ES2224124T3 - Metodo para tratar enfermedades autoinmunes usando interferones de tipo uno. - Google Patents
Metodo para tratar enfermedades autoinmunes usando interferones de tipo uno.Info
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Abstract
INVENCION QUE PROPORCIONA UN METODO PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES EN ANIMALES Y QUE CONSISTE EN LA ADMINISTRACION ORAL DE INTERFERON TIPO UNO AL ANIMAL EN CUESTION. TAMBIEN SE FACILITA UN METODO PARA REDUCIR LA INFLAMACION ASOCIADA CON UNA ENFERMEDAD AUTOINMUNE EN ANIMALES, CONSISTENTE EN LA ADMINISTRACION ORAL DE INTERFERON TIPO UNO AL ANIMAL.
Description
Método para tratar enfermedades autoinmunes
usando interferones de tipo uno.
La presente invención se refiere en general a los
campos de la neurología, inmunología y química de las proteínas. De
forma más específica, la presente invención se refiere a
procedimientos de tratamiento de enfermedades autoinmunes que usan
interferones de tipo uno.
La encefalomielitis autoinmune experimental aguda
[EAE] es un proceso autoinmune inflamatorio mediado por los
linfocitos T del sistema nervioso central, el cual se asemeja a la
enfermedad humana de la esclerosis múltiple. La
CR-EAE, un proceso autoinmune inflamatorio crónico
del sistema nervioso central que se asemeja a la esclerosis múltiple
humana [MS] tanto en su expresión patológica como clínica,
proporciona un modelo para establecer intervenciones para alterar el
curso de una enfermedad autoinmune humana. La proteína básica de la
mielina [MBP] es un neuroantígeno importante en la patogénesis de
esta enfermedad. La CR-EAE en ratones SJL/J se puede
transferir adoptivamente tras la inyección intravenosa de una línea
de linfocitos T específica de 89-100 péptidos de la
MBP. El cultivo conjunto de linfocitos T específicas de
91-103 péptidos de la MBP con péptido químicamente
reticulado hace a los linfocitos T tolerantes a la MBP en
CR-EAE en ratón SLJ/J.
La administración por vía parenteral, por ejemplo
intravenosa, de interferón natural de rata [10^{5} unidades]
elimina parcialmente la EAE aguda en ratas Lewis macho e inhibe la
EAE localizada hiperaguda pasiva cuando se administra el mismo día
de la inoculación de inmunógeno. Otras citoquinas administradas por
vía parenteral tales como la TGF-\beta pueden
disminuir la enfermedad clínica y la inflamación en cerebro y
médula espinal en EAE. La IFN-\alpha natural
humana administrada por vía parenteral puede disminuir la función de
los linfocitos T y la producción de anticuerpos dependiente de los
linfocitos T en humanos. La IFN-\alpha natural
humana administrada por vía oral puede prevenir el desarrollo
experimental de infecciones víricas y parasitarias en animales. La
EAE aguda proporciona un modelo para demostrar la capacidad de las
sustancias inmunoactivas administradas por vía oral para influir en
el curso de una enfermedad autoinmune.
La IFN-\alpha humana es una
proteína inmunoactiva que se puede administrar por vía oral a dosis
bajas en el tratamiento de enfermedad vírica en animales. La
IFN-\beta humana, otra interferón de tipo 1,
aumenta la función celular supresora in vitro en MS
progresiva y la IFN-\beta de rata disminuye la
gravedad de los síntomas en la EAE de rata. A la vista de las
propiedades inmunoreguladoras y antivíricas de los interferones de
tipo 1, se ha analizado su respuesta y producción en enfermedades
autoinmunes. La artritis reumatoide inactiva se pone de manifiesto
mediante niveles incrementados de oligoadenilato sintasa
[2'-5'] [OAS], una medida fácilmente obtenida de la
actividad del interferón de tipo 1, en leucocitos sanguíneos
periféricos secundarios frente a un estímulo de la
IFN-\alpha/\beta; la artritis reumatoide activa
mostró una producción de IFN-\alpha/\beta
significativamente reducida en comparación con los dadores
normales. Otras enfermedades autoinmunes, tales como la psoriasis y
la dermatitis atópica, mostraron también una producción del
interferón reducida. Los linfocitos sanguíneos periféricos en
pacientes con MS muestran una producción inefectiva similar de
interferones de tipo 1 en respuesta a estímulos víricos o
mitogénicos, lo cual es paralelo a la gravedad de la enfermedad. La
actividad de las células [NK] asesinas naturales es deficiente en
MS, lo cual se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y se
puede normalizar con tratamiento con
IFN-\alpha.
Las anormalidades indicadas de producción o
respuesta a la interferón de tipo 1 en enfermedades autoinmunes han
impulsado distintos pequeños estudios piloto que usan los
interferones de tipo 1 como agentes terapéuticos en MS. Estos
estudios usaron la interferón de tipo 1 administrada sistémicamente
en dosis de 1 millón de unidades o más diariamente sin mejora
clínica significativa. Un estudio de IFN-\beta
administrado por vía parenteral en la MS recidivante y remitente
sugiere que de 1,6 a 8 millones de unidades de
IFN-\beta por vía subcutánea, tres veces a la
semana, puede disminuir las recaídas de un 40 a un 50% y disminuir
la inflamación del cerebro, como se indica mediante MRI en
serie.
La técnica anterior es deficiente en cuanto a la
falta de medios efectivos de tratamiento de enfermedades
autoinmunes mediante administración oral de citoquinas, tales como
interferones de tipo 1. La presente invención cubre esta duradera
necesidad y deseo en la técnica.
Es un objeto de la presente invención mostrar que
la administración por vía oral de un interferón de tipo uno inhibe
la proliferación de antígenos sensibilizados, suprime la expresión
clínica de las recaídas y disminuye la inflamación mediante la
alteración de las citoquinas en la CR-EAE de
ratón.
Es otro objeto de la presente invención ilustrar
el efecto de los interferones de tipo uno administradas por vía oral
antes y después de la inmunización con GP-MBP en EAE
aguda.
Es otro objeto de la presente invención suprimir
la expresión clínica de los ataques de enfermedad autoinmune,
disminuir las secuelas patológicas e inhibir las citoquinas
inflamatorias en tales enfermedades mediante la administración por
vía oral de modificadores de la respuesta biológica tales como los
interferones de tipo uno.
Es también un objeto de la presente invención
mostrar el efecto de la IFN-\alpha/\beta de
rata por vía oral sobre la respuesta clínica, histología y
secreción de IFN-\gamma en neuritis alérgica
experimental, el modelo in vivo de la radiculoneuropatía
desmielinizante inflamatoria o síndrome de
Guillain-Barré.
En una realización de la presente invención se
proporciona el uso de un interferón de tipo uno en la producción de
un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad
autoinmune mediante administración por vía oral, caracterizado
porque dicho interferón se encuentra en una dosificación de 50 UI/kg
a 25.000 UI/kg y porque dicho interferón se ingiere tras la
administración.
En otra realización de la presente invención se
proporciona el uso de un interferón de tipo uno en la producción de
un medicamento para uso en la disminución de la gravedad o
frecuencia de una recaída de la esclerosis múltiple en un humano
mediante administración por vía oral, caracterizado porque dicho
interferón se ingiere tras la administración.
Aún en otra realización de la presente invención
se proporciona el uso de un interferón de tipo uno en la producción
de un medicamento para uso en la reducción de la inflamación
asociada con una enfermedad autoinmune mediante administración por
vía oral, caracterizado porque dicho interferón es para ingestión
tras la administración.
