ES2207639T3 - Composiciones modulares inmunologicas a partir de las bilis. - Google Patents

Composiciones modulares inmunologicas a partir de las bilis.

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ES2207639T3 ES94926737T ES94926737T ES2207639T3 ES 2207639 T3 ES2207639 T3 ES 2207639T3 ES 94926737 T ES94926737 T ES 94926737T ES 94926737 T ES94926737 T ES 94926737T ES 2207639 T3 ES2207639 T3 ES 2207639T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION PARA USO COMO UN INMUNOREGULADOR QUE COMPRENDE COMPONENTES DE PESO MOLECULAR PEQUEÑO INFERIORES A 3000 DALTONS, Y QUE TIENEN LAS SIGUIENTES PROPIEDADES: A) SE PUEDE EXTRAER DE BILIS DE ANIMALES; B) ES CAPAZ DE ESTIMULAR MONOCITOS Y MACROFAGOS IN VITRO; C) ES CAPAZ DE REGULAR LA PRODUCCION DE FACTOR DE NECROSIS POR TUMOR; D) CONTIENE IL-1A, IL-1B, TFN, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF O IFNGAMMA NO MEDIBLES; E) TIENE UN EFECTO ANTI-PROLIFERATIVO EN UNA LINEA CELULAR DE HIBRIDOMA DE RATON MALIGNO; F) MUESTRA NO CITOTOXICIDAD A LAS CELULAS MONONUCLEARES SANGUINEAS PERIFERICAS HUMANAS; Y G) NO ES UNA ENDOTOXINA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN METODO DE PREPARACION DE LA COMPOSICION Y A SU USO COMO UN INMUNOREGULADOR.

Description

Composiciones moduladoras inmunológicas a partir de la bilis.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones moduladoras inmunológicas, agentes farmacéuticos que contienen las composiciones y con el uso de las composiciones y agentes en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de animales.
Antecedentes de la invención
Se están desarrollando continuamente terapias para la profilaxis y el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas, como el Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Algunas de estas terapias intentan usar terapéuticamente el sistema inmunológico. Un enfoque se basa en los elementos específicos del sistema inmunológico al antígeno, a saber los anticuerpos y linfocitos T. Por ejemplo, la investigación se ha enfocado a las vacunas en desarrollo contra los agentes foráneos, o contra ciertos mensajeros químicos endógenos. Como las interleuquinas, para suprimir las reacciones de anticuerpos. Un segundo enfoque se basa en el aislamiento, duplicación, expresión y producción de péptidos y proteínas de partes no antígenas específicas del sistema inmunológico. Por ejemplo, proteínas, como las citoquinas que comprenden las interleuquinas producidas por los glóbulos blancos de la sangre, e interferones, que estimulan los linfocitos y las células barredoras que digieren los antígenos foráneos, que brindan posibilidades terapéuticas.
El tratamiento de cáncer se podría mejorar grandemente si la contestación inmune temprana a un tumor se pudiera aumentar para que el tumor no alcance un tamaño crítico. Las estrategias que se han sugerido para aumentar la contestación inmune a un tumor incluyen vacunas específicas para los antígenos asociados a tumores; el uso de anticuerpos monoclonales contra los antígenos en la superficie de las células del tumor, como contra el receptor de la interleuquina-2, el uso de moléculas biespecíficas que contengan anticuerpos antitumorales y superantígenos.
Relativamente reciente, se ha estudiado el papel del polipéptido fisiológicamente activo, conocido como el factor de necrosis de tumor ("TNF", por las siglas de la expresión inglesa, Tumor Necrosis Factor), particularmente con respecto a su habilidad de inducir la necrosis de tumores sin tener efecto sobre los tejidos normales del cuerpo vivo. La secuencia de aminoácidos del TNF, así como la secuencia base del código DMA para el TNF se revela en la patente de los EE.UU. No. 4.879.226.
Debido a que el TNF se ha de mostrado que tiene un papel en la inducción de la necrosis de tumores, cualquier agente que pueda estimular la producción o accesibilidad biológica del TNF in vivo tiene utilidad potencial como tratamiento de varias condiciones tumorales. Adicionalmente, cualquier agente que pueda estimular monocitos y macrófagos humanos para liberar TNF in vitro será útil como un medio de mantener una fuente de TNF para administración terapéutica, así como para propósitos analíticos y de diagnóstico.
La bilis, que se secreta por el hígado y almacena en la vesícula, se ha investigado para diversos propósitos, incluso el uso de extractos de la bilis para mejorar la accesibilidad biológica de drogas que se metabolicen prontamente por la función normal del hígado (véase WO 90/12583) y para inhibir la promoción leucocitosis en un mamífero (véase Shinoda et al., Chem. Pharm. Bull., 30, 4429-4434 (1982)). Sin embargo, nunca se ha considerado que la bilis sea una fuente de terapéuticamente composiciones útiles con respecto a las enfermedades neoplásicas o infecciosas. Es interesante, de acuerdo con la Patente británica No. 337,797, que se sugería usar la propia vesícula como una fuente potencial de agentes anticanceroso, pero sólo después de que la bilis se hubiera retirado de la vesícula y la vesícula lavado completamente.
Sumario de la invención
Se ha descubierto ahora que la bilis es una fuente importante de una composición que puede estimular liberación y/o producción de TNF, tanto in vitro como in vivo y es eficaz en el tratamiento de varios carcinomas, especialmente pancreático del cáncer.
La composición de la bilis para uso en tratamientos se obtiene del extracto de bilis con un solvente soluble en, o miscible con, agua. El extracto que se obtuvo así se procesa adicionalmente para separar de éste los componentes innecesarios o indeseables.
El producto obtenido por el proceso descubierto de extracción de la bilis que se describe a continuación en mayor detalle se ha encontrado que tiene una actividad estimulante del TNF y se ha creído que tiene actividad anticancerígena, sobre todo contra los cánceres pancreáticos y otros. Obviamente, no necesariamente la composición total que se obtiene será necesaria para alcanzar dicha actividad. En consecuencia, es posible adicionalmente separar, fraccionar, o de otra forma procesar el producto así obtenido y todavía retener la actividad estimulante del TNT y anticancerosa deseada. Es más, se prevé que es posible obtener sintéticamente un producto con la misma o similar estimulación del TNF y actividad anticancerosa. Así, se prevé que los componentes de dicho producto se analicen respecto a sus componentes, o a su combinación, que sean responsables de la actividad deseada, y que se elabore un producto sintético, basado en dicho análisis.
En general, el presente descubrimiento se refiere a una composición para uso como un modulador inmunológico que comprenda componentes de peso molecular pequeños de menos que 3000 daltons y que tenga una o más de las siguientes propiedades:
a) que sea extraíble de la bilis de animales,
b) que sea capaz de estimular monocitos y macrófagos in vitro
c) que sea capaz de modular la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor;
d) que no contenga ningún nivel apreciable de IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF o IFN-gamma;
e) que tenga un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón;
f) que no muestre ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana; y
g) que no sea una endotoxina.
Más particularmente, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, una composición extraída a partir de la bilis, usando un disolvente soluble en, o miscible con, agua para su uso como modulador inmunológico, que comprende por lo menos un componente menor que aproximadamente 3000 daltons que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular in vitro monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y
en la que dicho componente no es una de las endotoxinas, IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8 GM-CSE o IFN-gamma.
De acuerdo con una realización preferente la composición se extrae de la bilis de bovinos y es capaz de estimular la liberación del factor de necrosis de tumor.
La composición de la invención puede ser preparada por (a) mezclando la bilis de un animal, preferentemente un bovino, con un disolvente soluble en, o miscible con, agua, preferentemente en alcohol, y preferentemente con igual volumen de alcohol, para producir una solución bilis/alcohol; (b) separando la solución que preferentemente es una fracción soluble en alcohol, y aislando de ella una solución esencialmente libre de alcohol, o eliminando la mayoría del alcohol, mediante o por el uso de calor; (c) eliminando los pigmentos biliares de la solución para obtener un líquido incoloro; (d) tratando opcionalmente el líquido incoloro para eliminar esencialmente cualquier alcohol residual; (e) eliminando los materiales orgánicos grasos, como extrayendo el líquido incoloro con éter y aislando la fase acuosa; y (f) eliminando opcionalmente el éter residual de la fase acuosa.
La composición se puede usar sin modificación adicional, simplemente envasándola en frascos y esterilizándola. La composición también se puede usar en una forma concentrada. Una forma concentrada preferente se prepara como sigue. Antes del paso (e) el líquido incoloro opcionalmente se puede concentrar a aproximadamente un octavo del volumen de la solución bilis/alcohol y después del paso (f) la fase acuosa se puede concentrar para que sea un décimo del volumen de la solución bilis/etanol.
La invención también se refiere a un agente farmacéutico que comprende la nueva composición de la invención.
La invención se refiere adicionalmente a una composición farmacéutica para tratar a un paciente administrando a dicho paciente la cantidad eficaz de dicha composición. La invención todavía se refiere adicionalmente a una composición farmacéutica de la invención para su uso en la profilaxis y tratamiento de enfermedades y condiciones que requieran modulación de la respuesta inmune; preferentemente las enfermedades infecciosas y neoplasias.
En varios aspectos adicionales, la invención proporciona el uso de por lo menos un componente, extraído de la bilis y que tiene un peso molecular menor que 3000 daltons, que no muestra ninguna citotoxicidad a las células mononucleares de sangre periférica humana, y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y en la que dicho componente no es una endotoxina, IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma, para la fabricación de un medicamento para estimular el sistema inmunológico de un paciente o para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad o condición que requieran modulación de la respuesta inmune.
c) es capaz de modular la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor en los humanos.
d) no contiene ningún nivel apreciable de IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF o IFN-gamma.
e) tiene un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón.
f) no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y
g) no es una endotoxina.
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
Descripción breve de los dibujos
Los detalles adicionales de la invención se describen a continuación con la ayuda de los ejemplos ilustrados en los dibujos acompañantes en los que:
La figura 1 es un perfil de HPLC para una composición concentrada de la invención.
La figura 2 es un perfil de HPLC para una composición concentrada de la invención.
La figura 3 es un perfil de HPLC para una composición concentrada de la invención.
La figura 4 es un perfil de HPLC para una composición de la invención.
La figura 5 es un perfil de HPLC para una composición de la invención.
La figura 6 es un perfil de HPLC para una composición de la invención.
La figura 7 es un perfil de HPLC para una composición de la invención.
La figura 8 es un gráfico que muestra el efecto de la composición sobre la liberación de TNF inducida por LPS a partir de PBMN.
La figura 9 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la composición sobre liberación de TNF inducida por LPS a partir de PBMN.
La figura 10 muestra el perfil de RP-HPLC C_{18} de una composición de la invención.
La figura 11 muestra el análisis por RP-HPLC de las fracciones precipitadas de la composición de la invención.
La figura 12 muestra el análisis por RP-HPLC de las fracciones solubles de la composición de la invención.
La figura 13 es un gráfico que muestra la supervivencia registrada desde el diagnostico de pacientes de cáncer pancreático tratados con la composición de la invención.
La figura 14 es un gráfico que muestra la supervivencia registrada desde el tratamiento de pacientes de cáncer pancreático tratados con la composición de la invención.
La figura 15 es un gráfico que muestra la supervivencia de todos los pacientes de melanoma tratados con la composición de la invención.
La figura 16 es un gráfico que muestra la supervivencia de pacientes de melanoma con dos o más sitios de tumor, tratados con la composición de la invención.
La figura 17 es un gráfico que muestra la supervivencia de pacientes de melanoma con tres o más sitios de tumor, tratados con la composición de la invención.
La figura 18 es un gráfico que muestra el perfil de RP-HPLC de la composición total de la invención.
La figura 19 es un gráfico que muestra el perfil de RP-HPLC de un precipitado de la composición de la invención.
La figura 20 es un gráfico que muestra el perfil de RP-HPLC de un sobrenadante de la composición de la invención.
La figura 21 es un SDS de gel de la composición de la invención.
La figura 22 muestra las condiciones y tiempos de elución de la composición de la invención en HPLC hidrófila (a) y el perfil de elución para un sobrenadante de la composición de la invención (b).
La figura 23 muestra la elución de un precipitado de la composición de la invención en HPLC hidrófila.
La figura 24 es un gráfico que muestra la respuesta de dosis de la composición de la invención en la estimulación de la función monocito de sangre periférica. y
La figura 25 es una fotografía de un melanoma maligno antes (25a) y después (25b) del tratamiento con la composición de la invención.
Descripción detallada de la invención
Como se mencionó anteriormente, el presente descubrimiento se refiere a una composición para su uso como modulador inmunológico que comprende componentes de peso molecular pequeño menores que 3000 daltons, y que tiene por lo menos una o más de las siguientes propiedades:
a) es extraíble de la bilis de animales.
b) es capaz de estimular in vitro monocitos y macrófagos.
c) es capaz de modular la producción del factor de necrosis de tumor.
d) no contiene ningún nivel apreciable de IL-1\alpha IL-1\beta, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF o IFN-gamma.
e) tiene un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón.
f) no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y
g) no es una endotoxina.
También como previamente se mencionó, la invención reivindicada se lleva a cabo, en un primer aspecto, a una composición extraída de la bilis, usando un disolvente soluble en, o miscible con, agua para su uso como modulador inmunológico, que comprende por lo menos un componente menor que aproximadamente 3000 daltons que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y que tienen por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y en que dicho componente no es una endotoxina, IL-1\alpha, IL-1\beta, TN F, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma.
Más particularmente, las investigaciones han mostrado que por lo menos algunas de las composiciones de la invención estimularán a los monocitos normales para efectuar citotoxicidad hacia la línea celular del hepatoma de Chang, que se usa para medir la toxicidad del monocito. Monocitos y macrófagos de pacientes de cáncer (cáncer cervical y ovárico) también se ha informado que son estimulados por la composición para atacar y destruir sus propias células tumorales particulares.
Ciertas composiciones de la invención pueden modular la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor en los humanos (TNF). Una composición preferente de la invención aislada a partir de la bilis de bovinos, promueve la liberación del TNF de las células mononucleares de sangre periférica humana en lo que parecen ser las cantidades fisiológicas. Porque el TNF se conoce por comenzar una cascada de efectos inflamatorios y antitumorales de la citoquina, la composición preferente podría ejercer su efecto antineoplásico estimulando los leucocitos humanos a liberar TNF (y posiblemente otras citoquinas). En consecuencia, la presente invención también puede mejorar la citotoxicidad de linfocitos y macrófagos hacia las células tumorales.
También se han encontrado que ciertas composiciones de la invención inhiben el crecimiento de células de la línea celular Nº 6-1 del hibridoma del ratón. El efecto inhibitorio de la composición en las células del hibridoma del ratón hace pensar en actividad antiproliferativa.
También se examinó el efecto de la composición de la invención en la supervivencia de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMN, por las siglas de su expresión inglesa, Human Peripheral Blood Mononuclear Cells). La composición se encontró que no era citotóxica a PBMN humana.
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Como adicionalmente se ejemplifica a continuación, la composición de la presente invención puede tener entre otros, las siguientes características:
1) El componente o componentes, responsables de la liberación de TNF a partir de PBMN, eluye inicialmente de una columna RP-HPLC C_{18}.
2) El (los) componente(s) de la liberación de TNF es (son) precipitado(s), en parte, por cianometano al 80%.
3) El material no precipitado por el cianometano al 80% retiene alguna actividad de liberación de TNF.
4) La actividad de liberación de TNF en ambas fracciones, el precipitado de cianometano al 80% y el sobrenadante que eluyen inicialmente, al mismo tiempo, en la RP-HPLC (por las siglas de su expresión inglesa, Reverse Phase High Pressure Liquid Chhromatograpy). Los resultados sugieren que los componentes activos de la liberación de TNF en la composición pertenecen a la misma familia molecular, con quizás algunas sutiles diferencias moleculares que respondan por las diferencias en solubilidad.
5) La composición provoca la liberación de interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y el componente responsable de la liberación de IL-1\beta eluye tempranamente de RP-HPLC, sugiriendo que ésta sea probablemente la(s) misma(s) sustancia(s) que libera(n)el TNF.
6) La composición también provoca la liberación de cantidades bajas de interleuquina-2 (IL-2).
7) La composición provoca la liberación del factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF); la fracción precipitada con cianometano al 80% es más activa que la fracción sobrenadante.
8) La relación de liberación de TNF a GM-CSF es de aproximadamente 2:1.
9) La fracción precipitada con cianometano al 80% contiene componente(s) que liberan aproximadamente 3 veces más TNF y GM-CSF que los componente(s) en la fracción sobrenadante.
10) El análisis de las mencionadas fracciones, precipitada y sobrenadante, separadas por RP-HPLC muestran que la actividad liberadora de TNF, IL-1 R y GM-CSF eluye inicialmente para ambas, precipitado y el sobrenadante. Sin embargo, en el sobrenadante alguna actividad de IL-1\beta eluye tarde.
11) Es probable que la(s) misma(s) molécula(s), es decir, el(s) componente(s), en la composición sean responsables de liberar TNF, IL-1\beta y GM-CSF. Es posible que la composición actúe para estimular la liberación de múltiples citoquinas diferentes, o alternativamente, la composición activa la producción y liberación de una citoquina que a su vez estimula la producción y liberación de otras citoquinas.
12) El análisis fisicoquímico de la composición, incluso de los precipitados y sus sobrenadantes, por electroforesis de gel SDS y HPLC de tamiz molecular indican que los componentes principales son menores que 2500 daltons.
13) La separación fisicoquímica adicional por HPLC de tamiz molecular hidrofílico (polihidroxietilo) confirma el peso molecular pequeño de los componentes de la composición.
14) Los análisis de aminoácidos antes y después de la hidrólisis ácida hacen pensar en la presencia de enlaces peptídicos, indicando la presencia de péptido.
15) El contenido de aminoácido de la fracción activa de RP-HPLC muestra niveles altos de glutamato/glutamina y glicina. Además, se descubrieron residuos de asparigina, treonina, serina y alanina.
16) Hay algunos residuos positivos no identificados de nihidrina que son probablemente aminoácidos libres.
Como se mencionó antes, la composición de la invención se puede preparar:
(a) mezclando la bilis de un animal, preferentemente un bovino, con un volumen igual de un alcohol para producir una solución bilis/alcohol.
(b) separando la fracción soluble en alcohol y aislando una solución esencialmente libre de alcohol.
(c) eliminando los pigmentos biliares de la solución para obtener un líquido incoloro.
(d) tratando el líquido incoloro para eliminar esencialmente cualquier alcohol residual.
(e) extrayendo el líquido incoloro con éter y aislando la fase acuosa, y
(f) eliminando el éter residual de la fase acuosa.
La composición se obtiene a partir de la bilis de cualquier animal que produce bilis, preferentemente animales no humanos. Ya que la composición puede proporcionar una diferente actividad hacia una enfermedad específica si se obtiene a partir de la bilis de unas especies en lugar de otras, una fuente generalmente conveniente de bilis es la que se toma de bovinos, ovinos y cerdos. En la mayoría de los casos, es práctico obtener la bilis de animales saludables sacrificados para la alimentación, como bovinos, ovinos y cerdos, para uso en la preparación de la composición de la invención. La bilis así coleccionada debe venir directamente de las vesículas de los animales matados y debe estar esencialmente clara, indicando asimismo que la preparación de la bilis tiene un contenido de mucosa bajo y está esencialmente libre de pus o sangre.
En una realización preferente del método, se utiliza la bilis de fuentes bovinas. La bilis bovina es abundante, ya que, en parte, de cada animal se pueden extraer cantidades relativamente grandes. Es más, los bovinos rutinariamente se matan y se inspeccionan bajo regulaciones de salud normadas, así tales animales constituyen una fuente fiable para preparar la composición de la invención. Además, los humanos con menor probabilidad tendrían una reacción alérgica al material de origen bovino.
La bilis se puede mezclar con un volumen igual de un alcohol para producir una solución bilis/alcohol que es 50% alcohol. El alcohol puede ser un alcohol alifático, preferentemente metanol, etanol, o alcohol propílico, más preferentemente es el etanol.
Por centrifugación se puede aislar una solución esencialmente libre de material insoluble en alcohol al 50%. Preferentemente, la mezcla bilis/alcohol se centrifuga a 3000-5000 RPM, lo más preferentemente a 4200 RPM, durante por lo menos 2 horas, a aproximadamente 15-25ºC. El alcohol contenido en la fracción bilis/alcohol-soluble se puede luego eliminar aprovechando la diferente volatilidad del alcohol y el agua, usando métodos convencionales; es decir, calentando la fracción a una temperatura conveniente, por ejemplo, 80-85ºC, durante una cantidad conveniente de tiempo, por ejemplo, aproximadamente 10 horas.
Se pueden eliminar los pigmentos biliares de la solución para obtener un líquido incoloro usando carbón activado, poliamida microgranulada, o por filtración. Preferentemente, se utiliza el tratamiento con carbón activado. El procedimiento puede repetirse para que la solución satisfaga las normas de densidad óptica y conductibilidad.
El líquido incoloro se puede tratar para eliminar esencialmente cualquier alcohol residual, usando métodos convencionales. Preferentemente el líquido incoloro se filtra usando un filtro que tenga una retención entre 1,0-3,5 \mum, más preferentemente una retención de 2,5 \mum.
El líquido incoloro se extrae luego con éter y se aísla la fase acuosa. El éter usado en este paso es preferentemente éter dimetílico, éter etílico, éter n-propílico, éter isopropílico, o éter n-butílico, más preferentemente, éter etílico.
El éter residual se puede eliminar de la fase acuosa, por ejemplo, calentando la solución a 55ºC, preferentemente aproximadamente a 40ºC durante aproximadamente 5-15 horas, más preferentemente, durante aproximadamente 10 horas.
La composición se puede usar simplemente sin modificación adicional, envasándola en frascos y esterilizando. La composición también se puede usar en forma concentrada. Una forma concentrada preferente se ha preparado como sigue. Antes del paso (e) descrito anteriormente, el líquido incoloro se puede concentrar opcionalmente a aproximadamente un octavo del volumen de la solución bilis/alcohol, por ejemplo, calentando a una temperatura menor que aproximadamente 85ºC, preferentemente, a aproximadamente 60º-70ºC. Después del paso (f), la fase acuosa se puede concentrar para que sea un décimo del volumen de la solución bilis/etanol, por ejemplo, calentando a aproximadamente 80-85ºC.
