ273258A; CA2171281A1; NO960907D0; HK1007922A1; EP0717631A1

Abstract

本发明涉及一种用作免疫调节剂的组合物，含有分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性：a.可从动物的胆汁中提取；b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；d.含有不可测水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF或TNF-γ；e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；和g.不是内毒素。本发明还涉及制备该组合物的方法及其作为免疫调节剂的应用。

Description

得自胆汁的免疫调节组合物

发明领域

本发明涉及免疫调节组合物，含所述组合物的药剂及所述组合物和药剂在治疗动物方面的应用。发明背景

有关癌症和感染性疾病，如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的预防和治疗的疗法正在不断地发展。其中的一些疗法试图治疗性地利用免疫系统。有一种方法就是以免疫系统的抗原特异性成分即抗体和T细胞为基础的。例如，相关研究的目标集中在开发抗外源物质或抗某些内源性化学信使(如白细胞介素)的疫苗以抑制抗体反应。第二种方法是基于对免疫系统非抗原特异性部分之多肽和蛋白质的分离、克隆、表达和生产。例如，所述的蛋白质为所述的治疗提供了可能性，所述的蛋白质如包括由白细胞产生的白细胞介素和能刺激淋巴细胞及消化外源抗体之清道夫细胞的干扰素的细胞因子。

如果抗肿瘤的早期免疫应答能被增加以使所述肿瘤的大小不致于达到致命的大小，那么对于肿瘤的治疗则可大大增强。已提出的增大抗肿瘤之免疫应答的策略包括对肿瘤相关性抗原有特异性的疫苗；利用抗肿瘤细胞表面上的抗原(如IL-2受体)的单克隆抗体；含有抗肿瘤抗体和超抗原之双特异性分子的应用。

最近，已经研究了被称为肿瘤坏死因子(TNF)的生理活性多肽的作用，尤其是研究了其能够诱导肿瘤坏死而对活体的正常组织不产生影响的特性。美国专利4,879,226已公开了TNF的氨基酸序列和编码TNF之DNA的碱基序列。

因为已经证明了TNF在诱导肿瘤坏死中的作用，所以任何能够在体内刺激TNF产生或其生物有效性的因子都具有用于治疗各种肿瘤疾病的潜力。此外，任何能在体外刺激人单核细胞和巨噬细胞产生TNF的因子都可用作提供治疗性施用TNF来源的工具以及用于分析和诊断目的。

胆汁由肝脏分泌并贮存于胆囊中。出于种种目的，人们对胆汁进行了研究，包括利用胆汁提取物增强易于由正常肝功能合成的药物之生物有效性(参见WO 90/12583)和抑制哺乳动物中白细胞增多的促进作用(参见Shinoda et al.，Chem.Pharm.Bull.，30，4429-4434(1982))。然而，胆汁从未被考虑用作治疗肿瘤或感染性疾病的有用组合物。令人感兴趣的是，根据英国专利337,797的建议，胆囊本身可作为抗肿瘤剂的来源，但这仅仅在胆汁被从胆囊中取出且该胆囊被彻底清洗之后。发明概述

已经发现，胆汁是提供能够在体外和体内刺激TNF产生并能有效地治疗各种癌症，尤其是胰腺癌之组合物的重要来源。

所用的胆汁组合物可经用水溶性或可混性溶剂抽提胆汁而得。如此所得的提取物经进一步处理以除去不必要或不希望的成分。

已经发现，经过在下文将进一步公开的抽提胆汁法所获得的产物具有TNF刺激活性，且据信具有抗癌活性，尤其是抗胰腺癌或其它种类的癌症。很显然，如此所得的完整组合物并非是得到上述活性所必需的。因此，有可能对所得的产物进行分离、分级分离或其它处理，并仍然保留所需的TNF刺激性和抗癌活性。而且可以设想，有可能通过合成方法得到具有相同或相似的TNF刺激性和抗癌活性的产物。因此，可以想象可以以产生所期望活性的各成分或其组合分析产物的各成分，并基于这些分析，得到合成的产物。

本发明的一方面是涉及一种用作免疫调节剂的组合物，包括分子量小于3000Da的成分且具有一种或多种下列特性：

a.可从动物的胆汁中提取；

b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；

c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；

d.含有不可测水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GN-CSF或TNF-γ；

e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；

f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；及

g.不是内毒素。

根据优选的实施方案，所说的组合物是自牛胆汁中提取，能够刺激肿瘤坏死因子的释放。

本发明的组合物可由下列步骤制备：(a)将得自动物(优选牛)的胆汁与一种水溶性或可与水混溶的溶剂(优选的是醇，而且优选的是等体积醇)混合，得到胆汁/醇溶液；(b)分离最好是醇溶性部分的所说溶液，通过除去大部分的醇(例如应用加热)而分离基本不含醇的溶液；(c)从该溶液中除去胆汁色素，得到无色液体；(d)可任意选择地处理所得的无色溶液以除去任何残留的醇；(e)除去有机脂物质如通过用醚抽提无色液体，并分离水相和(f)可任意选择地从水相中除去残余醚。

所述组合物可在经简单地包装入瓶和高压灭菌后使用，勿需进行进一步的处理。该组合物也可以浓缩形式使用。优选的浓缩形式是按如下所述制备的：在步骤(e)之前无色液体可被任意选择地浓缩至胆汁/醇溶液体积的约1/8，在步骤(f)之后，可以浓缩水相以使其体积为胆汁/醇溶液的1/10。

本发明还涉及含有本发明新组合物的药剂。

本发明进一步涉及治疗病人的方法，包括给所述病人施用有效量的本发明组合物。本发明还涉及本发明组合物在预防和治疗需要调节免疫应答的疾病及病理状态中的应用，尤其是在感染性疾病和肿瘤中的应用。

本发明的上述及其它方面在参考下文的详细描述及附图后即可成为显而易见的。此外，本文参考了各种文献，这些文献全文引入本文作为参考。附图的简要说明

本发明更详细的内容将借助下文在附图中得以图示说明的实施例进行描述，所述的附图中：

图1为本发明的一个浓缩组合物的HPLC图；

图2为本发明的一个浓缩组合物的HPLC图；

图3为本发明的一个浓缩组合物的HPLC图；

图4为本发明的一个组合物的HPLC图；

图5为本发明的一个组合物的HPLC图；

图6为本发明的一个组合物的HPLC图；

图7为本发明的一个组合物的HPLC图；

图8图示说明本发明的组合物对LPS诱导的PBMN释放TNF的影响；

图9是表明本发明组合物对LPS诱导的PBMN释放TNF之影响的条图；

图10表示本发明的一个组合物的C₁₈RP-HPLC图；

图11表示对本发明组合物的沉淀部分进行RP-HPLC分析；

图12表示对本发明组合物的可溶性部分进行RP-HPLC分析；

图13表示胰腺癌的病人用本发明的组合物治疗后自诊断起的存活情况；

图14表示胰腺癌的病人在用本发明的组合物治疗后自治疗时起的存活情况；

图15表示用本发明的组合物治疗后所有黑瘤病人的存活情况；

图16表示有两个或更多肿瘤部位的黑瘤病人在用本发明的组合物治疗后的存活情况；

图17表示有三个或更多肿瘤部位的黑瘤病人在用本发明的组合物治疗后的存活情况；

图18表示本发明的完整组合物的RP-HPLC图；

图19表示本发明组合物沉淀物的RP-HPLC图；

图20表示本发明组合物之上清液的RP-HPLC图；

图21为本发明组合物的SDS凝胶分析；

图22表示在亲水性HPLC上洗脱本发明组合物的条件和时间(a)以及本发明组合物之上清的洗脱图(b)；

图23表示在亲水性HPLC上洗脱本发明组合物的沉淀物；

图24表示本发明组合物在刺激外周血单核细胞功能中的剂量反应；

图25是恶性黑瘤在用本发明组合物治疗前(25a)和治疗后的照片。本发明的详细描述

如上所述，本发明涉及用作免疫调节剂的组合物，包括分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性：

a.可从动物的胆汁中提取；

b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；

c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；

e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；

f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；及

g.不是内毒素。

更确切地说，研究人员已经证实，至少有一些本发明的组合物可刺激正常的单核细胞以影响针对Chang肝癌细胞系的细胞毒性，后者通常用于检测单核细胞的毒性。也已经报道了癌症病人(宫颈和卵巢癌)的单核细胞和巨噬细胞在受到本发明组合物的刺激后，攻击和破坏其自身的特定肿瘤细胞。

本发明的组合物能够调节肿瘤坏死因子(TNF)的产生。得自牛胆汁的本发明优选组合物能够促进人外周血单核细胞中生理量TNF的释放。因为已知TNF可以启动炎症的级联反应和抗肿瘤的细胞活素作用，所以优选的组合物可以通过刺激人白细胞释放TNF(以及可能释放其它的细胞因子)来发挥其抗肿瘤作用。因此，本发明也可以增强淋巴细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

还发现本发明的组合物能够抑制小鼠杂交瘤细胞系^#6-1之细胞生长。组合物在小鼠杂交瘤细胞中的抑制作用提示其有抗增生活性。

本发明组合物对人外周血单核细胞(PBMN)之存活的影响也被检查，发现该组合物对人PBMN无细胞毒性。

如下文将进一步举证说明，本发明组合物除了其它特性外还具有下列特性：

1.负责TNF从PBMN中释放的一种或多种成分较早地从C₁₈RP-HPLC柱中洗脱出来。

2.释放TNF的成分被80％乙腈部分沉淀。

3.未被80％乙腈沉淀的物质仍保留一些释放的TNF活性。

4.80％乙腈的沉淀物及上清液部分的TNF释放活性都在同一较早时间从RP-HPLC中洗脱出。该结果表明，组合物中的活性TNF-释放成分属于相同的分子族，该分子族可能存在一些细微的分子差别因而引起溶解性的不同。

5.本发明组合物导致IL-1β的释放，并且负责IL-1β释放的成分也是从RP-HPLC中较早地洗脱出，这表明释放TNF的可能是相同的物质。

6.本发明组合物还引起释放小量的IL-2。

7.本发明组合物还引起粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的释放；80％乙腈的沉淀物部分比上清液部分更具活性。

8.TNF与GM-CSF释放的比例约为2∶1。

9.80％乙腈沉淀物部分所含的成分比上清液部分中的成分能引起释放约3倍以上的TNF和GM-CSF。

10.对用RP-HPLC分离的上述沉淀物部分和上清液部分分析表明，两者中TNF、IL-1β和GM-CSF的释放活性都是较早地被洗脱出。然而，上清液中的一些IL-1β活性洗脱出来的时间较迟。

11.有可能是由组合物中相同的分子(即成分)负责释放TNF、IL-1β和GM-CSF。该组合物的作用可能是同时刺激多种不同的细胞因子释放，或者也可以是所述组合物引发了一种细胞因子的产生和释放，该因子反过来又刺激其它细胞因子的产生和释放。

12.借助凝胶电泳和分子筛HPLC对组合物(包括其沉淀物及上清液)理化分析表明，主要成分分子量小于2500Da。

13.用亲水性(聚羟乙基)分子筛HPLC进行进一步的理化分离研究证实了组合物中的小分子量成分。

14.酸解前后的氨基酸分析表明存在肽键，这说明有肽存在。

15.对RP-HPLC中的活性级分之氨基酸成分分析显示有高水平的谷氨酸/谷氨酰胺和甘氨酸。此外，还检测到精氨酸、苏氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基。

16.存在一些未确定的茚三酮阳性残基，推测为游离氨基酸。

如上所述，本发明组合物可由下列步骤制备：(a)将动物(优选牛)胆汁与等体积的醇混合形成胆汁/醇溶液；(b)分离出醇溶性部分，并离析基本上不含醇的溶液；(c)从溶液中去除胆汁色素，得到无色液体；(d)处理无色液体以基本除去任何残留的醇；(e)用醚抽提无色液体并分离水相和(f)从水相除去残留醚。

本发明的组合物可从产生胆汁的任何动物的胆汁中获得，优选的是非人动物。然而由不同种属动物胆汁得到的组合物对某一特殊疾病可能有不同的活性，甚至可能相反，所以一般适宜的胆汁来源是得自牛、绵羊和猪。在大多数情况下，从被屠宰的健康食用动物如牛、绵羊和猪处获取胆汁用于制备本发明组合物是实际可行的。胆汁应直接来自屠宰动物的胆囊且应是基本清亮的，由此提示胆汁制备物粘液含量低并基本上无脓液或血液。

在本方法的一项优选实施方案中，应用了牛的胆汁。牛胆汁丰富，因为在某种程度上可从每只动物上获得相对较多的胆汁。而且，牛是按健康方面的有关法规进行常规屠宰和检验的，因而这样的动物为制备本发明组合物提供了可靠的来源。更进一步地说，人对牛来源的物质较少可能产生致敏反应。

将胆汁与等量的醇混合以制备胆汁/醇溶液，其中醇是50％的醇。醇可以是脂族醇，优选甲醇、乙醇或丙醇，最优选乙醇。

将基本上无50％醇不溶性物质的溶液通过离心分离出。优选地将胆汁/醇混合物以3000-5000rpm，最优选4200rpm，在约15-25℃离心至少2小时。然后通过利用醇与水不同挥发性去除胆汁/醇可溶组分中的醇，所用的挥发方法为常规方法，即将级分加热至适宜的温度如80-85℃，保持适宜的时间如可至约10小时。

用活性炭、聚酰胺微粒或过滤可以将胆汁色素从溶液中去除获得无色液体。优选用活性炭处理。重复此过程以使溶液满足光密度和传导性标准。

以常规方法处理无色液体以基本去除任何残留醇。优选用可滤除约1.0-3.5μm物质的滤器，最优选滤除约2.5μm物质的滤器过滤无色液体。

用醚提取无色液体并分离出水相。此步骤中所用醚优选二甲醚、乙醚、正-丙基醚、异丙基醚、或正-丁基醚，最优选乙醚。

用下列方法可从水相中去除残余醚，例如将溶液加热至55℃，优选至约40℃约5-15小时，最优选加热约10小时。

将组合物简单包入管形瓶中并消毒后不需进一步处理即可加以使用。组合物也可以浓缩的形式应用。优选的浓缩形式按下述方法制备。在前文描述的(e)步骤之前，可选择性地通过例如加热至低于约85℃，优选约60-70℃将无色液体浓缩至胆汁/醇溶液体积的约1/8。(f)步骤后，可以浓缩水相，方法是例如加热至约80-85℃使其体积为胆汁/乙醇溶液的1/10。

在制备本发明组合物的优选方法中，将收集的胆汁与等体积乙醇混合。然后将胆汁/醇混合物在约20±2℃以约4200rpm离心至少2

小时。倾出上清液并测其pH和乙醇含量。用活性炭去除胆汁色素。检测处理后的胆汁/乙醇溶液的光密度(O.D.)和传导性。如O.D.值或传导性超出可接受的范围，则需要对胆汁/乙醇溶液进行进一步处理以去除胆汁色素，例如再次用活性炭处理以使读数在限制范围内。

活性炭处理后，用可滤除2.5μm物质的滤器过滤溶液，通过加热至低于85℃的温度蒸发掉醇，溶液被浓缩至原胆汁/乙醇溶液体积的约1/8。冷却浓缩液至约20-25℃之间。然后将该溶液与乙醚混合，弃去醚相。优选地，用相对较少体积的醚，如0.1-1体积，优选0.2-0.5体积，并剧烈搅动。将水相加热至约55℃10小时除去残余醚，再通过加热至约80-85℃进一步将其体积减少至仅为原胆汁/乙醇溶液的1/10。然后检测溶液的外观、生物活性、乙醇及醚的含量。

用盐酸(1％)和氢氧化钠(1％溶液)将组合物pH调节到生理pH，即7.4-7.5，用常规方法配制以一代和二代磷酸钠盐作为缓冲剂的缓冲液。

将组合物简单包入管形瓶并消毒后不需进一步处理即可使用。优选的消毒方法是将组合物进行三次由高压灭菌和温育组成的消毒循环。

组合物可以浓缩形式应用。上文已描述了浓缩形式组合物的制备。组合物也可被冻干。

组合物和浓缩组合物为基本不含外来物质的清亮淡黄色溶液，它含有不多于10ppm的乙醇和不多于5ppm醚。在实施例4描述的生物测定中，已显示组合物引起约18单位/ml非增殖性生长。

用上文大致描述的方法可以以一致地可再现形式(已显示了各批的特性、效力和纯度)制得本发明组合物。用反相高效液相层析测定其特性和纯度(见实施例1)。本发明组合物在反相HPLC上具有一致地可再现性，其中峰在约27分钟和32分钟的早期排除的级分中可见。在高峰之前，之间和之后，有程度不同的较小峰。图1-3中显示了三份本发明浓缩组合物的HPLC读数。批号B0211(图4)、B0209(图5)、B29/3006(图6)和B15/1606(图7)的RP-HPLC图也显示重现程度非常高的图样。在实施例4中描述的生物测定中组合物也显示出约18单位/ml的非增殖性生长。通过上文提到的特性如其体外刺激单核细胞和巨噬细胞的能力等表征组合物。

本组合物中可能存在的化合物，考虑到其来源，包括磺化胆汁酸、氧化胆汁酸、其它天然产生的胆汁酸、以及其氨基酸(特别是甘氨酸、牛磺酸)连接物和甾醇。因此，据信本组合物包括至少一种具有下列通式的化合物

其中分子可以或可以不是饱和，如A与B、B与C或C与D间的键可以是单键或双键，且其中X为H、OH、＝O或OSO₃H；Y是

其中R是氨基酸残基，如甘氨酰基、谷氨酰基或牛磺酰基，因此构成了甘氨酸或牛磺酸连接物。

特别地是，已分析了本发明组合物的成分化合物，包括有机和无机成分。用分析化学的标准方法(包括质谱(MS))获得这些信息。研究的结果包括例如鉴定认为可能存在的特殊胆汁酸化合物，这些化合物包括胆酸、甘氨胆酸、脱氧甘氨胆酸、乌索脱氧胆酸、硫酸胆甾醇、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和牛磺胆酸。

如果某些化合物在MS中失去OH和H₂或开始时就存在这些化合物的脱氧、二脱氧和不饱和类似物，则MS就不能加以区分。这些化合物可以都以铵盐、烷基铵盐和无机阳离子盐的形式存在。

MS分析也支持对本发明组合物磷脂类、鞘脂类和能形成微团(miscellos)的相关物的鉴定结果。认为可存在的特殊化合物包括：

硬脂酸 CH₃(CH₂)₁₆COOH

棕榈酸 CH₃(CH₂)₁₄COOH

油酸Z-9十八烷酸：CH₃(CH₂)₂CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆COOH

氧化或羟基化/不饱和短链脂肪酸：C₆H₈O₃(如

CH₃CH＝CHCOCH₂COOH或含2个双键和一个氢氧化物的C₆酸)

乙酸

硬脂酸甘油二酯

棕榈酸甘油二酯

硬脂酸、棕榈酸甘油二酯

硬脂酸-单甘油酯-胆碱磷酸(溶血卵磷脂)

硬脂酸单甘油酯

硬脂酸三甘油酯

棕榈酸单甘油酯

胆碱磷酸

磷酸丝氨酸

磷酸鞘氨醇

硬脂酸-鞘氨醇

鞘氨醇

硬脂酰胺

硬脂酸甲酰胺(stearic acid methylamide)

棕榈酰胺

卵磷脂

唾液酸-甘油二聚物另外，已获得预HPLC和滴定证据，显示也含更短链的脂肪酸。

鉴于来源和由MS及HPLC分析所得的信息，可能存在的磷脂、鞘脂和相关的水解产物化合物包括至少一种具有下列通式的化合物

其中R¹、R²、R³可相同或不同，且为H、COR⁴、CH＝CH-R⁵、X、-P(O)(OH)O-或-S(O)₂O-；X选自胆碱、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、丝氨酸、肌醇、含游离羟基的糖、氨基糖、磺化糖和唾液酸；R⁴为饱和或不饱和，氧化或羟基化的C₁-C₃₀烷基；R³为烷基或其氧化和/或羟基化类似物。

脂肪酸及其连接物可以盐形式存在于前述的水性提取物中。这些化合物的溶解性也可以被混合物的其它成分增强。所包括的羧酸酰胺，RCONR¹R²也被认为存在，R¹和R²可以相同或不同且为H或烷基。