Todavía en otra realización de la presente
invención se proporciona el uso de un interferón de tipo uno en la
producción de un medicamento para uso en la inhibición del comienzo
de una enfermedad autoinmune mediante administración por vía oral,
caracterizado porque dicho interferón se ingiere tras la
administración y porque dicho interferón se encuentra en una
dosificación de 50 UI/kg a 25.000 UI/kg.
En tanto se consiga y se pueda entender con
detalle las características, ventajas y objetos, así como también
otros que se harán aparentes, de la invención anteriormente
mencionados, se pueden presentar descripciones más particulares de
la invención, brevemente resumidas anteriormente mediante referencia
a ciertas realizaciones de la misma, las cuales se ilustran en los
dibujos adjuntos. Estos dibujos forman parte de la memoria
descriptiva. Se ha de observar, sin embargo, que los dibujos
adjuntos ilustran las realizaciones preferidas de la invención y
por tanto no se han de considerar limitativos de su alcance.
La figura 1 muestra que la
IFN-\alpha/\beta natural de ratón administrada
por vía oral suprime la recaída clínica en CR-EAE de
ratón. Se inocularon dos grupos de seis animales y tras el primer
ataque se alimentaron bien con IFN fingida o con cien unidades de
IFN-\alpha/\beta natural de ratón 3 veces a la
semana durante siete semanas. Se muestra uno de los dos experimentos
representativos. SEM es < 10%.
La figura 2 muestra que la administración por vía
oral de 5.000 unidades de IFN-\alpha/\beta de
rata inhibe la enfermedad clínica en EAE aguda. Se alimentaron
cuatro grupos de 6 ratas Lewis con IFN fingida, 1.000, 3.000 ó 5.000
unidades de IFN-\alpha/\beta de rata durante
siete días antes de la inmunización [-7] y durante 21 días después
de la misma [+14]. Los resultados se expresan como valoración
clínica media para cada grupo en cada día de enfermedad
post-inoculación \pm SEM. Se muestra uno de los
dos experimentos representativos. No se muestran los datos para
1.000 y 3.000 unidades. *p < 0,02 entre los animales alimentados
con IFN fingida y 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta.
La figura 3 muestra que la administración por vía
oral de hrIFN-\alphaa en EAE aguda en rata retarda
el comienzo, disminuye la gravedad y acelera la recuperación de los
ataques clínicos. Se inocularon tres grupos de siete ratas Lewis con
MBP y CFA en el día 0 y se administra por vía oral, PBS, 1.000
unidades o 5.000 unidades de hrIFN-\alpha
diariamente comenzando siete días antes de la inmunización [-7] y
durante 14 días después de la misma [+14]. Los valores representan
valoraciones clínicas de neuritis alérgica experimental para cada
grupo de 7 animales \pm SEM. Se muestra uno de los dos
experimentos representativos.
La figura 4 muestra que la administración por vía
oral de hrIFN-\alpha en EAE aguda en rata
disminuye la gravedad clínica acumulativa de neuritis alérgica
experimental de los ataque clínicos agudos. Se trataron tres grupos
de siete ratas Lewis como se describió en la figura 3. Los valores
representan valoraciones clínicas acumulativas de neuritis alérgica
experimental para cada grupo de 7 animales desde el día 10 hasta el
16 tras la inoculación. *p < 0,001, entre 5.000 unidades de
IFN-\alpha frente a 1.000 unidades de
IFN-\alpha y el control con PBS.
La figura 5 muestra que la administración por vía
oral de 5.000 unidades de hrIFN-\alpha disminuye
el número de focos inflamatorios en la médula espinal en
comparación con el grupo de control y el de 1.000 interferones.
Después del sacrificio se procesaron las médulas espinales de los
animales de la figura 3 como se describe en los procedimientos. Los
resultados se expresan como nº de focos inflamatorios por médula
\pm SEM. Se muestra uno de los dos experimentos representativos.
*p < 0,04, entre el grupo alimentado con 5.000 unidades de IFN
frente al alimentado con 1.000 unidades de IFN o grupo de control
con PBS.
La figura 6 muestra que la administración por vía
oral de 5.000 unidades de hrIFN-\alpha, y no la
administración por vía subcutánea, disminuye la gravedad de los
ataques clínicos. Se inocularon tres grupos de 6 ratas Lewis con MBP
y CFA el día 0 y bien se dejaron sin tratar, se alimentaron con
5.000 unidades o se inyectaron por vía subcutánea con 5.000 unidades
de hrIFN-\alpha diariamente comenzando siete días
antes de la inmunización [-7] y durante 21 días después la misma
[+14]. Los valores representan las valoraciones clínicas diarias de
neuritis alérgica experimental para cada grupo de 6 animales \pm
SEM. Se muestra uno de los dos experimentos representativos.
La figura 7 muestra que la administración por vía
oral de hrIFN-\alpha en EAE aguda en rata
disminuye la gravedad clínica acumulativa en la neuritis alérgica
experimental de ataques clínicos agudos. Se trataron tres grupos de
seis ratas Lewis como se describe en la figura 6. Los valores
representan valoraciones clínicas acumulativas de neuritis alérgica
experimental para cada grupo de 6 animales a partir del día 10 hasta
el 16 tras la inoculación. *p < 0,005, animales alimentados
frente a animales no tratados / tratados por vía subcutánea.
La figura 8 muestra que la administración por vía
oral de 5.000 unidades de hrIFN-\alpha disminuye
el número de focos inflamatorios en la médula espinal en
comparación con el grupo de control. Tras el sacrificio se
procesaron las médulas espinales de los animales de la figura 6
como se describió anteriormente y se evaluaron independientemente
en cuanto a focos inflamatorios por parte de un observador, sin
conocimiento del estatus de tratamiento. Se expresan los resultados
como nº de focos inflamatorios por médula \pm SEM. Se muestra uno
de los dos experimentos representativos. *p < 0,04, entre
animales alimentados con 5.000 unidades de IFN frente a 5.000
unidades tratados por vía subcutánea.
Las figuras 9A y 9B demuestran que la
interferón-\alpha/\alpha de rata administrada
por vía oral reduce la enfermedad clínica en ratas con neuritis
alérgica experimental. Se alimentaron ratas Lewis bien con 5.000
unidades de IFN-\alpha/\beta (interferón) o IFN
fingida (interferón fingida) comenzando 7 días antes de la
inmunización con mielina de nervio periférico bovino. La valoración
clínica fue significativamente superior en las ratas con
IFN-fingida (n=11) que en las ratas con
IFN-\alpha/\beta (n=11). Más ratas del grupo
alimentado con IFN fingida que del grupo alimentado con
IFN-\alpha/\beta alcanzaron una valoración
clínica de 4 o superior (IFN fingida 7 de 11 frente a
IFN-\alpha/\beta 4 de 11 ratas) (figura 9A) y
perdieron un 25% o más de su peso corporal (IFN fingida 4 de 11
frente a IFN-\alpha/\beta 2 de 11 ratas)
(figura 9B).