En un método preferente para preparar una composición de la invención, la bilis reunida se mezcla con un volumen igual de alcohol etílico. La mezcla bilis/alcohol se centrifuga entonces a aproximadamente 4200 RPM durante por lo menos 2 1/2 horas, a aproximadamente 20 \pm2ºC. El líquido sobrenadante se decanta y se verifica el pH y volumen de etanol. Los pigmentos biliares son luego eliminados usando carbón activado. Luego se determina la densidad óptica (O.D., por las siglas de su expresión inglesa, Optical Density) y la conductibilidad de la solución tratada bilis/etanol. Los niveles de la O.D. o los niveles de conductibilidad fuera de especificaciones aceptables requerirán que la solución bilis/etanol se trate adicionalmente para eliminar el pigmento biliar, por ejemplo de nuevo tratándola con carbón activado para lograr una lectura dentro de los límites de la especificación.
Seguido del tratamiento con carbón activado, la solución se filtra a través de un filtro que tenga una retención de 2,5 \mum, el alcohol se evapora calentando a menos de 85ºC y la solución se concentra a aproximadamente un octavo del volumen de la solución bilis/etanol original. La solución concentrada se refresca entre aproximadamente 20-25ºC. Esta solución luego se mezcla con éter etílico y la fase de éter se descarta. Preferentemente, se usan volúmenes relativamente pequeños de éter y agitación fuerte, como 0,1 a 1 de volumen, preferentemente de 0,2 a 0,5. Este paso se puede repetir una vez. La fase acuosa se calienta para eliminar el éter residual calentando a 55ºC durante aproximadamente 10 horas, y adicionalmente se reduce el volumen a un décimo del volumen bilis/etanol original, calentando a aproximadamente 80-85ºC. A esta solución se le determinan entonces la apariencia, actividad biológica, y volúmenes de etanol y
éter.
El pH de la composición se puede ajustar al pH fisiológico, es decir a 7,4-7,5, usando solución (al 1%) de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio (al 1%); y se puede obtener una solución tampón usando como tampones las sales monobásicas y dibásica del fosfato de sodio, mediante métodos convencionales.
La composición se puede usar sin modificación adicional, simplemente envasándola en frascos y esterilizando. Un método de esterilización preferente es someter la composición a tres ciclos de esterilizaciones en autoclave, seguidos por incubación.
La composición se puede usar en forma concentrada. La preparación de la forma concentrada se describió anteriormente. La composición también se puede liofilizar.
La composición y la composición concentrada son soluciones claras, incoloras o amarillentas, esencialmente libres de materia extraña, conteniendo no más de 10 ppm de etanol y no más de 5 ppm de éter. En el ensayo biológico descrito en el Ejemplo 4, la composición se ha mostrado para provocar el crecimiento no proliferativo a aproximadamente 18 unidades por ml.
Las composiciones de la invención se pueden producir en una forma constantemente reproducible usando el método, generalmente como se describió anteriormente con identidad, potencia y pureza demostradas de lote a lote. La identidad y pureza se determinan usando cromatografía líquida de alta presión y fase reversa (RP-HPLC), véase el Ejemplo 1. Las composiciones de la invención tienen un patrón reproducible en forma constante en HPLC en fase reversa, en el que pronto se ven los picos en la fracción de exclusión a aproximadamente 27 y 32 minutos. Antes de, entre y después de los picos altos, hay picos menores que varían en intensidad. Las lecturas de HPLC para tres lotes de la composición concentrada de la invención se muestran en las figuras 1 a 3. Los perfiles de RP-HPLC para los lotes B0211 (figura 4), B0209 (figura 5), B29/3006 (figura 6) y B15/1606 (figura 7), también muestran un patrón muy reproducible. Las composiciones también despliegan crecimiento no proliferativo de aproximadamente 18 unidades por ml en el ensayo biológico descrito en el Ejemplo 4. Las composiciones también se pueden caracterizar por las propiedades mencionadas anteriormente, por ejemplo su habilidad para estimular in vitro monocitos y macrófagos, etc.,
Compuestos probablemente presentes en la composición, considerado la fuente, incluyen ácidos biliares sulfonados, ácidos biliares oxidados, otros ácidos biliares de origen natural, y sus aminoácidos conjugados (sobre todo glicina y taurina) y esteroles. De acuerdo con esto, se cree que la presente composición incluye por lo menos un compuesto que tiene la fórmula:
1
en la que la molécula puede o no ser totalmente saturada, de forma que, por ejemplo, el enlace entre A y B, b y C, o C y D pueden ser enlaces simples o dobles, y en la que X es H, OH, =O, o OSO_{3} H; e Y es
2
y en la que R es un residuo de aminoácido, como, por ejemplo, glicilo, glutamilo o taurilo, que por eso forman glicina o taurina conjugada.
En particular, la composición de la presente invención se ha analizado acerca de sus compuestos componentes, incluyendo los componentes orgánicos e inorgánicos. Tal información se obtuvo usando los métodos estándares del análisis químico, incluso la espectroscopía de masas (MS, por las siglas de su expresión inglesa, Mass Spectroscopy). Los resultados de tales estudios incluyen, por ejemplo, la identificación de compuestos de ácidos biliares específicos que se pensó estarían presentes, incluso el ácido cólico, ácido glicocólico, ácido desoxiglicocólico, ácido ursodesoxicólico, sulfato de colesterol, ácido desoxicólico, ácido del quenodesoxicólico y ácido taurocólico.
De la MS no es discernible si la pérdida de OH y H_{2} de algunos compuestos está ocurriendo en la MS, o si los desoxi-, didesoxi- y análogos no saturados de tales compuestos están también presentes al comienzo. Estos compuestos pueden todos estar presentes como sales de amonio, alquilamonio y cationes inorgánicos.
El análisis por MS también apoya la identificación en la presente composición de fosfolípidos, esfingolípidos y agentes relacionados, capaces de formar las micelas. Compuestos específicos que se piensa estén presentes incluyen:
Ácido esteárico CH_{3}(CH_{2})_{16}COOH,
Ácido palmítico CH_{3}(CH_{2})_{14}COOH
Ácido oleico Z-9 ácido octadecanoico: H_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}CH=CHCH_{2}(CH_{2})_{6}COOH
Ácidos grasos oxidados o hidroxilados/insaturados de cadena corta: C_{6}H_{8}O_{3} (por ejemplo, CH_{3}CH=CHCOCH_{2}
COOH o un ácido de C_{6} con 2 enlaces dobles y un hidróxido)
Ácido acético
Diglicérido del ácido esteárico
Diglicérido del ácido palmítico
Ácido esteárico, diglicérido del ácido palmítico monoglicérido-ácido esteárico-fosfocolina (una lisolecitina)
Monoglicérido del ácido esteárico
Triglicérido del ácido esteárico
Monoglicérido del ácido palmítico
Fosfocolina
Fosfoserina
Fosfoesfingosina del ácido esteárico-esfingosina
Esfingosina
Amida del ácido esteárico
Metilamida del ácido esteárico
Amida del ácido palmítico
Lecitina
Glicerol dímero del ácido siálico
Además, la HPLC preliminar y la titulación evidencian que se han obtenido, lo que demuestra que los ácidos grasos de cadena más corta también están presentes.
Fosfolípido; esfingolípido, y los compuestos relacionados, productos de la hidrólisis, probablemente están presentes considerando la fuente y la información derivada del MS y los análisis por HPLC, incluido un compuesto que por lo menos tenga la fórmula
3
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3} son diferentes o los mismos y son H, COR_{4}, CH=CH-R_{5}, X, -P(O)(OH)O-, o –S(O)_{2}o-; X es seleccionado del grupo que consta en colina, etanolamina, etanolaminas N-alquiladas, serina, inositol, azúcares portando hidroxilos libres, amino-azúcares, azúcares sulfonados; y ácidos siálicos; R^{4} es un grupo alquilo entre C_{1}-C_{30} saturado o no saturado, oxidado o hidroxilado; y R^{5} es un grupo alquilo, u oxidado y/o sus análogos hidroxilados.
Los ácidos grasos y sus conjugados pueden estar presentes como sales en el extracto acuoso mencionado. La solubilidad de tales compuestos también es mejorada por otros componentes de la mezcla. Las amidas de los ácidos carboxílicos incluidos, RCONR' R^{2}, en las que R' y R^{2} son el mismo o diferente y son H o alquilo, cree que también se están presentes.
Una tercera clase de compuestos, a saber, las mucinas y productos de la hidrólisis de proteoglicanos, también es probable que estén presentes, considerado la fuente de la composición y su análisis mencionado por MS. Tales compuestos incluyen productos de la hidrólisis de mucoproteínas biliares y de la pared de la vesícula, como: 4- y 6-sulfatos de condroitín, sulfato de dermatan, heparina, sulfato de heparina, ácido hialurónico y los productos de la hidrólisis (los monómeros, dímeros, oligómeros y polímeros) de estas mucinas. La quitina y otras mucinas pueden ser semejantemente hidrolizadas y los productos de la hidrólisis incluirían:
N-acetilo-D-glucosamina, 4-sulfato-N-acetilo-D-glucosamina, 6-sulfato de galactosa, 6-sulfato de N-acetilo-D-glucosamina, 6-sulfato de glucosamina, 2-sulfato de D-glucosamina, 2,3-disulfato de D-glucosamina, 6-sulfato de D-galactosa, 2-sulfato del ácido glucurónico, ácido N-acetilneuramínico, ácido siálico, N-acetilo de condrosina, 4-sulfato de condroitina, 6-sulfato de condroitina, D-glucosamina, D-galactosamina, ácido glucurónico, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, ácido del idurónico, hexosa, hexosamina, sulfato de éster, ácido glucurónico, galactosamina, 2-amino-2-deoxi-D-galactosa, serina, prolina, treonina, taurina, glicina, alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina y péptidos pequeños.
Productos similares serían obtenidos por la hidrólisis de mucinas como sulfatos de queratina, sulfatos de dermatan, uniones naturales azúcar-azúcar en dímeros, oligómeros y polímeros pueden ser reemplazados por los puentes -O-Si(OH)_{2}-O- entre los monómeros de azúcar o cadenas de azúcares adyacentes.
En particular, las mucinas específicas y los compuestos producto de la hidrólisis de los proteoglicanos que se piensa están presentes incluyen:
Ácidos siálicos y sus monómeros mono y diacetilado, y glicosilados.
Ácido N-acetilneuramínico.
Hexosaminas.
L-fucosa.
Disulfato (dímero) de hexosamina-ácido hexurónico.
Ácido glucurónico o disulfato del ácido idurónico, monoacetilado.
Ácido siálico-glicerol (dímero); y
Dímeros, trímeros, oligómeros y polímeros de los monómeros anteriores en las formas acetilada y sulfatada.
Una cuarta clase de compuestos, a saber las vitaminas liposolubles, que probablemente estén presentes considerando la fuente y el análisis por MS mencionado, incluyen las vitaminas A, D, y K (por ejemplo, D1; D3; D4; K1, K2, K5, K6, K7, K-S(II), y la acetato de vitamina E, por ejemplo.
En particular, compuestos específicos vitaminas liposolubles que se piensa estén presentes incluyen por lo menos uno del grupo que consta en Vitamina A2, Vitamina D1, Lumisterol (presente a partir de su complejo de vitamina D1), Vitamina E, óxido de Vitamina K1, y Vitamina K5.
Es probable que varios compuestos orgánicos misceláneos estén presentes, considerado la fuente y el mencionado análisis por MS. Tales compuestos incluyen:
Bilirrubina, y su gluconúrido conjugado; biliverdina, y su gluconúrido conjugado; trazas de esteroides; otros solutos del plasma, como azúcares, purinas y pirimidinas; lípidos dietéticos misceláneos; y glutationa y productos de su hidrólisis.
En particular, compuestos orgánicos misceláneos específicos que se cree están presentes en la composición incluyen uno por lo menos del grupo que consta de urea, metil-amina; di-metil-amina, etil-amina, metil-etil-amina, di-etil-amina, di-propil-amina, butil-etil-amina, amoníaco, colina, taurina, ácido glutámico, glicina, alanina, p-ser, p-eu, p-ea, asp, tr, ser, sar, a-aba, cit, val, ile, leu, B-ala, G-aba, OH-lis, orn, lis, butil-hidroxi-tolueno (BHT) y polietilenglicol.
Aminas presentes en la presente composición, particularmente las aminas secundarias, pueden incluir óxidos de nitrógeno provenientes del aire, que forman compuestos nitrosos. También pueden ser incluidos los subproductos N-óxidos y N-carbamatos. Deben extenderse estas series de aminas citadas para incluir todas alquil-aminas primarias, secundarias y terciarias.
Se han identificado y cuantificado ciertos elementos inorgánicos (mg/I) como sigue:
Tungsteno 0,07, Cinc 0,666, Fósforo 378, Cadmio 0,01, Cobalto 0,008, Níquel 0,022, Bario 0,032, Hierro 0,022, Manganeso 0,039, Cromo 0,060, Magnesio 7,46, Aluminio 0,136, Calcio 5,97, Cobre 0,087, Titanio 0,01, Estroncio 0,060, Sodio 9600, Potasio 483, Cloruro 15400, Amoníaco 218, Vanadio 1 ppm.
Las composiciones de la invención tienen valiosas propiedades farmacológicas. En particular, las composiciones de la invención pueden afectar la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor. Las composiciones se han mostrado que no provocan ninguna toxicidad significativa y sólo efectos colaterales adversos transitorios (por ejemplo, fiebre ligera, polidipsia, dolor en el sitio de inyección). Se ha encontrado también que no contienen ningún componente perceptible de materia de peso molecular alto (es decir, sobre aproximadamente 5,000 daltons) que puedan provocar reacciones inmunológicas perjudiciales. Las composiciones pueden usarse como agentes para la profilaxis y el tratamiento de condiciones que requieran modificación de la respuesta inmune, en particular las enfermedades infecciosas, neoplasias, y enfermedades autoinmunológicas. Ellas pueden ser especialmente útiles en el tratamiento de varias formas de neoplasia, como las leucemias, linfomas, melanomas, adenomas, sarcomas, y carcinomas. En particular, la composición puede ser útil para tratar el melanoma maligno, cáncer pancreático, cáncer cérvico-uterino, cáncer del riñón, estómago, pulmón, recto, mama, intestino, gástrico, hígado, tiroides, cuello, cervical, glándula salival, pierna, lengua, labios, conducto hepático, pelvis, mediastino, uretra, bronquios, vejiga, esófago, colon, y Sarcoma de Kaposi, que es una forma de cáncer asociado en los pacientes Infectados con HIV con el Síndrome de Deficiencia Inmune Adquirida (SIDA). La composición también puede usarse para otras condiciones antiproliferativas, como las arteriosclerosis e infecciones virales, en particular el SIDA. También puede usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, incluso esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, miastenia grave, Enfermedad de Addison, anemia hemolítica autoinmunológica, enfermedad de Crohn, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Tumbas, tiroiditis de Hashimoto, trombocitopenia púrpura idiopática, anemia perniciosa, glomerulonefritis postestreptocóccica, soriasis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, infertilidad espontánea, y el pénfigo vulgar.
Las composiciones de la invención pueden convertirse en agentes farmacéuticos usando métodos convencionales. Los agentes farmacéuticos contienen la composición de la invención sola o junto con otras sustancias activas. Tales agentes farmacéuticos pueden ser de uso oral, tópico, rectal, parenteral, local, inhalante o intracerebral. Están por consiguiente en forma sólida o semisólida, por ejemplo píldoras, tabletas, cremas, cápsulas de gelatina, cápsulas, supositorios, cápsulas de gelatina suave, geles, membranas, y extrudados. Para usos parenteral e intracerebral, pueden usarse formas para la administración intramuscular o subcutánea, o formas para la infusión o inyección intravenosa o intracerebral, y pueden prepararse por consiguiente como soluciones de las composiciones o como polvos de las composiciones activas para ser mezclados con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, convenientes para los usos mencionados y con una osmolaridad que sea compatible con los fluidos fisiológicos. Para uso local, pueden ser consideradas esas preparaciones en forma de cremas o ungüentos para uso externo o en forma de sprays; para uso por inhalación, se pueden considerar preparaciones en forma de sprays, por ejemplo sprays nasales. Preferentemente, la composición se administra intramuscularmente.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse per se mediante los métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que puedan administrarse a los pacientes, y tales que una cantidad eficaz del producto activo se combine en una mezcla con un vehículo aceptable farmacéuticamente. Por ejemplo, se describen los vehículos convenientes en Remington's Pharmaceutical Sciences (Nack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985).
En estas bases, los agentes farmacéuticos incluyen, aunque no exclusivamente, la composición de la invención opcionalmente en asociación con uno o más vehículos o diluyentes aceptables farmacéuticamente, y pueden contenerse en soluciones tampones con un pH conveniente e isoosmóticas con fluidos fisiológicos.
Las composiciones se indican como agentes terapéuticos solos o junto con otros agentes terapéuticos u otras formas de tratamiento. Por ejemplo, en el caso de un tumor maligno, el presente tratamiento puede dar un tumor conveniente para la eliminación quirúrgica que no era previamente operable. Se proponen las composiciones y agentes de la invención para la administración a humanos o animales.
En general, se establece un intervalo de dosificación diaria de la composición para la administración en medicina humana de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente pueden emplearse 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal. En el caso de administración intravenosa, la dosificación diaria es aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, y en el caso de administración oral la dosificación diaria es aproximadamente de 1 a 5 mg/kg de peso corporal. Cuando se usa la composición concentrada, pueden usarse aproximadamente la mitad de las dosificaciones antedichas. Por ejemplo, para la administración intramuscular, una dosificación diaria de aproximadamente 0,2 a 1,0 mg/kg de peso corporal, preferentemente diariamente pueden usarse 0,275-0,75 mg/kg de peso corporal.
Se apreciará por practicantes médicos que puede ser necesario desviarse de las cantidades mencionadas y, en particular, hacerlas una función del peso corporal y la condición del animal a ser tratado, la enfermedad particular a ser tratada, la naturaleza de la ruta de administración y la terapia deseada. Además, el tipo de animal y su comportamiento individual hacia la medicina o la naturaleza de su formulación y el tiempo o intervalo al que se administra también pueden indicar el uso de cantidades diferentes de aquellas mencionados. Así puede bastarle, en algunos casos, manejar cantidades menores que las mínimas antedichas aunque en otros casos el límite superior mencionado deba excederse. Cuando se administran cantidades mayores, puede ser aconsejable dividir éstas en varias administraciones a lo largo del curso del día.
Así, la presente invención comprende un proceso para preparar una composición modulador inmunológico que comprende (a) mezclar la bilis de un animal con un disolvente soluble en agua para producir una solución bilis/disolvente; (b) aislar una solución acuosa esencialmente libre del disolvente de la solución bilis/disolvente; y (c) eliminar los pigmentos biliares de la solución esencialmente sin disolvente para obtener un líquido incoloro, preferentemente en la que el disolvente soluble en agua es un alcohol, y en la que la bilis del animal es mezclada con un volumen igual del alcohol. Los aspectos preferentes del proceso mencionado también comprenden adicionalmente la concentración del líquido incoloro a aproximadamente un octavo, o un décimo, del volumen original de la solución bilis/disolvente. Obviamente, las composiciones producidas vía el proceso anterior forman un aspecto preferente de la invención.
La presente invención también comprende una composición para uso como modulador inmunológico, que comprende un componente que tiene un peso molecular menor que aproximadamente 3000 daltons que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro (y opcionalmente in vivo) para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y
en la que dicho componente no es una endotoxina, IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma.
La composición puede tener un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón. Pueden obtenerse tales composiciones de la bilis de animales, preferentemente bovinos, o de otras fuentes, en una realización preferente de la composición, la composición estimula la producción in vitro o in vivo del factor de necrosis de tumor, y más preferentemente en los humanos, en ausencia de exógenos IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, e IFN-gamma.
Las composiciones de la presente invención también tienen componentes que pueden caracterizarse por cromatografía en columna tal, que cuando dicha composición se seca para obtener un residuo sólido, y se disuelven 2 gramos de dicho residuo en 20 ml de una solución al 10% de hidróxido de amonio concentrado en metanol, y después de que cualquier material insoluble se elimina, se somete a cromatografía en columna en una columna de metanol con dimensiones de 5 cm. x 12,5 cm., y que contiene 102 g de silicagel flash 60 A, y se opera a una presión de 10 p.s.i y a una tasa de flujo de 11 ml/min con una solución al 10% de hidróxido de amonio concentrado disuelto en metanol, dicho componente eluye de la columna en una fracción tomada cuando la elución total de la columna está entre 180 y 220 ml aproximadamente, entre 220 ml a 260 ml aproximadamente, o entre 260 ml y 300 ml aproximadamente.
La caracterización de componentes también puede lograrse por cromatografía de intercambio iónico, de tal forma que cuando 10 ml de dicha composición se someten a cromatografía de intercambio aniónico en una columna que contiene resina en forma de hidróxido AG-1 Bio-Rad en una cantidad suficiente para enlazar esencialmente todos los aniones presentes en dichos 10 ml de composición, dicho componente eluye de la columna usando un gradiente de paso del tampón de bicarbonato de amonio a una concentración del tampón de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M, preferentemente a una concentración del tampón de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 1,5 M, y más preferentemente a una concentración del tampón de aproximadamente 1,5 M.