考虑到组合物来源和其前述的MS分析结果，第三类化合物即粘蛋白和蛋白多糖水解产物也可能存在。这些化合物包括胆汁和胆囊壁粘蛋白的水解产物，如：软骨素4-和6-硫酸盐、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、透明质酸及粘蛋白的水解产物(单体、二聚物、寡聚物和多聚物)。壳多糖及其它粘蛋白也可类似地水解，水解产物包括：

N-乙酰基-D-葡糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺-4-硫

酸盐、半乳糖-6-硫酸盐、N-乙酰基-D-葡糖胺-6-硫

酸盐、葡糖胺-6-硫酸盐、D-葡糖胺2-硫酸盐、D-葡糖

胺2，3-二硫酸盐、D-半乳糖-6-硫酸盐、葡糖醛酸2-

硫酸盐、N-乙酰神经氨酸、唾液酸、N-乙酰软骨生、软骨素

4-硫酸盐、软骨素6-硫酸盐、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、

葡糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、艾杜糖醛酸、己

糖、己糖胺、硫酸酯、葡糖醛酸、软骨糖胺、2-氨基-2-脱

氧-D-半乳糖、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、氨基丙酸、甘氨酸、

牛磺酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸和小肽。

通过水解粘蛋白可得到相似产物，如角蛋白硫酸盐、硫酸皮肤素、二聚体、寡聚体和多聚体中天然糖-糖连接可被糖单体或相邻糖链间的-O-Si(OH)₂-O-桥取代。

特别地是，认为存在的特殊粘蛋白和蛋白多糖水解产物化合物包括：

唾液酸及其单或二乙酰化和乙醇酰单体；

N-乙酰神经氨酸；

己糖胺；

L-岩藻糖；

己糖胺-己糖醛酸(二聚体)二硫酸盐；

葡糖醛酸或艾杜糖醛酸二硫酸盐，单乙酰基化的；

唾液酸-甘油(二聚体)；和乙酰化和硫酸化的上述单体的二聚

体、三聚体、寡聚体和多聚体。

考虑到来源和前述的MS分析，第四类化合物即脂溶性维生素包括例如维生素A、D和K(即D₁、D₃、D₄、K₁、K₂、K₅、K₆、K₇、K-S(II)、)和维生素E乙酸酯。

特别地是，认为存在的特殊脂溶性维生素化合物至少包括下述物质中的一种：维生素A₂、维生素D₁、光甾醇(来自其维生素D₁复合物)、维生素E、维生素K₁氧化物和维生素K₅。

考虑到来源和前述的MS分析，各种混杂的有机化合物可能存在。这些化合物包括：

胆红素，及其葡萄糖醛酸化物(gluconuride)轭合物；

胆绿素，及其葡萄糖醛酸化物轭合物；

痕量甾族化合物；

其它浆液溶解物，如糖、嘌呤和嘧啶；

混杂的饮食脂类；和

谷胱甘肽和其水解产物。

特别是，相信在组合物中存在的特殊的混杂有机化合物至少包括下列中的一种：尿素、甲胺、二甲胺、乙胺、甲基乙基胺、二乙胺、二丙胺、丁基乙基胺、氨、胆碱、牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、p-ser、p-eu、p-ea、asp-thr ser sar、a-aba、cit、val、ile、len、B-ala、G-aba、OH-lys、orn、lys丁基化羟甲苯(BHT)和聚乙二醇。

本发明组合物中存在的胺类，尤其是仲胺，可以包括空气中的氧化氮，从而形成亚硝基化合物。也可包括N-氧化物和N-氨基甲酸酯副产品。上述列举的一系列胺应扩展包括所有伯、仲和叔烷基胺。

已对某些无机元素进行了鉴别和定量(mg/l)如下：

钨 0.07

锌 0.666

磷 378

镉 0.01

钴 0.08

镍 0.022

钡 0.032

铁 0.022

锰 0.039

铬 0.060

镁 7.46

铝 0.136

钙 5.97

铜 0.087

钛 0.01

锶 0.060

钠 9600

钾 483

氯 15400

氨 218

钒 1ppm

本发明的组合物具有有价值的药理学特性。特别地，本发明的组合物具有抗增殖作用，作用于新生物的生长并作用于肿瘤坏死因子的释放。已表明所述组合物不引起显著的毒性，且只有短暂的不良副作用(例如，轻度发热、烦渴、注射部位疼痛)。也发现其含有不能被检出的高分子量物质成分(即大于约5,000Da)，该物质可以导致有害的免疫反应。所述组合物可以用作预防和治疗需调节免疫反应的疾病的物质，这些疾病特别是感染性疾病，肿瘤形成及自身免疫性疾病。在治疗不同类型的肿瘤形成(如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腺瘤、肉瘤和癌)中所述组合物特别有用。特别地，所述组合物可用于治疗恶性黑色素瘤、胰腺癌、宫颈癌和肾、胃、肺、直肠、乳腺、肠、胃、肝、甲状腺、颈部、子宫颈、唾液腺、腿、舌、唇、胆管、骨盆、纵膈、尿道、支气管原的、膀胱、食道和结肠等部位癌，以及卡波氏(Kaposi′s)肉瘤(一种与患获得性免疫缺陷症(AIDS)的HIV感染病人相关的癌症)。所述组合物也可用于其它抗增殖性疾病如关节硬化和病毒感染，特别是获得性免疫性缺陷综合症(AIDS)。所述组合物也可用于治疗自身免疫性疾病。包括多发硬化症、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、重症肌无力、Addison′s病、自身免疫性溶血性贫血、克隆氏病、Goodpasture′s综合症、Grave′s病、Hashimoto′s甲状腺炎、自发的血小板减少性紫瘢、恶性贫血、链球菌感染后肾小球肾炎、牛皮癣、硬皮病、Sjogren′s综合症、自发性不育症和寻常天疱疮。

本发明的组合物可用通常的方法转换成药剂。该药剂或单独含有本发明组合物或同时含有其它活性物质。这种药剂可以经口、局部、直肠、肠外、局部、吸入或脑内给药。因此它们可以为固体或半固体形式，如丸剂、片剂、霜剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂、软明胶胶囊、凝胶、膜片和小管。对于肠外及脑内应用，那些用于肌内或皮下应用的剂型也可以加以应用，或将用于输注或静脉内或脑内注射的剂型进行应用，并且因此剂型可制成组合物溶液或制成与一种或多种制药学上可接受的赋形剂或稀释剂混合的活性组合物粉剂，可适用于前述的用途且其渗透压与生理液相容。对于局部应用，以霜剂或油膏剂型或喷雾剂型的制备物可以考虑；对于吸入应用，以喷雾剂型(如鼻喷雾)的制备物可以考虑。优选地，组合物以肌内的方法应用。

药物组合物可以以本身已知的药物学上可接受的组合物制备方法进行制备，这种药物组合物可以用于病人，并且有效数量的此活性物质与药物可接受的载体形成混合物。适宜的载体已得到描述，例如，在Remington′s Pharmaceutical Science(Nack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA 1985)中。

以此为基础，药剂包括，尽管不排除，与一种或多种药物可接受的载体或稀释剂相结合的本发明组合物，并且含于具有适宜的pH且与生理液等渗透压的缓冲液中。

所述组合物适于作为治疗剂单独或与其它治疗药剂或其它形式的治疗方法联合应用。例如，在恶性肿瘤情况下，本治疗方法可以使以前不能进行手术的肿瘤能够经外科手术切除。本发明的组合物和药剂目的是用于人和动物。

一般来讲，本发明组合物作为人用药应用的剂量范围设想为约0.01-20mg/kg/天，优选为约0.1-10mg/kg/天，最优选为0.1-1mg/kg体重/天。如果静脉内应用，每天剂量约为0.1-5mg/公斤体重，如果口服，每天剂量约为1-5mg/公斤体重。如果应用浓缩的组合物，可以用约半量于上述剂量的量。例如，肌内应用，每天剂量约为0.2-1.0mg/公斤体重，优选每天0.275-0.75mg/公斤体重。

医生将意识到偏离前述的剂量且特别是根据体重的情况和进行治疗动物的状况，所治的特殊疾病，用药途径的特点及所期望的治疗方法来调整剂量是必要的。另外，根据动物类型和其对药物的不同行为反应或药物的剂型及用药的时间或间隔也可使用不同于上述剂量的药量。因此，在某些情况下用少于前述的最小量进行治疗已足够，而在另一些情况下必须用超过前述上限的量。如果应用较大量，建议将这些量分成一天数次进行应用。

因此，本发明包括制备免疫调节剂组合物的方法，它包括(a)将动物胆汁与水溶性溶剂混合，制成胆汁/溶剂溶液；(b)从胆汁/溶剂溶液中分离出基本不含溶剂的水溶液；(c)从基本不含溶剂的溶液中去除胆汁色素，得到无色液体，优选水溶性溶剂为乙醇，且动物胆汁与等体积的乙醇混合。前述方法的优选方面也包括进一步浓缩无色液体至原胆汁/溶剂溶液体积的1/8或1/10。很明显，通过上述方法产生的组合物构成了本发明的优选方面。

本发明也包括用作免疫调节剂的组合物，它包含至少一种分子量小于约3000Da的成分，该成分对人外周血单核细胞未显示出细胞毒性，且具有至少下述特性之一：

(a)可以于体外或体内刺激单核细胞和巨噬细胞产生一种或多种细胞因子；

(b)可以刺激单核细胞和巨噬细胞于体外或体内产生肿瘤坏死因子；或

(c)对恶性小鼠杂交瘤细胞系具有抗增殖作用；且

所说的成分不是内毒素、IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF或IFN-γ。所述组合物可以从动物优选为牛的胆汁中获得，或从其它来源获得。在组合物的一个优选实施方案中，组合物于体外或体内(最优选为人)在无外源性IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ的情况下刺激肿瘤坏死因子产生。

本发明组合物也含有能被柱层析表征的成分，方法是将所说组合物干燥得到固体残余物，将2g该残余物溶于20ml以甲醇溶解的10％浓缩氢氧化铵中，在去除不溶物后，将其进行柱层析，所用柱为5cm×12.5cm大小的甲醇柱并含有102g 60A闪硅胶，于10磅/英吋²压力和11ml/min的流速下，用溶于甲醇溶剂中的10％浓缩氢氧化铵溶液进行层析，所说的成分在总柱洗脱液约180ml至约220ml、约220ml至约260ml、约260ml至约300ml的级分中洗脱出来。

也可用离子交换层析法表征各成分，方法是将10ml所说组合物进行离子交换层析，所用层析柱含足以基本上结合10ml所说组合物中所有阴离子量的Bio-Rad AG-1氢氧化物形式树脂，用阶梯梯度的碳酸氢铵缓冲液将所说成分自柱中洗脱出来，缓冲液浓度约0.5M至约1.5M，优选约1.0M至约1.5M，最优选约1.5M。

也可用反相(C₁₈)HPLC表征各成分，方法是将所说组合物冻干并再配制于溶于水的0.1％TFA中，然后在Phenomenex WP60009-C₁₈柱中进行反相(C₁₈)HPLC，该柱大小为250×4.6mm，用溶于水的0.1％TFA作为第一缓冲液过柱约10分钟，然后用溶于乙腈的0.1％TFA作为第二缓冲液从0至80％的线性梯度过柱约55分钟，再用第二缓冲液80％溶液过柱约5分钟，然后用第二缓冲液80％-0％梯度过柱约5分钟，流速为1ml/min，不超过柱和缓冲液的容量，所说的成分在将再配制组合物上柱后约2.4～约3.4分钟时自柱中洗脱出来。组合物各成分的特征也可用另一种反相HPLC法确定，方法是将所说组合物透析或溶解于0.1％TFA水溶液第一缓冲液中，然后进行反相(C₁₈)HPLC，所用柱为Bio-Rad Hi-Pore RP 318(C₁₈)柱，尺寸250×4.6mm，将第一缓冲液过柱约10分钟，然后用0.1％TFA的乙腈溶液作为第二缓冲液以0-80％线性梯度过柱约55分钟，再用第二缓冲液80％溶液过柱约5分钟，然后用第二缓冲液80％-0％梯度过柱约5分钟，流速为1ml/min，不超过柱及缓冲液容量，所说的成分在将透析的组合物上柱后约2分钟至21.4分钟，或约21.4分钟至25.6分钟时自柱中洗脱出来。

本发明组合物也可用TLC表征，方法是将所说组合物加样至溶于10％浓缩氢氧化铵甲醇溶液中的硅胶板上进行薄层层析，用茚三酮喷雾识出，与茚三酮的阳性反应发生在约0.80至约0.90R_f值处。

本发明也包含于人体中刺激TNF生产的方法，它包括施用有效量的，含有至少下列化合物之一的组合物。

(a)具有下式化合物：

其中A-B、B-C和C-D之间的键可以是单键或双键，且X＝H、OH、＝O、或OSO₃H；Y＝

其中R为-氨基酸残基；

(b)具有下式化合物：

(R¹O)CH₂CH(OR²)CH₂(OR³-x)或

的化合物

其中R¹、R²和R³为H、COR₄、CH＝CH-R⁵、X、P(O)(OH)O-、或-S(O)₂O-；

X为胆碱、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、丝氨酸、肌醇、含游离羟基的糖、氨基糖、磺化糖或唾液酸；和

R⁴为具有约C₁-C₃₀碳链的饱和或不饱和烷基，或其氧化和羟基化类似物；和

R⁵为烷基或其氧化和羟基化类似物；

(c)粘蛋白水解产物或蛋白多糖水解产物；或

(d)脂溶性维生素。

优选地，本发明方法的组合物至少含有选自下列化合物之一的化合物：牛磺胆酸及其磺化衍生物；甘氨胆酸及其磺化衍生物：鞘氨醇；二酰基甘油、卵磷脂；少于10个糖单位的寡糖(所说的寡糖包括唾液酸、岩藻糖、己糖胺或磺化己糖胺)；维生素A；视黄酸衍生物；视黄醇衍生物；牛磺酸；和谷氨酸及其轭合物。组合物也可另外至少含有选自下列化合物之一的化合物：氨；伯烷基胺；仲烷基胺；叔烷基胺；和羧酸R⁶CO₂H，其中R⁶为饱和或不饱和的C₁-C₃₀烷基，和其氧化和/或羟基化衍生物。

本发明的方法也包括通过施用至少含有选自下列化合物之一的化合物的组合物刺激TNF生成：牛磺胆酸及其磺化衍生物；甘氨胆酸及其磺化衍生物；鞘氨醇；二酰基甘油；卵磷脂；长度少于10个糖单位的寡糖(所说寡糖包括唾液酸、岩藻糖、己糖胺或磺化己糖胺)；维生素A；视黄酸衍生物；视黄醇衍生物；牛磺酸；和谷氨酸及其轭合物。

本发明也提供了一种治疗胰腺癌的方法，它包括给患所说癌症的病人施用治疗有效剂量的本发明组合物。

也构成本发明一部分是这样的组合物，它包括(1)鞘氨醇或与盐配合的鞘氨醇分子团，或(2)视黄酸或其衍生物的分子团，它至少具有下述特性之一：

(a)可在体外刺激单核细胞和巨噬细胞产生一种或多种细胞因子；

(b)能够刺激单核细胞或巨噬细胞于体外或体内产生肿瘤坏死因子；或

(c)对恶性小鼠杂交瘤细胞系具有抗增殖作用。

分子团也可含有二酰基甘油酯或卵磷脂，并可进一步含有胆汁酸盐和铵或烷基铵离子源。

最后，本发明也注意到这样的组合物含有：(1)鞘氨醇、一种胆汁酸盐和铵或烷基铵离子源，(2)一种胆汁酸盐、鞘氨醇、二酰基甘油、铵或烷基铵离子源，和视黄醇衍生物，(3)二酰基甘油酯、卵磷脂和一种胆汁酸盐、或(4)(a)二酰基甘油酯，(b)卵磷脂，和(c)粘蛋白水解产物或蛋白多糖水解产物，它至少具有下列特性之一：

(a)能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞产生一种或多种细胞因子；

(c)对恶性小鼠杂交瘤细胞系具有抗增殖作用。

下列非限制性实施例用于说明本发明：

实施例1本发明组合物的制备

从有执照并已检查的屠宰场屠宰的、用于食用的、至少一岁半的健康牛身上收集胆汁。自己检验的被屠宰的动物身上收集胆囊，将胆囊与肝脏分离并经兽医检验证实胆囊不含寄生虫并无感染迹象，因此该胆囊适于用作胆汁的来源。

将通过检验的胆囊用70％乙醇擦干净其外表，并用注射器抽出胆汁。抽出的在注射器内的胆汁经兽医用肉眼检查，保证它不含血液或脓液，而且其它方面也令人满意。将令人满意的胆汁移入标有刻度的含乙醇之琥珀色瓶中。胆汁是基本上不含血和脓液的绿色液体。将胆汁加至是乙醇刻度两倍的刻度处，得到50％胆汁/乙醇溶液。胆汁/乙醇溶液为约50％/50％胆汁/乙醇溶液，是基本上不含外来物的绿色液体。它也显示了对乙醇USP XXII Part B的阳性。将这些瓶子标上收集日期作为份号。各份组成的样本库至少要50头动物。从那些其胆汁入选样品库的动物收集部分肝、脾和淋巴结，并检查其是否有寄生虫或疾病的其它指征。

以4200rpm将胆汁/醇混合物离心至少2 小时，温度保持在20±2℃。倾出上清液并检查pH和乙醇含量。然后将倾出的液体进行活性炭处理。然后监测处理后的胆汁/乙醇的光密度(“O.D.”)和传导性。O.D.值或传导性在可接受范围以外时，将需要用活性炭对胆汁/乙醇溶液再次处理以达到于限制范围内的读数。

活性炭处理后，用滤器(例如用可保留2.5μm滤物的滤器)对溶液过滤，蒸发醇(例如，通过加热至不高于85℃)，将溶液浓缩至胆汁/乙醇溶液原体积的1/8。将浓缩溶液冷却至20-25℃。然后将溶液与乙醚混合并将醚相弃去。重复一次该步骤。将水相加热除去残余醚(例如加热至约55℃约10小时)并进一步加热至80-85℃缩减其体积至胆汁/乙醇溶液原体积的1/10。然后将所产生的组合物进行检测，检测其外观、生物活性和乙醇及醚的含量。组合物为基本上不含外来物质的清亮淡黄色溶液，且它含有的乙醇不超过10ppm，醚不超过5ppm。在实施例4描述的生物测定中，菲增殖性生长为18±单位/ml。

用反相高压液相层析测定同一性和纯度。用实施例4描述的抗增殖方法测定效力。

初始批次的本发明组合物作为非缓冲的液体而制备出。随后的批次作为缓冲的液体制备，方法是用盐酸(1％)溶液和氢氧化钠(1％溶液)调节组合物pH至7.4±0.05，并用二代和一代磷酸钠盐作为缓冲液。于104±2℃下在高压灭菌器中进行60分钟的生物负载的缩减(Bioburden reduction)。将大包装的溶液充至5ml或10ml无菌瓶中并盖上盖子。然后将这些已灌注并盖盖的瓶子用高压灭菌器进行三次消毒处理，每次处理为104℃±2℃，进行60分钟，然后于35℃温育23±1小时。在每一循环(高压灭菌+温育)之间取样并检测其生物负载。最后一次循环之后，以黑白为背景肉眼观察各瓶以检测可能出现的颗粒。

检测后从该份中取样并检测其与规格的一致性。检验包括同一性、无菌性、致热源性、内毒素、生物测定、HPLC及一般安全性(见表1)

表1

各批次的结果终产物检验批号# 批号# 批号#

BC0226 BC0227 BC0228生物活性 17 14.0 22.5(18.0+/-5单位/ml)同一性/纯度通过通过通过与参考物一致安全性(通过试验) 通过通过通过致热源性(体温增加应不超过0.4℃)内毒素≤0.4EU/ml ≤0.25 ≤0.25 ≤0.25无菌性(无生长) 通过通过通过pH(7.40+/-0.05) 7.45 7.39 7.36

表1(续)终产物检验批号# 批号# 批号#

BC0226 BC0227 BC0228外观-肉眼(清亮，通过通过通过仅有很少或没有沉淀的淡黄色液体)外观-O.D(通过检验) 0.088 0.118 0.088渗透压 540 603 445进行中的检验固体(18+/-3mg/ml) 18 15 20氨基酸(800+/-10％mg/ml) 790 742 878乙醇(不大于10ppm) 通过通过通过乙醚(不大于10ppm) 通过通过通过传导性(26+/-5mMHO) 25 22 29