La figura 10 demuestra que la
interferón-\alpha/\beta de rata administrada
por vía oral reduce la inflamación y la producción de
IFN-\gamma en neuritis alérgica experimental. Se
alimentaron ratas Lewis bien con 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta o con IFN fingida comenzando 7
días antes de la inmunización con mielina de nervio periférico
bovino hasta el momento del sacrificio. La inmunocitoquímica de las
raíces del nervio lumbosacro usando anticuerpo ED1 (1:1000) y
anticuerpo IFN-\gamma (1:10) en el día 13 tras la
inmunización en el comienzo de la enfermedad clínica mostró menos
macrófagos positivos ED1 (figura 10A, 2B) en ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta en comparación con ratas
alimentadas con IFN fingida (figura 10D, 10E). De forma
concomitante, con niveles reducidos de macrófagos positivos ED1 hubo
menos expresión de IFN-\gamma en ratas
alimentadas con IFN-\alpha/\beta (figura 10C)
en comparación con las ratas alimentadas con IFN fingida (figura
10F). Barra = 20 micrómetros.
En la presente invención, la modificación de la
enfermedad e inhibición de la producción de citoquina inflamatoria
inducida mediante citoquinas administradas por vía oral en EAE
proporciona un medio conveniente, efectivo y a largo plazo para el
tratamiento de enfermedades autoinmunes de antígenos desconocidos
humanos, en particular de la esclerosis múltiple.
La presente invención se refiere al uso de un
interferón de tipo uno para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de enfermedad autoinmune, en donde dicho medicamento
se va a administrar por vía oral. Por lo general, la interferón
útil en los procedimientos de la presente invención es, bien la
interferón alfa o bien la interferón beta. La interferón de tipo uno
se puede derivar a partir de cualquier fuente adecuada.
Preferiblemente, la interferón se selecciona del grupo constituido
por interferón recombinante humano, interferón de rata e interferón
de ratón.
Por lo general, la interferón de tipo uno usada
en la presente invención se administraría a una dosis que inhiba de
forma efectiva el comienzo o recurrencia etc., de la enfermedad
autoinmune. Por ejemplo, la interferón se puede administrar en una
dosificación de aproximadamente 50 UI/kg a aproximadamente 25.000
UI/kg.
Los usos de la presente invención pueden ser para
cualquier animal que presente una enfermedad autoinmune. Lo más
preferiblemente, los usos de la presente invención serán útiles para
humanos.
Los ejemplos representativos de enfermedades
autoinmunes incluyen la esclerosis múltiple, artritis reumatoide,
diabetes sacarina, soriasis, enfermedades autoinmunes específicas
de órganos, poliradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria
crónica y síndrome de Guillain-Barré.
El uso de la presente invención es también para
la disminución de la gravedad o frecuencia de una recaída de la
esclerosis múltiple en un humano. Además, el uso de la presente
invención también es para la inhibición del comienzo de una
enfermedad autoinmune.
Los siguientes ejemplos se dan a fin de
ilustración de las distintas realizaciones de la invención y no se
trata de limitar la presente invención en forma alguna a neuritis
alérgica experimental.
Se induce una forma con recaídas crónica de la
EAE en ratones SJL/J hembras de 7-10 semanas de edad
usando el procedimiento de Brown y McFarlin, Lab. Invest.
(1981) 45:278-284 modificado por Millar y col.,
J. Immunol. (1987) 138:3776-3784. De forma
breve, cada ratón recibió una inyección subcutánea sobre el flanco
derecho afeitado de 0,3 ml de una emulsión que contiene 1 mg de
homogeneizado de médula espinal de ratón singeneica [MSCH] en 0,15
ml de solución salina tamponada con fosfato y 0,03 mg de
Mycobacterium tuberculoses homines H37Ra [MT] [Difco Labs,
Detroit, MI] en 0,15 ml de adyuvante de Freund incompleto [IFA].
Siete días después, los ratones recibieron una inyección similar en
el flanco izquierdo. Se aprecian signos clínicos iniciales de
enfermedad entre los días 13 y 25 tras la inmunización. Se asigna
la gravedad clínica del ataque de recaída como sigue por parte de un
observador objetivo: 0 = no enfermedad; 1 = debilidad de la
pata trasera mínima o suave; 2 = debilidad de la pata trasera
moderada o ataxia suave; 3 = debilidad de la pata trasera de
moderada a grave; 4 = debilidad de la pata trasera grave o ataxia
moderada; 5 = paraplejía con debilidad de las cuatro patas no más
de moderada; 6 = paraplejía con debilidad de las cuatro patas grave
o ataxia grave. Se valoran los animales en forma objetiva durante
6-8 semanas y se computa una valoración semanal
acumulativa mediante el promedio de tres valores por semana [lunes,
miércoles, viernes] para cada grupo de animales.
Tras el ataque inicial se alimentan los animales
con dosis variables [1-100 unidades] de
IFN-\alpha/\beta natural de ratón
[IFN-\alpha + \beta de ratón citoinmune, 4,0 x
10^{5} IRU/ml, Lee Biomolecular Research, Inc., San Diego, CA], o
IFN-\alpha/\beta fingida de ratón [citoinmune
< 2 IRU/ml, Lee Biomolecular Research, Inc., San Diego, CA.
{generado idénticamente a IFN-\alpha/\beta
excepto en que los cultivos se indujeron con preparación fingida}]
usando una jeringuilla de 2,5 cm equipada con una aguja de punto de
bola de calibre 20 [Thomas Scientific, Swedesboro, NJ] tres veces
por semana [lunes, miércoles, viernes] durante 6-8
semanas. Se usa IFN fingida como control ya que la IFN
desnaturalizada con calor puede retener algo de actividad
inmunológica.
Se añade 20 gramos de médula espinal de cobaya a
4,7 ml de metanol a -20ºC y se homogeniza con un homogenizador de
tejidos. Se añade 9,4 ml de cloroformo a -20ºC, se homogeniza en 2
minutos más y se agita durante 60 minutos a temperatura ambiente;
luego a 4ºC durante 60 minutos más. Se filtra el material a través
de dos espesores de gasa estéril equipada matraz Buchner enfriado y
un papel de filtro Whatman nº 1. Se lava la torta de tejido con 20
ml de acetona a -20ºC y se suspende nuevamente en 40 ml de H2O
bidestilada fría; luego se agita durante 30 minutos a 4ºC, se
filtra una segunda vez y se suspende nuevamente en 10 ml de
H_{2}O bidestilada fría. Se somete la suspensión a ultrasonidos
para facilitar la resuspensión del agregado en H_{2}O
bidestilada.
Se ajusta la suspensión de tejido/H_{2}O a pH =
3 con HCl 1N y se agita durante la noche a 4ºC. Después de la
agitación durante la noche se reajusta el pH a 3 y se centrifuga a
10.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se filtra el sobrenadante a
través de un papel Whatman nº 1 y se retuvo el filtrado líquido. Se
ajusta el filtrado a pH = 9 con NaOH 10 N y se agita durante 60
minutos a 4ºC; luego se centrifuga a 10.000 x g durante 15 minutos
a 4ºC. Se mide el volumen de sobrenadante y se añade sulfato de
amonio hasta una concentración final de 27,7 gramos / 100 ml; se
agita el sobrenadante en frío durante 30 minutos y luego se
centrifuga a 10.000 x g durante 15 minutos a 4ºC y se suspende
nuevamente en 1 ml de H_{2}O bidestilada. El agregado resuspendido
se dializa en entubaciones de diálisis de pequeño peso molecular
[6-8000 PM] junto con H_{2}O bidestilada. Se
determina la concentración de proteína a A_{280} mediante
espectroscopia UV. Para comprobar la pureza de la preparación de
proteína básica de mielina se prepara un gel de
SDS-PAGE en gradiente de 7-20% y se
colorea con CuCl_{2} 0,3 M. Se demuestra la pureza de la
preparación de proteína básica de la mielina de cobaya
[GB-MBP] por una banda a 18 kDa.