La HPLC (C_{18}) en fase reversa también puede usarse para la caracterización de componentes, tal que cuando dicha composición es liofilizada y reconstituida en 0,1% de TFA en agua y luego se somete a HPLC (C_{18}) en fase reversa en una columna de WP60009-C_{18} Phenomenex, con dimensiones de 250 x 4,6 mm, en la que un primer tampón de TFA al 0,1% en agua se pasa a través de la columna durante aproximadamente 10 minutos, luego se pasa un gradiente lineal de 0 a 80% de un segundo tampón de TFA al 0,1% en cianometano durante aproximadamente 55 minutos, seguidos por una solución al 80% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y un gradiente 80%-0% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y en la que la tasa de flujo es de 1 ml/min, y no se exceden la capacidad de la columna y de los tampones, dicho componente eluye de la columna en un tiempo de aproximadamente 2,4 minutos a aproximadamente 3,4 minutos después de que se aplique a la columna dicha composición reconstituida. La caracterización de los componentes de la composición también puede lograrse por un método adicional de HPLC en fase reversa, de tal forma que cuando dicha composición se dializa o disuelve en un primer tampón de TFA al 0,1% en agua y luego se somete a HPLC (C_{18}) en fase reversa en una columna (C_{18}) RP 318 Hi-Pore de Bio-Rad, con dimensiones de 250 x 4,6 mm, en la que el primer tampón se pasa a través de la columna durante aproximadamente 10 minutos, luego se pasa un gradiente lineal de 0-80% de un segundo tampón de TFA al 0,1% en cianometano durante aproximadamente 55 minutos; seguido por una solución al 80% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y un gradiente 80%-0% del segundo tampón durante aproximadamente cinco minutos, y en la que la tasa de flujo es de 1 ml/min, y no se exceden la capacidad de la columna y de los tampones, dicho componente se eluye de la columna a un tiempo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 21,4 minutos, o a un tiempo de aproximadamente 21,4 minutos a aproximadamente 25,6 minutos después de que se aplique a la columna dicha composición dializada.
Las composiciones de la presente invención también pueden ser caracterizadas por TLC, de tal forma que cuando dicha composición se somete a cromatografía en capa delgada sobre placas de silicagel en hidróxido de amonio concentrado al 10% en metanol y visualizado con un spray de nihidrina, ocurre una reacción positiva con la nihidrina a un valor de Rf desde aproximadamente 0,80 hasta aproximadamente 0,90.
A la luz de esta caracterización, el presente descubrimiento contempla un método de estimular el factor de liberación y/o producción de la necrosis del tumor en los humanos, comprendiendo la administración de una cantidad eficaz de una composición que comprenda por lo menos uno de los siguientes compuestos:
(a)
un compuesto de la fórmula
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en el que los enlaces entre A-B, B-C y C-D pueden ser simples o dobles enlaces, y en la que X = H, OH, =O, u OSO_{3}H e Y =
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en los que R es un residuo de aminoácido.
(b)
un compuesto de la fórmula:
(R^{1}O)CH_{2}CH(OR^{2})CH_{2}(OR^{3}-X)
48
en el que R^{1}, R^{2} y R^{3} son H, COR^{4}, CH=CH-R^{5}, X, P(O) (OH)O-, o -S(O)_{2}O-;
X es colina, etanolamina, etanolaminas N-alquiladas; serina, inositol, azúcares portando hidroxilos libres, azúcares aminados, azúcares sulfonados, o ácidos siálicos; y
R^{4} es un grupo alquilo saturado o no saturado que tiene una cadena de carbono aproximadamente desde C_{1} hasta C_{30}, o sus análogos oxidados e hidroxilados; y
R^{5} es un grupo alquilo o sus análogos oxidados e hidroxilados;
(c) un producto de hidrólisis de mucina o un producto de hidrólisis de proteoglicano; o
(d) una vitamina liposoluble.
Preferentemente, las composiciones del método inventivo comprenden por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consta de ácido taurocólico y sus derivados sulfatados; ácido glicocólico y sus derivados sulfatados; esfingosina; un diacil-glicerol; lecitina; un oligosacárido de longitud menor que 10 unidades del sacárido, en el que dicho oligosacárido comprende ácido siálico, fucosa, hexosaminas, o hexosaminas sulfatadas; vitamina A; derivados del ácido retinoico; derivados del retinol; taurina; y ácido glutámico y sus conjugados. La composición también puede comprender adicionalmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consta de amoníaco; alquil-aminas primarias; alquil-aminas secundarias; alquil-aminas terciarias; y un ácido carboxílico R^{6}CO_{2}H, en el que R^{6} es un alquilo saturado o no saturado de C_{1}-C_{30}, y de sus derivados oxidados y/o hidroxilados.
El presente descubrimiento también abarca la estimulación de la liberación y/o producción de TNF por la administración de una composición que comprende por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consta de ácido taurocólico y sus derivados sulfatados; ácido glicocólico y sus derivados sulfatados; esfingosina; un diacil-glicerol; lecitina; un oligosacárido de longitud menor que 10 unidades del sacárido, en el que dicho oligosacárido comprende ácido siálico, fucosa, hexosaminas, o hexosaminas sulfatadas; vitamina A; derivados del ácido retinoico; derivados del retinol; taurina; y ácido glutámico y su conjugados.
La presente invención tal como se reivindica, también mantiene el uso de una composición de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer pancreático por la administración a un paciente que sufre de dicho cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición.
También formando ciertas realizaciones de la presente invención están esas composiciones reivindicadas que comprendan (1) micelas de esfingosina o esfingosina acomplejada con una sal, o (2) micelas de ácido retinólico o de sus derivados que tengan por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) ser capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) ser capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo.
Las composiciones pueden tener un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón.
Las micelas también pueden comprender un diacil-glicérido o lecitina, y pueden comprender adicionalmente una sal de ácido biliar, y una fuente de amonio o iones alquil-amonio.
Finalmente, las realizaciones de la presente invención también incluyen composiciones reivindicadas que comprendan (1) esfingosina, una sal de ácido biliar y una fuente de amonio o iones alquil-amonio, (2) una sal de ácido biliar, esfingosina, un diacil-glicerol, una fuente de amonio o iones alquil- amonio, y un derivado del retinol, (3) un diaci- glicérido, lecitina, y una sal de ácido biliar, o (4) (a) un diacil glicérido, (b) lecitina, y (c) un producto de hidrólisis de mucina o un producto de hidrólisis de proteoglicano que tenga por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) ser capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) ser capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo.
De nuevo las composiciones pueden tener un efecto antiproliferativo en una línea celular del hibridoma maligno del ratón.
Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la presente invención:
Ejemplo 1 Preparación de la composición de la invención
La bilis bovina es reunida de las manadas saludables por lo menos de uno a uno y medio años de edad que se han matado para uso alimentario en un matadero autorizado e inspeccionado. Las vesículas de los animales matados que se han inspeccionado son reunidas y las vesículas son separadas de los hígados y examinadas por un veterinario para confirmar que las vesículas están libres de parásitos y de evidencia de infección, y así son convenientes para su uso como una fuente de bilis. Las vesículas que pasan esta inspección se limpian con una solución al 70% de etanol para sanear el exterior y se inserta una jeringa para extraer la bilis. La bilis quitada se examina visualmente por el veterinario en la jeringa para asegurar que no contiene sangre alguna o pus y que por otra parte es satisfactoria. La bilis encontrada satisfactoria se transfiere a una botella ambarina graduada que contenga alcohol etílico. La bilis es esencialmente un fluido verdoso libre de sangre y pus. La bilis se agrega a cada botella a un nivel marcado en la botella, dos veces el nivel de etanol presente para dar una solución al 50% de bilis/etanol. La solución bilis/etanol es un fluido verdoso esencialmente libre de material extraño con una relación aproximada de 50%/50% bilis/solución etílica. También corresponde como positiva según USP XXII Parte B alcohol etílico. Estas botellas son etiquetadas con la fecha de colección, la que sirve como número de lote. Un mínimo de cincuenta animales sirve como muestras reunidas para cada lote. Fracciones de hígados, bazo, y ganglios linfáticos de los animales, cuya bilis constituyó las muestras reunidas son también reunidas y las fracciones se examinan para determinar la presencia de parásitos u otras indicaciones de enfermedad.
La mezcla bilis/alcohol se centrifuga luego a 4200 RPM durante por lo menos 2 ½ horas a 20 \pm 2ºC. El líquido sobrenadante se decanta y se verifican el pH y volumen de etanol. El líquido decantado se somete luego a un tratamiento de carbón activado. La mezcla bilis/etanol tratada se supervisa entonces para determinar la densidad óptica (O.D. , por las siglas de su expresión inglesa, Optical Density) y la conductibilidad. Los niveles de O.D. o conductibilidad fuera de las especificaciones aceptables requerían que la solución de bilis en etanol se sometiera a tratamiento adicional con carbón activado para lograr una lectura dentro de los límites de la especificación.
Seguido al tratamiento de carbón activado, la solución se filtra a través de un filtro (por ejemplo usando filtros que tengan una retención de 2,5 \mum), el alcohol se evapora (se por ejemplo, se calienta a menos de 85ºC) y la solución se concentra a aproximadamente un octavo del volumen de la solución bilis/etanol original. La solución concentrada se refresca a 20-25ºC. Esta solución luego se mezcla con éter etílico y se descarta la fase de éter. Este paso puede repetirse una vez. La fase acuosa se calienta para eliminar el éter residual (por ejemplo se calienta a aproximadamente 55ºC durante aproximadamente 10 horas) y adicionalmente se reduce en volumen a un décimo del volumen bilis/etanol original, se calienta a aproximadamente 80-85º C. De la composición resultante se ensayan luego su apariencia, actividad biológica y volumen de etanol y éter. La composición es una solución amarillenta clara, esencialmente libre de materia extraña, y no contiene más de 10 ppm de etanol y no más de 5 ppm de éter. En el ensayo biológico descrito en el Ejemplo 4, el crecimiento no proliferativo es \pm 18 unidades/ml.
La identidad y pureza se determinan usando cromatografía líquida de alta presión y fase reversa. La potencia se ensaya usando el método antiproliferativo como se describe en el Ejemplo 4.
Los lotes iniciales de la composición de la invención se prepararon como un líquido no tamponeado. Los lotes siguientes fueron preparados como un líquido tamponeado, preparado ajustando el pH de la composición a aproximadamente 7,4 \pm 0,05, usando soluciones al 1% de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio, así como usando las sales de los fosfatos de sodio monobásico y dibásico como tampones. La reducción de Bioburden se lleva a cabo en un autoclave a vapor a 104 \pm 2ºC durante 60 minutos. La solución a granel se envasa en botellas estériles de 5 ml o 10 ml y se tapan. Las botellas llenas y tapadas se someten a tres ciclos de esterilizaciones mediante autoclave a 104ºC \pm 2ºC durante 60 minutos seguidos por incubación a 35ºC durante 23 \pm 1 hr. Entre cada ciclo (muestras en autoclave más incubación) se toman y se ensayan para determinar su biocarga. Seguido del último ciclo, las botellas se inspeccionan visualmente contra un fondo negro y otro blanco para descubrir cualquier partícula que pudiera estar presente.
Seguido de la inspección, el lote se muestra y se ensaya para determinar su conformidad con las especificaciones. Los ensayos incluyen identidad, esterilidad, pirogenicidad, endotoxina, ensayo biológico, HPLC y seguridad general (Véase Tabla 1).
TABLA 1 Resultados para los lotes individuales
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Ejemplo 2 Características químico-físicas y bioquímicas de la composición de la invención
Varias de las características fisicoquímicas de la preparación (conductividad, osmolaridad y sólidos totales) se muestran en la Tabla 2. Más particularmente, se llevaron a cabo los resultados de los ensayos para tres lotes preparados de una composición preparada de acuerdo con el Ejemplo 1. Los resultados mostrados en la Tabla 2 demuestran la esterilidad, potencia, y reproducibilidad del producto manufacturado. Se conoce que el alcohol etílico y éter etílico sólo se miden como ensayos en proceso. Un resumen del método para la determinación de la actividad biológica se proporciona en el Ejemplo 4.
TABLA 2 Especificaciones del producto
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Las propiedades físicas y químicas como conductibilidad, osmolaridad y sólidos totales son consistentes con una composición de sal mayor que 99%. Menos del 1% de los sólidos en la composición son material orgánico, no hay lípidos, alrededor de la mitad son hidratos de carbono y el resto son aminoácidos. Están presentes proteínas y péptidos. La electroforesis SDS de Gel confirmó que puede haber más péptidos que proteínas en la composición. No se detectan pesos moleculares altos. Éste es un rasgo importante de una droga péptido porque no se espera que sea inmunogénica.
Para la composición de la invención usando el producto no tamponeado se desarrollaron los métodos de ensayo por HPLC y el ensayo biológico. Estos ensayos se usan para caracterizar el producto tanto el líquido tamponeado, como la fórmula concentrada. Los resultados de HPLC descritos a continuación indican que el producto es el mismo en todas las presentaciones. El ensayo biológico muestra que la actividad de la composición concentrada es dos y medio veces mayor que la composición original. Por consiguiente, el producto usado en los estudios ha demostrado ser equivalente.
Análisis por hplc (C_{18}) fase reversa de la composición de la invención
La composición de la invención tiene un patrón reproducible de forma constante en la HPLC en fase reversa en la que se ven los picos iniciales en la fracción de exclusión y a aproximadamente 27 y 32 minutos. Antes, entre y después de los picos altos, hay picos menores que varían en intensidad. Las lecturas de la HPLC para tres lotes de la composición concentrada de la invención se muestran en las figuras 1 a 3. Los perfiles de RP-HPLC para los lotes B0211 (figura 4), B0209 (figura 5), B29/3006 (figura 6) y 815/1606 (figura 7), también muestran un patrón muy reproducible.
Para caracterizar la composición de la invención se llevó a cabo la RP-HPLC como sigue. Fueron usadas la columna protectora, (C_{18}) RP 318 Hi-Pore Bio-Rad, 4,6 x 30 mm, y la columna (C_{18}) RP 318 Hi-Pore Bio-Rad, 4,6 x 250 mm. Las muestras fueron dializadas en ácido trifluoracético al 0,1% (TFA Pierce) en H_{2}O (tampón A) y aplicadas a la columna. Se pasó durante 10 minutos el tampón A, luego se pasó un gradiente lineal 0-80% de tampón B (0,1% de TFA en 100% de cianometano) durante 55 minutos. Al final de este período, se pasó el tampón B al 80% durante 5 minutos y el tampón B al 80 -0% durante 5 minutos. La tasa de flujo fue 1,0 ml/minute. Las fracciones de los pases sucesivos fueron reunidas, agrupadas y concentradas en un aparato Speedvac (Modelo SVC 200H, Savant Instruments, Farmington, N. Y.).
Caracterización preliminar de la composición
Se sometieron picos de HPLC a la secuenciación de proteínas. La muestra inicial, el pico mayor de HPLC designado RP-HPLC -31.00 min, lote 0210 en TFA/CH3CN, no manifestó datos cuando se sometió al análisis por secuencia del N-término. Los resultados pueden interpretarse como un problema de cantidad u bloqueo del N-término. La cuantificación del contenido de proteína de esa fracción por el análisis de aminoácido, después de que la hidrólisis ácida reveló que suficiente cantidad se debió haber sometido al análisis de secuencia; sin embargo, debido a la composición, se concluyó que la muestra puede no ser una proteína, y así el problema no sería el bloqueo N-terminal. Las muestras presentaron la composición siguiente: aproximadamente 70% GIx (glutamato/glutamina) más aproximadamente 15% glicina (Gly). Además, el análisis de la muestra equivalente por RP-HPLC dio resultados similares: 68% GIx y 15% Gly (Tabla 3). Adicionales caracterizaciones de material no fraccionado más el de varias otras fracciones revelaron lo siguiente. El material de partida (32 mg/ml) manifestó una señal de secuencia que indica una relación péptido de poliglutamato /proteína, consistente con los datos de composición del aminoácido.
TABLA 3
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El análisis de varias fracciones por HPLC (Tabla 3) reveló que todas son muy ricas en GIx (Glu/Gln) (28-70 mol%) y Gly (10-44 mol%). Cada fracción, sin embargo, exhibe diferencias reales en las cantidades relativas de los otros aminoácidos.
Ejemplo 3 Actividad biológica de fracciones de la composición
Se ha investigado la actividad biológica de fracciones de la composición. Se piensa que la actividad biológica de la composición es atribuible a los componentes de peso molecular pequeño (p.m. menor que 3000 daltons). Esto se determinó a través de un experimento en el que se probaron cuatro fracciones de la composición y composición no fraccionada para determinar la actividad biológica. La primera fracción contenía proteínas y péptidos con peso molecular menor que 3000 daltons, mientras las tres fracciones restantes contenían además proteínas de peso molecular más grande y polipéptidos. Todas las fracciones contenían proteínas adicionales de peso molecular más grande y polipéptidos. Todas las composiciones fraccionadas y no fraccionadas demostraron la misma actividad biológica. Ya que todas las fracciones eran tan eficaces como el producto no fraccionado, y desde que el común denominador de todas las fracciones era la presencia de la misma concentración de moléculas menores de 3000 daltons, esto llevó a la conclusión de que la actividad biológica de la composición es debida a los componentes con pesos moleculares menores que 3000 Daltons.
Ejemplo 4 Efecto en las líneas de células malignas
Se midió el efecto de la composición de la invención en la proliferación de cultivos de cuatro líneas de células malignas (células del linfoma humano de Daudi, células del carcinoma cervical humano ME-180, células de carcinoma de ampolla humano T-24, y células del hibridoma de ratón Nº 6-1). La composición de la invención tenía un efecto antiproliferativo en las células del hibridoma de ratón. Los estudios sugirieron que el efecto inhibitorio de la composición en las células del hibridoma del ratón es antiproliferativo en lugar de citocidal.
Para facilitar la caracterización de la composición, en un modelo celular de hibridoma de ratón se diseñó un ensayo biológico, basado en el efecto antiproliferativo reproducible de la composición de la invención El ensayo biológico se llevó a cabo como sigue. Se ajustan la osmolaridad y el pH de la composición para igualar éstos en el medio de cultivo celular, para aislar la actividad biológica de la composición de sus propiedades físicas y químicas. Se preparan las diluciones de serie de composición isotónica de 1:5 a 1:10,000 en el medio de cultivo. Las muestras celulares de hibridoma son específicamente cuantificadas. Usando un hemocitómetro se cuentan las células en 100 \mul de muestra. Las células se concentran por centrifugación y luego la concentración celular se ajusta a 1,000 células/ml (dos veces la concentración deseada final) por la adición de volúmenes apropiados de médium fresco. Las suspensiones celulares de hibridoma (1 ml) mezcladas con las diluciones correspondientes de la composición (1 ml) se incuban en 24 viales de la placa a 37ºC en una atmósfera húmeda con CO_{2} controlado al 6%. Después de 96 horas, de cada vial se toman muestras de 100 \mul X 3 y se ponen en 96 viales de la placa (se incluye un blanco de 100 \mul de médium sin células). La densidad celular se determina usando un equipo PROM EGA CeII Titer 96TM. La concentración celular se mide leyendo la absorbancia a 595 nm (la referencia a 650 nm) y se registra por el lector de placa ELISA. Para cada ensayo se prepara una curva tipo de concentración celular. Se muestrean las células cultivadas en la fase troncal de crecimiento, se cuentan, concentran y resuspenden en las diluciones de serie. De cada dilución se toman muestras de 100 \muI X 3 y se ponen en los 96 viales de una placa. La curva tipo se construye graficando la densidad celular contra OD "neta" a 595 nm después de la sustracción del cero de los blancos celulares y OD a 650 nm. La densidad celular de muestras desconocidas se determina por interpolación.
Para calcular la actividad biológica, se grafica la densidad celular como un porcentaje del control (ninguna composición) contra la dilución de la composición última (en escala linear y logarítmica), y se ajusta una curva a través de los puntos utilizando el método Spline de ajuste de curvas. Luego, la dilución de la composición que corresponde al 50% de inhibición de la proliferación celular se determina a mano y se convierte directamente a UNIDADES de composición. Por definición, una unidad de composición inhibe al 50% la proliferación de 1 ml de cultivo celular de línea celular HYB Nº 6-1, sembrada a 500 células/ml, después de 96 horas a 37ºC y 6% CO_{2}. La actividad media de la composición de la invención en el ensayo biológico es 18,24 \pm 1,82 unidades/ml.
Ejemplo 5 Efecto sobre los linfocitos T y B en el cultivo
La composición de la invención ha mostrado no ser tóxica a los linfocitos T y B normales en el cultivo. Se examinó el crecimiento de linfocitos humanos bajo condiciones cuidadosamente controladas en presencia y ausencia de la composición. Se incubaron concentraciones tipo de linfocitos en viales que contienen varias concentraciones de la composición. Cuando los linfocitos humanos T y B normales se incubaron con la composición en concentraciones similares a aquellas que se usan clínicamente, no hubo efectos adversos como se juzgó por la exclusión del 
\hbox{Tripán
Azul.}
Se examinó el efecto de la composición en la supervivencia de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMN). En este experimento, se incubaron las PBMN durante 24 y 48 horas en placas de microviales plásticos con varios volúmenes de la composición y medio de cultivo de tejido. Al final de este período, el número de células supervivientes se estimó por exclusión con el indicador Tripán Azul. La Tabla 4 muestra que el número de células supervivientes cayó a las 24 y de nuevo a 48 horas; sin embargo, el número de células supervivientes en presencia o ausencia de la composición no era diferente. Es más, los volúmenes crecientes de la composición no tenían efecto en la supervivencia (Tabla 4). Así, la composición no mostró ninguna citotoxicidad a PBMN humana.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Concentración de PBMN viables después de la incubación
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'Aproximadamente 1 x 106 células colocadas/vial por triplicado. 2 Actual número de células contadas/vial (x106).
Ejemplo 6 Contenido de citoquina de la composición
Se realizaron los ensayos ELISA para TNF-\alpha. IL-1\alpha, IL-\beta. IL-4, IL-6. IL-8. GM-CSF e IFN en la composición de la presente invención. Fue determinado que la composición de la invención no contuvo ningún nivel apreciable de citoquinas (TNF. IL-1 alfa. IL-1 beta, IL-4. IL-6. IL-8. GM-CSF y IFN gamma) (Véase Tabla 5).
TABLA 5 Determinación elisa de citoquinas en la composición
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Ejemplo 7
Fueron determinadas las propiedades físicas, químicas y biológicas para varios lotes de la composición de la invención, preparados de acuerdo con el método como está descrito en el Ejemplo 1. Adicionalmente, la composición química de los lotes fue determinada y realizado un análisis de aminoácido de los lotes. Los resultados se muestran en Tablas 6-8.
TABLA 6 Composición química
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Propiedades físicas, químicas y biológicas
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Comentarios: 1. A los lotes No. B0106 y B0706 se adicionaron sólidos PBS totalmente isotónicos. 2. Los lotes B1306, B2006 y B2306 se concentraron X2, sin ajuste de pH.