实施例2本发明组合物的物理化学和生物化学特性

制备物许多的理化性质(传导性、渗透压及总固体)示于表2。更特别地是做出了对按实施例1方法制备的组合物三个生产批次的检验结果。示于表2的结果显示所生产产物的无菌性、效力和再现性。请注意乙醇和乙醚仅仅是在检验中而测定的。实施例4提供了测定生物活性方法的总结。

表2：产物规格检验规格方法生物活性 18+/-5单位/ml 生物活性同一性/纯度与参考物一致 HPLC安全性通过检验一般安全性检验

(小鼠和豚鼠)

21 CFR part 610.11致热源性体温升高不超过0.4℃ 致热源试验(兔)

USP内毒素＜2 EU/ml Linulus

Amoebocyte溶解产物

试验USP无菌性无生长无菌性试验

USPpH 7.40+/-0.05 pH试验USP外观清亮，仅有很少或没有肉眼检查

沉淀的淡黄色液体固体 18+/-3mg/ml 冻干氨基酸 800+/-10％μg/ml 三硝基苯-磺酸法渗透压凝固点降低法

USP乙醇不多于100ppm 直接注射气相层析乙醚不多于100ppm 直接注射气相层析传导性 26+/-5 mMHO Copenhagen

Radiometer Model

理化特性如传导性、渗透压和总固体与超过99％盐的组合物一致。组合物中小于1％的固体是有机物，没有脂质，约一半为碳水化合物，其余为氨基酸。存在蛋白质和肽。SDS凝胶电泳证实组合物中肽比蛋白质多。未测得高分子量。这是肽药物的重要特征，因为未预期有免疫原性。

用非缓冲的产物发展了对本发明组合物的HPLC和生物测定法。用这些检验确定作为缓冲液体和浓缩配方之产物的特征。下文描述的HPLC结果提示产物在所有图中均为相同。生物测定显示浓缩组合物的活性比原组合物高2倍半。因此，已表明实验中所用的产物是相等的。本发明组合物的反相(C₁₈)HPLC分析

本发明的组合物在反相HPLC中有一致地再现性，其中在早期排出的组分中可见峰且在27和32分钟处。在高峰之前，之间和之后，有些较小的强度不一致的峰。三份本发明浓缩组合物的HPLC读数示于图1-3中。批次B0211(图4)、B0209(图5)、B29/3006(图6)和B15/1606(图7)的RP-HPLC图也显示了很强再现性的图形。

按下述方法进行表征本发明组合物的RP-HPLC。用Bio-RadHi-Pore RP 318 guard柱(C₁₈)(4.6×30mm，Bio-Rad)和Bio-Rad Hi-Pore RP 318(C₁₈)柱(4.6×250mm)。在溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA，Pierce)中对样品进行透析，然后上柱。用缓冲液A过柱10分钟，然后用线性梯度0-80％的缓冲液B(溶于100％乙腈中的0.1％TFA)过柱55分钟。此期结束后，用80％缓冲液B过柱5分钟并用80％-0％的缓冲液B过柱5分钟。流速为1.0ml/min。收集连续流出的级分、贮存并于Speedvac(ModelSVC 200H，Savant Instruments，Farmington，N.Y)中浓缩。组合物初级表征

将HPLC峰进行蛋白质测序。起始样品被称为RP-HPLC-31.00分钟的主要HPLC峰。于TFA/CH₃ CN中的批次0210在进行N-末端序列分析时不能得到数据。这些结果可被解释为或由于量的原因或由于N-末端阻断。在酸水解后通过氨基酸分析对级分蛋白质含量的定量分析显示已对足够数量进行了序列分析；然而，由于组合物，可认为样品可能不是蛋白质，因而N-末端阻断不应是问题。样品显示出下列组成。约70％Glx(谷氨酸/谷氨酰胺)加上约15％甘氨酸(Gly)。进一步来讲，RP-HPLC等同样本的分析得出相似结果：68％Glx和15％Gly(表3)。对未分级分离物质及几个其它级分的进一步特征化显示下述结果。起始物质(32mg/ml)产生提示聚谷氨酸肽/蛋白质的序列信号，这与氨基酸组合物数据一致。

表3

操作R₁的HPLC级分之Glx Gly的摩尔％(见图)

组分号# 分析号# 摩尔％总和

(07/11/92)

Glx Gly Glx+Gly

1a 393 28 44 72

1b+c 394 35 37 72

2a 395 39 36 75

2b 396 35 43 78

2c 397 44 30 74

3a 398 69 21 90

3b 399 70 10 80

3c 400 52 18 70

4 401 68 15 83

402 48 30 78

对几个HPLC级分的分析(表3)显示所有均富含Glx(Glu/Gln)(28-70摩尔％)和Gly(10-44摩尔％)。然而各组分在其它氨基酸相对数量上显示一个真正的差异。

实施例3组合物组分的生物活性

研究了组合物级分的生物活性。组合物的生物活性被认为归因于小分子量成分(分子量小于3000Da)。这一结论是通过对四个组合物级分和未分级分组合物进行生物活性检测的实验确定的。第一级分含有分子量小于3000Da的蛋白质和肽，而其余三个级分含有另外较大分子量的蛋白质和多肽。所有级分均含有另外较大分子量蛋白质和多肽。所有级分和未分级分的组合物均显示出同样的生物活性。由于所有级分与未分级分的产物一样有效，且由于所有级分的共同特性是存在相同浓度的小于3000Da的分子，这样得出结论，组合物的生物活性是由分子量小于3000Da的成分而产生。

实施例4对恶性细胞系的作用

检测了本发明组合物对四种恶性细胞系培养物增殖的作用，这四种细胞系为Daudi人淋巴瘤细胞、ME-180宫颈癌细胞、T-24-人膀胱癌细胞和小鼠杂交瘤细胞^#6-1。本发明的组合物对小鼠杂交瘤细胞具有抗增殖作用。研究提示组合物对小鼠杂交瘤细胞的抑制作用是抗增殖性的而不是杀细胞作用。

于小鼠杂交瘤细胞模型上设计了基于本发明组合物可再现的抗增殖作用的生物测定，以更便利的测定组合物的特征。按下文所述进行生物测定。调节组合物的渗透压和pH以与细胞培养基之渗透压和pH相匹配，从而能够将组合物的生物活性与其理化特性分开。在培养基中制备等张组合物1∶5至1∶10,000系列稀释液。对杂交瘤细胞样品进行特殊的定量测定。用血细胞计数器对100μl样品中的细胞计数。用离心浓缩细胞，然后将细胞浓缩物调整至1,000个细胞/毫升(两倍于最终所期望的浓度)，方法是加入适宜体积的新鲜培养基。将与组合物相应稀释液(1ml)混合的杂交瘤细胞悬液(1ml)于潮湿环境下在37℃温育在24孔板中，CO₂控制在6％。96小时后，每孔取样100μl×3并置于96孔板中(包括不含细胞的100μl培养基空白)。用PROMEGA CellTiter 96^TM试剂盒测定细胞密度。通过于595nm处的吸收读数(650nm作参考)测定细胞浓度并以ELISA板读数器记录。对每次测定，制备细胞浓度的标准曲线。对对数生长期的培养细胞取样、计数、浓缩并再悬浮于系列稀释液中。将各稀释液以100μl％×3取样并置于96孔板中。通过画出细胞密度对减去零细胞空白和650nm处O.D.后于595nm处“净”O.D.的图制成标准曲线。未知样品的细胞密度通过推断得出。

为计算生物活性，将作为对照百分数(无组合物)的细胞密度对终组合物稀释液(以对数或线性尺度)作图，利用Spline曲线适配法，将曲线适配穿过各点。然后，用手工方法确定相应于细胞增殖50％抑制的组合物稀释液并直接换算成组合物单位。定义上一个单位的组合物对1ml细胞系HYB ^#6-1(500个细胞/ml)在37℃和6％CO₂条件下培养96小时后产生50％增殖抑制作用。生物测定中本发明组合物平均活性为18.24±1.82单位/ml。

实施例5对培养的T和B淋巴细胞的作用

本发明组合物已显示出对培养的正常T和B淋巴细胞无毒性。在有和无组合物的仔细控制的条件下检测人淋巴细胞的生长情况。在含有不同浓度组合物之孔中将标准浓度的淋巴细胞温育。当将正常T与B淋巴细胞与相似于临床应用浓度的组合物一起温育，用台盼蓝排除法判断未有副作用。

检测了组合物对人外周血单核细胞(PBMN)存活的影响。实验中将PBMN在含有不同体积的组合物和组织培养基的塑料微孔板中培养24和48小时。此期结束时，用台盼蓝染料排除法估计存活细胞数。表4显示在24和48小时时存活细胞数下降，然而，存在或无组合物时存活细胞数没有不同。而且，增加组合物量对存活无影响(表4)。因而，组合物未显示出对人PBMN的细胞毒性。

表4

温育后有活力PBMN的浓度病人S.Z.

台盼蓝测定每孔中存活PBMN数(×10⁸)¹浓度(μl/孔) 零时间 24小时后有活 48小时后有活

力细胞(％) 力细胞(％)

0 0.70² 0.23(33) 0.10(14)

25 0.43(61) 0.15(21)

50 0.10(14) 0.23(33)

100 0.15(21) 0.18(26)

200 0.48(69) 0.23(33)LPS(μg/孔)

1 0.30(43) 0.28(40)

10 0.25(36) 0.13(18)

病人E.S.

0 1.30² 0.70(54) 0.33(25)

25 0.65(50) 0.15(12)

50 0.68(52) 0.38(29)

100 0.75(58) 0.23(18)

200 0.65(50) 0.20(15)

表4(续)

温育后有活力PBMN的浓度病人S.Z.

台盼蓝测定每孔中存活PBMN数(×10⁶)浓度(μl/孔) 零时间 24小时后有活 48小时后有活

力细胞(％) 力细胞(％)LPS(μg/孔)1 0.60(46) 0.53(41)10 0.15(12) 0.15(12)¹ 重复三次的每孔中已铺板的大约1×10⁶细胞数。² 每孔中计数的实际细胞数(×10⁶)。

实施例6组合物的细胞因子含量

对本发明组合物进行TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN的ELISA检测。已确定本发明组合物不含有可测浓度的细胞因子(TNF、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ)(见表5)。

表5

组合物细胞因子的ELISA测定

组合物细胞因子 50μl 100μlTNF pg/ml ＜5 ＜5

检测限：5pg/mlIL-1βpg/ml - 6.5

检测限：4.3 pg/mlGM-CSFpg/ml ＜5 -IL-6pg/ml ＜7 -

检测限：7pg/mlIFNγpg/ml ＜5 -

检测限：5pg/mlIL-1αpg/ml ＜50 -

检测限：50pg/mlIL-4pg/ml - ＜3

检测限：3pg/mlIL-8ng/ml ＜4.7

检测限：4.7ng//ml

实施例7

对按照实施例1所述方法制备的本发明组合物的多个批次进行了物理、化学和生物学性质的测定。另外，测定了各批次的化学组成并进行了各批次的氨基酸分析。结果示于表6-8中。

表6化学组成批号固体氨基酸糖脂类高分子量

mg/ml μg/ml μg/ml μg/ml ＞3kD PROT

μg/mlB0201 15.3 4.59 40.85 ND＜0.5 NAB0202 15.7 13.16 54.95 ND＜0.5 NAB0203 15.0 72.67 25.5 ND＜0.5 NAB0208 7.8 4.53 30 ND＜0.5 ND＜1.0B0209 8.5 2.27 24 ND＜0.5 ND＜1.0B0211 5.6 1.47 19.2 ND＜0.5 ND＜1.0B0106 32.2 1.16 32.6 ND＜0.5 ND＜1.0B0706 32.7 1.42 26.2 ND＜0.5 ND＜1.0B1306 22.3 8.01 48 ND＜0.5 ND＜1.0B2006 21.7 9.73 38.4 ND＜0.5 ND＜1.0B2306 28.5 16.35 42 ND＜0.5 ND＜1.0物理、化学和生物学特性批号 pH 传导性渗透压吸收值 UV，VIS 活性

mMHO mOsM O.D.280nm 峰单位/mlB0201 7.37 16.9 361 0.98 404nm 10.5B0202 7.35 17.3 298 0.777 无 6.5B0203 7.3 17.7 360 0.67 365nm 21.0B0208 7.00 16.1 250 0.453 无 8.1B0209 7.31 11.2 259 0.594 无 6.7B0211 7.35 34.9 175 0.287 无 7.5B0106 7.57 34.3 627 0.341 无 17.2B0706 7.57 11.6 627 0.387 无 23.0B1306 8.02 35.6 790 1.147 无 17.0B2006 8.56 33.9 651 1.024 无 21.0B2306 8.01 35.1 623 1.054 无 19.0注释：1.向批号B0106和B0706中加入全等张PBS固体2.批号B1306、B2006和B2306浓缩2倍，不调整pH

表7化学组成批号固体氨基酸糖脂类高分子量

mg/ml μg/ml μg/ml μg/ml ＞3.5kD PROT

μg/mlB0213 31.6 21 61 ND NDR0201/-pH 52.5 1553 216 ND NDR0201/+pH 55.8 1530 280 ND NDC0203 36.1 113 42 ND ND0-13/2109 12.1 149 36 ND NDB27/2806 17.5 28 37 ND NDB29/3006 28.7 26 60 ND NDB15/1606 26.8 41 45 75 ND物理、化学和生物学特性批号 pH 传导性渗透压吸收值 UV，VIS 活性

mMHO mOsM O.D.280nm 峰单位/mlB0213 7.75 29.5 628 0.48 无 14.5R0201-pH 7.95 44.5 877 1.59 271nm 51.5

0.65O.D.R0201/+pH 7.60 50.0 1162 2.29 266nm 61.5

1.6O.D.C0203 7.90 34.8 657 0.96 无 5.00-13/2109 7.73 17.0 316 0.83 无 14.5B27/2806 7.71 22.0 453 0.49 无 12.4B29/3006 7.67 28.8 605 0.55 无 14.0B15/1606 7.84 35.0 753 1.04 无 14.0

表8氨基酸组成批号# B-0208 B-0209 B-0211 01/06 07/06 1306 2006 2306天冬氨酸 365 113 289丝氨酸 69 12 7 17 144 119 308甘氨酸 22 449 274 279 417 3731 5314 10371组氨酸 192 90 68 938 1335 2114精氨酸 161 533苏氨酸 19 13 30 148 142 250丙氨酸 173 112 24 64 949 1002 1423脯氨酸 1092 74 817 639 1075酪氨酸 15 55 57 43 39 205 135 45缬氨酸 121 63 31 10 15 367 335 224甲硫氨酸 970 461 462 13 107 121 70半胱氨酸 103 90 41 12 86 49 10异亮氨酸 2721 84 95 17 232 216 68亮氨酸 58 9 221 242 84苯丙氨酸 57 200 16 45 80 23赖氨酸 191 36 123 6 18 15总AAμg/ml 4.53 2.27 1.47 1.16 1.42 8.01 9.73 16.35

实施例8单核细胞和巨噬细胞的激活

研究表明本发明的组合物将激活正常单核细胞，显示出对用于测定单核细胞毒性的Chang肝癌细胞系的细胞毒性，研究也显示癌症病人(宫颈和子宫癌)的单核细胞和巨噬细胞被组合物刺激，攻击和消灭其自身的特殊肿瘤细胞。

更特别地是，在本发明组合物存在时检测了单核细胞杀肿瘤功能，且下文初步描述了这些实验的基本过程。

在肝素化的空试管中收集静脉血。将血用置于淋巴细胞分离培养基之上的Hanks平衡盐溶液(HBSS)以3∶1稀释并离心得到外周血单核细胞(PBMN)条带。离心后，从在培养基中冲洗两次的界面上回收单核细胞层，用胶乳吸入(latex ingestion)对单核细胞计数。通过粘附于96孔板上分离单核细胞(于37℃2小时，再经2个循环的冲洗)。估计附着的细胞大于90％的单核细胞。将含有吸附细胞的孔在组合物(11∶10稀释)、粒细胞巨噬细胞刺激因子或PMA存在情况下温育过夜。然后冲洗吸附细胞并与肿瘤细胞一起温育过夜。实验应用了标准细胞系⁵¹CR标记的Chang肝癌细胞，因为该细胞系对自然杀伤细胞细胞毒性不敏感。以效应器：靶细胞(E∶T)比为20∶1将肝癌靶肿瘤细胞加至吸附细胞单层上。之所以用该E∶T比是因为它正好落入由不同E∶T比(5∶1至30∶1)制备的曲线的平台期。24小时后收集上清液且测定⁵¹Cr释放量。特异性细胞毒性百分比按如下公式计算：

％特异性释放＝(E-S)/(T-S)×100其中E＝在效应细胞存在时自靶细胞释放的CPM；S＝在无效应细胞存在时自靶细胞释放的CPM；T＝用2％十二烷基硫酸钠处理后自靶细胞释放的CPM。

用该方案，发现组合物导致健康供者单核细胞产生对Chang肝癌细胞系的细胞毒性。随后，研究了是否癌症病人之单核细胞和巨噬细胞可被组合物刺激以攻击和消灭其自身的特定肿瘤。用类似于所描述的标准细胞系(Chang肝癌细胞)的方案，分离癌症病人的单核细胞和/或腹腔巨噬细胞(腹腔巨噬细胞自于腹腔镜检查时收集的腹腔液中分离得到)。发现组合物激活宫颈癌病人外周单核细胞和腹腔巨噬细胞产生针对病人自身肿瘤细胞的细胞毒性。该作用与IFN或脂多糖产生的作用相当或更好。也发现卵巢癌病人腹腔巨噬细胞在组合物刺激后攻击和消灭培养的卵巢肿瘤细胞。

实施例9对TNF的作用

进行了评价本发明组合物对自外周血单核细胞(PBMN)释放的细胞因子之作用。进行TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN的ELISA测定。

在实施例中描述的研究中应用了下述方法。

在TNF的研究中，从5例健康者抽出全血置入肝素化的Vacutainer试管中。用于Ficoll-Hypaque(Pharmacia)上的梯度离心分离外周血单核细胞(PBMNs)。用磷酸缓冲液(PBS)冲洗PBMN两次，计数并以10⁶细胞/0.5ml的浓度重悬于RPMI 1640培养基(Gibco Labs)中。将细胞于24孔平底组织培养板(Falcon，Becton.Dickinson)中培养将0.5ml PBMN悬液加入含50ng脂多糖(LPS)(得自大肠杆菌)、10μl胎牛血清和受检之各相应体积组合物(10-300μl)的孔中。为中和组合物的高渗性，将蒸馏水以等同于10％组合物体积加入培养孔中。然后用RPMI将总体积补至1ml/孔。用PBS取代组合物作为对照。在湿润的5％CO₂培养箱中于37℃将细胞培养2、6、24、48和72小时。在每次温育期结束时，收获细胞并以9000rpm离心10分钟的方式获得无细胞培养液。样品贮于-70℃直至进行细胞因子的ELISA(两周内)。

用Pierce Micro BCA蛋白测定技术(Smith et al.，Anal.Biochem.1985，150：76-85)进行组合物蛋白质测定。用蒸馏水将10μl组合物样品补至1ml。用5种浓度的牛血清白蛋白(0.150μg/ml)作为标准物。用0.1N NaOH作空白。向所有样品中加入BCA、2％二辛可酸钠盐(Pierce)、4％硫酸铜和Microreagent A(NaCO₃、NaHCO₃、溶于0.2N NaOH的酒石酸)的混合物。将混合物于60℃温育1小时，冷却并用分光光度计读出于562nm处的吸收值。然后将受试样品中的蛋白质数量与所画的曲线比较并进行相应的计算。组合物的蛋白质浓度较低估计为32μg/ml。

在以200μl和300μl/孔本发明组合物刺激人PBMN后，测定上清液中的细胞因子的合成。组合物的初始制备物对细胞因子生成无刺激作用(表9)。如果有任何作用的话，提示在PBMN于培养基中单独温育时细胞因子产生低于基本水平：