Se sacrifican los animales a las
6-8 semanas tras el inicio de la alimentación y se
extraen los nódulos inguinales de drenaje y las células del bazo y
se preparan suspensiones de células simples mediante un tamiz de
alambre de acero inoxidable de 90 micrómetros. Se lleva a cabo la
lisis de eritrocito en las suspensiones de células del bazo con 2
ml de solución de ACK añadida al agregado y se deja que la reacción
continúe 5 minutos a temperatura ambiente.
Siete días tras el ataque de recaída clínico se
sacrifican los ratones, se reúnen los nódulos linfáticos inguinales
de drenaje y se cultivan in vitro para determinar las
respuestas proliferativas de linfocitos T específicas del antígeno.
Se lleva a cabo la estimulación del antígeno con antígeno a 0 ó 100
\mug/ml [GP-MBP o MT] y la estimulación del
mitógeno con ConA a 2,5 \mug/ml mediante la incubación de las
células del nódulo linfático a 2 x 10^{5} células/pocillo en RPMI
[Gibco, Grand Island, NY] enriquecido con suero bovino fetal al 10%
[SFB] [Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD], piruvato de sodio
al 1% [Gibco, Grand Island, NY], glutamina al 1% [Gibco],
penicilina/estreptomicina al 1% y 2-mercaptoetanol
50 \muM. Se incuban las placas en CO_{2} al 5% y se humidifica
a 37ºC durante 4 días. En ese momento se pulsan las células con 2
\muCi de [^{3}H]dTd tritiado y se recogen 18 horas
después en un recolector automatizado. Se mide la captación de
[^{3}H]dTd en un contador de centelleo líquido Beckman. Se
llevan a cabo cultivos por triplicado y los resultados se expresan
como \DeltaCPM.
Tras el sacrificio se extraen las médulas
espinales y se fijan en inmersión en formalina tamponada neutra al
10% durante un mínimo de dos semanas. Tras la fijación se
biseccionan los cerebros en el plano horizontal y se seccionan las
médulas en su totalidad en el plano horizontal a intervalos de
aproximadamente 3 mm y se procesan en parafina. Se seccionan los
bloques en parafina a 6-8 micrómetros y se colorean
las secciones con hematoxilina y eosina y con azul
Luxol-fast/PAS/hematoxilina y se examinan mediante
microscopia óptica. Se evalúan las secciones de la médula
independientemente en cuanto a focos de inflamación por parte de un
observador objetivo, sin conocimiento del estado del tratamiento de
los animales antes del sacrificio. Se toman muestras del tejido de
la médula espinal de forma idéntica para cada animal y se cuenta el
número de focos inflamatorios por sección [> 20 células
inflamatorias] en la parénquima.
Se cultivan células del bazo de animales tratados
con IFN fingida y 100 unidades de
IFN-\alpha/\beta de ratón con ConA [2,5 ug/ml] a
1 x 10^{6} células/ml en matraces de cultivo de tejido de 75
cm^{2} durante 48 horas en un incubador con CO_{2} en un 5% /
aire en un 95% a 37ºC. Se recogen los sobrenadantes a las 24 y 48
horas tras la activación con ConA y se congelan a -70ºC tras
centrifugación. Se miden las interleucinas usando un ensayo ELISA de
fase sólida. Se incuban anti-IL-2,
anti-IL-10 o
anti-IFN-\gamma [PharMingen, San
Diego, CA] sobre placas de microtitulación de 96 pocillos de
plástico de polivinilo con tampón de carbonato 0,01M (pH 9,6)
durante la noche a 4ºC. Se bloquean las placas con BSA al 3% en
solución salina tamponada con fosfato durante 3 horas. Se añaden
100 \mul de los sobrenadantes a distintas diluciones que se
comprobó que se encontraban en la parte lineal de la curva de
absorbancia / concentración por triplicado y se incuba durante una
hora a temperatura ambiente. Una vez que las placas se lavaron
durante cinco veces con solución salina tamponada de fosfato Tween
(0,05%), se añaden durante 60 minutos 100 \mul de anticuerpo
monoclonal de interleucina conjugado con peroxidasa (con un
determinante epitópico diferente al primer anticuerpo usado para
recubrir la placa de polivinilo) a una concentración de 1:1000. A
continuación se añade el diclorhidrato de
O-fenilendiamina en sustrato de peroxidasa y se
mide la absorbancia a 450 nm. Se generan curvas convencionales con
distintas cantidades de las diferentes interleucinas. Se lleva a
cabo el análisis estadístico en un ensayo T de Student de una
vía.
De una a diez unidades de IFN de tipo 1
administradas por vía oral presentaban un efecto inmunológico pero
no era adecuado para suprimir las recaídas clínicas. Por tanto, se
alimentaron dos grupos de seis ratones SLJ/J inmunizados con IFN
fingida o con 100 unidades de IFN-\alpha/\beta
natural de ratón tres veces por semana comenzando el día 30, tras
la recuperación del primer ataque. Las valoraciones clínicas del
grupo tras el ataque inicial no eran significativamente diferentes
entre los distintos grupos. Las recaídas clínicas tuvieron lugar
aproximadamente 40 días tras la inoculación. Las valoraciones
clínicas mostraron diferencias significativas en la respuesta en los
animales alimentados con la IFN fingida frente a los alimentados
con 100 unidades de IFN-\alpha/\beta natural de
ratón [p < 0,03, véase figura 1]. Tuvieron lugar dos recaídas
principales en el grupo alimentado con IFN fingida durante el curso
de las siete semanas con un déficit neurológico incrementado
resultante. El grupo de la IFN-\alpha/\beta
natural de ratón sufrió un ataque simple retardado sin déficit
neurológico residual. La IFN-\alpha/\beta
natural de ratón por vía oral suavizó la gravedad y disminuyó la
valoración del grupo entre el ataque inicial y la recaída.
La activación con ConA de las células del nódulo
linfático inguinal de drenaje se inhibió en animales alimentados
con IFN fingida en comparación con animales alimentados con 100
unidades de IFN-\alpha/\beta natural de ratón
[88.222 cpm \pm 1.910 frente a 38.095 cpm \pm 3.160]. Las
células del nódulo linfático de animales alimentados con IFN
fingida ensayadas con MBP generaron una respuesta proliferativa
robusta, pero esa respuesta era profundamente inhibida en los
animales alimentados con IFN-\alpha/\beta
natural de ratón [14.052 cpm \pm 842 frente a 448 cpm \pm
50].
Para determinar si había inhibición para otro
antígeno sensibilizado se examina la proliferación específica de
antígeno del nódulo linfático inguinal de drenaje respecto a un
segundo antígeno sensibilizado, Mycobacterium tubercoloses
homines [MT], un componente del inóculo de MSCH. Las células del
nódulo linfático de animales alimentados con IFN fingida generaron
una fuerte respuesta proliferativa a MT pero esa respuesta
disminuía profundamente en los animales alimentados con
IFN-\alpha/\beta natural de ratón [52.401 cpm
\pm 857 frente a 5.214 cpm \pm 818].
También se examinaron histológicamente los
animales 65 días después de la inmunización. Había
significativamente menos focos inflamatorios en el grupo alimentado
con IFN [0,5 \pm 0,1] en comparación con el grupo de IFN fingida
de control [1,8 \pm 1,1] [p < 0,05]. Por tanto, los
interferones de tipo 1 naturales de ratón administradas por vía
oral pueden eliminar la enfermedad clínica, disminuir la
inflamación e inhibir la proliferación para MBP y MT.