TABLA 7 Composición química
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TABLA 8 Composición de amino ácidos
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Ejemplo 8 Activación de monocitos y macrófagos
Las investigaciones han mostrado que la composición de la invención activará los monocitos normales para demostrar citotoxicidad hacia la línea celular del hepatoma de Chang ,que se usa para medir la toxicidad del monocito y que los monocitos y macrófagos de los pacientes de cáncer (cáncer cervical y ovárico) se han estimulado por la composición para atacar y destruir sus propias células tumorales particulares.
Más particularmente, la función tumoricida del monocito se ha ensayado en presencia de la composición de la invención y el procedimiento básico para estos experimentos se perfila a continuación.
Se reúne sangre venosa en tubos Vacutainer heparinizados. La sangre se diluye 3:1 en solución de sal balanceada de Hanks (HBSS, por las siglas de su expresión inglesa, Hanks Balanced Salt Solution), estratificada sobre el medio de separación del linfocito y centrifugada para obtener una franja de células mononucleares de sangre periférica (PBMN). Después de la centrifugación, el estrato de células mononucleares se recupera de la interfase lavada dos veces en el medio y los monocitos son enumerados por ingestión de látex. Los monocitos son aislados por adhesión en placas de 96 viales (durante 2 horas a 37ºC seguido por dos ciclos de lavado). Las células adherentes se estiman ser monocitos en más del 90%. Se incuban viales conteniendo las células adherentes toda la noche en presencia de la composición (11:10 dilución) el factor de estimulación de granulocitemacrófago o PMA. Luego se lavan las células adherentes y se incuban toda la noche con células tumorales. Para estudios usando una línea celular tipo se usan células del hepatoma de Chang 51CR-etiquetadas porque esta línea celular es insensible a la citotoxicidad celular asesina natural. Estos hepatomas marcan las células tumorales se adicionan a las monocapas de células adherentes en un efector : marcador (E:T) en relación celular de 20:1. (Esta relación de E:T se usa porque entra bien en el intervalo de la meseta en una curva preparada variando la relación de E:T de 5:1 a 30:1.) Después de 24 horas los sobrenadantes son reunidos y se cuantifica el 51CR liberado. El por ciento de citotoxicidad específica es calculado como:
Liberación específica = (E-S)J(T-S) x 100
donde E = CPM liberado de las células marcadas en la presencia de las células del efector; S = CPM liberado de las células marcadas en la ausencia de las células del efector; T = CPM liberado de las células marcadas después del tratamiento con 2% de dodecil sulfato de sodio.
Usando este protocolo, se encontró que la composición provoca que los monocitos de los donantes saludables ejerzan citotoxicidad sobre la línea celular del hepatoma de Chang. Como consecuencia, se investigó si los monocitos y macrófagos de un paciente de cáncer pudieran ser estimulados por la composición para atacar y destruir su propio tumor particular. Usando similares protocolos como se describió para la línea celular tipo (células del hepatoma de Chang), se aislaron monocitos y/o macrófagos peritoneales de los pacientes de cáncer (se aislaron macrófagos peritoneales de fluidos peritoneales recopilados durante la laparoscopia). Se encontró que la composición activa monocitos periféricos y macrófagos peritoneales de un paciente con cáncer cervical para producir citotoxicidad contra las propias células tumorales del paciente. Este efecto era comparable a o mejor que el producido por interferón o lipopolisacárido. Macrófagos peritoneales de un paciente con cáncer ovárico resultaron también estimulados por la composición para atacar y destruir las células tumorales ováricas en el cultivo.
Ejemplo 9 Efecto en TNF
Se llevaron a cabo los estudios a evaluar el efecto de la composición de la invención sobre la liberación de citoquina de las células mononucleares de sangre periférica (PBMN). Se realizaron ensayos de ELISA para TNF-\alpha, IL-1\alpha, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF e IFN.
Los métodos siguientes se usaron en los estudios descritos en el Ejemplo.
En los estudios de TNF se tomó sangre entera de 5 sujetos saludables en tubos de Vacutainer heparinizados. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMN) se aislaron por centrifugación de gradiente en Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Las PBMN se lavaron dos veces con fosfato salino tamponeado (PBS, por las siglas de su expresión inglesa, Phosphate Buffered Saline), se contaron y resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 (Laboratorios Gibco) a una concentración de 106 células/0,5 ml. Estas células se cultivaron en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 24 viales (Falcon, Becton, Dickinson). De la suspensión de PBMN, 0,5 ml se agregaron a cada vial conteniendo 50 mg de Lipopolisacárido (LPS) (de E. coli), 10 \mul de suero de ternero fetal y los volúmenes respectivos de composición ensayados (10-300 \muI). Para neutralizar el efecto hiperosmolar de la composición, se agregó agua destilada a los viales de cultivo a un volumen equivalente a 10% del volumen de composición usado. El volumen total se llevó luego a 1 ml/vial con RPMI. Como control, se usó PBS en lugar de la composición. Las células se cultivaron durante 2, 6, 24, 48 y 72 horas a 37ºC en una incubadora humedecida y con 5% de CO_{2}. Al final de cada período de incubación; las células fueron cosechadas y se obtuvieron los fluidos de cultivo libres de células por centrifugación a 9000 rpm durante 10 minutos. Las muestras se guardaron luego a -70ºC hasta (durante 2 semanas) hasta que se llevó a cabo ELISA para las citoquinas. Se hizo la estimación de la proteína de la composición usando la técnica de determinación Pierce Micro BCA Protein (Smith et al., Anal. Biochem. 1985, 150:76-85). 10 \mul de una muestra de la composición se enrasaron hasta 1 ml con agua destilada. Cinco concentraciones de Albúmina de Suero Bovino (0,150 \mug/ml) también se enrasaron para ser usadas como patrones. Como blanco, se usó 0,1 N NaOH. A todas estas muestras se agregó una mezcla de la sal sódica del ácido bicincónico al 2% (BCA, por las siglas de su expresión inglesa, Bicinchonic Acid sodium salt) (Pierce), Sulfato de cobre al 4% y Microreagent A (Na_{2}CO_{3}, NaHCO_{3}, tartrato de Na en 0,2 N NaOH). Las mezclas de la muestra se incubaron durante 1 hr a 60ºC, se enfriaron y la absorbencia resultante se leyó a 562 nm usando un espectrofotómetro. La cantidad de proteína en la muestra del ensayo se comparó luego a la curva tipo graficada y se hicieron los cálculos apropiados. La concentración de la proteína de la composición se encontró baja y se estimó de ser 32 \mug/ml.
La síntesis de citoquina en los sobrenadantes se midió después de la estimulación de PBMN humana con la composición de la invención a volúmenes de 200 y 300 \mul/vial. Las preparaciones iniciales de la composición no muestran ningún efecto estimulante sobre la producción de citoquina (Tabla 9). Si hubo algún efecto, la sugerencia fue que la producción de citoquina estuvo por debajo del nivel constitutivo, cuando se incubaron las PBMN exclusivamente en el medio.
TABLA 9 Efecto Directo de la Composición en la Producción de Citoquina después de 24 hrs. Suma de Citoquina Liberada (pg/ml)^{1}
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1. Media de muestras de ocho pacientes por duplicado 2. Media de muestras de siete pacientes por duplicado 3 ng/ml
Se realizaron los experimentos para determinar si la composición de la invención dañaría la liberación estimulada por LPS. Los LPS se usaron como un estímulo positivo, y se comparó la habilidad de la composición para perjudicar la liberación de citoquinas estimulada por LPS para las diferentes citoquinas (Tabla 10). La composición inhibe claramente a IL-1 alfa, IL-1 beta y TNF. Los efectos sobre las otras citoquinas IL-6, IL-8, IFN-gamma y GM-CSF no eran tan marcados. Sin embargo, en ningún caso las composiciones ensayadas aumentaron el efecto de la liberación estimulada por LPS de citoquinas.
TABLA 10 Diferencia entre la citoquiina liberada por LPS y por LPS más la composición
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1. PBMN de seis pacientes se probaron por duplicado 2. composición lote B0209
Se examinó el efecto de volúmenes diferentes de las composiciones de la invención sobre la inhibición de la liberación estimulada por LPS de TNF. La figura 8 muestra una curva de dosis-respuesta de la composición inhibiendo la liberación de TNF a partir de PBMN, estimulada con LPS. Diez \mul de la composición inhibieron el 10% aproximadamente y la inhibición aumentó cerca del 30% con 100 \mul de la composición. Otro lote (B0201) de la composición inhibió la producción inducida por LPS de TNF a 200, 100 y 10 \mul en 45, 21 y 12 por ciento, respectivamente.
Similarmente, la producción de IL-1 beta se inhibió por la composición de una manera dependiente de la dosis: 100, 25 y 10 \mul de la composición inhibieron un 16, 10 y 9 por ciento, respectivamente.
Se examinaron diferentes lotes de la composición para determinar su efecto sobre la liberación inducida por LPS de TNF. En resumen, se encontró que los lotes de la composición producidos de la misma manera y del mismo animal indujeron un efecto idéntico. Sin embargo, los cambios en el método de preparación o la composición proveniente de especies animales diferentes tenían efectos diferentes. Los lotes B29/3006, B0213 (B = bovino) y C0203 (cabra) indujeron una liberación fuerte de TNF sobre aquellas inducidas por LPS solo (Tabla 11).
TABLA 11 Efecto dosis-respuesta sobre la liberación TNF de lotes de estimulación fuerte de la composición
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La Tabla 12 muestra los resultados con los lotes B15/1606 (preparación concentrada) y B27/2806, los cuales fueron moderadamente estimuladores.
TABLA 12 Efecto dosis-respuesta sobre la liberación de TNF en lotes de estimulación moderada
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La Tabla 13 muestra que el lote 013/2109 (oveja) era mínimamente estimulador.
TABLA 13 Efecto dosis-respuesta sobre la liberación de TNF en lotes de estimulación mínima
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La Tabla 14 muestra que el lote R0201 (tiburón) era inhibitorio a la mayoría de concentraciones para la producción de TNF inducida por LPS.
TABLA 14 Efecto dosis-respuesta sobre la liberación de TNF del lote inhibitorio
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Inicialmente, la composición mostró que afecta la liberación de TNF inducida por LPS a partir de PBMN humana. Así, en las próximas series de experimentos, se examinó el efecto del tiempo y la composición sobre la liberación de TNF inducida por LPS (Tabla 15). El LPS estimuló la liberación de TNF. A las 2 horas el nivel había subido a 697 pg/ml y el pico se produjo a las 6 hrs. a aproximadamente 2006 pg/ml. A las 24, 48 y 72 hrs. la liberación de TNF cayó progresivamente. De hecho, en 48 y 72 hrs., la liberación de TNF estaba simplemente sobre los niveles de producción constitutivos anteriores. Por contraste, el Lote 0213 de la composición, que era fuertemente estimulador para la liberación de TNF, no mostró ninguna liberación de TNF sobre aquella producida por LPS solo a 2 y 6 hrs. Por cuanto LPS indujo picos de liberación de TNF a 6 hrs., la composición en combinación con LPS indujo picos de liberación a 24 hrs. en un tiempo cuyo efecto estimulante de LPS había empezado a caer. Diferente al LPS solo, la composición + LPS continuó estimulando la liberación de TNF a 48 y 72 hrs. aunque la cantidad de TNF liberada cae progresivamente (Tabla 15). Así el lote 0213 era estimulador para la liberación de TNF. El lote B15/1606 que sólo era moderadamente estimulador, inhibió la liberación inducida por LPS a 2 y 6 hrs. En 24 hrs., B15/1606 en combinación con LPS era ligeramente estimulador para la liberación de TNF. A 48 y 72 hrs., B15/1606 en combinación con LPS, tenía un efecto estimulante ligero sobre la liberación de TNF. Así, lote B15/1606 tenía un efecto bifásico; inicialmente inhibió la liberación inducida por LPS de TNF, y principalmente a 24 hrs. la combinación con LPS, tenía un efecto estimulante ligero sobre la liberación de TNF. Así, el lote B15/1606 tenía un efecto bifásico; inicialmente inhibió la liberación de TNF inducida por LPS, y principalmente a 24 hrs. causó un efecto aditivo ligero junto con LPS en inducir liberación de TNF.
TABLA 15 Efecto del tiempo sobre la liberación de TNF estimulada por LPS para diferentes lotes
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El lote R0201 que era inhibitorio para la liberación de TNF inducida por LPS, era notablemente inhibitorio para la liberación de TNF inducida por LPS a 2, 6 y 24 hrs. A 48 y 72 hrs., el LPS indujo una liberación de TNF mínima y el lote R0201 tenía un efecto positivo o negativo mínimo a estos tiempos.
Los efectos estimulantes directos del Lote B0203 se probaron a volúmenes diferentes y luego a tiempos diferentes.
El Lote B0203 estimuló la liberación máxima de TNF a aproximadamente 100 \mul (Tabla 16). El efecto máximo se observó a 24 hrs. para un volumen de 200 \mul (Tabla 17). Así, la composición pudo estimular la liberación de TNF sola, esto es, en ausencia de LPS y las curvas para la liberación de TNF eran similares a cuando se combinaron la composición y el LPS. Parece que la composición sola era menos estimuladora para la liberación de TNF, que el efecto aditivo que tenía cuando se combinó con LPS.
TABLA 16 Dosis-respuesta del Lote B0203 en la estimulación de liberación de TNF
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TABLA 17 Efecto de Lote B0203 sobre la liberación del TNF a través del tiempo
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1 Media
En resumen, los resultados experimentales indican que algunos lotes de la composición pueden inhibir la liberación de TNF cuando se estimulan PBMN humana con LPS. Otros lotes tienen efectos bifásicos sugiriendo que ellos inhiben parcialmente la liberación de TNF inducida por LPS y tienen, como un efecto tardío, la habilidad de inducir una liberación ligera de TNF. Una tercera preparación no tenía efecto inhibitorio sobre la liberación de TNF inducida por LPS; pero a un punto de tiempo diferente que LPS, la preparación pudo estimular las PBMN humana para liberar TNF. En conclusión, la composición de la invención puede modular la liberación y/o producción de TNF, un mediador importante de respuesta antitumor. Un resumen de los datos se muestra en la figura 9 y la Tabla 18.
TABLA 18 Resultados del conjunto de ensayos de TNF
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Ejemplo 10
Este ejemplo demuestra, en resumen, lo siguiente: la composición tiene actividad liberadora de TNF-\alpha y actividad liberadora TNF-\alpha no se relaciona con cualquier contaminación con endotoxina. La preparación de los macrófagos mejora la habilidad de la composición de estimular la liberación de TNF-\alpha. La hiperosmolaridad de la composición no es responsable de la actividad liberadora de TNF-\alpha. La actividad liberadora de TNF-\alpha de la composición puede separarse, en parte, de otro constituyentes. La actividad liberadora de TNF-\alpha de la composición no se liga o se liga pobremente con RP-HPLC C_{18}. La mayoría de la actividad de las composiciones inicialmente eluye en RP-HPLC. Menos del 20% de la actividad de la composición es recuperable de las fracciones que se retienen después en la RP-HPLC y eluyen más tarde. La actividad liberadora de TNF-\alpha se precipita por cianometano al 80%, un volumen alto de tampón orgánico. El material precipitado cuando se reconstituye en tampón acuoso y se analiza en RP-HPLC muestra gran similitud al pico de la composición, excluido en RP-HPLC. Es posible separar y concentrar el componente activo de la composición en una fracción que constituye aproximadamente el 30% del material original.
A. Polimixina y la liberación de TNF-alfa
Para eliminar cualquier posibilidad de un efecto de endotoxina de la composición se realizaron experimentos con polimixina, agregada a los reactantes. La polimixina inhibe la acción de la endotoxina en los leucocitos. La Tabla 19 muestra que la polimixina inhibe completamente la liberación de TNF-\alpha, inducida por LPS. En la ausencia de polimixina, el LPS induce 517 pg/ml de TNF-\alpha, mientras que en presencia de polimixina se liberan 11 pg/ml de TNF-\alpha. La composición, por otro lado, libera 1591 pg/ml de TNF-\alpha en presencia de polimixina. En ausencia de polimixina, el LPS y la composición muestran más de sólo un efecto aditivo de los estimuladores, sugiriendo que la composición actúa con mayor intensidad cuando se preparan los macrófagos.
TABLA 19 Efecto de la polimixina sobre la liberación de TNF por LPS + Composición
TNF Liberado (pg/ml)
Muestra Ensayada Aditivo Total - LPS
LPS Polimixina 11 \pm 7 0
Ninguno 517 \pm 118 0
Composición (Nº B0213) Polimixina 1591 \pm 413 1581
Ninguno 5256 \pm 2585 4738
Notas:
1. El TNF Total Liberado se corrige por el TNF liberado por el Medio 1640.
2. Concentración de polimixina: 50,000 unidades/ml.
3. Volumen de la composición: 200 \mul.
4. Con polimixina, 8 pacientes ensayados. Sin aditivo, 3 pacientes ensayados.
5. Concentración de LPS: 50 ng/10 \mul.
B. Actividad liberadora de TMF de las fracciones provenientes de la cromatografía líquida a alta presión en fase reversa (RP-HPLC)
La figura 10 muestra los perfiles de RP-HPLC C_{18} de la composición, del Lote 0213 y de las 5 fracciones separadas que se ensayaron en su actividad liberadora de TNF.
Inicialmente; el efecto de fracciones diferentes se examinó en la presencia de polimixina. La Tabla 20 muestra que la fracción que eluye inicialmente (2:05 a 21:20 minutos) de RP-HPLC tenía la mayoría de la actividad liberadora de TNF perceptible. Sin embargo, esta actividad sólo era aproximadamente del 50% de la composición de partida. La columna derecha de la Tabla 20 muestra la osmolaridad de las muestras. El lote B0213 tenía 369 y mayor. Las fracciones de 21 minutos y después tenían la osmolaridad normal, considerando que la primera fracción que era activa era aún más hiperosmolar que el material de partida, indicando que mucha de la sal en la composición también eluye pronto. Por consiguiente, se investigó si la hiperosmolaridad de las muestras estaba inhibiendo o mejorando la liberación de TNF-\alpha como se presenta a continuación.
(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 20 Separación y ensayo de fracciones diferentes de HPLC de la composición en presencia de polimixina
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Nota: 1. El TNF Total Liberado se corrige por TNF liberado por el Medio RPMI. 2. Se reconstituyen las fracciones en PBS. 3. El volumen de composición y fracciones: 200 \mul. 4. La concentración de Polimixina: 50,000 unidades/ml. 5. El número de pacientes ensayados: 5. 6. La Osmolaridad no se midió para LPS.
La Tabla 21 muestra la comprobación adicional en dos pacientes con las fracciones de la composición 1 (2:05-21:20) y 2 (21: 20-25.32). Una vez más; la mayoría de la actividad se recuperó en la fracción 1; pero había alguna actividad en la fracción 2. Sin embargo, las fracciones 1 y 2 sólo tenían aproximadamente el 50% de la actividad de partida de la composición.
TABLA 21 Evaluación repetida de las fracciones HPLC 2:05-21:20 y 21:20-25:32 minutos de la composición sobre la liberación de TNF en presencia de Polimixina
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Nota: 1. El TNF Total Liberado se corrige por la liberación por el Medio RPMI. 2. Se reconstruyen las fracciones en PBS. 3. El volumen de la composición y las fracciones: 200 \mul. 4. La concentración de Polimixina: 50.000 unidades/ml. 5. El número de pacientes ensayados: 2
Para determinar si había alguna actividad no específica en las fracciones, se hizo un experimento en blanco y se reunieron las mismas fracciones, se concentraron y probaron. Las fracciones del blanco no produjeron virtualmente ninguna liberación de TNF. Este resultado indicó que las fracciones de RP-HPLC podrían usarse para probar la actividad liberadora de TMF-\alpha sin preocupación de que la columna o los tampones contribuyeran a la actividad liberadora de TNF-\alpha.
A continuación se probaron las fracciones de la composición en ausencia de polimixina para tener el efecto del pretratamiento de LPS. La Tabla 22 muestra que el Lote BO213 indujo una marcada liberación de TNF-\alpha. Había 5 fracciones de la composición de la RP-HPLC, con los tiempos de elución como se indican. Una vez más, la fracción 1 tenía la mayoría de la actividad liberadora de TNF-\alpha. Sin embargo, con el efecto del pretratamiento de LPS, las fracciones de la 2 a la 4 tenían alguna actividad liberadora de TNF-\alpha. La fracción 2 (21:20-25:32) tenía aproximadamente el 25% de la actividad de la fracción 1 y el doble de actividad de las fracciones más tardías.
TABLA 22 Separación y ensayo de fracciones de HPLC de la composición en ausencia de polimixina
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Notas: 1- El TNF Total Liberado se corrige según la liberación del Medio RPMI. 2- La Reconstitución de la fracción: 2:05-21:20 en agua. 21:20 a 48:55 en PBS. 3- El volumen de la composición y las fracciones: 200 \mul. 4- El número de pacientes ensayados para TNF liberación: 5. 5- Las Osmolaridades son los promedios para 2 de 5 pacientes; los errores tipo muy pequeños, por consiguiente, no se reportan.
Considerando que la Tabla 22 muestra los resultados de usar volúmenes de 200 \mul, la Tabla 23 muestra los resultados de probar a un tercer paciente adicional con 100 \mul de la composición y 100 \mul de sus fracciones de RP-HPLC en ausencia de polimixina. Aunque la liberación por la composición es más baja que con 200 \mul de la composición (Tabla 22), los resultados son similares. La fracción 1 contiene la mayoría de la actividad con alguna actividad en las más tardías fracciones 2 y 3.
TABLA 23 Separación y ensayo de fracciones de HPLC de la composición en ausencia de polimixina
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Nota: 1- El TNF Total Liberado se corrige según la liberación del Medio RPMI. 2- La Reconstitución de la fracción: 2:05-21:20 en agua. 21:20 a 48:55 en PBS. 3- El volumen de la composición y las fracciones: 200 \mul. 4- El número de pacientes ensayados para TNF liberación: 3. 5- Las Osmolaridades son los promedios de pacientes ensayados; errores tipo muy pequeños, por consiguiente, no reportados.