表9

24小时后组合物对细胞因子产生的直接作用

释放的细胞因子量(pg/ml)¹测定的细胞因子培养基组合物 LPS

100μl 200μl 1μg

IL-1α 61.6±12 59.6±7.8 54.3±6.0 315±117

IL-1β 199±184 218±165 188±174 965±99

TNF² 203±149 151±117 107±120 1501±284

IL-6 928±776 853±673 829±543 2016±41

IL-8 126±70³ 94±50³ 77±41³ 361±165³

GM-CSF 13±4 13±7 15±11 54±20

IFN-γ 11±18 9±14 5±6 54±94

IL-4 ＜3.0 ＜3.0 ＜3.0 ＜3.0¹ 双份8例病人样品的平均值² 双份7例病人样品的平均值³ ng/ml

进行确定本发明组合物是否损害LPS刺激的释放的实验。用LPS作阳性刺激物，组合物损害LPS刺激的细胞因子释放之能力通过对不同细胞因子的影响进行了比较(表10)。组合物明显抑制了IL-1α、IL-1β和TNF。对其它细胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ和GM-CSF的作用不显著。然而，在所有实验中，受试组合物均未放大LPS刺激细胞因子释放的作用。

表10

LPS和LPS+组合物释放的细胞因子之间的差异

细胞因子刺激物测定的细胞因子 LPS(50ng/m l) LPS+组合物² 平均差异

IL-1α 129±135 77±27 -52

IL-16 1314±723 919±460 -395

TNF 915±763 497±525 -418

IL-6 2320±1081 2320±1145 0IL-8(ng/ml) 118±62 109±56 -9

IFN-γ 30±24 13±10 -17

GM-CSF 54±65 50±63 -4¹ 以双份检测6例病人的PBMN² 组合物批号B0209

检测了不同体积本发明组合物抑制LPS刺激的TNF释放之作用。图8显示组合物抑制由LPS刺激的PBMN之TNF释放的剂量反应曲线。10μl组合物抑制10％、100μl组合物抑制接近30％。另一批号(B0201)的组合物在200、100和10μl时分别抑制LPS诱导的TNF产生45％、21％和12％。

与此相似，组合物以剂量依赖形式抑制IL-1β的产生：100、25和10μl的组合物分别抑制16％、10％和9％。

检测了不同批号组合物对LPS诱导的TNF释放之影响。概括来讲，以同样方式产生及来自同一种动物的各批号组合物产生相同的作用。然而，制备方法的改变或组合物来自不同动物种属则有不同的作用。批号B29/3006、B0213(B＝牛)和C0203(山羊)产生强于由LPS单独诱导的TNF释放(表11)。

表11

具有强TNF释放刺激作用的组合物批号之剂量反应效应

LPS+组合物和单用LPS之间TNFα释放的差异

批号组合物体积(μl) TNF(pg/ml)

B0213 10 193±161

100 858±819

200 2131±1742

B29/3006 10 121±102

50 422±78

100 834±811

200 2252±676

C0203 10 101±47

50 643±231

100 2650±1372

200 1851±980

表12显示批号B15/1606(浓缩制备物)和B27/2806(它们有中度刺激作用)的结果。

表12

具有中度TNF释放刺激作用的组合物批号之剂量反应效应

LPS+组合物和单用LPS之间TNFα释放的差异

批号组合物体积(μl) TNF(pg/ml)

B27/2806 10 -24±120

50 71±103

100 667±844

200 984±200

B15/1606 10 299±351

50 294±145

100 667±800

200 1224±446

表13显示批号013/2109(绵羊)具有最小的刺激作用。

表13

具有最小TNF释放刺激作用的组合物批号之剂量反应效应

LPS+组合物和单用LPS之间TNFα释放的差异

批号组合物体积(μl) TNF(pg/ml)

013/2109 50 -9±73

200 179±162

300 178±373

表14显示批号R0201(鲨鱼)在大多数浓度对LPS诱导的TNF产生有抑制作用。

表14

具有TNF释放刺激作用的组合物批号之剂量反应效应

LPS+组合物和单用LPS之间TNFα释放的差异

批号组合物体积(μl) TNF(pg/ml)

B0201 50 145±256

200 -370±385

300 -400±185

开始显示出组合物影响人PBMN的LPS诱导的TNF释放。因此，在接着的一系列实验中，检测了组合物对LPS诱导的TNF释放的时间效应(表15)。LPS刺激TNF的释放。2小时时TNF水平升至697pg/ml且6小时达高峰约2006pg/ml。于24、48和72小时时TNF的释放进行性下降。事实上，到48和72小时时TNF的释放仅在基本产生水平之上。与此相对，组合物批号0213(它具有强的刺激TNF释放作用)于2小时和6小时时未显示出超过单用LPS的TNF释放水平。LPS诱导的TNF释放高峰在6小时时，而组合物与LPS联合使用在24小时时产生释放高峰，此时是LPS刺激作用开始下降之时。不像单用LPS，组合物+LPS在48小时和72小时时继续刺激TNF释放，尽管释放的TNF量进行性下降(表15)。因此，批号0213具有刺激TNF释放的作用。仅有中度刺激作用的批号B15/1606在2小时和6小时时抑制了LPS诱导的释放。在24小时时，B15/1606+LPS轻度地刺激TNF释放。48和72小时时，B15/1606+LPS对TNF释放只有轻度刺激作用。因而，批号B15/1606有双相作用；早期它抑制LPS诱导的TNF释放，主要在24小时时，与LPS联用有轻度的刺激TNF释放作用。因此批号B15/1606具有双相作用；早期它抑制LPS诱导的TNF释放，且主要在24小时时，与LPS联用有轻度导致TNF释放的加合作用。

表15

不同组合物批号对LPS诱导的TNF释放的时间效应

三个不同批号用LPS+组合物和单用LPS之间

TNFα释放(pg/ml)的平均差异时间 LPS诱导的TNF释放(小时) (50ng/ml) B0213 B15/1606 R0201

2 697±94 693±339 363±189 62±42

6 2006±736 1949±422 1080±377 430±260

24 800±222 2301±658 876±351 343±183

48 170±149 1419±447 234±183 129±78

72 132±147 945±367 184±107 153±68

对LPS诱导的TNF释放具有抑制作用的批号R0201于2、6和24小时时显著抑制了LPS诱导的TNF释放。于48和72小时时，LPS诱导最小的TNF释放且批号R0201于这些时间有最小的正性和负性作用。

检测了批号B0203于不同体积和不同时间下的直接刺激作用。

约100μl时，批号B0203刺激最大量的TNF释放(表16)。200μl在24小时时观察到最大的效应(表17)。因此，组合物自身可以刺激TNF释放，这是在无LPS时产生的，而且TNF释放曲线与用组合物+LPS时相似。显示出组合物本身对TNF释放的刺激作用小于它与LPS联用时的加合作用。

表16

批号B0203刺激TNF释放的剂量反应

体积(pg/ml) 24小时的TNF释放平均数量

(μl)

无(PBS 50μl) 128±207

50 223±65

100 327±90

200 105±54

300 189±94

表17

批号B0203对TNF释放的时间效应

时间(小时) TNF释放¹(pg/ml)

6 47±154

24 106±73

48 20±25

72 13±8

96 5.5±6

120 9.5±2

中值

概括起来，实验结果提示组合物某些批次在以LPS刺激人PBMN时可抑制TNF释放。其它批次具有双相作用，提示其部分抑制LPS诱导的TNF释放，且作为晚期效应，具有诱导TNF轻度释放的能力。第三种制备物对LPS诱导的TNF释放无抑制作用；但在与LPS不同的时间点，制备物可以刺激人PBMN释放TNF。总之，本发明组合物可以调节TNF产生，TNF是抗肿瘤反应的重要介质。数据的总结示于图9和表18中。

表18

TNF生物测定结果批号 RP-HPLC 来源正常或浓度缓冲液 TNF释放B0213 27，32 牛正常有 ↑ ↑C0203 27，32 公山羊正常有 ↑ ↑013/2109 27，32，21 绵羊浓缩有 ↓/↑

：50，25R0201 21-25，28 鲨鱼正常有 ↓ ↓

29，29.5，

27，32B29/3006 27，32 牛正常有 ↑ ↑B27/2806 ↓27，↓32 牛正常有 ↑B15/1606 27，32，22，牛浓缩有 ↑

28

有 ↓

实施例10

本实施例总结性地证明了下述内容：组合物具有TNF-α释放活性，且TNF-α释放活性与内毒素的污染无关。加入巨噬细胞增强了组合物刺激TNF-α释放的能力。组合物的高渗性并不对TNF-α释放活性负责。组合物的TNF-α抑制释放活性可部分地与其它组分分开。组合物TNF-α释放活性不与C₁₈ RP-HPLC结合，或者结合得很差。组合物活性大多数较早地从RP-HPLC中洗脱出来。只有不到20％的组合物活性可以从留在RP-HPLC上的级分中回收并稍后洗脱出来。TNF-α释放活性可以被一种高含量的有机缓冲液80％乙腈沉淀。当沉淀物在含水缓冲液中重新配制并于RP-HPLC上分析时，结果显示沉淀物与组合物于RP-HPLC上的排除峰(excluded Perk)极为相似。有可能将由约30％起始物组成的级分中的组合物活性成分分离并浓缩。A.多粘菌素及TNF-α释放

将多粘菌素加入反应体中进行实验，以消除组合物之内毒素作用的任何可能性。多粘菌素抑制了内毒素对白细胞的作用。表19显示多粘菌素完全抑制了TNF-α的LPS诱导释放。无多粘菌素时LPS诱导517pg/ml的TNF-α，而在有多粘菌素时，则释放了11pg/ml的TNF-α，另一方面，组合物在多粘菌素存在时释放1591pg/ml的TNF-α。在无多粘菌素时，LPS和组合物表现得比仅加入刺激因子的效果更强，这说明组合物在有巨噬细胞引发时作用强度更大。

表19

多粘菌素对由LPS+组合物诱导的TNF释放的影响

释放的TNF(pg/ml)受试样品加入总量 -LPSLPS 多粘菌素 11±7 0

无 517±118 0组合物#B0213 多粘菌素 1591±413 1581

无 5256±2585 4738注释：1.释放的总TNF用1640培养基的TNF释放校正。2.多粘菌素浓度：50,000单位/ml。3.组合物体积：200μl。4.用多粘菌素，检测了8位病人。不加入多粘菌素，检测了3位病人。5.LPS浓度：50ng/10μl。B.反相高压液相层析(RP-HPLC)级分的TNF释放活性

图10显示了批次0213的组合物及用来检测TNF释放活性的5个相互分离级分的C₁₈ RP-HPLC图谱。

最初，在多粘菌素存在时检测了不同级分的效应。表20表明RP-HPLC早期洗脱级分(2：05至21：20分钟)具有大部分可测出的TNF释放活性。然而，该活性大约只有起始组合物的50％。表20的右栏显示了样品的渗透压。批次B0213的渗透压很高为369。21分钟及后来的级分渗透压正常，而有活性的第一级分具有甚至比起始物还高的渗透压，这说明组合物中大量的盐也较早地洗脱出来。因此，如下文所述，对样品的高渗性是抑制还是增强TNF-α的释放作了研究。

表20

多粘菌素存在下组合物不同HPLC级分的分离与测试

释放的TNF(pg/ml) 渗透压受试样品总量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培养基 0 - 287LPS(50ng/10μl) 40±25 0组合物#B0213 1222±448 1182 369级分(分钟)：2：05-21：20 554±394 514 43421：20-25：32 7±7 0 30125：32-31：55 0 0 29931：55-34：58 4±4 0 29234：58-46：55 32±28 0 295注释：1.释放的总TNF用RPMI培养基的TNF释放校正。2.级分重新配制于PBS中。3.组合物和级分的体积：200μl。4.多粘菌素浓度：50,000单位/ml。5.受试病人数：55.LPS渗透压未测。

表21显示用组合物级分1(2：05-21：20)和2(21：20-25.32)对两例病人所进行的另一测试。在级分1中又一次发现了大部分的活性，但级分2中也有一些活性。然而，级分1和2仅有组合物起始活性的50％。

表21

重复评价在多粘菌素存在时组合物HPLC级分

2：05-21：20和21：20-25：32分钟的TNF释放作用

释放的TNF(pg/ml)

测试样品总量 -LPS

1640 RPMI培养基 0 -

LPS(50ng/10μl) 31±31 0

组合物#B0213 2013±726 1983

级分(分钟)

2：05-21：20 526±126 496

21：20-25：32 132±108 101注释：1.总的TNF释放用RPMI培养基的TNF释放校正。2.级分重新配制于PBS中。3.组合物和级分的体积：200μl。4.多粘菌素浓度：50,000单位/ml。5.受试病人数：2

为了确定级分中是否存在有任何非特异性活性，进行一次空白操作，收集同样的级分并浓缩和测试。空白级分实际上不会引起TNF释放。这个结果表明RP-HPLC的级分可以用来对TNF-α释放活性进行测试，而不必担心层析柱或缓冲液对TNF-α释放活性的影响。

接着在无多粘菌素以便具有LPS的引发作用的条件下检测组合物各级分。表22显示批号B0213诱导了TNF-α显著的释放。用所示的洗脱时间，有5份来自RP-HPLC的组合物级分。级分1再一次具有最大的TNF-α释放活性。然而，由于LPS的引发作用，级分2至4均具有某些TNF-α释放活性。级分2(21：20-25：32)的活性为级分1的25％，并且是其后级分活性的2倍。

表22

无多粘菌素时组合物HPLC级分的分离和检测

释放的TNF(pg/ml) 渗透压受检样品总量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培养基 0 - 299LPS(50ng/10μl) 219 0 305组合物#B0213 1575±470 1356 376级分(分钟)2：05-21：20 656±206 436 32121：20-25：32 345±82 126 30925：32-31：55 287±70 68 30531：55-34：58 262±50 43 30434：58-46：55 237±59 18 3761.释放的总TNF用RPMI培养基的TNF释放校正。2.级分的重新配制：将2：05-21：20的级分配于水中，将21：20至48：55的级分配于PBS中。3.组合物和级分的体积：200μl。4.用于测试TNF释放的病人数：5人。5.渗透压为5例病人测试两次的平均值；标准误差很小，因而未列出。

鉴于表22显示了用200μl体积的结果，表23显示于无多粘菌素条件下用100μl组合物和100μl其RP-HPLC级分测试另外三例病人的结果。尽管由组合物引起的释放比用200μl组合物的低(表22)但结果相似。级分1含有大部分的活性而后来的级分2和3中只有一些活性。

表23

无多粘菌素时组合物HPLC级分的分离和检测

释放的TNF(pg/ml) 渗透压受检样品总量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培养基 0 - 303LPS(50ng/10μl) 195±72 0 302组合物#B0213 692±266 497 347级分(分钟)

2：05-21：20 575±82 379 310

21：20-25：32 226±65 31 337

25：32-31：55 210±71 14 305

31：55-34：58 192±40 0 313

34：58-46：55 182±73 0 3441.释放的总TNF用RPMI培养基的TNF释放校正。2.级分重新配制：2：05-21：20的级分配于水中，21：20-48：55的级分配于PBS中。3.组合物及级分的体积：200μl。4.用于测试TNF释放的病人数：35.渗透压为受试病人的平均数；标准误差很小，因而未列出。C.组合物的渗透性对释放TNF的影响

本发明的组合物为高渗性。人们研究了本发明组合物高渗性对TNF-α释放活性的影响，发现甚至将渗透性调至低渗性时，组合物仍能继续释放TNF-α。D.利用高含量有机溶剂的沉淀作用对组合物进行物理化学分离

正如组合物快速洗脱所显示的那样，由于组合物的大部分TNF释放活性未与RP-HPLC结合，因此人们决定使用其作用原理与反相层析分离法相反的层析柱，其中样品存在于高浓度有机溶剂中且允许亲水性相互作用。将此分离方法用于小极性的物质。然而，当组合物被置于80％乙腈中时，沉淀形成了。因此，在高浓度有机溶剂缓冲液中一定含量的组合物沉淀下来。分离沉淀物和可溶级分。通过冷冻作用沉淀物和可溶级分都得以干燥。将沉淀物和可溶级分重新分配于水溶液中，且将两者用RP-HPLC分析并且检测TNF-α释放活性。表24表明大部分的TNF-α释放活性包含在沉淀物中。

表24

由80％乙腈沉淀制备的组合物各级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

体积/ 渗透压受检样品浓度总量 -LPS (mOsm)1X 199培养基 0 - 306LPS 50ng/10μl 161±50 0 301组合物 100μl 471±304 310 307#B0213 200μl 505±210 344 318上清液 100μl 192±63 31 309

200μl 221±69 60 310沉淀物 100μl 626±212 465 307

200μl 1299±565 1138 346注释：1.释放的总TNF用1×199培养基的TNF释放校正。2.重新分配：上清液配制于PBS中；沉淀物配在双蒸水中。3.沉淀物于(低渗性)70％1×199培养基中。4.受试病人数：55.渗透压为5例受试病人中4例的平均值；标准误差很小，因此未列出。

对组合物的沉淀物(图11)和可溶级分(图12)二者的RP-HPLC分析表明组合物的RP-HPLC级分1中所含的物质主要是沉淀物(图10)，而可溶物质所包含的是组合物的其它RP-HPLC级分(图10)。因此，用这两种不同的方法表明组合物的活性包含在由RP-HPLC保留最少的级分中。事实上，沉淀物以100μl和200μl检测时具有的活性与未沉淀的组合物相等。

只有200μl沉淀物具有超出正常的渗透压。因而，用RP-HPLC将组合物的沉淀物和可溶级分(上清液)分离开(图11和12)并且将它们分成两个级分(参见RP-HPLC图)。级分1(2：00-21：10分钟)等同于被RP-HPLC分离的组合物的相同级分1，级分2等同于被RP-HPLC分离的组合物的级分2至5。然后检测分离物的TNF-α释放活性。表26显示对两例病人而言，经RP-HPLC分离后，无论是沉淀物还是上清液均无任何TNF-α释放活性。然而，对起初两例病人的检测结果(表25)表明存在着沉淀物未能以理想的体积进行检测的可能性。接下来，对另外的两例病人并且以更低一点的浓度重新检测各级分。表26显示了在50μl和100μl时，沉淀物的级分1具有最大的活性。在50μl时，其释放的TNF-α比50ng LPS多一倍。然而，在沉淀物的RP-HPLC级分2中也发现了较少量的释放活性，另外在上清液的RP-HPLC级分1和2中也发现了较少量的活性。

表25

80％乙腈沉淀组合物的HPLC分离级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 体积/ 渗透压受试样品培养基浓度总量 -LPS (mOsm)培养基 1X 0 - 294LPS 1X 50ng/10μl 194±93 0 294(#B0213) 1X-70％1X 100μl 855±88 661 281

200μl 926±163 732 291上清液2：15-21：28 1X 100μl 92±75 0 269

1X 200μl 25±25 0 24221：48-46：13 70％1X 100μl 61±56 0 296

70％1X 200μl 2±2 0 297

表25(续)

80％乙腈沉淀组合物的HPLC分离级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 体积/ 渗透压受试样品培养基浓度总量 -LPS (mOsm)沉淀物2：00-21：10 1X 100μl 183±15 0 305

1X 200μl 0 0 35421：10-46：20 70％1X 100μl 62±61 0 299

70％1X 200μl 0 0 302注释1.释放的总TNF用199培养基1×的TNF释放校正。2.重新配制：第一级分配制于双蒸水中，第二级分配制于PBS中。3.受试病人数：24.渗透压为受试病人的平均值；标准误差很小，因而未列出。5.1×和70％1×199培养基中的平均值。

表26

以80％乙腈级分的沉淀物和上清液进一步滴定后的TNF释放

TNF释放(pg/ml)

体积/ 渗透压受检样品浓度总量 -LPS (mOsm)1X199培养基 0 - 317

LPS 50ng/10μl 136±38 0 320#B0213 100μl 274±80 138 317

表26(续)

以80％乙腈级分的沉淀物和上清液进一步滴定后的TNF释放

TNF释放(pg/ml)

体积/ 渗透压受检样品浓度总量 -LPS (mOsm)上清液2：15-21：28 50μl 171±66 35 319

100μl 193±73 57 32221：48-46：13 50μl 184±34 48 311

100μl 162±40 26 310沉淀物2：00-21：10 50μl 287±69 150 333

100μl 204±40 68 35521：10-46：20 50μl 148±46 11 323

100μl 198±44 62 325

200μl 1299±565 1138 346注释1.释放的总TNF用199培养基1×的TNF释放校正。2.重新配制：第一级分配制于双蒸水中，第二级分配制于PBS中。3.受试病人数：24.渗透压为受试病人的平均值；标准误差很小，因而未列出。5.所有样品均在1×199培养基中。E.不同培养基的TNF-α释放