La intensidad de la enfermedad en EAE se ha
asociado con la secreción de IFN-\gamma tras
estimulación con ConA de células del bazo. Por tanto, se
estimularon células del bazo reunidas tanto alimentadas con IFN
fingida [n = 5] como con 100 unidades de
IFN-\alpha/\beta de ratón [n = 5] con ConA [2,5
\mul/ml] a 1 x 10^{6} células/ml durante dos días y se analizan
los sobrenadantes mediante ELISA de fase sólida
[IL-2, IL-10,
IFN-\gamma]. La
IFN-\alpha/\beta por vía oral disminuyó de forma
consistente la IFN-\gamma un mediador de la
inflamación [exp. nº 1, células del bazo con IFN fingida 2.500
ng/ml \pm 300 frente a células del bazo con 100 unidades de
IFN-\alpha/\beta *1.100 ng/ml \pm 200; exp. nº
2, células del bazo con IFN fingida 2.180 ng/ml \pm 100 frente a
células del bazo con 100 unidades de
IFN-\alpha/\beta 247 *143 ng/ml \pm 13, *p
< 0,001 en comparación con el control con IFN fingida]. Hubo
también una disminución en IL-2, un factor de
crecimiento de los linfocitos T y una producción de
IL-10 mayor, si bien estos cambios no alteraban la
significación estadística.
La presente invención ilustra que los
interferones de tipo 1 administrados por vía oral pueden modificar
la respuesta biológica en CR-EAE cuando se
administran una vez que los animales se recuperan del ataque
inicial. Cuando se administran a dosificaciones adecuadas, los
interferones de tipo 1 administrados por vía oral eliminan las
recaídas clínicas, disminuyen la inflamación e inhiben la
proliferación de las células activadas de los nódulos linfáticos
inguinales de drenaje, los sitios naturales para las frecuencias
altas de linfocitos T activados por antígenos administrados por vía
subcutánea. Así pues, los interferones de tipo 1 son activos por
vía oral con efectos inmunológicos significativos en compartimentos
inmunes susceptibles. La IFN por vía oral disminuye de forma
consistente la secreción de IFN-\gamma inducida
con ConA en células del bazo. La eliminación de la proliferación
respecto a MBP puede tener lugar incluso tras un periodo de 6
semanas tras la inoculación y de 4 semanas tras el ataque clínico
inicial. Por tanto, las citoquinas administradas por vía oral, con
falta de un matriz protectora para prevenir la digestión proteica en
la orofaringe y el resto del canal alimentario, son capaces de
inhibir la proliferación frente a antígenos previamente
sensibilizados.
La suavización de una respuesta inmune
establecida e incipiente es un importante efecto terapéutico. La
administración de antígenos de la mielina del animal por vía oral
puede mejorar el curso clínico de la CR-EAE en ratas
y cobayas y disminuir las secuelas patológicas de los antígenos de
la mielina en CR-EAE. La administración por vía
oral de proteínas de la mielina puede disminuir la gravedad de los
ataques en pacientes DR2-MS macho y la frecuencia de
líneas de linfocitos T específicas de MBP en individuos tratados
con mielina. Sin embargo, en los ensayos en humanos y experimentos
en animales hubo solo una eliminación parcial de la enfermedad
clínica o patológica lo que sugiere que otras sustancias
inmunoactivas administradas por vía oral pueden ser superiores a los
antígenos de mielina.
No se conoce el mecanismo inmunomodulador del
interferón de tipo 1 administrado por vía oral. Los efectos
moduladores de los linfocitos activados con ConA sobre las
respuestas del mitógeno de las células respondedoras normales se
pueden abolir mediante la adición de suero de IFN de leucocito
anti-humano in vitro; esto puede evitar la
producción de factores inhibitorios inducidos por
IFN-\alpha, por ejemplo supresores de la respuesta
inmune solubles [SIRS] y factor supresor derivado de macrófagos
[M\phi-SF]. Los linfocitos T periféricos se
pueden requerir para la producción de interferón después de tal
estimulación del mitógeno. Sin embargo, la administración oral de
IFN-\alpha en dosis baja en ratones no da lugar a
cantidades detectables de IFN-\alpha en la sangre
al contrario que con la administración intraperitoneal, ni puede su
efecto ser bloqueado por anticuerpos anti-IFN
circulantes. El efecto neutropénico de la IFN administrada por vía
oral se puede transferir mediante inyección de células sanguíneas
pero no de suero a los animales receptores. El análisis del ARNm de
la citoquina del CNS (sistema nervioso central) en EAE sugiere que
los niveles de IL-2, IL-6 e
IFN-\gamma son elevados en la enfermedad aguda
pero durante la estabilización de los síntomas estas citoquinas
diminuyen con cantidades de IL-10 crecientes lo cual
puede regular los linfocitos Th1. Por tanto, la IFN de tipo 1 puede
ser una molécula inmunomodulatoria que induce factores supresores,
tal como el IL-10, inhibe la respuesta a antígenos
inmunizados tales como MBP y MT.
En resumen, la administración por vía oral de
modificadores de la respuesta biológica tales como los interferones
de tipo 1 proporciona un medio potencialmente no tóxico,
conveniente y continuo de inhibir la reactividad inmune. Los
modificadores de la respuesta biológica liberados por vía oral
proporcionan otro medio de tratar las enfermedades autoinmunes.
Se induce EAE en ratas Lewis hembra de
8-10 semanas de edad [Harlan Sprague Dawley,
Indianápolis, IN], usando una emulsión que contiene partes iguales
de proteína básica de mielina en PBS y adyuvante de Freund completo
[CFA]; Mycobacterium tuberculoses homines H37Ra [MT] [Difco
Labs, Detroit, MI]. Se inmunizan las ratas Lewis por vía subcutánea
en una almohadilla trasera con 0,1 ml de emulsión que contiene 50
\mug de MBP y 500 \mug de MT en adyuvante de Freund. Se
observan los signos clínicos iniciales de la enfermedad entre los
días 9 y 11 tras la inmunización. Se gradúa la gravedad clínica del
ataque inicial como sigue por parte de un observador
objetivo: 0 = sin enfermedad; 1 = cola flácida; 2 = ligera
debilidad de la pata trasera; 3 = debilidad de la pata trasera
moderada; 4 = total debilidad de la pata trasera e incontinencia.
Se calcula la valoración clínica diaria media mediante la
determinación de la valoración media para cada grupo en cada día de
ataque. Se calcula una valoración clínica acumulativa de la
neuritis alérgica experimental que incorporaba la gravedad clínica
global, incidencia de la enfermedad y duración de los signos
clínicos en un índice comparativo mediante la suma de todas las
valoraciones diarias de todas las ratas en un grupo de tratamiento
entre el comienzo y el final del ataque y dividiendo por el número
total de ratas dentro del grupo de tratamiento. Se lleva a cabo el
análisis estadístico sobre datos combinados a partir de al menos
dos experimentos similares.