C. Efecto de la osmolaridad de la liberación de TNF por la composición
La composición de la invención es hiperosmolar. El efecto de la hiperosmolaridad de la composición en la actividad de liberación de TNF se estudió. Se encontró que la composición, cuya osmolaridad se ajusta incluso al punto de ser hiposmolar, continuó liberando TNF-\alpha.
D. Separación fisicoquímica de la composición por la precipitación con alto volumen de disolvente orgánico
Ya que la mayoría de la actividad Liberadora de TNF de la composición no se liga con al RP-HPLC como se evidenció por su rápida elución, se decidió usar una columna que actúa en el principio inverso de separación cromatográfica en fase reversa, en la que la muestra está en un volumen alto de disolvente orgánico y permite la interacción hidrófila. Esta técnica de la separación se usa para sustancias polares pequeñas. Sin embargo, cuando la composición se llevó a cianometano al 80%, se formó un precipitado. Así, algunos de los componentes de la composición precipitaron en un tampón de disolvente orgánico alto. Se separaron el precipitado y la fracción soluble. Ambos el precipitado y la fracción soluble se llevaron a sequedad por liofilización. El precipitado y la fracción soluble se reconstituyeron en soluciones acuosas y ambos se analizaron por RP-HPLC y se ensayaron en su actividad liberadora de TNF-\alpha. La Tabla 24 muestra que la mayoría de la actividad liberadora de TNF-\alpha la contenía el material precipitado.
TABLA 24 Actividad liberadora de TNF de fracciones de la composición preparadas por precipitación en cianometano al 80%
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Nota: 1. El TNF Total Liberado se corrige para el nmedio 1 X 199. 2. La reconstitución: el sobrenadante en PBS, el precipitado en agua doblemente destilada. 3. El Precipitado está en el medio 1 X 199(hipotónico) al 70%. 4. El número de pacientes ensayados: 5. 5. Las Osmolaridades son los promedios de 4 de 5 pacientes ensayados; los errores estándares muy pequeños, por consiguiente, no reportados.
El análisis por RP-HPLC de ambos, del precipitado (figura 11) y de las fracciones solubles (figura 12) de la composición, muestra que el precipitado es principalmente el material contenido en la fracción 1 de la RP-HPLC de la composición (figura 10), y el material soluble contiene las otras fracciones de la RP-HPLC de la composición (figura 10). Así de dos maneras diferentes, se demostró que la actividad de la composición está contenida en la fracción que se retiene mínimamente por RP-HPLC. De hecho, la composición precipitada tenía igual actividad que la no precipitada cuando se probó a 100 y 200 \mul.
Sólo los 200 \mul precipitados tenían osmolaridad sobre lo normal. Por consiguiente, las fracciones precipitadas y las solubles (el sobrenadante) de la composición se separaron por RP-HPLC (figura 11 y 12) y se dividieron en dos fracciones (véase los perfiles de RP-HPLC). La fracción 1 (2:00-21:10 min) era equivalente a la misma fracción 1 de la composición separada por RP-HPLC y la fracción 2 era equivalente a las fracciones de la 2 a la 5 de la composición separada por RP-HPLC. Los aislados se probaron luego en su actividad liberadora de TNF-\alpha. La Tabla 26 muestra que para dos pacientes ni el precipitado ni el sobrenadante después de la separación de RP-HPLC no tenía ninguna actividad liberadora de TNF. Sin embargo, los resultados para los dos pacientes iniciales (Tabla 25) hicieron pensar en la posibilidad de que el precipitado pudo no haberse ensayado al volumen ideal. Por consiguiente, las fracciones se probaron de nuevo en dos pacientes adicionales y a una más baja concentración. La Tabla 26 muestra a 50 y 100 \mul, la fracción 1 del precipitado tenía la mayor actividad. A 50 \mul liberó tanto TNF-\alpha como el doble de cuando se hizo 50 \mul LPS. Sin embargo, la actividad liberadora menor también se encontró en la fracción 2 de RP-HPLC del precipitado, así como la actividad menor se encontró en las fracciones 1 y 2 de RP-HPLC del sobrenadante.
TABLA 25 Actividad liberadora de TNF de las fracciones HPLC separadas de la composición precipitada con cianometano al 80%
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Nota: 1. El TNF Total Liberado se corrigen para TNF liberado por el medio 199 1 X. 2. La reconstitución: las primeras fracciones en agua doblemente destilada, las segundas fracciones en PBS. 3. El número de pacientes ensayados: 2. 4. Las Osmolaridades son los promedios de pacientes ensayados: errores estándares muy pequeños, por consiguiente no reportados. 5. Los promedios de valores en 1X y 1X 199 Medio al 70%.
TABLA 26 TNF liberación con adicional titulación de precipitado y sobrenadante fraccionados con cianometano al 80%
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Nota: 1. El TNF Total liberado se corrige para TNF liberado por 1 X 199 Medio. 2. La reconstrucción: las primeras fracciones en agua doblemente destilada, las segundas fracciones en PBS. 3. El Número de pacientes ensayadois: 2. 4. Las Osmolaridades son los promedios de pacientes ensayados: errores estándares muy pequeños, por consiguiente, no reportados. 5. Todos las muestras en 1X 199 Medio. E. TNF-\alpha Liberadora por Medios Diferentes
Fue observado que el ensayo del medio RPMI 1640 al medio 199 resultó en una menor liberación de TNF-\alpha, se evaluó en el medio 199 y RPMI 1640 (Tabla 27). Los resultados muestran que LPD de 10 a 200 ng es mucho más eficaz en liberar TNF-\alpha en el medio RPMI 1640 que en el medio 199. Probablemente la composición también da mayor liberación en el medio RPMI 1640. Así, las condiciones del cultivo pueden influir en el grado de liberación de TNF-\alpha
TABLA 27 Evaluación de la liberación de TNF en medios diferentes
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F. Osmolaridad de la Composición
La tabla 28 muestra las osmolaridades de lotes diferentes de la composición. B0213 es ligeramente alto en 675 mOsm. BO22 muestra que tienen una actividad liberadora de TNF aún mejor que B0213, es menos hiperosmolar, 581 mOsm. Las fracciones BO226, BC11-06 y BC11-09 van desde 540 hasta 603 mOsm.
TABLA 28 Osmolaridades de lotes enteros
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Ejemplo 11 A. Actividad liberadora del factor de necrosis de tumor (TNF) de una composición de la invención 1. El cianometano precipitado y sobrenadante de la composición
Como, se muestra en el Ejemplo anterior, cianometano al 80% precipitó material de una composición de la invención. El material precipitado y el no precipitado (de aquí en adelante llamado sobrenadante) la composición se probó adicionalmente a 55 para determinar donde residía la actividad liberadora de TNF.
La Tabla 29 muestra que el componente Liberadora de TNF de la composición se precipita por cianometano al 80%, un disolvente orgánico. Por cuanto la composición total a 0.04 ml liberó aproximadamente 15 pg/ml de TNF, 0.05 ml de precipitado.
Los lotes de la composición liberaron 58 (B0222), 0 (B0221), y 17 (B0213) pg/ml, haciendo pensar en la recuperación del componente de la liberación de TNF por la precipitación con cianometano al 80%. La composición del precipitado se reconstituyó en el mismo volumen de líquido del que había sido precipitado. Así, 0.1 ml de precipitado viene de 0.1 ml de composición total y se iguala a 0.1 ml de composición total.
TABLA 29 Actividad TNF liberadora de precipitados de virulizin* preparados en cianometano al 80%
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Nota: 1. El número de pacientes ensayados:5. 2. El TNF Total liberado se corrige para TNF liberado por 1X 199 Medio. 3. Osmolaridades no corregidas para el medio 1 X 199 (311 mOsm). 4. Promedio de osmolaridades dado; errores estándares no informados los valores son muy bajos. 5. Precipitado reconstituido en agua doblemente destilada. 6. El volumen de LPS agregado a los vials era 10 \mul. 7. Los vials contuvieron un volumen total de 1000 \mul. 8. Los volúmenes de la muestra son equivalentes. \text{*} La composición de la invención también se refiere a partir de aquí, como VIRULIZIN
Es de interés notar que en estudios más iniciales generalmente entre 0.1 y 0.2 ml de la composición se usaron para estimular la liberación de TNF. Los precipitados B0222, B0221 y B0213, reconstituidos a 0.1 y 0.2 ml liberaron entre 205 y 821 pg/ml de TNF. A 0.1 ml de precipitado, los lotes B0222, B0221 y B0213 liberaron entre 205 y 365 pg/ml de TNF, una cantidad muy similar de TNF, indicó la constancia de la actividad Liberadora de TNF de los tres lotes diferentes.
En un grupo separado de leucocitos del donante, se probaron los sobrenadantes de la composición que permanecen después de la precipitación con cianometano al 80%. Por cuanto 0.04 ml de los lotes enteros de la composición (B0222 y B0213) liberaron 175, 50 y 233 pg/ml de TNF, 0.05 ml del sobrenadante liberaron 42 y 41 pg/ml aproximadamente el 33% de la actividad de la composición total. Muestras en blanco preparadas en el mismo modo con cianometano al 80% no tenían ninguna actividad Liberadora de TNF. Así, la actividad Liberadora de TNF en el precipitado no era el resultado de algunas sustancias residuales en los tampones usados para inducir el precipitado.
Considerando que en los estudios anteriormente descritos las fracciones del precipitado y del sobrenadante se probaron en leucocitos de donantes diferentes, otro estudio fue dirigido en el que las dos fracciones se probaron en leucocitos de los mismos donantes. Para los dos lotes ensayados, la composición total a 0.04 ml liberaron entre 0 y 41 pg/ml de TNF. En comparación, el precipitado de los mismos lotes de la composición a 0.05 ml liberaron 141 y 749 pg/ml de TNF, considerando que 0.05 ml de la fracción del sobrenadante liberaron entre 6 y 57 pg/ml de TNF. Así el precipitado contenía mucha de la actividad de liberación de TNF. La fracción del sobrenadante todavía tenía algo de actividad Liberadora de TNF pero mucho menor que él y no más que la composición total.
2. Fracciones de la composición de la invención separadas por HPLC en fase reversa
Como se mostró, el precipitado de la composición contenía mucha de la actividad liberadora de TNF, el perfil del precipitado se examinó por C_{18} RP-HPLC. Las figuras 18, 19 y 20 muestran, respectivamente, los perfiles de RP-HPLC de la composición total, el precipitado y el sobrenadante. El perfil del precipitado muestra principalmente los picos eluídos inicialmente de composición total (figura 19), mientras que el perfil del sobrenadante (fig. 20) es similar al de la composición total sólo que el pico inicial es menos intenso.
En las próximas series de experimentos, las actividades del precipitado y el sobrenadante se evaluaron después de su separación por RP-HPLC C_{18}. El precipitado y el sobrenadante se reunieron como en 2 muestras reunidas de RP-HPLC: 2 a 21 min y 21 a 46 min. Estudios previos de fracciones de la composición total separadas por RP-HPLC indicaban que la actividad Liberadora de TNF eluía principalmente en la fracción de 2 a 20 min. La Tabla 30 muestra los resultados de probar la composición total y las RP-HPLC fracciones del precipitado y el sobrenadante. En este experimento particular, sólo 10 \mul de la composición total se usaron y no causó ninguna liberación de TNF. Las muestras reunidas de 2 a 21 min del precipitado liberó TNF, mientras que las muestras reunidas de 21 a 46 min no lo hizo (Tabla 30). Las muestras reunidas del sobrenadante de 2 a 21 min también liberó actividad de TNF, mientras que las muestras reunidas de 21 a 46 min liberó cantidades mínimas de TMF (Tabla 30). Así para ambos el precipitado y el sobrenadante, la actividad Liberadora de TNF reside principalmente en la fracción eluída inicialmente de RP-HPLC C_{18}.
TABLA 30 Actividad liberadora de TNF de fracciones de hplc de precipitado y sobrenadantes de Virulizin preparado en cianometano al 80% (2x lavado)
35
Nota: 1. El número de pacientes ensayados: 5. 2. El TNF total que liberado se corrige para TNF liberado por el medio 1X 199. 3. Osmolaridades no corregidas para el medio 1X 199 (309 mOsm); los errores estándares son muy bajos y, por consiguiente, no reportados. 4. La reconstitución: precipitados en agua TIpo 1, sobrenadantes en tampón de PBS. 5. Volúmen de LPS agregado a los viales era 10 \mul. 6. Los viales contuvieron un volumen total de 1000 \mul.
Los resultados sugieren que la sustancia liberadora de TNF en el precipitado y el sobrenadante sus moléculas probablemente se refieren estrechamente, si no idénticas, con la única diferencia, si existiera alguna, siendo quizás el grado de solubilidad en cianometano al 80%.
En otro experimento la actividad Liberadora de TNF de los dos muestras reunidas de RP-HPLC del precipitado se examinaron para tres lotes de la composición. La Tabla 31 muestra de nuevo que para tres lotes diferentes (B0222, B0221, y B0213), la actividad Liberadora de TNF está principalmente en las muestras reunidas de 2 a 21 min. Así lotes diferentes son constantes.
TABLA 31 Actividad liberadora de TNF de fracciones precipitadas HPLC de Virulizin preparado en cianometano al 80%
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Nota: 1. Para muestras 100 & 10 \mul: 3 pacientes ensayados para estas muestras. 2. Para muestras 200 & 40 \mul: 4 pacientes ensayados para estas muestras. 3. Total TNF que se libera se corrige para TNF liberado por Medio 199 1 X. 4. Medio 199 1 X C 100 & 10 \mul - 306 mOsm. 200 &40 \mul -305 mOsm. 5. Las Osmolaridades son los promedios y no se corrigieron para el Medio 199 1 X: no se informan los errores estándares ya que los valores son muy bajos. 6. Volumen de LPS agregado a los viales era 10 \mul. 7. Los viales contuvieron un volumen total de 1000 \mul. 8. Los volúmenes de la muestra son equivalentes. 9. La reconstitución: los primeros fracciones están en agua doblemente destilada. Las segundas en el búfer de PBS.
En un experimento adicional se examinó el efecto de lavar el precipitado con cianometano al 80%. El objetivo del experimento era demostrar que la actividad de liberación del TNF no estaba simplemente entrampando. La composición total, 0,04 ml. libera 325 pg/ml de TNF. La cantidad unida precipitada desde 2 hasta 24 min a las 0,1 ml liberaron 324 pg/ml de TNF y a 0,05 ml, 3 pg/ml. La cantidad unida desde 24 min hasta los 46 min no liberó ningún TNF. Igualmente los dos grupos sobrenadantes desde 2 a hasta 24 min liberan TNF a 0,1 y 0,05 ml. por cuanto la cantidad unida desde 24 hasta los 46 min tenía algunos, pero considerablemente menos. La actividad liberadora de TNF es en RP-HPLC.
Para ser cierto que el manejo de fracciones RP-HPLC aisladas de la composición no era responsable de la presencia de actividad liberadora de TNF. se prepararon las muestras en la misma forma pero sin la composición. Los perfiles RP-HPLC de PBS y los blancos de H20, sus precipitados y los sobrenadantes estaban esencialmente libres de cualquier pico.
Usando las células mononucleares de donantes idénticos, las muestras se ensayaron en leucocitos de los mismos donadores. La composición total y el precipitado eluído desde 2 hasta 24 min liberaron TNF, considerando que PBS, H20 o su precipitado separado en RP-HPLC no tenían ninguna actividad liberadora de TNF en la cantidad unida desde 2 hasta 23 min. Así, el precipitado eluído desde 2 hasta 24 min provoca una liberación específica de TNF.
La cantidad unida precipitada eluída de la composición desde 24 hasta los 46 min no liberó ningún TNF. Los controles de agua y PBS mostraron liberación desde 114 hasta 40 pg/ml, respectivamente. Así no había ninguna liberación específica de TNF de la cantidad unida precipitada 24 a 46 min.
\newpage
Las fracciones sobrenadantes de la cantidad unida desde 2 hasta 24 min y desde 24 a hasta 46 min liberaron 82 y 68 pg/ml de TNF, respectivamente. las cantidad unidas para agua y blancos PBS de RP-HPLC mostraron alguna actividad liberadora de TNF. La cantidad unida de agua desde 2 hasta 25 min y desde 25 hasta 46 min liberó 149 y 216 pg/ml de TNF respectivamente. y grupos PBS liberaron 0 y 126 pg/ml respectivamente.
Así, ambos precipitados y las fracciones del sobrenadante tenían actividad liberadora de TNF. La separación de RP-HPLC de la actividad liberadora de TNF mostró que ambos eluyeron inicialmente en RP-HPLC, sugiriendo que los componentes activos son físicamente muy similar si no idénticos.
La Tabla 32 proporciona un resultado sumario como muestra adicional para precipitado y sobrenadantes de cianometano 80% después de la separación de RP-HPLC, menos la actividad en muestras de blancos preparadas semejantemente.
TABLA 32 Actividad de liberación de Virulizin menos la liberación por soluciones de reconstitución
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Nota: 1. Los datos se derivaron de Virulizin Sumtable, Tabla 24.4. 2. Reconstitución de Virulizin: 1 fracción precipitada en el agua Tipo 1, todas las otras fracciones en PBS. 3. Las cantidades enteras son las no reconstituidas y por consiguiente no corrigieron. 4. Los volúmenes de la muestra son equivalentes.
La composición total libera TNF, GM-CSF y IL-1\beta in vitro de las células mononucleares a 24 hrs. El precipitado con cianometano al 80% contiene la misma actividad liberadora y la mayoría eluye en la fracción temprana de RP- HPLC. La fracción del sobrenadante retiene actividad liberadora y la mayoría eluye en la fracción temprana de RP-HPLC. La fracción del sobrenadante retiene actividad liberadora, pero también eluye en la RP-HPLC fracción eluída inicialmente para TNF y GM-CSF. Los resultados sugieren que probablemente el mismo componente libera las tres citoquinas. Para GM-CSF e IL-1 (3, el hecho que alguna actividad liberadora eluya en la fracción tardía de RP-HPLC sugiere que pueda haber otra sustancia en la composición que puede actuar en los monocitos para liberar GM-CSF e IL-1(3.
Análisis fisicoquímico por electroforesis de gel SDS
Habiendo identificado que la actividad liberadora de TNF, IL-1\beta y GM-CSF se puede precipitar, en parte, por cianometano al 80% y que mucha de la actividad liberadora eluye inicialmente de RP-HPLC C_{18}, se han estudiado las propiedades del fisicoquímicas de la fracción precipitada y se han comparado con la composición total y la fracción sobrenadante de la composición.
La figura 21 muestra una SDS electroforesis de gel de la composición total, el precipitado y el sobrenadante de la composición. En todos los tres casos, las experimentos de la composición próximos los frentes de SDS, indicaron un peso molecular bajo. El menor patrón usado era 14,400 daltons.
HPLC de tamiz molecular
El tamaño molecular de la composición también se examinó determinó su tiempo de elución de una columna de HPLC de tamiz molecular. Los tiempos de elución de la composición total, el precipitado y el sobrenadante comparados con patrones. Todos los tres eluyen después que la insulina que eluye a 24.5 min. Una vez más, el análisis fisicoquímico indica un peso molecular menor que 2,400 daltons.
HPLC hidrófila (Polihidroxietil)
El componente liberador de TNF eluye inicialmente. Así se escogió una columna con el efecto opuesto, una columna hidrófila en presencia de disolventes orgánicos. Las condiciones de elución ideales para la columna de polihidroxietil es el cianometano al 80%. Sin embargo, como se indica en el Ejemplo anterior, algunas de las sustancias en la preparación precipitaron a esta concentración. Por consiguiente, la composición se analizó a una concentración baja de cianometano, en la que la columna funciona principalmente como una columna de tamiz molecular. Las figuras 22 y 23 muestran los perfiles enteros de sobrenadante y precipitado. La próxima hoja resume los tiempos de elución de los diferentes picos. Los tiempos de elución indican que el componente activo de la composición tiene un peso molecular bajo.
Análisis de aminoácido y la secuenciación del componente precipitado
Se sometieron dos muestras a análisis de proteína por el análisis de la composición de aminoácidos antes y después de la hidrólisis ácida: el cianometano precipitado y las muestras reunidas de 2-20 min eluídos de RP-HPLC del precipitado. Las dos muestras eran muy similares por la comparación del contenido de aminoácidos antes y después de la hidrólisis ácida. Hay, sin embargo, diferencias significativas entre la composición de aminoácidos (la posterior hidrólisis ácida), y el volumen de aminoácido libre que sugiere que esos enlaces péptidos fueron hidrolizados. La composición de las muestras fue peculiar debido a que eran muy ricas en glicina más glutamato/glutamina.
De lo anterior se puede especular que por lo menos uno de los componentes activos es proteico. El análisis revela cantidades potencialmente significantes de ninhidrina no identificada positiva (más probablemente los compuestos son aminoácidos, pero otros compuestos pueden dar una respuesta), componentes que parecen ser estable a la hidrólisis ácida. Los aminoácidos principales por 1000 residuos en la muestra son Asx (asparigina) 143, Thr (Treonina) 31, Glx (glutamato) 381, Gly (glicina) 187, y Ala (alanina) 170.
Se realizó una comparación era hecho entre aminoácidos libres y liberados - (hidrólisis ácida) los. Ésta muestra los aminoácidos siguientes por 1000 residuos: Asx (asparigina) 51, Treonina 8.6, Serina 18, Glx (glutamina) 375, Pro (prolina) 17, Glicina (Gly) 429 y Alanina 86.
La relación Libres/1000 es la siguiente:
Llbres/1000
Asx 4,09
Thr 2,03
Ser 1,65
Glx 1,18
Gly 0,37
Ala 1,69
Hay 5 componentes no identificados (ninhidrina positiva). Las asignaciones muy especulativas son ácido cistéico, ácido glucosamínico y sarcosina. Pueden también haber sulfóxido de metionina y sulfona de metionina. El componente mayor de la ninhidrina no identificada parece ser los componentes libres de la muestra.
Ejemplo 12 Liberación de IL-1\beta e IL-8
La Tabla 33 muestra que la composición de la invención estimula las células mononucleares humanas en el cultivo para que liberen IL-1\beta, y el precipitado de cianometano al 80% libera de la composición más que el sobrenadante remanente. Por cuanto la composición entera no estimula IL-8 la liberación, la composición fraccionada parece liberar algo de IL-8. Los resultados mostrados en la Tabla 33 se relación luego de restar la liberación de IL-1\beta e IL-8 con las muestras simuladas.