人们已经观察到在199培养基和RPMI 1640中对从RPMI 1640至199培养基导致较低TNF-α释放的seitch进行了评价(表27)。结果显示在RPMI 1640培养基中10-200ng的LPS比在199培养基中的LPS能更有效地释放TNF-α。可以推测，组合物在RPMI 1640培养基中能产生更大的释放作用。因此，培养条件可以影响TNF-α释放的程度。

表27

对不同培养基中TNF释放的评价

释放的TNF 渗透压释放的TNF 渗透压受检样品 (pg/ml) (mOsm) (pg/ml) (mOsm)培养基 23 296 47

LPS：10ng/10μl 124 291 -50ng/10μl 155 292 356 285100ng/10μl 147 293 323 289200ng/10μl 213 294 455 2881000ng/10μl 404 298 558 292F.组合物的渗透压

表28显示了组合物不同批次的渗透压。B0213稍微高一些，为675mOsm。表现出甚至比B0213更好的TNF释放活性的B0222其高渗性较低，为581mOsm。级分B0226、BC11-06和BC11-09的渗透压范围从540到603mOsm。

表28

全部批号的渗透压

批号 pH 渗透压(mOsm)

浓缩的

B0222 未调节pH 411

B0222 已调节pH 581

B0216 已调节pH 872

B0219 已调节pH 886

表28(续)

全部批号的渗透压批号 pH 渗透压(mOsm)未浓缩的B0221 未调节pH 652B0221 已调节pH 533B0213 已调节pH 675B0225 已调节pH 590B0226 已调节pH 540BC11-06 已调节pH 445BC11-09 已调节pH 603

实施例11A.本发明组合物肿瘤坏死因子(TNF)释放活性1.组合物的乙腈沉淀物和上清液

如上实施例所示，80％乙腈沉淀物形成了本发明组合物。对沉淀物和未沉淀(上文称为上清液)组合物进行进一步检测以确定TNF释放活性位于何处。

表29显示80％乙腈，一种有机溶剂沉淀了组合物的TNF释放成分。而0.04ml的全部组合物释放了约15pg/ml的TNF，0.05ml组合物的各沉淀批次分别释放58(B0222)、0(B0221)和17(B0213)pg/ml，这说明80％乙腈沉淀物回收了TNF释放成分。将沉淀的组合物用相同体积的已将其沉淀的液体重新配制。因此0.1ml的沉淀物来自于0.1ml的总组合物并等于0.1ml的总组合物。

表29

80％乙腈制备的Virulizin^*之沉淀物的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 孔中渗透压受试样品培养基的量总量 -LPS (mOsm)

LPS 1X 50ng 322±115 0 308Virulizin：B0222总组合物 80％1X 40μl 337±107 15 312沉淀物 70％1X 200μl 1091±137 769 351

70％1X 100μl 620±186 298 317

70％1X 50μl 380±132 58 297

70％1X 25μl 312±137 0 294Virulizin：B0221总组合物 90％1X 40μl 282±75 0 306沉淀物 70％1X 200μl 981±205 660 348

70％1X 100μl 526±169 205 314

70％1X 50μl 308±104 0 298

70％1X 25μl 318±185 0 292Virulizin：B0213总组合物 90％1X 40μl 383±72 61 312

沉淀物 70％1X 200μl 1143±172 821 366

70％1X 100μl 687±186 365 326

70％1X 50μl 339±133 17 305

70％1X 25μl 300±144 0 298注释1.受试病人数：52.释放的总TNF用1×199培养基的TNF释放校正。3.渗透压未用1×199培养基(311mOsm)校正。4.给出渗透压平均值，由于标准误差很小，所以未列出。5.沉淀物重配于双蒸水中。6.加至孔中的LPS体积为10μl。7.孔的总体积为1000μl 。8.样品体积相同^* 本发明组合物在此也被称为VIRULIZIN。

令人有兴趣注意到的是在早期的研究中通常使用0.1和0.2ml之间的组合物刺激TNF释放。重新分配至0.1和0.2ml的B0222、B0221和B0213，其沉淀物所释放的TNF在205至821pg/ml之间。0.1ml的沉淀物，批号B0222、B0221和B0213所释放的TNF在205与365pg/ml之间，TNF的量非常近似，这说明三个不同批次的TNF释放活性具有一致性。

在单独一组的供体白细胞上，对组合物经80％乙腈沉淀后尚存的上清液进行了检测。而事实上0.04ml全部批次的组合物(B0222和B0213)释放了175和233pg/ml的TNF，0.05ml的上清液释放了42和41pg/ml TNF，约为全部组合物活性的33％。因此，沉淀物中的TNF释放活性不是用于诱导沉淀物的缓冲液中某些残余物的结果。

鉴于前述在不同供体的白细胞上检测沉淀物和上清液级分的研究，导致了另一项在相同供体的白细胞上检测两级分的研究。对于两种受试的批次而言，0.04ml的全部组合物释放了0到41pg/ml之间的TNF。与此相比，0.05ml相同批次组合物的沉淀物释放了141和749pg/ml的TNF，而0.05ml上清液级分释放了6到57pg/ml之间的TNF。因此沉淀物含有很多TNF释放活性。上清液级分也具有某些TNF释放活性，但比沉淀物小得多，且不会超过全部组合物。2.本发明组合物的反相HPLC分离级分

由于组合物沉淀物显示出含有很多TNF释放活性，所以检测了沉淀物的C₁₈ RP-HPLC图谱。图18、19和20分别表示全部组合物、沉淀物和上清液的RP-HPLC图谱。沉淀物的图谱主要显示了全部组合物早期洗脱峰(图19)，而上清液的图谱(图20)除了早期峰较弱外与全部组合物相似。

以下的系列实验评价了在C₁₈ RP-HPLC分离后沉淀物和上清液的活性。由RP-HPLC收集2份沉淀物和上清液：2-21分钟和21-46分钟。对由RP-HPLC分离的全部组合物各级分的早期研究表明TNF释放活性主要洗脱在2-20分钟的级分中。表30显示了全部组合物和沉淀物及上清液RP-HPLC级分的检测结果。在这个特定实验中，仅使用了10μl的全部组合物但未引起TNF释放。2-21分钟部分的沉淀物释放了TNF，而21-46分钟部分没有(表30)。2-21分钟部分的上清液也释放了TNF活性，而21-46分钟部分则释放了最小量的TNF(表30)。因此对沉淀物和上清液而言，TNF释放活性主要驻留在C₁₈ RP-HPLC的早期洗脱级分中。

表30

80％乙腈(2×冲洗)制备的Virulizin^*

之沉淀物和上清液HPLC级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 孔中渗透压受试样品培养基的量总量 -LPS (mOsm)LPS 1X 50ng 99±43 0 307Virulizin：B0222全组合物 80％1X 10μl 83±33 0 289HPLC沉淀物2：00-21：36

70％1X 100μl 153±43 54 306

70％1X 50μl 50±14 0 28921：36-46：28 1X 100μl 97±29 0 306

1X 50μl 103±43 3 306

表30(续)

80％乙腈(2×冲洗)制备的Virulizin^*

之沉淀物和上清液HPLC级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 孔中渗透压受试样品培养基的量总量 -LPS (mOsm)HPLC上清液2：00-21：35 1X 100μl 192±55 92 330

1X 50μl 183±72 83 32021：35-46：30 1X 100μl 65±21 0 311

1X 50μl 142±40 43 309Virulizin：B0213全组合物 90％1X 10μl 93±36 0 296HPLC沉淀物2：00-21：12 70％1X 100μl 165±52 66 310

70％1X 50μl 48±15 0 28721：12-46：12 1X 100μl 88±31 0 307

1X 50μl 101±38 1 307HPLC上清液2：00-21：15 1X 100μl 193±76 93 317

1X 50μl 126±43 26 30621：15-46：20 1X 100μl 59±24 0 309

1X 50μ1 126±32 26 312注释1.受试病人数：52.释放的总TNF用1×199培养基的TNF释放校正。3.渗透压未用1×199培养基(309mOsm)校正；标准误差很小，所以未列出。4.重新配制：沉淀物配于类型1的水中，上清液配于PBS缓冲液中。5.加至孔中的LPS体积为10μl。6.孔含有的总体积为1000μl。

结果表明沉淀物和上清液中的TNF释放物质可能是密切相关的分子，如果不相同，仅有的差异(如果有的话)也许是在于80％乙腈中的可溶程度。

在另一实验中，检测了三个批次组合物的两个RP-HPLC部分的沉淀物其TNF释放活性。表31还显示了对于三个批次(B0222、B0221和B0213)而言，TNF释放活性主要在2-21分钟的部分中。因此，不同的批次是一致的。

表31

80％乙腈制备的Virulizin之HPLC沉淀物级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 孔中渗透压受试样品培养基的量总量 -LPS (mOsm)LPS(1) 1X 50ng 136±62 0 299LPS(1) 1X 50ng 81±25 0 306Virulizin：B0222全组合物 1X 40μl 734±276 659 329

10μl 119±11 38 303HPLC沉淀物2：00-21：25min 70％1X 200μl 20±4 0 354

100μl 155±32 74 30721：25-46：20 1X 200μl 67±39 0 313

100μl 78±10 0 310Virnlizin：B0221全组合物 90％1X 40μl 626±90 490 315

10μl 62±31 0 290HPLC沉淀物2：00-21：45min 70％1X 200μl 20±7 0 365

100μl 170±6 90 32921：45-46：50min. 1X 200μl 45±5 0 336

100μl 73±15 0 311

表31(续)

80％乙腈制备的Virulizin之HPLC沉淀物级分的TNF释放活性

释放的TNF(pg/ml)

所用的199 孔中渗透压受试样品培养基的量总量 -LPS (mOsm)Virulizin：B0213全组合物 90％1X 40μl 620±123 484 315

10μl 80±17 0 290HPLC沉淀物2：00-21：30min 70％1X 200μl 6±4 0 393

100μl 153±45 72 31421：30-46：30min 1X 200μl 182±96 47 312

100μl 78±20 0 310注释：1.对于100和10μl样品，测试了3例病人。2.对于200和40μl样品，测试了4例病人。3.释放的总TNF用199培养基1×的TNF释放校正。4.199培养基1×@100和10μl-306mOsm，@200和40μl-305mOsm。5.渗透压为平均数且未用199培养基1×进行校正；6.加至孔中的LPS体积为10μl。7.孔含1000μl的总体积。8.样品体积相同9.重新配制：级分1配于双蒸水中，级分2配于PBS缓冲液中。

进一步实验，检测用80％乙腈洗涤沉淀物的效果。实验的目的是为了证明TNF释放活性不会被容易捕获。0.04ml的全部组合物释放325pg/ml TNF。0.1ml的2-24分钟部分的沉淀物释放324pg/mlTNF，0.05ml时释放3pg/ml。24-46分钟部分不释放TNF。同样地，0.1和0.05ml的2-24分钟部分的上清液释放TNF，而24-46分钟部分在RP-HPLC上具有某些，但相当小的TNF释放活性。

为了确认组合物RP-HPLC分离物的处理并不对TNF释放活性的存在负责，以同样的方式制备样品但不加入组合物。PBS和H₂O空白样的RP-HPLC图谱，它们的沉淀物和上清液图谱基本上无任何峰。

利用相同供体的单核细胞，在相同供体的白细胞上检测样品，全部组合物及从2-24分钟洗脱的沉淀物释放TNF，而PBS、H₂O或者于RP-HPLC上分离的沉淀物在其2-23分钟部分中无TNF释放活性。因此，从2-24分钟洗脱的沉淀物导致特异性的TNF释放。

从24-46分钟洗脱的组合物沉淀物部分没有释放TNF。实验表明水与PBS的对照样分别释放114和40pg/ml。因此，24-46分钟的沉淀物部分无特异性TNF释放。

2-24分钟及24-46分钟的上清液级分部分分别释放了82和68pg/ml的TNF。RP-HPLC的水和PBS空白部分释放了一些TNF活性。2-25分钟及25-46分钟的水部分分别释放了149和216pg/ml的TNF，而PBS部分分别释放0和126pg/ml。

因此，沉淀物及上清液级分均有TNF释放活性。TNF释放活性的RP-HPLC分离表明二者均较早地从RP-HPLC中洗脱出来，这说明活性成分在物理学上即使不相同也非常近似。

进一步检测经RP-HPLC分离后80％乙腈沉淀物与上清液表32给出了它的总结性结果，该结果减去相同情况下制备的空白样品的活性。

表32

重新配制溶液Virulizin释放活性的减少

所用199 孔中实际释放渗透压受试样品培养基的量 TNF-a GM-CSP IL-1β (mOsm)Virulizin：B0222全组合物 80％1X 40μl 178 136 142 310HPLC沉淀物(min)：2：20-24：10 70％1X 100μl 75 13 18 31424：10-46：20 70％1X 100μl 0 16 0 292HPLC上清液(min)：2：00-23：55 1X 100μl 82 86 0 33623：55-46：20 1X 100μl 0 45 29 316注释1.数据来源于Virulizin总表表24.4。2.重新配制Virulizin：第1沉淀物级分配于类型1的水中，其它所有级分配于PBS中。3.总量未重新配制，因而未校正。4.样品体积相等。

全部组合物从24小时的单核细胞体外释放TNF、GM-CSF和IL-1β。80％乙腈沉淀物含有相同的释放活性，并且大部分洗脱在RP-HPLC早期级分中。上清液级分保留有释放活性，并且大部分洗脱在RP-HPLC早期级分中。上清液级分保留了释放活性，但它也洗脱在用于TNF和GM-CSF的早期洗脱RP-HPLC级分中。这些结果表明同一种成分可能释放了三个细胞因子。对于GM-CSF和IL-1β来讲，某些释放活性洗脱在RP-HPLC后期级分中的事实表明在组合物中可能有另一种物质能够作用于单核细胞去释放GM-CSF和IL-1β。物理化学分析SDS凝胶电泳

由于已经确定TNF、IL-1β和GM-CSF释放活性可以部分被80％乙腈沉淀，而且多数释放活性从C₁₈ RP-HPLC中较早洗脱出来，所以对沉淀物级分的理化特性进行了研究并将其与全部组合物和组合物上清液级分进行了比较。

图21显示了全部组合物及组合物的沉淀物与上清液其SDS凝胶电泳。在所有三个例证中，组合物跑得最接近SDS前沿，这说明它具有低分子量，所用的最小标准物为14,400道尔顿。分子筛HPLC

通过测试组合物从分子筛HPLC柱中洗脱的时间，以测定组合物分子的大小。将全部组合物、沉淀物和上清液的洗脱时间与标准物比较。所有这三个时间均晚于胰岛素，其洗脱时间为24.5分钟。物化分析又一次说明分子量小于2.400Da。亲水(聚羟乙基)HPLC

TNF释放成分较早洗脱出来。因此在有机溶剂存在的情况下选择有相反作用的层析柱。即疏水柱。对聚羟乙基柱而言理想的洗脱条件是80％乙腈。然而，如上一实施例所示，制备物中的某些物质在此浓度时会沉淀。因此，对低浓度乙腈条件下的组合物作了分析，此时层析柱主要是作为分子筛柱。图22和23显示了全部上清液和沉淀物的图谱。前一页总结了不同峰的洗脱时间。这些洗脱时间表明组合物的活性成分具有低分子量。沉淀成分的氨基酸分析与测序

两份样品于酸水解前后用氨基酸组成分析法进行了蛋白质分析：乙腈沉淀物和沉淀物的2-20分钟RP-HPLC洗脱级分。比较酸水解前后的氨基酸含量，说明两份样本非常相似。然而在氨基酸组成上两者有显著的区别(酸水解后)，并且使人联想到肽键水解的游离氨基酸含量上也有显著差异。这两种样品的组成均很特别即它们均富含甘氨酸加谷氨酸/谷氨酰胺。

根据前面可以推测至少有一种活性成分是蛋白性的。分析显示很可能有显著数量的、未鉴定出的茚三酮阳性(极可能为氨基酸化合物，但其它化合物也会产生反应)成分，该成分似乎对酸水解稳定。样品中每1000个残基中的主要氨基酸为Asx(精氨酸)143、Thr(苏氨酸)31、Glx(谷氨酸)381、Gly(甘氨酸)187和Ala(丙氨酸)170。

对游离的和释放的(酸水解)氨基酸之间进行了比较。表明每1000个残基中有下述氨基酸：Asx(精氨酸)51、Thr 8.6丝氨酸18、Glx(谷氨酸)375、Pro(脯氨酸)17、谷氨酸(Gly)429和丙氨酸86。

游离的1000的比率如下：

释放的/1000

Asx 4.09

Thr 2.03

Ser 1.65

Glx 1.18

Gly 0.37

Ala 1.69

有5个未确认(茚三酮阳性)成分。很可能的分配是半胱氨酸、葡糖胺酸和肌氨酸。也可能是蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜。主要的未确认的茚三酮成分似乎为样品中的游离成分。

实施例12IL-1β和IL-8的释放

表33显示本发明的组合物刺激培养的人单核细胞释放IL-1β且该组合物80％乙腈沉淀物比残留的上清液释放得更多。而全部组合物并不刺激IL-8的释放，分级的组合物似乎可以释放一些IL-8。示于表33中的结果为减去模拟样品的IL-1β和IL-8的释放。

表33

用重新配制的溶液Virulizin释放活性的较小释放

实际释放量受测样品所用的199 孔中的数量 IL-1β IL-8 渗透压

培养基 (pg/ml) (ng/ml) (mOsm)Virulizin：B0222总样品 80％1× 40μl 171 0 304沉淀样品 70％1× 100μl 160 71 292上清液样品 90％1× 100μl 17 87 335注意：1.受试病人数目：52.重新配制，沉淀物于类型1水中；上清液于PBS缓冲液中。3.用来释放的样品用1×199培养基及LPS校正：释放的IL-1β和IL-8，分别为154、1065pg/ml和68、294ng/ml。4.培养基及LPS的渗透压分别为311和309。5.加至孔中的LPS体积：10μl。6.孔的总体积：1000μl。7.样品体积相等。物理化学特征

用离子交换HPLC分离所说组分及其沉淀物和上清液。用A×300(阴离子交换)层析和CMX300(阳离子交换)层析均无组分的显著分离。疏水反相层析法没有将峰分开。毛细管电泳

毛细管电泳分析沉淀物。在高pH时，于190nm处观察到W吸收峰，但该峰在200nm处完全消失。于214nm Uv吸收处没有明显的峰。除非游离氨基酸是非衍生的，否则其不能被识别。有人认为190nm处的W峰可能是一种盐。

实施例13

在下述三种指示系统中评价组合物的刺激活性：(1)刺激淋巴细胞DNA的合成；(2)诱导淋巴细胞介导的细胞毒素功能；及(3)诱导单核细胞/巨噬细胞介导的细胞毒素功能。筛选出这些试验是因为它们可以检测早已显示与恶性疾病患者不同临床指标相关联的免疫功能。这些免疫功能的指示物也可调节以不同生物反应调节剂如干扰素或白细胞介素-2治疗的癌症病人。初始筛选过程的结果示于下文。

(1)刺激淋巴细胞DNA的合成：与植物凝集素(PHA)最理想的刺激浓度相比。

刺激物每分钟计数

培养基 374

PHA 125,817

组合物(^#222) 1,116

组合物(1∶10) 1,021

组合物(1∶50) 649

结论：不同于原型促细胞分裂剂PHA，该组合物并不刺激淋巴细胞进行芽基发育和细胞分化。

(2)刺激淋巴细胞介导的细胞毒素功能：与白细胞介素-2(IL-2)最理想刺激浓度相比

刺激物溶解单位

培养基 30.8

IL-2 472.5

组合物(纯净) 48.1

组合物(1∶10) 33.3

组合物(1∶50) 44.8

结论：不同于淋巴细胞细胞毒素功能的原型刺激因子白细胞介素-2，该组合物未激发淋巴细胞细胞毒性。

(3)组合物对单核细胞介导的细胞毒素功能的刺激作用：与γ干扰素和内毒素(γ-IFN和LPS)相比

刺激物细胞毒性(％)