Siete días antes de la inmunización [-7] y
durante 21 días tras la misma [+14], se alimentaron las ratas con
IFN fingida, 1.000, 3.000 ó 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta natural de rata [IFN \alpha+
\beta de rata Cytimmune, 4,0 x 10^{5} IRU/ml, Lee Biomolecular
Research, Inc. San Diego, CA] o IFN-\alpha
recombinante humana [hrIFN-\alpha]
[IFN-\alpha_{11} 3,0 x 10^{6} IU/ml, Schering
Corp, Kenilworth, NJ] usando una jeringuilla equipada con una aguja
de punta de bola de calibre 20 [Thomas Scientific, Swedesboro, NJ]
colocada en la orofaringe posterior o inyectada subcutáneamente con
placebo PBS o 5.000 unidades de hrIFN-\alpha
diariamente. Se reconstituyen las preparaciones de IFN liofilizadas
con DPBS y se diluyen de 1/600 a 1/3.000. Se prepara la preparación
fingida natural de forma idéntica a la
IFN-\alpha/\beta natural de rata pero no se
induce con virus Newcastle.
Como se describió anteriormente se llevó a cabo
la preparación de proteína básica de mielina de cobaya
[GP-MBP], es decir, homogenización y dilapidación,
elución en ácido de MBP, preparación de célula del nódulo linfático
y bazo, proliferación de linfocitos T in vitro y análisis de
citoquinas.
Tras el sacrificio se extraen las médulas
espinales y se fijan en inmersión en formalina tamponada neutra al
10% durante un mínimo de dos semanas. Tras la fijación se seccionan
las médulas totalmente en el plano horizontal a intervalos de
aproximadamente 3 mm y se procesan en parafina. Se seccionan los
bloques en parafina a 6-8 micrómetros y se colorean
las secciones [n = 5] con hematoxilina y eosina y con azul
Luxol-fast / PAS / hematoxilina, y se examina
mediante microscopia óptica. Se evalúan las secciones de la médula
independientemente en cuanto a focos de inflamación por parte de un
observador objetivo, sin conocimiento del estatus de tratamiento de
los animales antes del sacrificio. Se toman muestras del tejido de
la médula espinal de forma idéntica para cada animal y se cuenta el
número de focos inflamatorios por sección (> 20 células
inflamatorias) en la parénquima. Se lleva a cabo el análisis
estadísimo usando un ensayo T de Student de dos vías.
Se inmunizan cuatro grupos de seis ratas Lewis de
8-10 semanas de edad con partes iguales de MBP y
CFA y a continuación presentaban ataques que comienzan en el día 9
y continúan hasta el día 16. Durante siete días antes de la
inmunización [-7] y durante 21 días después de la misma [+14], cada
grupo de animales se alimentó con IFN fingida, 1.000, 3.0000 ó
5.000 unidades de IFN-\alpha/\beta de tipo 1 de
rata diariamente en 0,1 ml de PBS. Se valora la enfermedad clínica
en todos los animales hasta el día 16 después de la inmunización.
Los resultados del examen objetivo de las valoraciones clínicas
diarias del grupo mostraron diferencias significativas en la
respuesta clínica en los animales alimentados con IFN fingida
frente a los alimentados con 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta de forma particular en los días
13-16 pero no en los animales alimentados con 1.000
ó 3.000 unidades. Las ratas tratadas con 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta natural de rata presentaban un
pico de enfermedad que era menos grave que en el grupo de IFN
fingida, y el grupo tratado con 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta se recuperó más rápidamente y
volvió al basal más pronto que el grupo tratado con IFN fingida
[figura 2, datos no mostrados para 1.000 y 3.000 unidades]. La
valoración clínica acumulativa de neuritis alérgica experimental de
los animales tratados con 5.000 unidades de
IFN-\alpha natural de rata fue significativamente
menor que la de los controles alimentados con IFN fingida [0,8
\pm 0,2, alimentadas con 5.000 unidades frente a 1,2 \pm 0,2,
alimentadas con IFN fingida, p < 0,02]. También se examinaron
los animales histológicamente a los 16 días tras la inmunización.
Había menos focos inflamatorios en los tratados con
IFN-\alpha/\beta [26 \pm 6] en comparación
con el grupo del interferón fingida de control [50 \pm 2] si bien
esto no iba unido a significación estadística debido al pequeño
número de médulas espinales examinadas por grupo [n = 3] [p <
0,06].
Se inhibe la proliferación de ConA en nódulo
linfático poplíteo de drenaje de 16.209 \pm 1.234 cpm de animales
alimentados con IFN fingida a 8.120 \pm 765 cpm en animales
alimentados con 5.000 unidades de
IFN-\alpha/\beta. Se estimulan las células de
nódulo linfático poplíteo de drenaje de animales tratados con IFN
fingida y 5.000 unidades de IFN-\alpha/\beta con
ionomicina + PMA y muestran una proliferación disminuida de
animales tratados con IFN fingida [20.505 cpm \pm 505] a animales
tratados con 5.000 unidades de IFN-\alpha/\beta
[6.111 cpm \pm 636]. No se muestran diferencias consistentes en
la proliferación de MBP o MT entre los animales alimentados y
alimentados con preparación fingida en el nódulo linfático poplíteo
de drenaje. No había inhibición en bazo o nódulo linfático
mesentérico no de drenaje respecto a ConA o ionomicina/PMA en
animales tratados con IFN.
Así pues, los interferones de tipo 1 específicas
de especie inhiben la gravedad de enfermedad clínica aguda cuando
se administran a dosificaciones adecuadas. La inhibición de la
proliferación a partir de IFN-\alpha/\beta
administrada por vía oral podría ser debida a una acción directa de
la IFN, la cual penetra en el torrente sanguíneo a través del tubo
digestivo o indirectamente. El tratamiento con IFN tipo 1 in
vitro del nódulo linfático poplíteo de drenaje y células del
bazo de animales inmunizados pero tratados con IFN fingida muestra
efectos similares al tratamiento in vivo. No hay efecto
claro sobre la proliferación de ConA en las células del nódulo
linfático poplíteo de drenaje o del bazo expuestas a IFN
[1-100 unidades] in vitro, al contrario que
para la administración por vía oral de IFN in vivo en la que
disminuye la proliferación en el nódulo linfático poplíteo de
drenaje. Así pues, puede mediar un efecto indirecto de la IFN de
tipo 1 a través del tejido linfoide asociado al tubo digestivo.
Debido a que la interferón de tipo 1 humana puede
mostrar actividad de especies cruzadas en ratones, cobayas,
terneros gnotobióticos, caballos y cerdos, y gatos, se utiliza la
interferón recombinante humano [hrIFN-\alpha], un
material uniforme que puede proporcionar más inmunosupresión por
unidad de actividad que las preparaciones naturales. Durante siete
días antes de la inmunización [-7] y durante 21 días después de la
misma [+14] se alimenta cada grupo de animales bien con PBS, 1.000
unidades o 5.000 unidades de hrIFN-\alpha
diariamente. Se inmunizaron tres grupos de ratas Lewis de
8-10 semanas de edad y a continuación presentaron
un ataque comenzando en el día 10 y extendiéndose hasta el día 16.
Todos los animales se valoraron en cuanto a la enfermedad clínica
hasta el día 16 después de la inmunización. Tal como se muestra en
la figura 3, los animales alimentados con PBS y 1.000 unidades de
hrIFN-\alpha mostraron ataques agudos graves a
partir del día 10 y alcanzando la intensidad de pico en el día 14.