TABLA 33
38
Nota: 1. El número de pacientes probó: 5. 2. La reconstitución: precipitado en el Tipo 1 agua, el sobrenadante en el pulidor de PBS. 3. Se corrigen las muestras para el liberación por 1 X 199 Medio y LPS: 154. 1065 pg/ml, y 68. 294 ng/ml. respectivamente. para IL-16 e IL-8. 4. Las osmolaridades para el medio y LPS son: 311 y 309, respectivamente. 5. Volumen de LPS agregó a los pozos: 1 Fuera. 6. Volumen total de pozos: 1000 \mul. 7. Los volúmenes de las muestras son equivalentes
Características fisicoquímicas
La composición, sus precipitados y sobrenadantes se separaron por HPLC de ión-intercambio. Ambos por la cromatografía AX 300 (intercambio aniónico) y por la cromatografía CMX 300 (intercambio catiónico), no hubo separación significativa de los componentes. La cromatografía en fase reversa hidrófoba no separó los picos.
Electroforesis capilar
El precipitado se analizó por electroforesis capilar. A pH alto, un pico absorbente W se observó a 190 nm pero desapareció completamente a 200 nm. No había ningún pico significativo a 214 nm de absorción de Uv.
El aminoácido libre no se visualiza a menos que se deriven. Se piensa que el pico W a 190 nm es probablemente una sal.
Ejemplo 13
La composición se evaluó para determinar la actividad estimuladora en los 3 sistemas indicadores siguientes: 1) la estimulación de la síntesis de ADN del linfocito; 2) la inducción de la función citotóxica del linfocito-mediante; y 3) la inducción de la función citotóxica del monocito/macrófago-mediante. Estos ensayos se escogieron para el escrutinio porque ellas miden funciones inmunológicas que se han mostrado por estar asociadas con parámetros clínicos diferentes en pacientes con la enfermedad maligna. Estos indicadores de la función inmune también pueden modularse en pacientes de cáncer que son tratados con respuesta biológica diferente modificando agentes tales como interferón o interleuquina-2. Los resultados del procedimiento de escrutinio inicial se presentan a continuación.
1) La estimulación de la síntesis de ADN del linfocito: la comparación con una concentración de estimulación óptima de fitohemaglutinina (PHA)
Estimulador Conteo por minuto
Medio 374
PHA 125,817
Composición (Nº 222) 1,116
composición (1:10) 1,021
composición (1:50) 649
Los resultados: contrario al mitógeno prototipo, PHA, la composición no estimula los linfocitos para experimentar blastogénesis y división celular.
2) La estimulación de la función citotóxica linfocito-mediante: la comparación con una concentración de estimulación óptima de Interleuquina-2 (IL-2)
Estimulador Unidades Líticas
Medio 30,8
IL-2 472,5
Composición (básica) 48,1
composición (1:10) 33,3
composición (1:50) 44,8
Resultados: A diferencia del estimulador prototipo de la función citotóxica del linfocito, la Interleuquina-2, la composición no revela citotoxicidad del linfocito.
3) Estimulación de la función citotóxica del monocito-mediante por la composición: la comparación con gamma interferón & endotoxina (y-IFN + LPS)
Resultados: La composición es capaz de estimular monocitos de sangre periférica para expresar la función tumoricida en una forma dependiente de la dosis. La magnitud de la estimulación es comparable a aquella lograda por el activador del macrófago prototipo la combinación de yIFN + LPS. Es importante reconocer que la acción de la composición en estos ensayos in vitro no requiriera la adición de endotoxina como en el caso con cualesquiera otros activadores del macrófago. Si la composición está libre de la contaminación de endotoxina, su actividad biológica en este ensayo de activación del macrófago sería considerada biológicamente significativa.
Estimulador, (EJT=20/1) Citotoxicidad, %
Medio 4,3
IFN +LPS 24,4
Composición (básica) 19,7
composición (1:10) 20,0
composición (1:50) 11,5
Estudios monocito/macrófago con la composición
Debido a que los procedimientos de reconocimiento demostraron que la composición no estimula las funciones del linfocito pero puede estimular las funciones del monocito, se apuntaron estudios siguientes a la caracterización adicional de las actividades estimuladoras monocito/macrófago de este compuesto. Varios estudios comparativos apuntaron a determinar las características de respuesta de dosis de la composición en la estimulación de la función tumoricida del monocito/macrófago, se realizaron tantos lotes diferentes del compuesto como ensayos. El énfasis principal de los estudios era probar la capacidad de la composición de simular la función tumoricida en los monocitos y macrófagos de los sitios anatómicos diferentes de pacientes de cáncer. La hipótesis central que guía estos estudios es que la eficacia terapéutica de cualquier estimulador biológico dependerá, principalmente, en su habilidad de sacar la función tumoricida en ambientes que contienen la enfermedad maligna. Eso podría ocurrir por el estímulo directo de células inmunes residentes en los microambientes del tumor. Alternativamente, esto podría ocurrir por el estímulo de circular las células inmunes si esas células eran luego capaces de alojarse en los sitios de la enfermedad maligna y funcionar en ese ambiente. Para estas investigaciones, lo siguiente se contó en: 1) los monocitos de sangre periférica de los pacientes de cáncer y los sujetos de control; 2) los macrófagos alveolares de los pacientes de cáncer pulmonar y pacientes de control con enfermedades del pulmón no-malignas; y 3) los macrófagos peritoneales de pacientes con malignidades ginecólogas.
1. Respuesta de dosis y los estudios de lotes diferentes con la composición
Estos estudios confiaron en monocitos de sangre periférica para probar las actividades estimuladoras de dosis diferentes y los lotes diferentes de la composición. Se mantuvieron probando tres lotes de la composición. Éstos eran designados como los lotes Nºs 216, 219 y 222. Cada lote de la composición se probó sin dilución (limpio), a una dilución 1:10 y a una dilución 1:50 del material. Los resultados se describen gráficamente en figura 24.
Los resultados: los Lotes N º222 y 216 estimulan la funcionan tumoricida del monocito, el Lote Nº 219 no lo hizo. Al parecer el lote Nº 222 era superior al 216 en estas investigaciones preliminares. El lote Nº 222 parece estimular niveles equivalentes de función tumoricida al no diluido (limpio) y la concentración de dilución 1:10 con menos, pero todavía actividad perceptible a la dilución 1:50. El lote Nº 216 dio la mayor estimulación de función tumoricida a la concentración no diluida (limpio), con menos actividad la dilución 1:10 y ninguna actividad perceptible la dilución 1:50. Como se declaró anteriormente, el Lote Nº 219 no logró función tumoricida perceptible del monocito a cualquiera de las concentraciones ensayadas.
2. Función tumoricida en los monocitos de sangre periférica
Se han realizado los ensayos en 4 muestras de monocitos de sangre periférica de los sujetos de control. Estos ensayos utilizaron una concentración estimulante óptima de la composición (la dilución 1:10 del lote Nº 222) y una concentración de estimulante óptima de y-IFN + LPS. Las células marcadas en estos estudios eran una cultivada, línea celular NK-insensible, el Hepatoma de Chang.
Estimulador, (EJ T= 20/1) Citotoxicidad, %
Medio 5,4 \pm 1
y-IFN + LPS 18,6 \pm 4
Composición 22,3 \pm 6
También se realizó un ensayo en 1 muestra de monocito de un paciente con cáncer cervical. Este ensayo era importante porque las propias células tumorales del paciente estaban disponibles para ser usadas como las células marcadas en el ensayo. Como antes, este ensayo utilizó una concentración estimulante óptima de la composición (la dilución 1:10 del lote Nº222) y una concentración estimulante óptima de y-IFN + LPS. También, la relación celular efecto/marca se redujo a 15/1 para conservar las células tumorales del paciente.
Estimulador, (EJT = 20/1) Citotoxicidad, %
Medio 5,5
y-IFN + LPS 14,4
Composición 20,9
Resultados: En los monocitos de sangre periférica de los sujetos de control, la composición estimuló la función tumoricida del monocito contra el Hepatoma de Chang a un nivel igual o mayor que el nivel logrado por una concentración estimulante óptima de y-IFN + LPS. En los monocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer cervical, la composición estimuló la función tumoricida contra las propias células tumorales del paciente a un nivel que excedió lo logrado por y-IFM + LPS por >30%.
3. Función tumoricida en los macrófagos peritoneales de los pacientes con malignidades ginecólogas
Estos ensayos se realizaron en muestras de macrófagos peritoneales aisladas de los fluidos del lavado de 1 paciente con cáncer cervical y 1 paciente con Cáncer Ovárico. Estos ensayos se realizaron con las propias células tumorales del paciente como las células marcadas en el ensayo. Como antes, una concentración estimulante óptima de la composición (la dilución 1:10 del lote Nº 222) y una concentración estimulante óptima de y-IFN + LPS se compararon. También, la relación celular efecto/marca se redujo a 15/1 para conservar las células tumorales del paciente.
Estimulador Cáncer cervical Cáncer de ovarios
Medio 8,2 0,6
IFN + LPS 29,8 4,1
Composición 13,2 8,9
Resultados: Estos resultados del ensayo resaltaron el hecho de que el ambiente del tumor local puede ser un determinante de la respuesta de las células inmunes a los activadores inmunológicos. En este caso de cáncer cervical, había ninguna evidencia patológica de enfermedad maligna dentro de la cavidad peritoneal y el desarrollo de la función tumoricida contra el autologous del tumor era mejor con y-IFN + LPS que con la composición. En el paciente con el cáncer ovárico, había tumor significativo en la cavidad peritoneal. La respuesta contra el propio tumor del paciente a y-IFN + LPS era a lo sumo mínima, mientras que la respuesta a la composición era mayor.
4. Función tumoricida en los macrófagos alveolares de los pacientes de cáncer pulmonar y sujetos de control
Estos ensayos se realizaron en muestras de macrófagos alveolares aisladas de los fluidos de lavado bronco alveolar de un paciente con cáncer pulmonar de célula no-pequeña y 3 pacientes con enfermedades no-malignas del pulmón. Estos ensayos utilizaron una concentración estimulante óptima de la composición (la dilución 1:10 del lote Nº 222) y una concentración estimulante óptima de y-IFN + LPS. Las células marcadas en estos estudios eran las células del Hepatoma de Chang y la relación celular efecto/marca fue 20/1.
Estimulador Pacientes de cáncer Control
Medio 2,6 \pm 2 19,54 \pm 4
y-IFN +LPS 10,9 \pm 13 1,2 \pm 5
Composición 5,2 \pm 2 18,6 \pm 8
Resultados: Los resultados: Los macrófagos alveolares de los pacientes de cáncer pulmonar se dañan en su desarrollo de función tumoricida en respuesta a activadores del macrófago convencionales como el y-IFN + LPS. Estos resultados son consistentes con esta observación; ellos muestran que la función tumoricida de macrófagos alveolares de los pacientes de cáncer pulmonar está muy reducido comparado a los sujetos de control. Ellos también muestran que la composición no activa la función tumoricida en los macrófagos alveolares de pacientes de cáncer pulmonar o los macrófagos alveolares de sujetos de control con enfermedades no malignas del pulmón.
Estos ensayos preliminares in vitro con la composición demuestran que es un activador del macrófago. El material proporcionado pudo lograr actividad tumoricida en un ensayo de citotoxicidad patrón contra ambos una línea celular NK insensible y contra células tumorales humanas recientemente disociadas. La actividad lograda también se encontró ser la dependencia de la concentración en estos ensayos. La capacidad de la composición para activar la función tumoricida del macrófago in vitro es comparable a la mejor combinación activadora del macrófago presentemente disponible, a saber, y-lFN + endotoxina. Como se declaró anteriormente, la capacidad de la composición de lograr este nivel de función tumoricida en la ausencia de endotoxina sería considerada importante biológicamente si el material está libre de contaminación de endotoxina.
Como se ha encontrado para otros activadores del macrófago, la actividad de la composición en la estimulación de la función tumoricida del macrófago varía con la fuente del macrófago. Al parecer la composición es un activador excelente de los monocitos de sangre periférica equivalente a y-IFN + LPS con los donantes normales y posiblemente superior al y-IFN + LPS con los donantes pacientes de cáncer. La enfermedad maligna tiene un impacto significativo en el desarrollo de la función tumoricida del monocito dependiendo del activador usado (Braun et al, 1991). Un determinante de la actividad biológica de activadores del macrófago diferentes en monocitos de pacientes de cáncer es la sensibilidad del activador al metabolismo del ácido araquidónico y la secreción, por la célula de prostaglinas. De estos estudios iniciales con la composición, parece que la actividad lograda con el compuesto no es sensible a los efectos inhibitorios de prostaglinas. Si puede demostrarse la insensibilidad de la prostaglina definitivamente para los monocitos de pacientes de cáncer estimulados con la composición, esto sería considerado importante terapéuticamente desde que la efectividad de muchos otros activadores biológicos está limitada por las prostaglinas. Los estudios preliminares con 2 especímenes indican que la composición puede tener buena actividad en los macrófagos peritoneales; particularmente cuando la enfermedad maligna se presenta en la cavidad peritoneal.
Estos resultados preliminares también ilustran lo que se ha encontrado cuando se comparó la capacidad de diferentes activadores para estimular la función tumoricida en los macrófagos peritoneales de pacientes con malignidades ginecólogas diferentes. En esos estudios, se encontró que la presencia de enfermedad maligna dentro de la cavidad peritoneal influye en la sensibilidad de los macrófagos peritoneales a los activadores específicos. En los pacientes con el cáncer cervical, la enfermedad maligna no está en general presente en la cavidad peritoneal, y así, la respuesta de los macrófagos residentes a y-IFN + LPS es normal. Cuando la enfermedad está presente en la cavidad, sin embargo, como en el caso con el cáncer ovárico, la respuesta al y-IFN + LPS se suprime. Esto está se refiere, en parte, a cambios en el metabolismo del ácido araquidónico de los macrófagos peritoneales cuando la enfermedad maligna está presente (Braun et al, 1993). El hecho de que la composición puede activar al parecer la función tumoricida en los macrófagos peritoneales de los pacientes de cáncer ovárico contra las propias células tumorales del paciente puede reflejar, una vez más, un mecanismo para la activación que es independiente de la vía metabólica del ácido araquidónico.
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Por otro lado, la composición no activa claramente los macrófagos alveolares para volverse tumoricida si la enfermedad maligna está presente en el pulmón o no. Se han encontrado macrófagos alveolares de los pacientes de cáncer pulmonar para ser inhibidos significativamente en su desarrollo de la función tumoricida cuando se comparó a monocitos de sangre periférica de los mismos pacientes o para controlar los macrófagos alveolares de los pacientes con enfermedades del pulmón no-malignas (Siziopikou et al., 1991). Así, la falta de actividad de la composición en este caso no es sorprendente.
Ejemplo 14
Se investigó el desarrollo de función tumoricida en respuesta a la composición de la invención y otros activadores del macrófago en monocitos de sangre periférica y macrófagos peritoneales de los pacientes con enfermedades ginecológicas. Más particularmente, la población de pacientes consistió de 7 pacientes, 3 con enfermedad benigna y 4 con enfermedad maligna (2 cánceres ováricos, 1 cáncer endometrial, y 1 cáncer cervical). Las muestras se tomaron de los pacientes al tiempo del procedimiento quirúrgico. Se aislaron preparaciones que contienen monocitos de sangre periférica se aislaron de muestras de sangre usando el procedimiento establecido en Braun et al. Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990 y preparaciones conteniendo macrófagos peritoneales se aislaron como se estableció en Braun et al., Cancer Research 53:3362, 1993. La citotoxicidad celular del tumor en respuesta a la composición de la invención (dilución 1:10 del lote usual 222) y otros activadores a saber el interferón gamma (100 U/ml), interleuquina-12 (500 U/ml), y monocito-CSF (500 U/ml) se evaluaron usando el ensayo de citotoxicidad del monocito descrito en Braun et al., Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990.
Los resultados como se muestran en la Tabla 34, demuestran que la composición de la invención estimula la función tumoricida en ambos los monocitos de sangre periférica y los macrófagos peritoneales de los pacientes con enfermedades ginecólogas malignas y no-malignas. La citotoxicidad del tumor lograda por la composición de la invención es igual a o mayor que aquella lograda por otros estimuladores biológicos que se probaron.
TABLA 34 Desarrollo de la función tumoricida en respuesta a la composición de la invención y a otros activadores de macrofagócisis en los monocitos de sangre periférica y los macrófagos peritoneales de los pacientes con enfermedades ginecológicas (3 enfermedades benignas, 4 enfermedades malignas)
39
Ejemplo 15
El efecto de la indometacina, un inhibidor de la síntesis de prostaglina, en el desarrollo de función tumoricida en respuesta a la composición de la invención y otros activadores del macrófago en monocitos de sangre periférica de los pacientes de cáncer también se investigó. Se probaron muestras de los pacientes con la enfermedad maligna en el Ejemplo 14 usando el sistema de ensayo como se describe en el Ejemplo 14 con la excepción de que la indometacina (hasta 5 ng/ml) se agregó simultáneamente con la composición de la invención, interleuquina-12 (500 U/ml), y monocito-CSF (500 U/ml).
Los resultados como se muestran en la Tabla 35 indican que la indometacina aumenta la citotoxicidad en la respuesta a IFNa, GM-CSF y N-CSF. Así, el desarrollo de función tumoricida en respuesta a IFN-y, GM-CSF, y M-CSF fue regulada por una función indometacina-sensibilidad. En contraste, el desarrollo de función tumoricida en la respuesta a Phorbol Ester (PNA), IL-12 y la composición de la invención no se reguló por una función indometacina-sensibilidad es decir la indometacina no aumentó la citotoxicidad en la respuesta a la composición de la invención, IL-12 y PNA.
TABLA 35 Efecto de la endometacina, un inhibidor de la síntesis de prostaglandina, en el desarrollo de la función tumoricida en respuesta a la composición de la invención y a otros activadores de macrofagócisis en monocitos de sangre periférica de los pacientes de cáncer
40
Ejemplo 16
Fue investigado el efecto de prostaglina E2 en el desarrollo de función tumoricida en respuesta a la composición de la invención en presencia de indometacina. La población de sujetos consistió de uno normal y ocho pacientes (un paciente con un tumor pancreático, dos pacientes con tumores de cabeza y cuello, uno con endometriosis, y cuatro con VIH). Se aislaron preparaciones que contienen monocitos de sangre periférica de las muestras de sangre de los pacientes usando el procedimiento establecido en Braun et al. Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990. La citotoxicidad en las células tumorales en respuesta a la composición de la invención (dilución 1:10 del lote usual 222) e indometacina (hasta 5 g/ml), con o sin PGE2(108M), se evaluó usando el ensayo de citotoxicidad de monocito descrito en Braun et al., Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990.
Los resultados en la Tabla 36 muestran que 36 niveles patofisiológicos de PGE2(108M) no suprimió el nivel de función tumoricida que desarrolló en respuesta a la composición de la invención. Esto está en contraste con la capacidad de PGE2 de suprimir la función tumoricida en monocitos estimulados con y-interferón (Braun et al, Cancer Research 53: 3362, 1993).
TABLA 36 Efecto de la Prostaglandina E2 en el desarrollo de la función tumoricida en respuesta a la composición de la invención en la presencia de endometacina
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Ejemplo 17
El desarrollo de función tumoricida contra el autologous de las células tumorales en monocitos estimulados con la composición de la invención fue investigado. Se aislaron preparaciones que contienen los monocitos de sangre periférica de las muestras de sangres de 6 pacientes (tres cánceres ováricos; un cáncer endometrial, un cáncer cervical y un cáncer de ENT) usando el procedimiento establecido en Braun et al., 1990. La citotoxicidad celular del tumor en respuesta a la composición de la invención (dilución 1:10 del lote usual 222) e indometacina (hasta 5 g/ml), con o sin PGE(108 N) se evaluó usando el ensayo de citotoxicidad de monocito descrito en Braun et al., 1990, con la excepción de que las células tumorales de los pacientes se usaron en lugar de las células del Hepatoma de Chang. Las células tumorales de los pacientes se trataron con colagenaza y DNase, se prepararon las preparaciones celulares solas, y las células se etiquetaron como se describe en Braun et al. 1990.
Los resultados mostrados en la Tabla 37 demuestran que la composición de la invención es capaz de activar los propios monocitos del paciente para matar el tumor del paciente. La composición de la invención es por lo menos tan eficaz como los activadores biológicos normales que están usándose actualmente.
TABLA 37 Desarrollo de la función tumorídica respecto a las células tumorales autólugas en monocitos estimulados con la composición de la invención (Virulizin)
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Los resultados experimentales en los Ejemplos 14 a 17 indican que la composición de la invención es capaz de activar los monocitos para expresar la función tumoricida, y es por lo menos tan eficaz como otros activadores que se usan actualmente en la escena clínica; funciona en la sangre con los macrófagos peritoneales; y, al parecer no está sujeta a los efectos inhibitorios de prostaglinas que es una de las formas principales de inmuno supresión en pacientes. Los datos experimentales también apoya la utilidad de la composición en el tratamiento de malignidades peritoneales y ginecólogas.
Ejemplo 18 Estudios de toxicidad iniciales
Se llevaron a cabo los estudios de toxicidad en una variedad de especies animales. Los estudios se resumen en la Tabla 38. Todos los animales se evaluaron en base a la observación clínica diaria mientras reciben las inyecciones en los días 14, 21 y 30 después de esto. Ningún efecto adverso se notó a lo largo del período que se administraron las inyecciones o durante el período siguiente (un mes para todas las especies excepto los perros que se siguieron durante 4 meses).
TABLA 38
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Los datos hematológicos recopilados cada tercer día durante los primeros 30 días y una vez al mes después de esto.
Un estudio de toxicidad fue dirigido a determinar el efecto de una sola dosis intramuscular grande de la composición. Trece ratas recibieron una sola dosis intramuscular de 5 ml/kg de la composición. Se observaron tres ratas durante 7 días. Se observaron diez ratas durante 14 días seguidos por la eutanasia y la necroscopia. Ningún síntoma de toxicidad se observó en cualquier grupo y ningún resultado patológico grueso se observó en los animales que fueron necrosados. Basado en éstas observaciones el LD_{50} para la administración intramuscular de la composición en las ratas fue determinado, siendo mayor que 5 ml/kg. La Tabla 39 resume estos resultados.