(E/T＝20/1)

培养基 4.3

IFN+LPS 24.4

组合物(纯净) 19.7

组合物(1∶10) 20.0

组合物(1∶50) 11.5

结论：组合物能够刺激外周血单核细胞以剂量依赖形式表达杀肿瘤功能。刺激程度可以与由原型巨噬细胞激活剂γIFN+LPS的联合激发程度相比。组合物在这些体外测定中的作用并不像其它任何巨噬细胞激活剂那样需要加入内毒素，认识到这一点是重要的。如果组合物没有内毒素污染，在这个巨噬细胞激活测定中的组合物其生物活性被认为具有显著的生物学性质。组合物对单核细胞/巨噬细胞的研究

因为筛选过程证明组合物不能刺激淋巴细胞功能但能刺激单核细胞功能，所以接下来的研究目的是进一步表征该化合物的单核细胞/巨噬细胞刺激活性。作了大量的比较研究，目的在于测定组合物刺激单核细胞/巨噬细胞杀肿瘤功能的剂量反应特征以及检验该化合物的不同批次。研究的主要重点是检测组合物刺激来自癌症病人不同解剖部位的单核细胞和巨噬细胞杀肿瘤功能的能力。指导这些研究的中心假设是任何生物刺激因子的治疗有效性大部分都将依赖于其在包含恶性疾病的环境下激发杀肿瘤功能的能力。这可通过直接刺激于肿瘤微环境下存在的免疫细胞而产生。另一种途径是它可以通过刺激循环免疫细胞而产生，如果这些细胞以后可以回位于恶性疾病部位并在该环境下发挥功能的话。对这些研究而言，依靠下列细胞：(1)来源于癌症病人及对照者的外周血单核细胞；(2)来源于肺癌病人及患有非恶性肺部疾病对照患者的肺泡巨噬细胞；以及(3)来源于患妇科恶性肿瘤病人的腹膜巨噬细胞。1.组合物的剂量反应及不同批次的研究

这些研究依靠外周血单核细胞检测组合物不同剂量及不同批次的刺激活性。三批组合物用来进行检测。它们被称为批次#s 216、219和222。每一批次的组合物分为不稀释(纯净)、物质1∶10稀释及1∶50稀释三种进行检测。结果以附图形式于图24中进行描述。

结论：批次#222及216刺激了单核细胞杀肿瘤功能，批次#219则没有。在这些预实验中，#222显得超过216。批次#222显得能够在未稀释(纯净)及1∶10稀释浓度时刺激相同程度的杀肿瘤功能，于1∶50稀释时有较小但仍可测出的活性。批次#216于未稀释(纯净)浓度时产生最大的杀肿瘤功能的刺激作用，于1∶10稀释时刺激作用减小，1∶50稀释时没有了可检测出的活性。如上所述，批次#219于任何所试浓度时均不激发出可测出的杀肿瘤功能。2.外周血单核细胞中的杀肿瘤功能

对4份来源于对照者的外周血单核细胞样品进行试验。这些试验利用了组合物的理想刺激浓度(批次#222的1∶10稀释物)以及γ-IFN+LPS的理想刺激浓度。本研究中的靶细胞为培养的NK-不敏感细胞系，Chang肝癌。

刺激物细胞毒性(％)

(E/T＝20/1)

培养基 5.4+/-1

γ-IFN+LPS 18.6+/-4

组合物 22.3+/-6

再对一份来源于患宫颈癌病人的单核细胞样品进行检测。该实验很重要，因为病人自身的肿瘤细胞可用于检测中的靶细胞。如前所述，该试验利用了组合物的理想刺激浓度(批次#222的1∶10稀释物)和γ-IFN+LPS的理想刺激浓度。而且，效应器/靶细胞的比值降至15/1为的是保存病人的肿瘤细胞。

刺激剂细胞毒性(％)

(E/T＝20/1)

培养基 5.5

γ-IFN+LPS 14.4

组合物 20.9

结论：来源于对照者的外周血单核细胞中，组合物以等于或大于γIFN+LPS理想刺激浓度激发的程度刺激单核细胞对Chang肝癌的杀肿瘤功能。来源于宫颈癌患者的外周血单核细胞中，组合物以超过γ-IFN+LPS激发的程度30％的程度刺激对病人自身肿瘤细胞的杀肿瘤功能。3.来源于妇科恶性肿瘤患者的腹膜巨噬细胞中的杀肿瘤功能

这些实验是对从1例宫颈癌患者及1例卵巢癌患者的灌洗液中分离的腹膜巨噬细胞样品进行的。这些实验用病人自身肿瘤细胞作为测定中的靶细胞。如前所述，对组合物的理想刺激浓度(批次#222的1∶10稀释物)及γ-IFN+LPS的理想刺激浓度作了比较。而且，将效应器/靶细胞比值降至15/1以保存病人的肿瘤细胞。

刺激剂宫颈癌卵巢癌

培养基 8.2 0.6

IFN+LPS 29.8 4.1

组合物(1∶10) 13.2 8.9

结论：这些试验结果突出了这样一个事实，即局部肿瘤环境可能是免疫细胞对免疫性激活物反应的决定因素。在宫颈癌这一例中，其腹腔中无恶性疾病的病原性迹象，且用γ-IFN+LPS发展的对自体肿瘤的杀肿瘤功能好于组合物。在患卵巢癌的病人中，腹腔中有明显的肿瘤。针对病人自身肿瘤对γ-IFN+LPS的反应至多也只是最小的，而对组合物的反应则较大，4.来源于肺癌病人及对照者的肺泡巨噬细胞中的杀肿瘤功能

对从1例非小细胞肺癌患者及3例肺非恶性疾病患者的支气管灌洗液中分离的肺泡巨噬细胞进行这些试验。这些试验利用了组合物理想的刺激浓度(批次#222的1∶10稀释物)和γ-IFN+LPS的理想刺激浓度。这些研究中的靶细胞为Chang肝癌细胞，且效应器/靶细胞比值为20/1。

刺激剂癌症病人对照者

培养基 2.6+/-2 19.5+/-4

γ-IFN+LPS 10.9+/-13 1.2+/-5

组合物 5.2+/-2 18.6+/-8

结论：在对如γ-IFN+LPS常规巨噬细胞激活剂发生反应的杀肿瘤功能发展过程中，来自肺癌病人的肺泡巨噬细胞受到损害。这些结论与这一观察相符；它们表明，与对照者相比，来自肺癌病人的肺泡巨噬细胞的杀肿瘤功能相当大程度地减弱。它们还显示在来自肺癌病人的或者在患非恶性肺部疾病的对照者的肺泡巨噬细胞中组合物均未激活杀肿瘤功能。

用组合物进行的这些体外预试验证明组合物是一种巨噬细胞激活剂。所提供的该物质能够在标准的细胞毒性测定中激发对NK-不敏感细胞系及新鲜分离的人肿瘤细胞的杀肿瘤活性。另外还发现这些试验中被激发出的活性为浓度依赖性。组合物体外激活巨噬细胞杀肿瘤功能的能力可以和现在能得到的最好的巨噬细胞激活联合物，即γ-IFN+LPS内毒素的激活能力相比。如上所述，如果组合物没有被内毒素污染，则在无内毒素下的组合物其激发到此种程度的杀肿瘤功能的能力应被认为具有重要的生物学性质。

如所发现的其它的巨噬细胞激活剂一样，组合物刺激巨噬细胞杀肿瘤功能的活性随巨噬细胞的来源而不同。这说明组合物是一种外周血单核细胞的杰出激活剂，等同于正常供体γIFN+LPS并且可能优于癌症病人供体的外周血单核细胞的γIFN+LPS。恶性疾病依其所用的激活剂对单核细胞杀肿瘤功能的发展具有显著的影响(Braun等人，1991)。癌症患者单核细胞中不同的巨噬细胞激活剂其生物活性的一个决定因素是激活剂对花生四烯酸的新陈代谢及细胞前列腺素分泌物的敏感性。这些用组合物的初始研究，表明由化合物激发的活性对前列腺素的抑制效应不敏感。如果能够准确证明前列腺素对用组合物刺激的癌症患者单核细胞具有不敏感性，那么这应被认为在治疗学上具有重要意义，因为其它许多生物激活剂的效力被前列腺素所限制。由2种试样所做的预实验表明组合物可能于腹膜巨噬细胞中有良好的活性，尤其是当恶性病变是在腹腔中时。

这些预实验的结果还说明了当不同激活剂刺激不同妇科恶性肿瘤患者腹膜巨噬细胞杀肿瘤功能的能力作比较时所发现的情况。这些研究，发现腹腔中恶性疾病的存在影响了腹膜巨噬细胞对特殊激活剂的反应能力。在患宫颈癌的病人中，在腹腔中一般不存在恶性病变，所以，腹腔中的巨噬细胞对γIFN+LPS的反应正常。然而，当恶性病变在腹腔内存在时，如卵巢癌，对γ-IFN+LPS的反应被抑制。当恶性疾病存在时，花生四烯酸的新陈代谢有了部分相关的改变(Braun等人，1993)。事实上组合物明显能够激活来自卵巢癌病人的腹膜巨噬细胞对患者自身肿瘤细胞的杀肿瘤功能，这再一次反映了激活机制是独立于花生四烯酸代谢途径的。

另一方面，无论恶性病变存在于肺中与否，显而易见组合物不能激活肺泡巨噬细胞使之成为杀肿瘤细胞。已发现当来自肺癌病人的肺泡巨噬细胞与来自同样病人的外周血单核细胞或与来自非恶性肺病患者的对照肺泡巨噬细胞相比时，其杀肿瘤功能的发展被显著地抑制(Siziopikou等人，1991)。因此，在这种情况下，组合物缺乏活性不会令人惊奇。

实施例14

在来源于患妇科疾病病人外周血单核细胞及腹膜巨噬细胞中进行了对本发明组合物及其它巨噬细胞激活剂发生反应的杀肿瘤功能之发展情况的研究。更具体地说，病例数为7例，3例为良性疾病，4例为恶性疾病(2例卵巢癌，1例为子宫内膜癌，1例为宫颈癌)。外科手术时，从病人身上切除样本。用Braun等人的方法(CancerImmunol，Immunother，32：55-61，1990)从血标本中分离含外周血单核细胞的制备物，并用Braun等人的方法(Cancer Research53：3362，1993)分离含腹膜巨噬细胞的制备物。用Braun等人描述的单核细胞细胞毒性测定法(Cancer Immunol Immmunother 32：55-61，1990)检测对本发明组合物(批次222贮存液1∶10稀释液)和其它激活剂如γ-IFN(100U/ml)、IL-12(500U/ml)和单核细胞-CSF(500U/ml)反应的肿瘤细胞细胞毒性。

结果示于表34，它表明本发明的组合物均能刺激来源于患恶性和非恶性妇科疾病病人的外周血单核细胞及腹膜巨噬细胞中的杀肿瘤功能。由本发明组合物激发的肿瘤细胞毒性与受测的其它生物刺激剂所激活的细胞毒性相等或更大。

表34来自于患妇科疾病病人(3例良性疾病，4例恶性疾病)外周血单核细胞及腹膜细胞对本发明组合物及其它巨噬细胞激活剂发生反应的其杀肿瘤功能的发展情况

单核细胞/肿瘤细胞比率-15∶1

时的肿瘤细胞毒性(％±S.E.)

激活剂外周血腹膜巨噬细胞

培养基 8.3±3 3.1±1

γ-IFN 18.3±2 9.5±1

IL-12 26.0±4 8.5±2

单核细胞-CSF 16.0±2 7.0±2

本发明组合物(Virulizin) 23.0±6 12.5±2

实施例15

也研究了消炎痛(一种前列腺素合成抑制剂)对癌症病人外周血单核细胞发生对本发明组合物及其它巨噬细胞激活剂反应的杀肿瘤功能发展情况的影响。用实施例14中所描述的测定系统(除了将消炎痛(多至5ng/ml)与本发明组合物、IL-12(500U/ml)和单核细胞-CSF(500U/ml)同时加入之外)检测患恶性疾病病人的样本。

示于表35中的结果显示消炎痛放大了对IFNa、GM-CSF和M-CSF发生反应的细胞毒性。因此，对IFN-y、GM-CSF和M-CSF反应的杀肿瘤功能的发展被一种消炎痛敏感性功能加以调节。相反，对佛波醇酯(PNA)、IL-12及本发明组合物反应的杀肿瘤功能的发展则不被消炎痛敏感性功能调节，即消炎痛不能放大对本发明组合物、IL-12和PNA反应的细胞毒性。

表35消炎痛(一种前列腺素合成抑制剂)对癌症病人外周血单核细胞发生对本发明组合物及其它巨噬细胞激活剂反应的杀肿瘤功能发展情况的影响激活条件 ^*供者细胞毒性(％)

^*IFN-γ 23 11.9±9^*IFN-γ+消炎痛 25.2±17^*GM-CSF 10 7.8±6^*GM-CSF+消炎痛 17.8±8

^*PMA 6 27.3±14^*PMA+消炎痛 22.0±17

IL-12 3 24.7±5IL-12+消炎痛 25.6±6

M-CSF 3 14.1±3M-CSF+消炎痛 19.0±3组合物(Virulizin) 4 18.7±6组合物(Virulizin)+消炎痛 16.4±6

实施例16

研究前列腺素E₂在消炎痛存在条件下对发生对本发明组合物反应的杀肿瘤功能发展情况的影响。受试人员由1名正常人及8名病人(1位患胰腺癌、2位患头颈部肿瘤，1位患子宫内膜异位症，4位患HIV)组成。用Braun等人(Cancer Immunol.Immunother 32：55-61，1990)方法从病人血液标本中分离出含外周血单核细胞的制备物。用Braun等人(Cancer Immunol.I mmunother 32：55-61，1990)描述的单核细胞细胞毒性测定法测定在有或没有PGE₂(10⁸ M)情况下对本发明组合物(批222贮存液)1∶10稀释液及消炎痛(多至5～g/ml)反应的肿瘤细胞细胞毒性。

表36的结果显示36个PGE₂(10⁸M)病理生理浓度不能抑制在对本发明组合物反应中发展的杀肿瘤功能的水平。这一结果对立于PGE₂能抑制γ-IFN刺激的单核细胞杀肿瘤功能(Braun et al.，Cancer Research 53：3362，1993)的报道。

表36前列腺素E₂在消炎痛存在的条件下对发生对本发明组合物反应的杀肿瘤功能发展情况的影响

单核细胞/肿瘤细胞比率＝15∶1时的肿瘤细胞毒性(％)诊断组合物组合物(Virulizin) 组合物(Virulizin)

(Virulizin) +消炎痛 +消炎痛+PGE₂正常 19 20 27胰腺癌 15 14 22HNSCC 9 8 12NHSCC 11 3 12子宫内膜 37 37 n.d.异位症HIV 6 7 8HIV 15 12 19HIV 21 16 20HIV 23 22 n.d.

实施例17

研究由本发明组合物刺激的单核细胞针对自身肿瘤细胞杀肿瘤功能的发展情况。用Braun等(1990)的方法从6例病人(3例卵巢癌，1例子宫内膜癌，1例宫颈癌及1例ENT癌)的血样中分离出含外周血单核细胞的制备物。用Braun等(1990)描述的单核细胞细胞毒性测定法(除用病人的肿瘤细胞替代Chang肝癌细胞外)测定有或无PGE(10⁸M)时对本发明组合物(批次222贮存液的1∶10稀释液)及消炎痛(多至5～g/ml)反应的肿瘤细胞细胞毒性。用胶原酶及DNA酶处理病人的肿癌细胞，制备单个细胞制备物，用Braun等(1990)描述的方法标记细胞。

表37所示的结果显示本发明的组合物可以激活病人自身的单核细胞杀死其肿瘤。本发明的组合物至少与目前所用的标准生物激活剂一样有效。

表37本发明组合物(Virulizin)刺激的单核细胞针对自身肿瘤细胞杀肿瘤功能的发展情况

诊断培养条件肿瘤细胞毒性(％)

(E/T-15/1)

卵巢癌培养基 2

组合物(Virulizin) 11

卵巢癌培养基 1

γ-干扰素+LPS 4

组合物(Virulizin) 9

卵巢癌培养基 0

γ-干扰素+LPS 14

组合物(Virulizin) 11

表37(续)本发明组合物(Virulizin)刺激的单核细胞针对自身肿瘤细胞杀肿瘤功能的发展情况

诊断培养条件肿瘤细胞毒性(％)

(E/T-15/1)

子宫内膜癌培养基 6

γ-干扰素+LPS 14

组合物(Virulizin) 21

宫颈癌培养基 8

γ-干扰素+LPS 30

组合物(Virulizin) 13

ENT癌培养基 11

γ-干扰素+LPS 12

组合物(Virulizin) 25

实施例14至17的实验结果显示本发明的组合物能够激活单核细胞表达杀肿瘤功能，且它至少与目前临床应用中所用的其它激活剂一样有效；它在含腹膜巨噬细胞的血中起作用；且似乎并不受前列腺素抑制作用影响，前列腺素的抑制作用是病人免疫抑制的主要形式之一。实验数据也支持在腹膜及妇科恶性肿瘤的治疗中应用该组合物。

实施例18早期毒性研究

在多种动物上进行了毒性研究。这些研究总结于表38。在注射后第14天、21天及30天根据每天的临床观察对所有动物进行评估。在整个进行注射期间或在随访期间(除狗随访4个月外，所有动物随访1个月)未观察到任何副作用。

表 38

早期毒性研究的总结动物数量剂量小白鼠 100 以三天的间隔注射四次，每次肌注0.2ml雄性Wistar大鼠 100 以三天的间隔注射四次，每次肌注2.0ml金黄地鼠 60 以四天的间隔注射四次，每次肌注1.5ml豚鼠 60 以三天的间隔注射四次，每次肌注3.0ml兔 15 以三天的间隔注射四次，每次肌注5.0ml猫 10 以三天的间隔注射六次，每次肌注3.0ml狗 12 2ml/kg肌注一次，观察四个月^**

30天内每三天收集血液学数据，然后每月收集一次。

进行一项毒性实验以确定单次大剂量肌肉注射本发明组合物的效应。有13只大鼠接受了单次肌肉注射5ml/kg的组合物。有三只大鼠观察了7天，有10只观察了14天然后无痛苦致死并尸检。两组均未观察到毒性症状，且尸检动物未观察到显著的病理改变。基于这些观察结果，确定大鼠组合物肌肉注射的LD₅₀应大于5ml/kg。表39总结了这些结果。

表39

Sprague-Dawley大鼠LD₅₀的估计

途径动物数量用药剂量单位/kg^* LD₅₀Sprague 3雄性 i.m.5ml/kg 52.5 ＞5Dawley大鼠

10 i，m，5ml/kg 52.5 ＞5ml/kg

(5雄性/5雌性)

^*.依测出#B0201 10.5单位/ml的生物活性的预期范围计算的单位狗的毒性试验

在一项由安大略兽医学院进行的研究中，使2只杂种狗应用了组合物。表40给出了实验方案。每只狗均在右腿施用一次剂量的组合物，7天以后在左后腿再给予第二次用药。在第一次注射后，观察两只狗的情况14天。在整个试验期间一天两次监测其食欲、活动能力、体温、脉博及呼吸频率。分别于用药前、用药24小时、72小时、7天及14天时进行尿常规、血液学及血清生化学检查。两只动物均未显示出与两次注射有关的疼痛的征象。也未发现与第二次注射相关的过敏征象。也未观察到归因于药物的物理或实验室指标的异常或改变。该药显示出可被健康狗良好地耐受。

表40

狗的毒性试验动物年龄及体重第1次剂量第2次剂量剂量

单位估算的^* 单位估算的^* 间隔雄性杂种成年5kg 5.5ml i.m. 0.6ml i.m. 7天

28.6-50.6单位 3.1-5.5单位雌性杂种 6月龄13kg 12.5ml i.m. 1.3ml i.m. 7天

65.0-115.0单位 6.8-12.0单位患恶性新生物动物的治疗

在一兽医医院中临床应用了本发明组合物治疗宠物的多种恶性肿瘤。用每周肌肉注射组合物治疗患不对常规治疗反应的晚期新生物疾病的11只猫和10只狗。表41对此项研究中单个临床病例的情况进行了总结。注射次数从2次至69次，体积可多至单一肌注点7.5ml。每周注射的方案允许对各动物进行体检及仔细监测针对每个动物进行的诊断试验。临床医师注意到既没有局部刺激症状，也无包括过敏在内的严重过敏反应。临床医师及动物的主人未观察到全身性的副反应。研究者注意到在一些动物身上出现了某些临床方面的改善，包括较小的肿瘤变小、食欲及活动能力的改善、体重的显著增加以及疼痛和/或不适的减轻。