Los animales alimentados con 5.000 unidades de
hrIFN-\alpha mostraron un comienzo del ataque
retardado, menor gravedad en el pico y una resolución más pronta
del ataque. La valoración clínica acumulativa de neuritis alérgica
experimental de los animales tratados con 5.000 unidades de
hrIFN-\alpha fue significativamente menor que la
de los animales alimentados bien con control PBS o con 1.000
unidades [figura 4]. Así pues, la hrIFN-\alpha
administrada por vía oral suprime el comienzo de los ataques
clínicos de EAE en la rata Lewis cuando se administra antes de la
inoculación. Tras el sacrificio a los 16 días
post-inmunización los animales también fueron
examinados histológicamente. Había significativamente menos focos
inflamatorios en el grupo alimentado con 5.000 unidades de
hrIFN-\alpha en comparación con el grupo de
control PBS o el grupo alimentado con 1.000 unidades de
hrIFN-\alpha [figura 5].
La hrIFN-\alpha administrada
por vía oral modifica la enfermedad clínica y disminuye la
inflamación en la médula espinal. Se examina la eficacia relativa
de cantidades equivalentes de hrIFN-\alpha
administrada por vía oral frente a vía parenteral. Se inmunizan
tres grupos de seis ratas Lewis y bien no se tratan, se alimentan
con 5.000 unidades de hrIFN-\alpha o se les
inyectan 5.000 unidades de hrIFN-\alpha por vía
subcutánea durante siete días precedentes a la inmunización [-7] y
durante 21 días tras la misma [+14]. Todos los animales se
valoraron en cuanto a enfermedad clínica hasta el día 18 tras la
inmunización. Las ratas tratadas con 5.000 unidades de
hrIFN-\alpha por vía oral presentaban una
enfermedad menos grave en el pico de la enfermedad y recuperación
más rápida en comparación con el grupo no tratado [figura 6].
Realmente, los grupos no tratado y tratado por vía subcutánea
presentaban valoraciones de la curva clínica muy similares, lo que
sugería que la hrIFN-\alpha por vía subcutánea
presentaba poco o ningún efecto sobre la enfermedad clínica. Las
valoraciones clínicas acumulativas de neuritis alérgica
experimental mostraban diferencias significativas en la respuesta
clínica en los animales no tratados / tratados por vía subcutánea
frente a alimentados [figura 7]. No había diferencia significativa
entre los animales no tratados y los tratados por vía subcutánea.
Dieciocho días tras la inmunización se sacrificaron los animales y
se examinaron histológicamente. Había significativamente menos
focos inflamatorios en los alimentados con 5.000 unidades en
comparación con el grupo tratado subcutáneamente con 5.000 unidades
[figura 8].
Los animales alimentados con PBS y los controles
inyectados con PBS por vía subcutánea mostraron hallazgos
similares. En este caso cuatro grupos de seis ratas Lewis se
alimentaron con PBS, se inyectaron por vía subcutánea con PBS, se
alimentaron con 5.000 unidades de hrIFN-\alpha o
se inyectaron con 5.000 unidades de hrIFN-\alpha
por vía subcutánea durante siete días antes de la inmunización [-7]
y durante 21 días después de la inmunización [+14]. Todos los
animales se inmunizaron en el día 0. Se valoraron los animales en
cuanto a enfermedad clínica hasta el día 16 tras la inmunización y
se sacrificaron. Las valoraciones clínicas acumulativas de la
neuritis alérgica experimental fueron significativamente inferiores
en los animales alimentados con hrIFN-\alpha [1,0
\pm 0,2] en comparación con los alimentados con PBS [2,5 \pm
0,4] [p < 0,005]. No había diferencia significativa entre los
animales tratados por vía subcutánea con preparación fingida [1,7
\pm 0,4] y con 5.000 unidades de hrIFN-\alpha
por vía subcutánea [2,1 \pm 0,4] incluso los animales tratados
por vía subcutánea no presentaban mayores valoraciones clínicas
acumulativas de neuritis alérgica experimental. Así pues, la
hrIFN-\alpha administrada por vía subcutánea no
puede modificar el comienzo de la enfermedad clínica aguda cuando
se administraba a dosificaciones por vía oral clínicamente
preventivas.
Se ha asociado la intensidad de enfermedad en EAE
con la secreción de IFN-\gamma tras estimulación
con ConA. Por consiguiente, se estimularon células del nódulo
linfático poplíteo de drenaje [día 18 tras la inmunización] tanto
de ratas alimentadas con preparación fingida como con 5.000 unidades
de hrIFN-\alpha con ConA [2,5 \mug/ml] durante
dos días y se analizaron los sobrenadantes mediante ELISA. Los
resultados de la tabla I mostraron que la
hrIFN-\alpha por vía oral disminuía la
IFN-\gamma, un mediador de la inflamación, en el
nódulo linfático poplíteo de drenaje pero no en el bazo.
| LN, | LN 5.000 | Bazo, | Bazo 5.000 | |
| preparación fingida | preparación fingida | |||
| IFN-\gamma [ng/ml] | 461 \pm 60 | 96 \pm 32* | 360 \pm 75 | 310 \pm 62 |
Se cultivan células del bazo y del nódulo
linfático poplíteo de drenaje [día 18] de ratas inmunizadas
alimentadas con IFN fingida y 5.000 unidades de IFN con ConA [2,5
\mug/ml] a 1 x 10^{6} células /ml durante 48 horas. Se recogen
los sobrenadantes a las 48 horas tras activación con ConA y se
congelan a -70ºC tras centrifugación. Se mide la
IFN-\gamma usando ensayo ELISA de fase sólida.
Los resultados se expresan en ng/ml. Se muestran los datos
combinados de los dos experimentos. LN 5.000 comparado con LN
alimentado con preparación fingida *p < 0,05.
Se describen en la presente invención
interferones de tipo 1 administrados por vía oral en oposición a
dosis idénticas por vía subcutánea como modificadores de la
respuesta biológica para MBP en EAE aguda en ratas Lewis cuando se
administran antes de la sensibilización y ataque clínico. Los
interferones de tipo 1 administrados por vía oral modifican en
parte los ataque clínicos, disminuyen el número de focos
inflamatorios en la médula espinal, disminuyen la proliferación no
específica por ConA e ionomicina/PMA y disminuyen la producción de
IFN-\gamma en nódulos linfáticos poplíteos de
drenaje. Esto sugiere que la IFN-\alpha es más
activa por vía oral y presenta efectos inmunológicos definibles y
confirma que las citoquinas específicas son capaces de inhibir la
enfermedad clínica cuando se administran a través del tracto
gastrointestinal.
De forma sorprendente, tanto la
IFN-\alpha recombinante humana como la IFN
natural de rata específica de especies actuaron en la presente
invención. Las IFN naturales son una mezcla de 14 subespecies
separadas incluyendo el subtipo IFN-\alpha_{11}
el cual puede ser solo un pequeño componente del tipo natural. La
IFN humana muestra algo de actividad de especies cruzada, sin
embargo, el uso exclusivo del subtipo IFN \alpha_{11} puede
proporcionar una cantidad relativamente mayor mediante unidades
actividad/total inhibitorias de actividad del componente más
importante para la inmunosupresión en rata.
Los efectos antiproliferativos de la IFN
administrada por vía oral fueron mayores en nódulo linfático
poplíteo de drenaje que en nódulos linfáticos poplíteos no de
drenaje. La administración oral de IFN-\alpha
también inhibió la producción de IFN-\gamma en
los nódulos linfáticos poplíteos de drenaje. Los nódulos linfáticos
poplíteos de drenaje son las zonas de drenaje naturales para
antígenos administrados por vía subcutánea y por tanto
presumiblemente la reserva de altas frecuencias de linfocitos T
específicas de MBP sensibilizadas. Las citoquinas administradas por
vía oral pueden dar como resultado de forma preferente la
proliferación y producción de citoquina en lugares de activación
inmune en comparación con la administración sistémica. La inhibición
de la secreción de IFN-\gamma en un
compartimiento inmune regional activado por
IFN-\alpha puede provocar un efecto inflamatorio
disminuido de las células específicas de la MBP en el CNS.