TABLA 39 Estimación de LD50 en las ratas Sprague-Dawley
Animal Cantidad Admin. Dosis Ruta, Unid/kg * LD_{50}
Ratas Sprague Dawley 3 varones i.m 5 ml/kg 52,5 >5
10 (5 varones / 5 i.m. 5 ml/kg 52,5 >5 ml/kg
hembras)
* Las unidades se calcularon en el intervalo esperado de bioactividad del Lote Nº 80201 medida a 10,5 unids/ml.
Ensayo de toxicidad en los perros
En un estudio dirigido por el la Universidad Veterinaria de Ontario, la composición se administró a dos perros de raza mezclada. El protocolo se resume en la Tabla 40. En cada caso que una dosis se dio después en la pierna derecha y la segunda dosis se dio a los 7 días en la pierna trasera izquierda. Se observaron ambos perros durante 14 días después de la primera inyección. La actividad, el apetito, la temperatura, la velocidad del pulso, la velocidad respiratoria se supervisó diariamente dos veces a lo largo del estudio. Los. Se realizaron análisis de orina rutinarios y los perfiles de hematología y química de suero. Los pretratamientos a 24 horas, 72 horas. 7 días y 14 días después de la primera inyección. Ningún animal mostró señales de dolor asociadas con cualquier inyección. Había ninguna evidencia de anafilaxis asociada con la segunda inyección. No se observaron ninguna anormalidad o cambios físicos o de los parámetros de laboratorio que podrían atribuirse a la droga. La droga parecía ser tolerada bien por los perros saludables
TABLA 40 Estudio de toxicidad en los perros
Animal Edad y peso Dosis 1 unid. calculada* Dosis 2 unid. calculada* Intervalo de Dosis
Varón Adulto 5,5 ml i.m 0,6 ml i.m 7 días
Raza mezclada 5 kg 28,6-50,6 unid. 3,1-5,5 unid
Hembra 6 meses 12,5 ml i.m 1,3 ml i.m. 7 días
Raza mezclada 13 kg 65,0-115,0 unid 6,8-12,0 unid.
Tratamiento de animales con neoplasmas maligno
La composición de la invención se usó clínicamente en un hospital veterinario para el tratamiento de varios tumores malignos en animales de compañía. Se trataron once gatos y diez perros con enfermedad neoplásica avanzada que no respondía a la terapia convencional con la composición dada intramuscular en dosis semanales. La Tabla 41 (que se adjunta a esta memoria descriptiva en las páginas 1-3 de la presente solicitud) resume los casos clínicos individuales en este estudio. El número de inyecciones fue de 2 a 69, con los volúmenes hasta 7,5 ml dados en un solo sitio intramuscular. Los protocolos de inyecciones semanales permitieron el examen y la supervisión cuidadosa de los casos individuales con ensayos de diagnóstico, determinadas individualmente para cada caso. El médico notó que no había ninguna irritación local ni reacciones alérgicas severas, incluso anafilaxis. El médico y los dueños de los animales no observaron ninguna reacción adversa sistémica. Los investigadores notaron algunas mejoras clínicas consistentes en reducciones menores, apetito mejorado y niveles de actividad, ganancia de peso significante en unos animales y una disminución en el dolor y/o incomodidad.
Los resultados clínicos se resumen como sigue: Seis animales (3/10 caninos y 3/11 felinos) experimentaron respuesta completa. Un animal (1/11 felinos) tenía la respuesta parcial mayor inicial. Once animales (5/10 caninos y 6/11 felinos) la respuesta parcial menor experimentada. Un animal (1/10 caninos) permanecía estable y un animal (1/11 felinos) no respondió. La Tabla 42 proporciona definiciones de cada tratamiento. La experiencia clínica en los animales hizo pensar en un papel potencial para la composición en el tratamiento de neoplasias malignas.
TABLA 42
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Ejemplo 19 Ensayos clínicos preliminares
Se trataron pacientes con tumores intratables con 0,11 ml por kilogramo de la composición de la invención por kilogramo de peso de los pacientes, tal como se preparó (de acuerdo con los métodos establecidos en el Ejemplo 1). La composición se dio intramuscularmente cada tres a cinco días. De los 58 pacientes tratados no había absolutamente ninguna toxicidad significativa. En los 37 pacientes evaluables tres pacientes tenían respuestas menores es decir encogimiento del tumor entre 25 y 50 por ciento, y cinco pacientes tenían enfermedad estable de por lo menos ocho semanas de duración. Los resultados más interesantes estaban en los pacientes pancreáticos que parecían tener los resultados más alentadores. De los siete pacientes un paciente tenía la estabilizada la enfermedad durante un 11 meses completos. Y un segundo paciente con la enfermedad sumamente avanzada tenía estabilizada la enfermedad durante cuatro meses. Basado en estos resultados el carcinoma del páncreas se seleccionó para un estudio básico de la composición de la invención. El objetivo del estudio era determinar la seguridad y eficacia de la composición en este grupo de pacientes.
El tratamiento consistió en la composición de la invención 0,11 ml por kilogramo con una dosis mínima de 7.5 ml dados como una sola inyección intramuscular profunda al máximo del glúteo. Los pacientes recibieron el tratamiento tres veces por semana durante la primera semana y luego dos veces por semana hasta la progresión de la enfermedad. Entre todos, se matricularon 22 pacientes en este estudio y todos eran evaluables para la toxicidad. Sólo 17 pacientes eran evaluables para la eficacia. Con un total de 570 inyecciones no hubo ninguna toxicidad de cualquier tipo informada local o sistémica. No hubo tampoco ninguna respuesta objetiva. Seis pacientes sin embargo tenían la enfermedad estable durante tres meses o más pero el resto de los pacientes progresó dentro de los primeros tres meses. La supervivencia media era ocho meses desde el momento del diagnóstico. Había una supervivencia media de cuatro meses desde la primera inyección. Había tres pacientes que tenían la enfermedad estable por mayor tiempo que seis meses. Un paciente, un hombre de 75 años recayó con metástasis de hígado 18 meses después de un procedimiento liberal. Él permanecía completamente estable en la composición durante ocho meses antes de progresar. Una mujer de 71 años con la enfermedad no reversible permaneció estable durante por lo menos diez meses y continuó para trabajar a tiempo completo. Una mujer de 64 años que recayó cuatro meses regionalmente después de que el procedimiento era estable durante por lo menos ocho meses.
Un cuarto paciente que tenía carcinoma inoperable del páncreas y no podría matricularse en el estudio porque el tejido no pudiera obtenerse para un diagnóstico patológico, era estable durante casi un año aunque su tumor progresó a pesar de las dosis superiores de la composición. En el resumen, la composición no tiene ningún sitio de actividad tóxica contra el cáncer pancreático a este esquema de la dosificación. Había una sugerencia de actividad antiproliferativa temporal en una minoría de casos con esta enfermedad usando la composición.
Ejemplo 20 Cáncer pancreático estudios clínicos
Un ensayo Fase II con la composición de la invención se empezó para pacientes con apreciable cáncer pancreático, biopsia-ensayado. La composición se administró como una 7.5 ml (0,11 ml/kg) inyección intramuscular 3 veces por semana durante 1 semana luego dos veces por semana hasta progresión de la enfermedad.
Los detalles del estudio se establecen a continuación.
Método
El tratamiento consistió en la composición preparada como en el Ejemplo 1, 0,11 ml/kg (dosis mínima 7.5 ml) administrada con una sola inyección intramuscular profunda al máximo del glúteo, nalgas alternas con cada dosis. Los pacientes recibieron 3 inyecciones durante la primera semana seguida por dos inyecciones por semana hasta progresión del tumor.
La respuesta se definió usando el criterio tipo. (Miller et al., Cancer 1981; 47:207-214). Una respuesta completa (CR) se definió como la desaparición completa de toda evidencia de enfermedad durante por lo menos 4 semanas. Una respuesta parcial (PR) se definió como una reducción > 50% en el producto de los dos diámetros perpendiculares mayores de la lesión apreciable más grande, sin nuevas lesiones o progresión de cualquier lesión, durante por lo menos 4 semanas. La enfermedad progresiva se definió como un 25%, o más de incremento en el tamaño de una o más lesiones apreciables o la aparición de nuevas lesiones. La enfermedad no encontrándose criterio para respuesta o la enfermedad progresiva se denominaba enfermedad estable.
Resultados
Un total de 22 pacientes se matricularon en el estudio, pero cinco pacientes se consideraron inestimables para la eficacia. No había ninguna respuesta completa o parcial. Tres pacientes tenían progresión de la enfermedad dentro del primer mes. Seis pacientes tenían estabilización de la enfermedad por más de 3 meses (3.5, 3.5, 5, 8, 12+, 14+). La supervivencia media para el grupo entero era de 8 meses desde la fecha de diagnóstico y de 5 meses desde el inicio del tratamiento. Un paciente con metástasis de hígado biopsia-ensayado y un CEA de 37 ng/ml (normal < 3 ng/ml), tenía estabilización absoluta de las metástasis del hígado y CEA durante 8 meses. Uno tenía la enfermedad estable durante 5 meses. Un paciente tenía la recaída de la enfermedad en su cama pancreática 4 meses después de un procedimiento de Whipple y se estuvo estable en la composición durante por lo menos un año, con la excepción de un retardo del crecimiento CEA. Un tercer paciente tenía un stent percutáneo insertado y continuó trabajando la jornada completa durante por lo menos 14 meses sin la evidencia de progresión del tumor.
Los 22 pacientes todos eran evaluables para la toxicidad, después de haber recibido un total de más de 500 inyecciones. Ninguno desarrolló alguna evidencia clínica o de laboratorio de toxicidad relacionada con la droga. No había efecto perjudicial en la calidad de vida que generalmente va paralela a la actividad de la enfermedad. Ningún cambio significativo en los conteos de glóbulos blancos totales, los conteos absolutos de linfocitos en la inmunoglobulina del suero se vio.
Las curvas de supervivencia representan los tiempos de supervivencia desde el inicio del diagnóstico y el tratamiento se presenta en las figuras 13 y 14, respectivamente. Para la comparación, una curva de supervivencia histórica de Gudjonsson (1987) ha sido sobre impuesta en la figura 13. Otro ejemplo de una curva de supervivencia histórica comparable puede encontrarse en Bakkevold, Petterson, Arnesjo y Espenhaug (1990).
Se resumen los resultados de los análisis de supervivencia en la Tabla 43. El tiempo de supervivencia malo para el diagnóstico era 281 días (figura 13). La supervivencia media era 182 días (aproximadamente 5 meses). Para la comparación, Gudjonsson (1987) informó la supervivencia mala de sus 188 pacientes quirúrgicos como 208 días con una supervivencia media de 120 días. El tiempo de supervivencia malo desde el inicio del tratamiento era 166 días (figura 14). La supervivencia media era 133 días (aproximadamente 4 meses y 1 semana).
TABLA 43
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También se estimaron tiempos de supervivencia entre un subconjunto de pacientes evaluables que habían cada uno recibido 1310 inyecciones por lo menos. Catorce de los 22 pacientes eran evaluables. Entre estos pacientes (Tabla 43), la supervivencia media del diagnóstico era 219 días (aproximadamente 7 meses y 1 semana). La supervivencia media del inicio del tratamiento era 146 días (aproximadamente 5 meses).
Ejemplo 21 Ensayos clínicos del re melanoma maligno
El melanoma maligno avanzado fue definido para incluir todos los pacientes de las fases III o IV y las recaídas todas loco-regionales o distantes que ocurren después del tratamiento primario. El tratamiento tipo por que todos los otros tratamientos se juzgan es DTIC (dacarbazina) que tiene una taza de respuesta reportada de aproximadamente 15%. La respuesta media es 3-6 meses, y se acompaña de náusea severa y vomito, y un efecto colateral potencialmente letal de necrosis aguda del hígado por la trombosis de las venas hepáticas. Este tratamiento no muestra cualquier ventaja de supervivencia definitiva.
Este estudio fue dirigido para determinar la seguridad y eficacia de la composición de la invención y su efecto en la supervivencia y la calidad de vida, al usarse en pacientes con melanoma maligno avanzado. El estudio 25, era un ensayo no comparativo multicentro.
Se usó un esquema de dosis inicial de 7.5 ml de la composición de la invención inyectados intramuscularmente 3 veces por semana. Después de que ninguna toxicidad de órgano o de médula se observó, el esquema de carga se aumentó a inyecciones diarias durante 15 días, seguidos por el mantenimiento de 3 inyecciones por semana. Como consecuencia la dosis de carga se aumentó a 30 días. La duración de tratamiento era 36 semanas y luego se redujo a 16 semanas después de que se dio a los pacientes la opción de entrar en un protocolo de continuación.
Treinta y tres pacientes con melanoma avanzado se incluyeron en la población del estudio (17 hembras y 16 varones), comprendidos en la edad de 17 a 85 años. Se habían tratado previamente el 64% y no tratados el 36%. De los 33 pacientes incluidos en la población del estudio, veinte cinco fueron evaluables. El Estado de Actuación Karndesky (línea base) estaba en el intervalo de 40-100%, la media 80%. Once pacientes estaban vivos al final del período del estudio y cinco de éstos estaba bajo tratamiento.
Una respuesta parcial menor se observó en 16/33 pacientes (48%). Un paciente tenía una reducción de 33% en los pulmones, seis pacientes tenían reducciones de dolor y ocho pacientes ganaron más de 1000 gramos de peso en más de un mes (Intervalo 1000-2600 gramos). Una condición estable se observó en 19/33 pacientes (58%) (Intervalo 60-170 días, 77 días promedio).
Las figuras 15, 16 y 17 muestran la supervivencia de pacientes tratados con la composición de la invención comparada con los controles históricos, medida como la supervivencia del diagnóstico de metástasis/recurrencia en días. La línea continua representa la curva de supervivencia para pacientes tratados con la composición de la invención y la línea interrumpida representa la curva de supervivencia histórica (Lote, C. M. et al., Cutaneous Nelanoma, 2º. ed. 1992, Chps. 14y39, pp. 165-187 & 499-508, Lippincott Co., Philadelphia, Penn.). La supervivencia de todos los pacientes tratados con la composición de la invención; incluso los pacientes con uno a más de tres sitios de tumor, se muestran en Figura 15. La supervivencia de pacientes con dos sitios de tumor y con tres o más sitios de tumor se muestra respectivamente en las figuras 16 y 17.
El grupo de todos los pacientes tratado con la composición de la invención tenía una supervivencia del 39% (estimación de Kaplan-Meier) a un año. La taza de supervivencia a un año para todos los pacientes de melanoma maligno avanzado (AMM) es aproximadamente 11% en los controles históricos (emparejado por el número de sitios de tumor). El grupo tenía una supervivencia media de 315 días comparada con la media histórica de 89 días.
Con dos sitios tumorales el de un año de supervivencia era del 49% en los pacientes tratados con la composición de la invención, comparado con 13% en los controles históricos. Este grupo tenía una supervivencia media de 360 días comparada con la media histórica de 120 días. Con tres o más sitios de tumor el de un año de supervivencia era de 31% en los pacientes tratados con la composición de la invención, comparado con 0% en los controles históricos. El grupo con tres o más tumores tenía una supervivencia media de 205 días comparada con la media histórica de 60
días.
La calidad de vida se evaluó por la ganancia de peso, estado de actuación (Karndesky), Calidad de Índice de Vida (Spitzer) y escala de dolor (Análogo Lineal). El peso ganado en el tiempo se muestra en la Tabla 39.
TABLA 44
Número de pacientes/evaluable 1 mes 2 mes 3 mes 4 mes 5 mes 6 mes
11/25 12/25 4/25 4/25 1/25 1/25
Porcentaje, (%) 44% 48% 16% 16% 4% 4%
Intervalo 100- 200- 100- 100
(gr) 2400 6000 1000 2000
Media (gr) 900 1480 525 775 100 2000
Las escalas de Karndesky y Spitzer son ambas subjetivas y se encontraron estar de acuerdo aproximadamente cada una individualmente. Quince pacientes no informaron ningún cambio en estos parámetros. Cuatro pacientes mostraron fluctuaciones que después volvieron a los niveles anteriores. Un paciente tenía una disminución (de 40-20%).
Los resultados de la evaluación del dolor mostraron que en seis pacientes por semana en 4 el dolor cayó de 5 (peor posible) a 2 (medida) ó 0 (ningún dolor). Un paciente tenía una caída en el dolor de 3 a 0. Un paciente con la metástasis hepática tenía reducción del dolor a 0 y estabilización durante 11 meses. Nueve pacientes que entraron en el estudio con 0 dolor mantuvieron ese nivel a lo largo del estudio. Cinco pacientes tenían un moderado (unidad 2) aumento en el dolor. Tres pacientes tenían aumentos de dolor pasajeros (unidades 1 a 2) durante el segundo o tercer mes.
Fuera de 1734 inyecciones administradas a 33 pacientes, 21 pacientes no tenían ninguna reacción de droga adversa. Se informaron catorce reacciones de droga adversas en 12 pacientes. Las reacciones de droga adversas normalmente ocurrieron a las semanas 4 ó 8 y eran de ligera a pasajera, y más frecuentemente era una fiebre de grado bajo.
La diferencia en la supervivencia entre los grupos históricos y los grupos protocolares tratados con la composición de la invención hace pensar en un beneficio de supervivencia para los pacientes tratados con la composición de la invención. El cáncer parecía estabilizar en 19 pacientes. Todos los pacientes tratados para AMM fueron incluidos en los datos de supervivencia. También fueron incluidos 21 pacientes previamente tratados (muchos ensayos clínicos requieren pacientes no tratados, debido a la prognosis pobre de tratamientos anteriormente fallados). La carga de tumor era alta (el 82% tenía más de un sitio de metástasis).
La supervivencia y calidad de los datos de vida sugieren que la mayoría de los pacientes recibiera algún beneficio del tratamiento. Once pacientes todavía estaban vivos al final del período de estudio y de esos 11, continuaban 5 el tratamiento.
Ejemplo 22 Melanoma maligno del protocolo patológico
Lo siguiente es un informe de una mujer de 73 años con el melanoma maligno progresivo del paladar duro y las encías. La figura 25 muestra dos vistas del melanoma maligno como se ve bajo el microscopio. En la figura 25a, vista de arriba a abajo, uno puede ver la capa epitelial con queratina acompañante, debajo que las células malignas empiezan a hacerse más manifiestas. Estas células del melanoma pueden verse que son redondas u ovaladas, con un citoplasma eosinofílico abundante, y núcleos hipercromáticos de pleomórficos. Estas células han sustituido el tejido submucosal normal. Los vasos sanguíneos que se ven parecen normales, y hay una escasez de cualquier clase de respuesta inflamatoria/inmune como se representaría por la presencia de leucocitos (células polimorfonucleares y mononucleares). Éste es un ejemplo de tejido de tumor que está creciendo, es decir la arquitectura tumoral está intacta.
En figura 25(b) una muestra de tejido de tumor se muestra del mismo paciente que había sido tratado con la composición durante dos meses. Empezó de arriba para abajo, uno puede ver que la continuidad del epitelio se ha roto por un proceso necrótico. Esta necrosis, mientras común en el centro de cualquier tumor que ha alcanzado una masa crítica, raramente se ve en la periferia, sobre todo en el melanoma maligno, y es una señal de que la respuesta inmune del anfitrión está montando un ataque contra el tumor. A lo largo de la fotografía están un número masivo de células diferentes de las células tumorales originales. Éstas son las células neutrófilas, linfocitos, inmunes a los macrófagos que han orquestado la ruptura de la arquitectura tumoral típica. Las paredes de los vasos sanguíneos se han infiltrado densamente con un número grande de células inmunes del anfitrión (flecha). Esta infiltración celular como consecuencia provocará la destrucción del vaso sanguíneo que a su vez impide al tumor recibir su suministro de nutrientes y oxígeno (necrosis isquémica). Esta respuesta inmune que contribuyó a la ruptura tumoral vista en esta diapositiva del tejido del paciente es consistente con los cambios informados conocidos por ser provocados por el TNF (factor de necrosis de tumor) y con los resultados del trabajo descritos en los ejemplos anteriores.
La respuesta inmune demostrada en el tratamiento posterior con la diapositiva de la composición (figura 25b) fuertemente enlaza la in vitro modulación inmune del TNF por la composición con los conocidos in vivo anti-tumorales efectos del TNF.
Del previo, se apreciará que, aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención en la presente solicitud con el propósito de ilustrar, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. En concordancia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones añadidas.
Ejemplo 23
Una muestra de 300 ml de la composición se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio en que la temperatura del baño no excedió 40ºC. Para asegurar que la solución permanecía básica durante la evaporación, se agregaron 5 gotas de una solución concentrada de hidróxido de amonio cada media hora a la composición hasta que la evaporación se completara. El residuo resultante tenía un peso de 11.6g.
20 ml de una solución concentrada de hidróxido de amonio al 10% en metanol se agregaron luego a 2 g del residuo anterior. El material insoluble se filtró y el filtrado se sometió al análisis cromatográfico a través de 101.93g de 60A flash silicagel en una columna con dimensiones de 5 cm. x 12.5 cm. El sistema disolvente usado era en hidróxido de amonio concentrado al 10% en metanol. La columna se pasó a una presión de 0,69 mPa y una tasa de flujo de 11 ml/min. Después que 100 ml de disolvente habían atravesado la columna, doce fracciones de 20 ml. se reunieron. La colección de estas fracciones se hizo en correlación con la cromatografía de capa delgada (TLC) de estas fracciones se pasó en placas de silicagel en una solución concentrada de hidróxido de amonio al 10% en metanol y se visualizó con un spray de nihidrina. Se combinaron fracciones con perfiles de TLC similares, produciendo las siguientes combinaciones de fracciones, que se secaron en un evaporador rotatorio.
Las fracciones 5-6, 7-8 y 9-10 tenían una reacción positiva con la nihidrina a un valor de Rf de 0,81.