表41

表5-5 治疗患恶性新生物动物结果的总结号码姓名-年龄种属-性别诊断起止时间注射次数外科手术次数结果01 Bandit-13 犬-M/n 口鼻 01.31.87- 16 3 较小的部分反应

纤维肉瘤 05.19.87 病情进行性发展

无痛苦死亡02 Bob-5 猫-M/n 局灶性骨化生， 04.02.87- 18 11 首次复发16个月

有骨肉瘤发展， 08.10.87 全部均有完全反应

梭状细胞肉瘤，

猫纤维肉瘤， 11.08.88- 69 对随后的治疗有反

鳞状的，复发的 02.21.90 应疾病呈进展性

梭状细胞肉瘤- (肿瘤变得侵入更快)

侵入性(尸检诊无痛苦死亡

断03 J.D.-7 犬-M/n 口腔无黑色素瘤 03.02.02.03.87 26 3 完全反应

良性乳头状瘤复 08.24.87. 20 目前无症状(4个月)

发性圆形细胞肉 12.14.87-04.05.88 14

瘤 04.04.89-08.01.89 17

11.09.89-11.30.89 15

241290 4

25029189 9404 Mimi-7 犬-F/s 侵入性纤维肉瘤 02.27.87-08.10.87 22 5 稳定(无变化)

复发截肢

无复发05 Goliath-17 猫-M/n 恶性黑色素瘤纤 04.02.87-09.14.87 22 3 初始主要部分反应

维肉瘤

表41(续)

表5-5 治疗患恶性新生物动物结果的总结号码姓名-年龄种属-性别诊断起止时间注射次数外科手术次数结果

11.30.87-07.25.88 31 随后较小的部分反

应病情进行性发展

无痛苦死亡06 Diablo-15 猫-M/n 恶性鳞状细胞癌 05.28.89-06.29.87 5 1 初始较小的反应

然后病情进行性发

展无痛苦死亡07 Oliver-10 犬-M/n 恶性圆形细胞肉 02.24.89-05.30.89 12 1 完全反应

瘤无症状1年08 Karu-7 犬-M/n 粘液性小肠癌- 06.01.87-09.14.87 14 1 较小的部分反应

转移性然后病情进行性发

展无痛苦死亡09 Puppy-12 猫-M/n 耵聍腺腺癌 07.22.88-10.04.88 10 1 较小的部分反应

然后病情进行性发

展于87年10月10日

死亡10 Grandpa-16 猫-M/n 退行发育的新生 01.17.89-03.20.89 9 2 较小的部分反应

物高等级恶性肿然后病情进行性发

瘤展于87年3月26日

无痛苦死亡11 Sam-7 猫-F/s 纵膈淋巴瘤 11.02.87-12.21.87 7 0 较小的部分反应

然后病情进行性发

展于87年12月21日

表41(续)

表5-5 治疗患恶性新生物动物结果的总结号码姓名-年龄种属-性别诊断起止时间注射次数外科手术次数结果12 Pete-3 猫-M/n 急性猫白血病 04.13.87-05.01.87 5 0 短暂较小的部分反

应然后病情进行性

发展死于87年5月5日13 Midnight-8 猫-M/n 猫白血病 11.24.87-01.01.88 2 0 病情进行性发展

无痛苦死于88年1月

月7日14 Stormy-10 犬-M/n 无黑色素黑色素 03.02.87-07.04.87 完全反应

瘤 9个月后复发

病情进行性发展15 Penny-10 犬-F 恶性黑色素瘤 03.02.87-07.08.87 部分反应

病情进行性发展16 Muky-5 猫-F 退行发育性癌 02.09.87-06.08.87 6 3 完全反应

三个月稳定期后

复发17 George-10 猫-M 恶性黑色素瘤 03.02.87-08.04.87 15 1 较小的部分反应

26个月稳定期后

无改变18 Simon-13 犬-M 良性前列腺增生 04.02.87-08.31.87 10 1 较小的部分反应

表41(续)

表5-5 治疗患恶性新生物动物结果的总结号码姓名-年龄种属-性别诊断起止时间注射次数外科手术次数结果19 Tequila-14 犬-F/s 恶性小肠腺癌 11.24.89-08.09.90 35 1 较小的部分反应

无痛苦死于

90年8月9日20 Sheba-12 犬-F/s 侵入性骨肉瘤 12.06.89-06.28.90 25 1 初始较小的部分反

颅骨应然后病情进行性

发展无痛苦死亡21 Mesha-14 猫-F/s 骨肉瘤 02.07.89-05.06.89 13 2 截肢

反完全应

1年无复发或转移

临床结果总结于下文：六只动物(3/10狗和3/11猫)有完全反应。一只动物(1/11猫)有初始的主要部分反应。11只动物(5/10狗及6/11猫)有较小的部分反应。1只动物(1/10狗)保持稳定，1只动物(1/11猫)无反应。表42提供了每个治疗反应的定义。在动物身上获得的临床经验提示组合物在治疗恶性新生物中有潜在的作用。

表42

治疗反应的定义反应定义完全反应活动肿瘤的所有临床证据全部消失。病者必须由

独立的、不少于四周的两项观察确定无所有已知

疾病。部分反应主要的所有可测出肿瘤的垂直大小乘积之和应减小50％

以上，其它部位无新病变出现。较小的所有可测出肿瘤的垂直大小乘积之和应减小25

-50％；或主观反应如活动状态、食欲及健康

的感受的改善；或超声、X线下所见肿瘤坏死或

消散或肿瘤致密性及特征的改变提示其粘附性降

低及肿瘤移动性增加。病情稳定一个或多个可测出病变的大小增加或减少小于

2％，无肿瘤消散、或新的病变出现。病情进行性发展一个或多个可测出的病变大小增加25％，而无

肿瘤消散或新病变出现。

实施例19预临床试验

对患不可治疗的肿瘤的病人用按实施例1的方法制得之本发明组合物每公斤0.11ml进行治疗，每3-5天肌肉内给予组合物。在58例治疗的病人中无明显的毒性。在37例可评价的病人中，有3例病人有较小的反应，即肿瘤缩小25-50％，有5例病人在此期间病情至少稳定8周。最有趣的结果是在似乎具有最令人鼓舞结果的胰腺疾病病人中。在7例病人中，1例病情稳定了整整11个月。1例极晚期病情的病人病情稳定了4个月。正是基于这些结果才选择胰腺癌进行本发明组合物的基础研究。研究的目的是确定组合物在此组病人中的安全性和有效性。

治疗包括将本发明组合物以0.11ml/kg(最小量为7.5ml)剂量一次深部肌内注射至臂大肌。在第一周，病人一周接受三次治疗，然后一周两次，直至病情进行性发展。总的来讲，有22例病人参与该实验，且全部可进行安全性评价。仅17例病人可进行药效评价。在总计570/次注射中，均无任何局部或全身性毒性的报道。也无任何客观的反应。然而有6例病人病情稳定三个月或更长，但其余的病人在头三个月中病情进行性发展。中值存活期自诊断之日算起为8个月。自首次注射算起，中值存活期为4个月。有3例病人病情稳定期超过6个月。一例75岁的病人于自在生活18个月后有肝转移的复发。在病情进行性发展之前，他渡过了用组合物后病情绝对稳定的8个月。一位患未切除肿瘤疾病的71岁老年妇女至少稳定了10个月，且继续满负荷工作。一位经过用药过程4个月后有局部复发的64岁妇女稳定了至少8个月。

第四位患不能行手术的胰腺癌且由于不能获得组织进行病理学诊断而不能收入本实验中的病人稳定了几乎一年，尽管虽然应用了大剂量组合物，其肿瘤仍进行性发展。总之，组合物在所计划的剂量范围内，无针对胰腺癌的毒性位点。这提示用组合物在少数患该种疾病的病人中有短暂的抗增殖活性。

实施例20胰腺癌临床研究

对患可测出的、经活检证明的胰腺癌的病人进行本发明组合物的II期临床试验。组合物以肌肉注射7.5ml(0.11ml/kg)，每周三次注射一周，然后每周两次注射至病情进行性发展。下文描述了试验的详细情况。方法

治疗包括按实施例1制备组合物，以0.11ml/kg(最小剂量7.5ml)剂量单次深部肌内注射至臂大肌，每次注射更换至另一例臂部进行注射。在头一周病人接受3次注射，然后每周两次注射直至肿瘤进行性发展。

用标准的准则定义反应(Miller et al.，Cancer，1981；47：207-214)。完全反应(CR)定义为疾病的所有证据消失至少四周。部分反应(PR)定义为最大可测出的病变其两个最大垂直直径乘积减少大于50％，无新的病变或无任何病变的进行性发展至少4周。病情进行性发展定义为一个或多个可测出病变的大小有25％或更大的增加，或有新的病变出现。将不符合反应或病情进行性进展标准的疾病病情定义为疾病稳定。结果

试验共有22例病人参加，但有5例病人被认为不能用于评价药效。无完全或部分反应。3例病人在第一个月内病情进行性发展。有6例病人病情稳定超过3个月(3.5，3.5，5.8.12+，14+)。整个试验组的中值存活期自诊断之日算起为8个月，自治疗之日算起为5个月。1例患经活检证实的肝转移及CEA为37ng/ml(正常值＜3ng/ml)的病人其肝转移及CEA绝对稳定了8个月。1例病情稳定5个月。一例病人在Whipple手术后4个月时其胰腺病有复发，且在用组合物后稳定了至少1年，只是CEA缓慢升高。第3例病人体内经皮插入了斯坦特印模并全负荷工作了至少14个月，而无肿瘤进行性发展的征象。

所有22例病人均进行毒性评价，这些病人共接受了500多次注射。无人出现任何与药物相关的毒性临床或实验室征象。对平行于疾病活动能力的生活质量的没有有害影响。总白细胞计数，绝对淋巴细胞计数及血清免疫球蛋白未见显著变化。

代表自诊断及治疗开始时起的生存期的生存曲线分别示于图13和14中。为了比较，将Gudjonsson(1987)的历史生存曲线置于图13之上。另一可比较的历史生存曲线的例子可见于Bakkevold，Petterson，Arnesjo和Espenhaug(1990)。

存活分析的结果总结于表43中。自诊断之日起的平均存活期为281天(图13)。中值存活期为182天(约5个月)。为了进行比较，Gudjonsson(1987)报告其188例外科病人的平均存活期为208天，中值存活期为120天。自治疗开始时起的平均存活期为166天(图14)。中值存活期为133天(约4个月又一周)。

表43

方案CO2-104存活期估计值存活期病人数平均存活期标准差中值存活期

(天) (天)自诊断方案CO2-104 281 203 182之日起病人

方案CO2-104 304 157 219

可评价病人自治疗开方案CO2-104 166 135 133始时起病人

方案CO2-104 220 132 146

可评价病人

在每个至少接受了13次注射的可评价病人的亚组中也估计了其存活期。22个病人中有14例可进行评估。这些病人中(表43)，自诊断时的中值存活期为219天(约7个月又1周)。自治疗开始时的中值存活期为146天(约5个月)。

实施例21有关恶性黑色素瘤的临床试验

将晚期恶性黑色素瘤定义为包括所有III期及IV期病人以及所有在初次治疗后发生了局域或远处复发的病人。所有其它治疗均由其判别的标准治疗为DTIC(dacarbazine)，它所报告的反应率为约15％。中值反应期为3-6月，并随之有严重的恶心及呕吐，且有由肝静脉栓塞引起急性肝坏死的致死性副作用。该治疗不能显示出确定的生存优势。

本项试验是为了在用于患晚期恶性黑色素瘤时确定本发明组合物的安全性及有效性并确定其对生存期及生活质量的影响。本试验是非对照性的，多中心的试验。

对病人应用了初始计划剂量为7.5ml的本发明组合物进行肌内注射，每周3次。在未观察到器官或骨髓毒性后，给药计划增加至每天注射，注射15天，然后维持每周三次注射。随后施用剂量增加至30天。治疗期为36周，然后降至16周，之后病人选择进入一连续方案。

受试者包括了患恶性黑色素瘤的33位病人(17人为女性，16人为男性)，年龄从17岁至85岁。64％以前接受过治疗，36％未接受过治疗。在试验的33例病人中，有25例为可评价的。Karnofsky行为状态(基础值)为40-100％，中值80％。试验期末期有11位病人存活，其中5例在治疗中。

在16/33病人中(48％)观察到较小的部分反应，1例病人肺部肿瘤减小33％，6例病人疼痛减轻，8例病人在超过一个月的时间内体重增加1000克以上(从1000-2600克)。在19/33(58％)的病人中观察到稳定状态(60-170天，中值77天)。

图15、16和17显示以本发明组合物治疗的病人的存活期，它是与历史对照值比较的并测为自转移/复发诊断时起的存活期(以天计算)。实线代表了用本发明组合物治疗的病人的存活曲线，虚线代表历史存活曲线(Balch，C.M.et al.，Cutaneous Melanoma，2nd，ed.1992，Chps，14 and 39，pp，165-187 & 499-508，Lippincott Co.，Philadephia，Penn)。图15显示了用本发明组合物治疗的所有病人(包括有一至三处以上部位的肿瘤的病人)的存活期。图16和17分别显示了患两处部位肿瘤及患三处和三处以上部位肿瘤病人的存活期。

用本发明组合物治疗的所有病人这一组一年存活率为39％(Kaplan-Meier估计法)。所有患晚期恶性黑色素瘤(AMM)病人历史对照的一年存活率为约11％(肿瘤部位的数目与本研究中病人之肿瘤部位数具有可比性)。这组病人的中值存活期为315天，而历史对照的中值存活期为89天。

用本发明组合物治疗的患两处肿瘤病人的一年存活率为49％，而历史对照的一年存活率为13％。该组的中值存活期为360天，而历史对照的中值存活期则为120天。用本发明组合物治疗的患三处及三处以上肿瘤病人的一年存活率为31％，而历史对照的一年存活率为0％。有三处及三处以上肿瘤病人的中值存活期为205天，而历史对照的中值存活期为60天。

用体重增加、行为状态(Karnofsky)、生活质量指数(Spitzer)及疼痛分级表(Linear Analogue)评定生活质量。体重增加随时间变化的情况示于表44。

表44病人数/可第1个第2个第3个第4个第5个第6个评价病人数月月月月月月

11/25 12/25 4/25 4/25 1/25 1/25百分比(％) 44％ 48％ 16％ 16％ 4％ 4％范围 100- 200- 100- 100-(克) 2400 6000 1000 2000平均值 900 1480 525 775 100 2000(克)

Karnofsky及Spitzer分级表均为主观性的及在各病人中这两项基本一致。15例病人在这些指标方面无变化。4例病人有波动，后来复归以前的水平。1例病人下降(从40％至20％)。

疼痛评价的结果显示在第四周有6例疼痛从5(可能最差)降至2(轻度)或0(无疼痛)。1例病人疼痛从3降至0，1例患肝转移的病人疼痛降至0并稳定了11个月。9例进入试验时为0级疼痛的病人在整个试验中维持了0级疼痛。5例病人有轻度(2个单位)的疼痛增加。3例病人在第2或第3个月期间有短暂的疼痛增加(1至2个单位)。

在对33个病人施用的1734次注射中，21例病人无不良药物反应。12例病人中报道了14次不良药物反应。不良药物反应通常发生于第4至第8周，且为中度至短暂的，最经常出现的是低烧。

历史对照组与用本发明组合物治疗的方案组间存活期的差异提示用本发明组合物治疗病人会有提高存活期的益处。19例病人的癌症似乎稳定。所有AMM治疗的病人均包括在存活期数据中。也包括了21例以前曾进行治疗的病人(许多临床试验要求未经治疗的病人，因为以前失败的治疗病人预后很差)。肿瘤数目很高(82％有多于一处的转移灶)。

存活期及生活质量的数据提示大多数病人从治疗中得到了某些益处。在试验终末时仍有11位病人存活，且其中5例继续进行治疗。

实施例22恶性黑色素瘤的病理学检查方案

下文是对一例患硬腭和牙床进行性发展的恶性黑色素瘤的73岁老年妇女的报告。图25显示显微镜下所见恶性黑色素瘤的两幅面面。图25a中，从上往下看，可以见到伴有角蛋白的上皮层，在此层下方恶性细胞开始变得更明显。所见这些黑色素瘤细胞为圆形或卵圆形，含丰富的嗜曙红性胞浆及多形性深色染色质的胞核。这些细胞取代了正常的粘膜下组织。所见的血管显示正常且缺少如由白细胞(多形核及单核细胞)出现所代表的任何类型的炎症/免疫反应。这是生长旺盛的肿瘤组织即肿瘤组织结构完整的实例。，

图25(b)中显示了以本发明组合物已治疗2个月病人的肿瘤组织样本。自上而下可看到上皮的连续性被坏死组织破坏。该坏死组织(生长至相当大体积的任何肿瘤中心部位常见)在边缘罕见，尤其是在恶性黑色素瘤的边缘，且它是宿主免疫反应正对肿瘤发起攻击的迹象。在整个照片中为大量的不同于原始肿瘤细胞的细胞。这些细胞为免疫细胞-中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，这些细胞造成了典型的肿瘤组织结构的破坏。血管壁已被大量的宿主免疫细胞(箭头)密集的侵入。这种细胞性侵入随后将导致血管的破坏，这反过来防止了肿瘤接受其养分及氧气的供应(缺血性坏死)。这一在该病人组织切片中所见的造成肿瘤破坏的免疫反应与已报道的由TNF(肿瘤坏死因子)引起的改变一致，也与在以前的实施例中描述的试验结果一致。

用组合物治疗后病人的组织切片(图25b)中显示的免疫反应由组合物将体外TNF免疫调节作用与在体内抗肿瘤TNF效应中之所知密切联系起来。

由前文所述，可以认为尽管在此为说明目的描述了本发明的特殊实施方案，但在不偏离本发明精神和范围的情况下进行多种修改。因此，除被权利要求限制外，本发明并未被限制。

实施例23活性级分的分离

将300ml本发明组合物样品在浴温不超过40℃的rotovap上蒸干。为了保证在蒸发期间溶液为碱性，每半小时向组合物中加入5滴浓缩的氢氧化铵溶液直至蒸发完成。所产生的残余物重11.6克。

然后向2克上述残余物中加入溶于甲醇溶液中的10％浓缩氢氧化铵20ml。将不溶物滤除，将滤液通过5cm×12.5cm柱中的101.93克60快速(flash)硅胶进行层析。所用的溶剂系统与溶于甲醇溶液中的10％浓缩氢氧化铵。于10p.s.i的压力下及以11ml/min的流速进行过柱。在有100ml溶剂流出层析柱后，收集12个20ml级分。这些级分的收集与快速向柱下端移动的米色条带的出现相互关联。

在浸入溶于甲醇的10％浓缩氢氧化铵溶液中的硅胶板上进行这些级分的薄层层析(TLC)，用茚三酮喷雾进行识别。将具有相似TLC图的级分混合产生了下列级分混合物，在旋转蒸发器上将其干燥。

级分获得级分的过柱体积产量(克)

1-4 100-180 0

5-6 180-220 0.1175

7-8 220-260 0.1969

9-10 260-300 0.0151

11-12 300-340 0.0053

级分5-6、7-8和9-10与茚三酮有阳性反应，R_f值为0.81。

实施例24

在体外检测由实施例23所得的级分5-6和9-10的抗增殖效应(按实施例4的方法)及TNF刺激作用(按实施例9的方法)。结果显示如下：

级分测定活性

5-6 抗增殖效应 11.57单位/mg

5-6 TNF刺激作用-LPS 50pg/mg

9-10 抗增殖效应 2.6单位/mg

9-10 TNF刺激作用-LPS 1814pg/mg

因此，级分5-6具有抗增殖作用，级分9-10为特别有活性的TNF刺激剂，且有轻度活性的抗增殖作用。

实施例25

用电子撞击质谱(EI MS)和电子喷射质谱分析级分5-6样本以鉴别级分中可能出现的特异的成分。电子喷射MS用溶于水中的5％乙酸作溶质，在Perkin-Elmer Sciex API-III分光计上进行。在某些情况下，加入甲醇以助溶。在用甘油作基质的VG Analyticalmodel ZAB-SE分光计上进行用直接插入探针的EI MS，且在KratosAnalytical Profile质谱仪上用DCI探针。

