CN101629951B - 一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开人胎盘组织液抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用的检测方法，其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。它是一种开创性的人胎盘组织液抗炎作用检测方法，它对人胎盘组织液抗炎药的研发与生产奠定了科学基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法。
背景技术
人们都知道人胎盘组织液具有抗炎作用，但是，具体多大浓度的人胎盘组织液才具有治疗效果，人们并不清楚，同时，目前人们还没有掌握人胎盘组织液抗炎作用的检测方法，这样，就影响了这种生物药品的研发和生产。因此，研究一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法。
本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。
所述的人胎盘组织试验液的配制步骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全培养液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液。
所述的hPBMC制备步骤，即在无菌条件下，预置10 ml Ficoll分离液于50 ml离心管中。取正常成人供者血液20 ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周血稀释，将60 ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30 ml Ficoll分离液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下， 2000 rpm离心20 min，小心收集界面单个核细胞层至50 ml离心管中，加入PBS至20 ml，1500 rpm离心10 min，洗涤2次，并作细胞计数，以完全培养基（RPMI1640+10% FBS+1%双抗）重悬细胞至2×106/ml。
所述的组织培养液与hPBMC共培养步骤，即50 μl hPBMC(2×106/ml) 和50 μl PHA混合接种于96孔平底板，然后向其中加入100 μl不同浓度的人胎盘组织试验液，每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种于96孔平底板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37 ℃，5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育72 h。所述的空白对照组为50 μl PHA与150 μl RPMI1640完全培养液的混合物，所述的阴性对照组为50 μl hPBMC(2×106/ml)与150 μl RPMI1640完全培养液的混合物，所述的阳性对照组为50 μl hPBMC(2×106/ml)、50 μl PHA和100 μl RPMI1640完全培养液的混合物。
所述的ELISA检测TNF-α及IFN-γ步骤，即将经72 h培养后的96孔板取出，1500 rpm离心10 min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0.5 ml EP管中，稀释，分别用人IFN-γ ELISA 试剂盒、人TNF-α ELISA 试剂盒检测IFN-γ及TNF-α含量。
所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20 μl上清，加入20 μl MTT，在细胞培养箱中继续培养4 h，1500 rpm离心10 min，吸弃培养液上清后每孔加入150 μl DMSO，微量振荡器振荡10 min后用酶标仪于599 nm检测。
所述的结果分析步骤，即采用SPSS13.0软件、GraphPad Prism 5 Demo软件进行统计学分析。
本发明的有益效果是;
本发明开创了一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，它对人胎盘组织液抗炎药的研发与生产奠定了科学基础。
本发明的目的：实验研究使用不同浓度的胎盘组织液，在体外对丝裂原激活人外周血单核细胞(hPBMC)增殖以及分泌炎症因子的抑制作用。
本发明的理论依据：使用不同浓度的人胎盘组织液，与丝裂原激活的hPBMC共培养，经37 ℃培养箱培养72 h后，用ELISA试剂盒检测各组IFN-γ、TNF-α的水平，用MTT法检测hPBLC增殖情况。
本发明试验的结果：在PHA的刺激作用下，hPBMC表达释放大量IFN-γ、TNF-α。然而，在不同浓度的人胎盘组织液中进行培养时，炎性因子的分泌均受到不同程度的抑制，并且在本试验范围内，人胎盘组织液对上述炎性因子分泌的抑制作用呈现良好的剂量相关性，其中，当人胎盘组织液浓度较高时，对IFN-γ、TNF-α炎性因子分泌的抑制率高达90%以上。MTT试验还发现，不同浓度的组织液也都具有抑制hPBMC增殖的作用(P<0.01)。
本发明实验的结论：人胎盘组织液可明显抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用，并且抑制作用与人胎盘组织液呈现良好的剂量相关性。
具体实施方式
一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。
所述的人胎盘组织试验液的配制步骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全培养液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液。
所述的hPBMC制备步骤，即在无菌条件下，预置10 ml Ficoll分离液于50 ml离心管中。取正常成人供者血液20 ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周血稀释，将60 ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30 ml Ficoll分离液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下， 2000 rpm离心20 min，小心收集界面单个核细胞层至50 ml离心管中，加入PBS至20 ml，1500 rpm离心10 min，洗涤2次，并作细胞计数，以完全培养基（RPMI1640+10% FBS+1%双抗）重悬细胞至2×106/ml。
所述的组织培养液与hPBMC共培养步骤，，即50 μl hPBMC(2×106/ml) 和50 μl PHA混合接种于96孔平底板，然后向其中加入100 μl不同浓度的人胎盘组织试验液，每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种于96孔平底板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37 ℃，5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育72 h，所述的空白对照组为50 μl PHA与150 μl RPMI1640完全培养液的混合物，所述的阴性对照组为50 μl hPBMC(2×106/ml)与150 μl RPMI1640完全培养液的混合物，所述的阳性对照组为50 μl hPBMC(2×106/ml)、50 μl PHA和100 μl RPMI1640完全培养液的混合物。
所述的ELISA检测TNF-α及IFN-γ步骤，即将经72 h培养后的96孔板取出，1500 rpm离心10 min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0.5 ml EP管中，稀释，分别用人IFN-γ ELISA 试剂盒、人TNF-α ELISA 试剂盒检测IFN-γ及TNF-α含量。
所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20 μl上清，加入20 μl MTT，在细胞培养箱中继续培养4 h，1500 rpm离心10 min，吸弃培养液上清后每孔加入150 μl DMSO，微量振荡器振荡10 min后用酶标仪于599 nm检测。
所述的结果分析步骤，即采用SPSS13.0软件、GraphPad Prism 5 Demo软件进行统计学分析。
Claims (2)
1.人胎盘组织液抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用的检测方法，其特征在于：其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③人胎盘组织试验液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析；所述的人胎盘组织试验液的配制步骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全培养液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液；所述的hPBMC制备步骤，即在无菌条件下，预置10mlFicoll分离液于50ml离心管中；取正常成人供者血液20ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周血稀释，将60ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30mlFicoll分离液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下，2000rpm离心20min，小心收集界面单个核细胞层至50ml离心管中，加入PBS至20ml，1500rpm离心10min，洗涤2次，并作细胞计数，以RPMI1640+10%FBS+1%双抗重悬细胞至2×106/ml；所述的人胎盘组织试验液与hPBMC共培养步骤，即50μlhPBMC和50μlPHA混合接种于96孔平底板，然后向其中加入100μl不同浓度的人胎盘组织试验液，每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种于96孔平底板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育72h；所述的空白对照组为50μlPHA与150μlRPMI1640完全培养液的混合物，所述的阴性对照组为50μlhPBMC与150μlRPMI1640完全培养液的混合物，所述的阳性对照组为50μlhPBMC、50μlPHA和100μlRPMI1640完全培养液的混合物；所述的ELISA检测TNF-α及IFN-γ步骤，即将经72h培养后的96孔板取出，1500rpm离心10min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0.5mlEP管中，稀释，分别用人IFN-γELISA试剂盒、人TNF-αELISA试剂盒检测IFN-γ及TNF-α含量；所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20μl上清，加入20μlMTT，在细胞培养箱中继续培养4h，1500rpm离心10min，吸弃培养液上清后每孔加入150μlDMSO，微量振荡器振荡10min后用酶标仪于599nm检测。
2.根据权利要求1所述的人胎盘组织液抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用的检测方法，其特征在于：所述的结果分析步骤，即采用SPSS13.0软件、GraphPadPrism5Demo软件进行统计学分析。
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