Nº Fracción Volumen a través de la Rend. (g)
columna para la fracc
1-4 100-180 0
5-6 180-220 0,1175
7-8 220-260 0,1969
9-10 260-300 0,0151
11-12 300-340 0,0053
Ejemplo 24
Las fracciones 5-6 y 9-10 del Ejemplo 23 se probaron in vitro para estimular el TNF (de acuerdo con el Ejemplo 9). Los resultados se muestran a continuación:
Fracción Ensayo Actividad
5-6 Estimulación TNF por LPS 50 pg/mg
9-10 Estimulación TNF por LPS 1814 pg/mg
Así, la fracción 9-10 fue un estimulador de TNF sumamente activo.
Ejemplo 25
Las muestras de la Fracción 5-6 se analizaron por Espectroscopía Masa de Impacto de Electrón (ElMS) y Espectroscopía de Masa de Electrospray para identificar los compuestos específicos que probablemente están presentes en la fracción. La MS de Electrospray se realizó en un espectrómetro Perkin-Elmer Sciex API-III, usando como solución ácido acético al 5% en agua. En algunos casos, se agregó metanol para ayudar a la disolución. El ElMS se realizó usando una sonda de inserción directa en un espectrómetro ZAB-SE modelo analítico VG con glicerol como matriz, y usando una sonda de DCI en un Espectrómetro de Masa de Perfil Analítico Kratos.
Una revisión de los espectros resultantes indicó que los siguientes compuestos estaban probablemente presentes en la Fracción 5-6: fosfocolina; ácido taurocólico, colina-ácido esteárico diglicérido, ácido esteárico, ácido esteárico diglicérido, ácido esteárico ácido palmítico diglicérido, y un conjugado esfingosina-ácido oleico.
Ejemplo 26
100 ml de la composición se acidificaron con 4 ml de una solución 1 N de HCI de tal forma que el pH de la composición era igual a 3. La composición se extraída luego con tres porciones de 100 ml. de HPLC calidad diclorometano. Las fracciones de diclorometano se combinaron luego y secaron encima de una cantidad pequeña de sulfato de sodio anhidro. La solución de diclorometano se filtró luego a través de papel en un frasco de fondo redondo y se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio para un rendimiento de 0.0049g de una película castaña.
0,0017g de esta película se disolvieron en 214 ppm de solución de NH_{3}\cdotH_{2}O a pH 7, y se escrutó para la actividad de antiproliferación de como se estableció en el Ejemplo 4. Esta pantalla reveló que la solución era un antiproliferativo activo, con una actividad de 14 Unidades/mg.
Ejemplo 27
El Ejemplo 23 se repitió a una escala mayor, como sigue: 10 ml de una solución concentrada de hidróxido de amonio se agregó a 900 ml de la composición y la solución resultante se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio en el que la temperatura del baño no excedió 40ºC. Para asegurar que la solución permanecía básica durante la evaporación, se agregaron 5 gotas de una solución concentrada de hidróxido de amonio cada media hora a la composición hasta que la evaporación se completara, dejando un residuo.
Luego se agregaron 150 ml de una solución de hidróxido de amonio concentrado al 10% en metanol al residuo total. La solución se sometió al ultrasonido por 15 min. y el material insoluble se filtró. El filtrado se sometió al análisis cromatográfico a través de 1695 g de silicagel 60A Flash en una columna con dimensiones de 30 cm. x 12 cm. El sistema disolvente usado era solución de hidróxido de amonio concentrado al 10% en metanol. La columna se pasó a una presión de 0,41 mPa y una tasa de flujo de 30 ml/min. Los resultados de la columna se resumen a continuación en la tabla.
Fracción Nº Volumen de cada fracción Observaciones
(ml.)
1 550 sin color
2 450 sin color
3 400 sin color
4 150 sin color
5 100 sin color
6-7 75 sin color
8-13 50 sin color
14 50 solución tan coloreada comienza a eluir
15-35 50 solución tan coloreada
36-40 50 sin color
TLC se ensayó en placas de silicagel en una solución de hidróxido de amonio concentrada al 10% y se visualizó con un spray de nihidrina. Se combinaron fracciones que tienen perfiles similares de TLC, produciendo las siguientes combinaciones de fracciones, que se secaron en un evaporador rotatorio.
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Todas las combinaciones de fracciones desde la 15-16 hasta la Fracción 31-34 tenían una reacción positiva con nihidrina a un valor de Rf de 0,87, un valor muy similar al valor de Rf para las fracciones activas del Ejemplo 23. Las fracciones 24-30 y 31-34 tenían una reacción positiva adicional con la nihidrina a un valor de Rf de 0,85.
Ejemplo 28
Las fracciones 4-5, 15-16 y 17-18 se ensayaron in vitro para el efecto antiproliferativo (de acuerdo con el Ejemplo 4) y la estimulación del TNF (de acuerdo con el Ejemplo 9). Los resultados se muestran a continuación:
Fracción Ensayo Actividad
4-5 Efecto Antiproliferativo 4,7 unid/mg
4-5 Estimulación TNF
15-16 Efecto Antiproliferativo 4,5 unid/mg
15-16 Estimulación TNF
17-18 Efecto Antiproliferativo 3,9 unid/mg
17-18 Estimulación TNF -
Así, las fracciones 4-5, 15-16, y 17-18 mostraron actividad antiproliferativa, pero ninguna actividad estimuladora del TNF. El análisis elemental de las fracciones anteriores mostró que eran altas en NH_{4}CI, lo que inhibe la liberación y/o producción del TNF.
Ejemplo 29
Las muestras de las fracciones 15-16 y 24-30 se dializó y luego se analizó por espectroscopía de masa, usando los métodos descritos en el Ejemplo 25. Las muestras no dializadas de las fracciones 17-18 y 24-30 también se analizaron. Una revisión de los espectros resultantes indicó que los siguientes compuestos probablemente estuvieran presentes: ácido glicocólico, un trímero, la trihexosamina, y ácido taurocólico (Fracción 15-16); ácido esteárico, y un dímero de la hexosamina; y ácido glicocólico (Fracción 24-30).
Ejemplo 30
La composición se dializó en tubos de diálisis separados como sigue: 100 ml de la composición se pusieron dentro de un spectra/Por® CE tubo de membrana que tenía un corte de peso molecular 100. Se sellaron los extremos de la tubería con grapas y la tubería se puso en un baño agitado de 10 L de agua destilada. La diálisis se supervisó diariamente para eliminar 1 ml. de solución del tubo de diálisis y agregar 3-4 gotas de una 1/10 N solución de nitrato de plata. La presencia de cloruro indicaba que la diálisis no se completaba. Si la diálisis no se completaba el baño se reemplazaba con agua destilada fresca. La culminación de la diálisis ocurrió después de 3-4 días. Después de que la diálisis se completó, el material dializado se secó en un evaporador rotatorio para rendir un promedio de 0.3 mg de sólido por ml de volumen original.
Una muestra del material sólido se disolvió luego en HPLC calidad agua, y TLC se pasó sobre placas de silicagel en una solución de hidróxido de amonio al 10% en metanol, y se visualizó con un spray de nihidrina. Una reacción positiva con la nihidrina se obtuvo a un valor de Rf de 0,83.
Ejemplo 31
Una muestra de material sólido del Ejemplo 30 también se analizó por espectroscopía de masa, usando los métodos descritos en el Ejemplo 25. Una revisión de los espectros resultantes indicó que los siguientes compuestos estarían presentes probablemente: un conjugado esfingosina-ácido oleico, diacetil-ácido siálico, un dímero fucosa-hexosamina, ácido desoxiglicocólico, ácido taurocólico, un dímero ácido siálico-fucosa, y un trímero di(fucosa)hexosamina.
Ejemplo 32
Los resultados anteriores indicaron que los componentes activos de la composición (por lo menos según un ensayo de liberación de TNF\alpha) estaban presentes en las fracciones no enlazadas (volumen nulo) después de la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) en un C_{18} \muBondapack la columna. También, la mayoría de la masa (70%) del extracto de la composición, que estaba cargada en una columna C_{18} \muBondapack, eluída en el volumen nulo. Estos resultados sugirieron que los componentes activos de la composición son, muy probablemente, muy polares o incluso moléculas iónicas.
Para examinar adicionalmente los resultados anteriores, se realizó la purificación de los componentes activos por cromatografía de intercambio iónico. Los componentes activos negativamente cargados (evaluados por su efecto de antiproliferación en las células tumorales y no en las células normales, y también por su actividad de liberación-inducción de TNF\alpha), si presentes, se enlazarían así a una resina de intercambio de aniones.
Procedimiento experimental
10 ml del extracto total de Virulizin se cargó en una columna cromatográfica de anión-intercambio (Bio-Rad AG-1, forma hidróxido, el volumen de humedad total de la resina era 10 ml (las dimensiones de la columna 1.5 cm. x 6.0 cm.), equilibrado con agua desionizada Millipore). El volumen de resina usado se calculó para que fuera suficiente para el enlazamiento de todos los aniones presentes en el extracto. La fracción no enlazada se reunía y se recargaba en la columna para maximizar el enlazamiento a la resina. La fracción no enlazada de este segundo pasaje se reunió y se guardó. Cualquier material no enlazado que permanecía en el volumen nulo de la columna se eliminó lavando con agua desionisada (2x20 ml). Las moléculas enlazadas se eluyeron con un gradiente de paso de bicarbonato de amonio (NH_{4}HCO_{3}) (20 ml/paso).
Los pasos de elución fueron 0 M
0,1 M
0,2 M
0,3 M
0,4 M
0,5 M
0,6 M
1,0 M
1,5 M
Ejemplo 33
Se analizaron muestras de todas las fracciones del Ejemplo 32 para determinar la actividad de antiproliferación y la actividad estimuladora del TNF 30, de acuerdo con los procedimientos de los Ejemplos 4 y 9, respectivamente.
Los resultados se muestran a continuación:
47
Los resultados del ensayo de actividad que la estimulación de la producción de TNF se encontró en las fracciones 0.6 M, 1.0 M, 1.5 M. La actividad antiproliferativa se encontró en las fracciones 0.4 M (actividad menor) y 0.5 M (fracción de actividad mayor).
Ejemplo 34
El análisis por cromatografía de capa delgada de las fracciones activas reveló una mezcla de varios componentes. Una muestra de la fracción 1.0 M del Ejemplo 32 se analizó por espectroscopía de masa de acuerdo con el Ejemplo 25. Una revisión del espectro generado sugirió que los siguientes compuestos pueden estar presentes: ácido siálico-glicerol dímero, sulfato de colesterol, y ácido taurocólico.
Ejemplo 35
El análisis por HPLC fase reversa (Cl 8) se realizó en una muestra de la composición de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2, sólo que (1) se usó una columna de WP60009- C_{18} Phenomenex, 250 x 4.6 mm, (2) la muestra se liofilizó y luego se reconstituyó en ácido trifluoracético (TFA) al 0.1% en agua, y (3) 150 \mul de la muestra de reconstituida se aplicó a la columna.
Varias fracciones eluídas se reunieron, incluso una fracción que eluye a aproximadamente 2.40-3.40 minutos 5 después de reconstituida la muestra se aplicó a la columna.
Ejemplo 36
Una muestra de los eluídos de la fracción a aproximadamente 2.40-3.40 minutos del Ejemplo 35 se analizó tres veces para determinar la actividad estimuladora del TNF de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 9. Se obtuvieron los siguientes resultados.
Ensayo Nº Estimulación TNF por LPS
1 259 pg/ml \pm 107 pg/ml
2 311 pg/ml \pm 14 pg/ml
3 572 pg/ml \pm 176 pg/ml
Ejemplo 37
Una muestra del eluídos de la fracción a aproximadamente 2.40-3.40 minutos del Ejemplo 35 se somete a HPLC en fase reversa de columna de tándem (Cl 8) como sigue. La columna del Ejemplo 35 se usó en tándem con una columna de esferas-imprimadas de HC- C_{18} Phenomenex, 250 x 4.6 mm. La muestra se liofilizó, reconstituida en TFA al 0,1% en agua (Tampón A) y 150 \mul de muestra reconstituida se aplicó a la columna. El tampón A se pasó durante veinte minutos, luego un gradiente lineal de 0-80% de TFA al 0,1% en cianometano (tampón B) se pasó durante 35 minutos. Al final de este período; se pasó tampón B 80-0% durante 5 minutos. La tasa de flujo era 0.9 ml/min. Seis fracciones eluídas se reunieron, a los siguientes tiempos aproximados de iny
\newpage
Fracción Nº Tiempo (min.)
1 5,6-6,25
2 6,25-6,6
3 6,6-7,1
4 7,1-8,2
5 8,8-9,6
6 14,7-16
Ejemplo 38
Una muestra de la Fracción 1 ("1") y una muestra de la Fracción 2 ("2") del Ejemplo 37 se liofilizaron y reconstituyeron en 214 ppm NH_{3}\cdotH_{2}O. Estas muestras reconstituidas se analizaron luego para determinar el efecto antiproliferativo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4. Los siguientes resultados se obtuvieron:
Muestra Efecto Antiproliferativo
1 17,8 unid/ml
2 0
Ejemplo 40
Las muestras de cada una de las seis fracciones del Ejemplo 37 se analizaron por espectroscopía de masa de acuerdo con el Ejemplo 25. Una revisión de los espectros resultantes para las seis fracciones indicó que los siguientes compuestos probablemente estaban presentes: ácido taurocólico, ácido siálico-glicerol dímero, NaCl, trimetilamina, metil-etilamina y propilamina.
Ejemplo 41
El efecto antiproliferativo, según el método del Ejemplo 4, fue medido para las siguientes tres muestras: (1) 10-11mg ácido taurocólico en 2 ml de H_{2}O; (2) 214 ppm NH_{3}\cdotH_{2}O; y (3) 0.7 mg de ácido taurocólico en 4.0 ml de 214 ppm NH_{3}\cdotH_{2}O. Ni la muestra (1) ni la muestra (2) tenían algún efecto antiproliferativo perceptible. La muestra (3), sin embargo, tenía un efecto antiproliferativo de 14 unidades/mg.
Este resultado indica que los ácidos biliares, como el ácido taurocólico, en combinación con iones amonio, exhiben actividad antiproliferativa a las concentraciones a continuación de esto, mientras que los componentes, ensayados individualmente, no muestran ninguna actividad. Así, la combinación de estos dos componentes, al parecer sinérgicamente, afecta la actividad antiproliferativa.

Claims (29)

1. Una composición extraída a partir de la bilis, usando un disolvente soluble en, o miscible con, agua, para uso como modulador inmunológico, que comprende por lo menos un componente menor que aproximadamente 3000 daltons, que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y
en la que dicho componente no es una endotoxina, IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición se extrae de la bilis de bovinos.
3. La composición de la reivindicación 2, en la que la composición estimula la liberación del factor de necrosis de tumor a partir de las células mononucleares de sangre periférica humana.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición estimula la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo en ausencia de IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma.
5. La composición de la reivindicación 4, en la que la composición estimula la liberación y/o producción del factor de necrosis de tumor en los humanos.
6. La composición de la reivindicación 1, en la que cuando la composición se seca para obtener un residuo sólido, y se disuelven 2 gramos de dicho residuo en 20 ml de una solución concentrada al 10% de hidróxido de amonio en metanol, y después de que se retire cualquier material insoluble, se somete a cromatografía en columna en una columna de metanol con dimensiones de 5 cm. x 12,5 cm., que contiene 102 g de silicagel flash 60 A, y opera a una presión de 0,69 mPa y una tasa de flujo de 11 ml/min con una solución concentrada al 10% de hidróxido de amonio en disolvente metanol, dicho componente es eluído de la columna en una fracción tomada cuando la elución total de la columna está entre 180 y 220 ml, entre 220 ml a 260 ml, o entre 260 ml y 300 ml.
7. La composición de la reivindicación 1, en la que cuando 10 ml de la composición se someten a la cromatografía de intercambio aniónico en una columna que contiene resina en forma hidróxido Bio-Rad AG-1 en una cantidad suficiente para enlazar esencialmente todos los aniones presentes en dichos 10 ml de composición, dicho componente es eluído de la columna usando un gradiente de paso de tampón de bicarbonato de amonio a una concentración del tampón de 0,5 M a 1,5 M.
8. La composición de la reivindicación 7, en la que dicho componente eluye de la columna a una concentración del tampón de 1,0 M a 1,5 M.
9. La composición de la reivindicación 8, en la que dicho componente eluye de la columna a una concentración del tampón de aproximadamente 1,5 M.
10. La composición de la reivindicación 1, en la que cuando la composición es liofilizada y reconstituida en 0,1% de TFA en agua y luego se somete a HPLC en fase reversa (C_{18}) en una columna Phenomenex WP60009- C_{18}, con dimensiones de 250 x 4,6 mm, en la que se pasa un primer tampón de TFA al 0,1% en agua a través de la columna durante aproximadamente 10 minutos, luego se pasa un gradiente lineal de 0 a 80% de un segundo tampón de TFA al 0,1% en cianometano durante aproximadamente 55 minutos, seguidos por una solución al 80% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y un gradiente 80%-0% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y, en la que la tasa de flujo es 1 ml/min, y no se exceda la capacidad de la columna y de los tampones, siendo dicho componente eluído de la columna en un tiempo de 2,4 minutos a 3,4 minutos después de que se aplique a la columna dicha composición reconstituida.
11. La composición de la reivindicación 1, en la que cuando la composición se dializa en un primer tampón de TFA al 0,1% en agua y luego se somete a HPLC en fase reversa (C_{18}) en una columna Bio-Rad Hi-Pore RP 318 (C_{18}), con dimensiones de 250 x 4,6 mm, en la que el primer tampón se pasa a través de la columna durante aproximadamente 10 minutos, luego se pasa un segundo tampón de TFA al 0,1% con un gradiente lineal de 0-80% en cianometano durante aproximadamente 55 minutos, seguidos por una solución al 80% del segundo tampón durante aproximadamente 5 minutos, y un gradiente 80-0% del segundo tampón durante aproximadamente cinco minutos y en la que la tasa de flujo es 1 ml/min, y no se exceda la capacidad de la columna y de los tampones, dicho componente eluye de la columna en un tiempo de 2 minutos a 21,4 minutos, o en un tiempo de 21,4 minutos a 25,6 minutos después de que se aplica la composición dializada a la columna.
\newpage
12. La composición de la reivindicación 1, en la que cuando la composición se somete a cromatografía en capa delgada sobre placas de silicagel en hidróxido de amonio concentrado al 10% en metanol y se visualiza con un spray de nihidrina, ocurre una reacción positiva con la nihidrina a un valor de Rf de 0,80 a 0,90.
13. Un proceso para preparar una composición modulador inmunológico que comprende:
(a) mezclar la bilis de un animal con un disolvente soluble en, o miscible con, agua para producir una solución de bilis/disolvente;
(b) aislar una solución acuosa esencialmente libre del disolvente de la disolución bilis/disolvente, y
(c) eliminar los pigmentos biliares de la solución esencialmente sin disolvente para obtener un líquido incoloro, en la que dicha composición comprenda por lo menos un componente menor que aproximadamente 3000 daltons, que no muestre ninguna citotoxicidad a las células mononucleares de sangre periférica humana y tenga por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas,
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo, y
en el que dicho componente no es una endotoxina IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma.
14. El proceso de la reivindicación 13, en el que el disolvente soluble en agua es un alcohol.
15. El proceso de la reivindicación 14, en el que la bilis de un animal se mezcla con un volumen igual de un alcohol.
16. El proceso de la reivindicación 14, en el que el alcohol es etanol.
17. El proceso de la reivindicación 15, en el que el alcohol es etanol.
18. El proceso de la reivindicación 13, el que adicionalmente comprende concentrar el líquido incoloro a aproximadamente un octavo del volumen original de la solución bilis/disolvente.
19. El proceso de la reivindicación 13, el que adicionalmente comprende concentrar el líquido incoloro a aproximadamente un décimo del volumen original de la solución bilis/disolvente.
20. El proceso de la reivindicación 15, el que adicionalmente comprende: (d) tratar el líquido incoloro para eliminar esencialmente cualquier alcohol residual, (e) extraer el líquido incoloro con éter y aislar la fase acuosa, y (f) eliminar el éter residual de la fase acuosa.
21. El proceso como se reivindica en la reivindicación 20, en el que, antes del paso (e), se concentra el líquido incoloro a aproximadamente un octavo del volumen de la solución bilis/alcohol y, después del paso (f), la fase acuosa se concentra para que sea un décimo del volumen de la solución bilis/alcohol.
22. Una composición farmacéutica para uso en la profilaxis y tratamiento de enfermedades y condiciones que requieran la modulación de la respuesta inmune, que comprende una composición como se reivindica en la reivindicación 1, y opcionalmente un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
23. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 22, para su uso en la profilaxis y tratamiento de enfermedades y condiciones que requieran el estímulo de la respuesta inmune.
24. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 22, para el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplasias.
25. El uso de por lo menos un componente, extraído a partir de la bilis y que tiene un peso molecular menor que 3000 daltons, que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y
en que dicho componente no es una endotoxina, IL-la, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma, para la fabricación de un medicamento para estimular el sistema inmunológico de un paciente.
26. El uso de por lo menos un componente extraído a partir de la bilis y que tiene un peso molecular menor que 3000 daltons, el que no muestra ninguna citotoxicidad para las células mononucleares de sangre periférica humana y tiene por lo menos una de las siguientes propiedades:
(a) es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos in vitro para liberar y/o producir una o más citoquinas;
(b) o es capaz de estimular monocitos y/o macrófagos para liberar y/o producir el factor de necrosis de tumor in vitro o in vivo; y
en el que dicho componente no es una endotoxina IL-W, IL-1\beta, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF o IFN-gamma, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad o condición que requiera modulación de la respuesta inmune.
27. Uso de la composición de la reivindicación 1 o reivindicación 22 para la fabricación de un medicamento por tratar las neoplasias.
28. Uso de la composición de la reivindicación 1 o reivindicación 22 para la fabricación de un medicamento por tratar cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer ovárico, cáncer de ENT, hiperplasia prostática benigna, papiloma benigno, neoplasmas anaplásticos, melanoma maligno, leucemias, linfomas, melanomas, adenocarcinomas, sarcomas, carcinomas o endometriosis.
29. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7, 10 ó 11 para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer pancreático.
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