所得的光谱回顾显示下列化合物可能存在于级分5-6中：胆碱磷酸、牛磺胆酸、胆碱-硬脂酸甘油二酯、硬脂酸、硬脂酸甘油二酯、棕榈酸-硬脂酸甘油二酯和鞘氨醇-油酸轭合物。

实施例26

用4ml 1N HCl溶液将100ml组合物酸化以使其pH等于3。然后用3个100ml的HPLC级的二氯甲烷将组合物提取。然后将二氯甲烷级分混合并在小量的无水硫酸钠上干燥。再将二氯甲烷溶液用纸过滤至圆底烧瓶中并于旋转蒸发器上蒸发干燥产生0.0049克的一棕色薄层。

将0.0017克此薄层溶于214ppm NH₃·H₂O溶液中，pH7，且如实施例4筛选抗增殖活性。该筛选提示此溶液是具有活性的抗增殖剂，其活性为14单位/mg。

实施例27

如下文，更大规模地重复实施例23。向900ml组合物中加入10ml浓缩的氢氧化铵溶液，且在浴温不超过40℃的旋转蒸发器中将所得溶液蒸发干燥。为保证蒸发期间溶液呈碱性，每半小时向组合物中加入5滴浓缩的氢氧化铵溶液，直至蒸发完成，产生残留物。

然后向全部残留物中加入150ml溶于甲醇的10％浓缩氢氧化铵。将溶液超声处理15分钟并滤除不溶物。将滤液通过30cm×12cm柱中的1695克60快速(flash)硅胶进行层析。所用溶剂系统为溶于甲醇溶液中的10％浓缩氢氧化铵，于6p.s.i的压力下及以30ml/min流速进行过柱。过柱的结果总结于下表：

级分号每一级分的体积外观

(ml)

1 550 无色

2 450 无色

3 400 无色

4 150 无色

5 100 无色

6-7 75 无色

8-13 50 无色

14 50 褐色溶液开始流出

15-35 50 褐色溶液

36-40 50 无色

于浸于10％浓缩氢氧化铵溶液中的硅胶板上进行TLC，并以茚三酮喷雾进行识别。将具有相似TLC图的级分混合产生了下列级分混合物，在旋转蒸发器上将其干燥。级分号获得级分的过柱体积产量(克) 备注3 1000-1400 0.0504 白色粉状固体4-5 1400-1650 0.0855 白色粉状固体6-8 1650-1850 0.1555 白色粉状固体9-12 1850-2050 0.3014 白色粉状固体13-14 2050-2150 0.3595 白色粉状固体15-16 2150-2250 0.6914 浅棕色-固体发粘17-18 2250-2350 1.0284 褐色-固体呈块状19 2350-2400 0.3432 褐色-固体呈块状20-23 2400-2600 1.1531 棕色-固体呈块状24-30 2600-2950 0.8517 棕色-固体呈块状31-34 2950-3150 0.0813 棕色油状

从15-16至级分31-34的所有级分混合物与茚三酮均有阳性反应R_f值为0.87，该值非常近似于实施例23的活性级分的R_f值。级分24-30及31-34与茚三酮有另一阳性反应R_f值为0.85。

实施例28

于体外检测了级分4-5、15-16和17-18的抗增殖效应(与实施例4一样)和TNF刺激作用(与实施例9一样)。结果示于下文：

级分检测活性

4-5 抗增殖效应 4.7单位/mg

4-5 TNF刺激作用 -15-16 抗增殖效应 4.5单位/mg15-16 TNF刺激作用 -17-18 抗增殖效应 3.9单位/mg17-18 TNF刺激作用 -

因此，级分4-5、15-16和17-18显示了抗增殖活性，但无TNF刺激作用活性。上述级分的初步分析显示其在NH₄Cl中较高，抑制了TNF产生。

实施例29

将级分15-16和24-30的样本透析，然后进行质谱分析，用实施例25中描述的方法。级分17-18和24-30的未透析样本也进行分析。对所产生光谱的回顾提示可能有下列化合物存在：甘氨胆酸、一种三聚己糖胺三聚物(trihexosamine)和牛磺胆酸(级分15-16)；硬脂酸及一种己糖胺二聚物；及甘氨胆酸(级分24-30)。

实施例30

按如下方法在分开的透析管中对组合物进行透析：

将100ml组合物置入分子量截流大小为100的Spectra/Por^C E膜管中。管的末端用夹子封住并将其置入不断搅动的10L蒸馏水浴中。每天通过从透析管中取1ml溶液并加入3-4滴1/10N硝酸银溶液对透析进行监测。氯化物的出现提示透析并不完全。如果透析不完全，用新鲜蒸馏水替换浴液。3-4天后透析完成。透析完后，将已透析物于旋转蒸发器上干燥产生每毫升原液获得0.3mg固体的结果。

将一份此固体物质的样品溶于HPLC级水中，并于浸入甲醇中10％浓缩氢氧化铵的硅胺板上进行TLC，并用茚三酮喷雾进行识别。于R_f为0.83处得到阳性反应。

实施例31

将一份自实施例30的固体用质谱进行分析，按实施例25中所描述的方法进行。对所得结果的回顾提示可能存在下列化合物：鞘氨醇-油酸轭合物、二乙酰唾液酸、岩藻糖己糖胺二聚物、脱氧甘氨胆酸、牛磺胆酸、唾液酸-岩藻糖二聚物及一种二(岩藻酸)己糖胺三聚物。

实施例32

以前的结果提示组合物的成分(至少是根据TNFα释放测定)在C₁₈μBondapack柱上的反相高效液相层析(RP-HPLC)后是在未结合级分(空隙体积)中存在的。且上柱于C₁₈μBondapack柱上之组合物提取物的大部分(质量的70％)在空隙体积中洗脱出。这些结果提示组合物的活性成分很可能具有很高的极性或双离子性分子。

为进一步检查以上结果，通过离子交换层析对活性成分进行纯化。如果存在带负电的活性成分(由其对肿瘤细胞而不是正常细胞的抗增殖效应以及其引起TNFα释放的活性测定)，它们将会结合到阴离子交换树脂上。实验方法

将10ml Virulizin提取物上柱于阴离子交换层析柱(Bio-RadAG-1，氢氧化物形式，总树脂湿体积为10ml，柱的大小为1.5cm6.0cm，以Millipore去离子水平衡)上。计算所用树脂的体积足以将提取物上所有阴离子结合。收集未结合的级分并再次上柱以最大程度地结合至树脂上。收集第二次流水的未结合级分并贮存。通过用去离子水(2×20ml)冲洗去除残留于层析柱空隙体积中的任何未结合物。用梯度NH₄HCO₃(20ml//每段)洗脱结合的分子。洗脱步骤为 0 M

0.1M

0.2M

0.3M

0.4M

0.5M

0.6M

1.0M

1.5M

实施例33

分别按实施例4和9的方法，分析实施例32的所有级分样品的抗增殖活性和TNF刺激活性。

结果显示于下文：

样品抗增殖活性引起TNFα释放的活性-LPS

(U/mg) (pg/ml)

0 M 0 35

0.1M 0 -79

0.2M 0 -76

0.3M 0

0.4M 2.5

0.5M 555.6

0.6M 0 107

1.0M 0 105

1.5M 0 189

活性测定的结果显示于0.6M、1.0M、1.5M级发中发现了TNF产生刺激活性。抗增殖活性在级分0.4M(较小活性)和0.5M(较大活性)中存在。

实施例34

对活性级分的薄层层析分析显示了几种成分的混合。按实施例25的质谱方法分析来自实施例32的1.0M级分的样品。对所产生的光谱进行的回顾提示可能有下列化合物：唾液酸-甘油二聚物，硫酸胆甾醇和牛磺胆酸。

实施例35

按实施例2的方法对组合物样品进行反相(C₁₈)HPLC分析，方法中有以下改动：(1)应用了Phenomenex WP 60009-C₁₈柱，250×4.6mm，(2)样品冻干，然后重新配于溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA)中，(3)将重新配成的样品150μl上柱。

收集洗脱液的不同级分，包括在将重新配成的样品上样后约2.40-3.40分钟时洗脱出的一份级分。

实施例36

按照实施例9的方法对实施例35中于约2.40-3.40分钟时洗脱出的级分样品进行了三次TNF刺激活性的分析。所得结果如下：测定号 TNF刺激作用-LPS

1 259pg/ml±107pg/ml

2 311pg/ml±14pg/ml

3 572pg/ml±176pg/ml

实施例37

如下文，将实施例35中于约2.40-3.40分钟时洗脱出的级分样品进行串联柱反相(C₁₈)HPLC。将实施例35的层析柱与Phenomenexprime-sphere HC-C₁₈柱串联，该柱为250×4.6mm。将样品冻干，然后重配于溶于水的0.1％TFA(缓冲液A)，再将150μl重配的样本加于柱上。用缓冲液A操作20分钟，然后用溶于乙腈的0.1％TFA(缓冲液B)之0-80％线性梯度操作35分钟。此期末期时，用80-0％缓冲液B操作5分钟。流速为0.9ml/min。在下述自注射时起大约的时间时收集6个洗脱级分。

级分号时间(分钟)

1 5.6-6.25

2 6.25-6.6

3 6.6-7.1

4 7.1-8.2

5 8.8-9.6

6 14.7-16

实施例38

将实施例37的级分1样品(“1”)和级分2样品(“2”)冻干并重新配制于214ppm NH₃·H₂O。然后按实施例4的方法分析这些样品的抗增殖作用。所得结果如下：

样品抗增殖作用

1 17.8单位/ml

2 0

实施例40

按实施例25的质谱法分析实施例37的6个级分样品。对这6个级分分析的光谱结果提示可能存在下列化合物：牛磺胆酸、唾液酸-甘油二聚物、NaCl、三甲胺、甲基乙胺以及丙胺。

实施例41

按实施例4的方法，对下列三个样品进行了抗增殖作用的检测：(1)溶于2.0ml水的10-11mg牛磺胆酸，(2)214ppm NH₃·H₂O；及(3)溶于4.0ml 214ppm NH₃·H₂O中的0.7mg牛磺胆酸。样本(1)和样本(2)均没有任何可测出的抗增殖作用。然而样本(3)有14单位/mg的抗增殖作用。

结果提示胆酸(如牛磺胆酸)与铵离子联合可在低于单独检测时各成分不显示出活性的浓度情况下显示出抗增殖活性。因此，将这两种成分联合起来可明显地协同影响抗增殖活性。

Claims

1.一种用作免疫调节剂的组合物，含有分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性：

a.可从动物的胆汁中提取；

b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；

c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；

d.含有不可测水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF或TNF-γ；

e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；

f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；及

g.不是内毒素。

2.如权利要求1中所要求的组合物，可从牛胆汁中提取，并能刺激人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子。

3.制备如权利要求1所述组合物的方法，包括(a)将动物胆汁与等体积醇混合，得到胆汁/醇溶液；(b)分离出醇溶性部分并分离基本上不含醇的溶液；(c)从溶液中除去胆汁色素，得到无色液体；(d)处理无色液体以基本除去任何残留的醇；(e)用醚提取无色液体；分离水相和(f)从水相中除去残留的醚。

4.如权利要求3所要求的方法，其中在步骤(e)之前将无色液体浓缩至胆汁/醇溶液体积的大约1/8，在步骤(f)之后将水相浓缩，使之为胆汁/乙醇溶液体积的1/10。

5.用于预防和治疗需要调节免疫应答之疾病和病理状态的药物组合物，含有如权利要求1所述的组合物和任意选择的一种药用可接受的稀释剂或载体。

6.如权利要求5所要求的药物组合物，用于预防和治疗需要刺激免疫应答之疾病和病理状态。

7.如权利要求5所要求的药物组合物，用于治疗感染性疾病和肿瘤。

8.刺激病人免疫系统的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求1的组合物。

9.权利要求1所要求的组合物在预防和治疗需要调节免疫应答之疾病和病理状态中的应用。

10.制备免疫调节剂组合物的方法，包括(a)将动物胆汁与水溶性溶剂混合，得到胆汁/溶剂溶液；(b)从胆汁/溶剂溶液中分离基本上不含溶剂的水溶液；(c)从基本上不含溶剂的溶液中除去胆汁色素，得到无色液体。

11.如权利要求10的方法，其中的水溶性溶剂是醇

12.如权利要求11的方法，其中的动物胆汁与等体积醇混合。

13.权利要求10的方法，进一步包括将无色液体浓缩至胆汁/溶剂溶液原始体积的大约1/8。

14.权利要求10的方法，进一步包括将无色液体浓缩至胆汁/溶剂溶液原始体积的大约1/10。

15.用作免疫调节剂的组合物，含有至少一种分子量小于约3000Da的成分，对人外周血单核细胞没有细胞毒性，并且至少具有下列特性之一：

(b)能够在体外或体内刺激单核细胞或巨噬细胞产生肿瘤坏死因子；或

(c)在恶生小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；并且，

其中所述成分不是内毒素：IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF或TNF-γ；

16.权利要求15的组合物，其中的组合物从动物胆汁中提取。

17.权利要求16的组合物，其中的组合物从牛胆汁中提取。

18.权利要求15的组合物，其中的组合物在不存在IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-γ的条件下可于体外或体内刺激肿瘤坏死因子的产生。

19.权利要求18的组合物，其中的组合物能够在人体中刺激肿瘤坏死因子的产生。

20.权利要求15的组合物，其中当所述组合物被干燥，获得固体残留物，并且将2克所述残留物溶于20ml以甲醇为溶剂的10％浓缩氢氧化铵溶液中，并在除去任何不溶物后，将其在甲醇柱中进行柱层析，该柱为5cm×12.5cm，含有102克的60A快速硅胶，并以10磅/英寸²的压力及11ml/分的流速用溶于甲醇中的10％浓缩氢氧化铵溶液进行层析操作，当总的层析柱洗脱液的体积达到约180-220ml，220-260ml或260-300ml之间时，所述成分从层析柱中以一个级分洗脱出来。

21.权利要求15的组合物，其中当10ml所述组合物在含有Bio-Rad AG-1氢氧化物形式树脂的柱中进行阴离子交换层析，且所述树脂的量足以基本上结合所述10ml组合物中存在的所有阴离子时，所述的成分被用缓冲液浓度为约0.5-1.5M的碳酸氢铵缓冲液的阶式梯度从柱中洗脱出。

22.权利要求21的组合物，其中所述的成分在大约1.0-1.5M的缓冲液浓度从柱中洗脱出。

23.权利要求22的组合物，其中所述的成分在大约1.5M的缓冲液浓度从柱中洗脱出。

24.权利要求15的组合物，其中当所述组合物被冻干并在以水为溶剂的0.1％TFA中重新配制，然后在Phenomenex WP60009-C₁₈柱中进行反相(C₁₈)HPLC，该柱大小为250×4.6mm，其中溶于水中的0.1％TFA第一缓冲液过柱约10分钟，然后是溶于乙腈中的0.1％TFA第二缓冲液的0-80％线性梯度过柱约55分钟，继而第二缓冲液的80％溶液过柱约5分钟，第二缓冲液的80％-0％的梯度过柱约5分钟，其中的流速为1ml/分，柱及缓冲液体积均不过量，在所述重配组合物上柱后，所述成分在约2.4-3.4分钟从柱中洗脱出。

25.权利要求15的组合物，其中所述的组合物在溶于水中的0.1％TFA第一缓冲液透析，然后在250×4.6mm Bio-Rad Hi-PoreRP 318(C₁₈)柱中进行反相(C₁₈)HPLC，其中第一缓冲液过柱约10分钟，然后溶于乙腈中的0.1％TFA第二缓冲液的0-80％线性梯度过柱约55分钟，继而第二缓冲液的80％溶液过柱约5分钟，第二缓冲液的80％-0％的梯度过柱约5分钟，其中的流速为1ml/分，柱及缓冲液体积均不过量，在所述透析过的组合物上柱后，所述成分在约2-21.4分钟或21.4-25.6分钟时从柱中洗脱出。

26.权利要求15的组合物，当所述组合物在浸于以甲醇为溶剂的10％浓缩氢氧化铵中的硅胶板上进行薄层层析并用茚三酮喷雾进行肉眼观察时，在R_f值约为0.80-0.90处出现与茚三酮的阳性反应。

27.在人体中刺激肿瘤坏死因子产生的方法，包括施用有效量的，含有至少一种下列化合物的组合物：

(a)下列通式的化合物

其中A-B、B-C和C-D间的键可以是单键或双键，且其中X＝H、OH₂＝O或OSO₃H；Y＝

其中R是一个氨基酸残基；

(b)下列通式的化合物：

(R¹O)CH₂CH(OR²)CH₂(OR³-X)或

其中R¹、R²、R³是H、COR⁴、CH＝CH-R⁵、X、P(O)(OH)O-或S(O)₂O-；

X是胆碱、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、丝氨酸、肌醇、含游离羟基的糖、氨基糖、磺化糖或唾液酸；

R⁴是具有约C₁-C₃₀碳链的饱和或不饱和烷基，或其氧化和羟基化的类似物；

R⁵是烷基或其氧化和羟基化的类似物；

(c)粘蛋白水解产物或蛋白多糖的水解产物；或

(d)脂溶性维生素。

28.权利要求27的方法，其中所述的组合物含有至少一种选自下列化合物的物质：牛磺胆酸及其硫酸化衍生物；甘氨胆酸及其硫酸化衍生物；鞘氨醇；二酰基甘油；卵磷脂；糖单位长度小于10的寡糖，其中所述寡糖由唾液酸、岩藻糖、己糖胺或硫酸化己糖胺组成；维生素A；视黄酸(retinoic acid)衍生物；视黄醇衍生物；牛磺酸和谷氨酸及其轭合物。

29.权利要求27的方法，其中所述组合物另外还含有至少一种选自下列的化合物的物质：氨、伯烷胺、仲烷胺、叔烷胺和羧酸R⁶CO₂H，其中R⁶是C₁-C₃₀烷基及其饱和或不饱和、氧化或羟基化衍生物。

30.权利要求29的方法，其中所述组合物含有至少一种选自下列化合物的物质：牛磺胆酸及其硫酸化衍生物；甘氨胆酸及其硫酸化衍生物；鞘氨醇；二酰基甘油；卵磷脂；糖单位长度小于10的寡糖，其中所述寡糖由唾液酸、岩藻糖、己糖胺或硫酸化己糖胺组成；维生素A；视黄酸衍生物；牛磺酸和谷氨酸及其轭合物。

31.用权利要求10、11、12、13或14的方法得到的组合物。

32.治疗胰腺癌的方法，包括给所述癌症患者施用治疗有效量的权利要求31的组合物。

33.治疗胰腺癌的方法，包括给所述癌症患者施用治疗有效量的权利要求15、20、21、24、25、27、28或29的组合物。

34.含有鞘氨醇或盐复合的鞘氨醇之微团的组合物，至少具有下列特性之一：

(a)能够在体外刺激单核细胞或巨噬细胞产生一种或多种细胞因子；

(b)能够在体外或体内刺激单核细胞和巨噬细胞产生肿瘤坏死因子；或

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。

35.含有视黄酸或其衍生物之微团的组合物，至少具有下列特性之一：

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。

36.权利要求34或35的组合物，其中的微团还含有二酰基甘油酯(diacyl glyceride)或卵磷脂。

37.权利要求34、35或36的组合物，进一步还含有胆汁酸盐和铵或烷基铵离子源。

38.含有鞘氨醇、胆汁酸盐和铵或烷基铵离子源的组合物，至少具有下列特性之一：

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。

39.含有胆汁酸盐、鞘氨醇、二酰基甘油、铵或烷基铵离子源和视黄酸衍生物的组合物，至少具有下列特性之一：

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。

40.含有二酰基甘油、卵磷脂和胆汁酸盐的组合物，至少具有下列特性之一：

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。

41.含有(1)二酰基甘油酯、(2)卵磷脂和(3)粘蛋白水解产物或蛋白多糖水解产物的组合物，至少具有下列特性之一：

(c)在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用。