La IFN-\alpha por vía oral fue
efectiva en la inhibición de la EAE en comparación con dosis
idénticas por vía subcutánea. La IFN in vitro no inhibió la
proliferación de ConA en pop LN al contrario que la administración
por vía oral in vivo. Por tanto, la ruta de administración es
crítica y puede determinar el mecanismo inmunológico para la IFN.
Las proteínas que podrían no sobrevivir al tránsito a través del
canal alimentario pueden mostrar aún actividad inmunoinhibidora a
través del tejido linfoide asociado al tubo digestivo [GALT] en la
orofaringe. Por tanto la administración oral proporciona un sistema
de liberación del fármaco alternativo para las citoquinas
terapéuticas en el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediante
la generación de células inmunoreguladoras por parte del sistema
inmune del tubo digestivo.
No se conoce el mecanismo inmunomodulador del
interferón de tipo 1 administrado por vía oral. Los efectos
moduladores de los linfocitos activados con ConA sobre las
respuestas del mitógeno de células respondedoras normales se pueden
eliminar mediante la adición de suero de IFN de leucocito
anti-humano in vitro el cual puede modificar
la producción de factores inhibitorios inducidos por
IFN-\gamma, por ejemplo el factor supresor se la
respuesta inmune soluble [SIRS] y el factor supresor derivado de
macrófago [M\phi-SF]^{16}. Se pueden
requerir linfocitos T periféricos para la producción de interferón
después de tal estimulación del mitógeno. Sin embargo, la
administración oral de IFN en dosis baja en ratones no da lugar a
cantidades detectables de IFN en sangre al contrario que la
administración por vía intraperitoneal, ni puede su efecto ser
bloqueado por anticuerpos anti-IFN en circulación.
El efecto neutropénico de la IFN administrada oralmente se puede
transferir mediante inyección de células sanguíneas pero no de
suero a los animales receptores. De forma similar, se pueden
inducir células en el parche de Peyer tras administración por vía
oral de antígeno en ratones que disminuye la respuesta humoral
in vitro. Por tanto, la IFN de tipo 1 puede ser una
moléculas inmunomodulatoria producida por linfocitos T activadas y
otras células inmunes que inducen factores supresores, tales como
el SIRS y el M\phi-SF, inhibiendo la respuesta a
antígenos inmunizados tal como la MBP.
La presente invención demuestra que la terapia
con IFN-\alpha por vía oral es relevante para la
esclerosis múltiple recidivante y remitente y otras enfermedades
autoinmunes no neurológicas crónicas debido a que la
IFN-\alpha administrada por vía oral parece ser
más efectiva que las dosis equivalentes de
IFN-\alpha por vía parenteral. Por tanto la
administración por vía oral de modificadores de la respuesta
biológica de la citoquina, tales como la
IFN-\alpha, proporciona un medio efectivo de
modificación de los ataques clínicos a un autoantígeno cuando se
administra antes de la sensibilización. La ruta oral es un sistema
de liberación del fármaco conveniente que permite el uso de dosis
significativamente menores de citoquinas, minimizando los efectos
secundarios y mejorando la eficacia.
Se inmunizaron ratas Lewis hembra (Harlan), de
150-170 g de peso con 20 mg (peso en húmedo) de
mielina de nervio periférico emulsionada en un volumen igual de
adyuvante de Freund completo (CFA), el cual contenía 10 mg de M.
tuberculosis por ml de Freund. Se inyecta el inmunógeno en 200
\mul en la garra de la pata trasera derecha. Se aísla la mielina
del nervio periférico de raíces espinales bovinas
(Pel-Freeze, TX) de acuerdo con el procedimiento de
Norton, Methods Enzymol. 31 (parte A), 435, 1975.
Comenzando siete días antes de la inmunización
hasta el sacrificio a los 20 días tras la inmunización se alimentan
las ratas bien con IFN fingida o con 5.000 U de
IFN-\alpha/\beta natural de rata
(IFN-\alpha/\beta de rata citoinmune 1,5 x
10^{6} U/ml, Lee Biomolecular Research Inc, San Diego, CA). Se
reconstituye la IFN liofilizada con agua estéril, se diluye en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administra en una
dosis diaria de 0,1 ml usando una jeringuilla equipada con una
aguja de punto de bola de calibre 20 (Thomas Scientific,
Swedesboro, NJ) colocada en la orofaringe posterior.
Se pesan las ratas diariamente comenzando en el
día 7 tras la inmunización y se evalúan clínicamente usando la
siguiente escala: 0, normal; 1, cojera; 2, paso anormal; 3
paraparesia suave; 4, paraparesia grave; 5, paraplejía; 6,
paraplejía con pata delantera implicada; 7, paraplejía con pata
delantera implicada e insuficiencia respiratoria; 8, moribundo o
muerte como describieron Hahn y col., Acta Neuropathol.
82:60-65 (1991). Se calculó la pérdida de peso para
cada animal como la diferencia entre el peso en el momento del
sacrificio y el peso máximo y se expresó como un porcentaje del
peso máximo.
En el sacrificio el día 20 tras la inmunización
se extraen los nódulos linfáticos poplíteos de drenaje y el bazo.
Se preparan suspensiones de células simples mediante el paso a
través de un tamiz de alambre de acero inoxidable de 90 \mum. Se
lleva a cabo la lisis de eritrocitos en las suspensiones de células
del bazo mediante la adición de 2 ml de solución de ACK al agregado.
Se reúnen las células del bazo y de los nódulos linfáticos de
drenaje para cada grupo de tratamiento para su cultivo in
vitro. Se incuban las poblaciones de bazo o nódulo linfático
completas a 2 x 10^{5} células ml con M. tuberculosis a 10
\mug/ml, SP26 a 1 \mug/ml [SP26 es un péptido neurotogénico de
26 aminoácidos (Rostami y col., J. Neuroimmunol.,
30:145-151 (1990) sintetizado en el Departamento de
Química Analítica de la Universidad de Texas], concavalina A a 2,5
\mug/ml (Sigma Chemical Co., Sant Louis, MO) en RPMI (Gibco,
Grand Island, NY), ionomicina a 100 ng/ml (Calbiochem, La Jolla,
CA) en combinación con éster palmitílico del ácido mirístico (PMA)
a 1 ng/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado con
suero bovino fetal al 10% (FCS; Whittaker Bioproducts, Walkersville,
MD), piruvato de sodio 1 mM (Gibco, Grand Island, NY), glutamina 2
mM (Gibco), 100 unidades de penicilina/estreptomicina y
2-mercaptoetanol 50 \muM. Se incuban las placas
en CO_{2} al 5% y humidificadas a 37ºC durante 4 días. En ese
momento se pulsan las células con 2 \muCi de (^{3}H) dTd
tritiado y se recogen 18 horas después en un recolector
automatizado. Se mide la captación de (^{3}H) dTd en un contador
de centelleos en líquido Beckman. Se llevan a cabo cultivos por
triplicado y los resultados se expresan como \DeltaCPM.
Se cultivan células del nódulo linfático poplíteo
de drenaje reunidas y del bazo reunidas de animales con neuritis
alérgica experimental tratados con preparación fingida y 5.000
unidades de IFN de rata, con ConA (2,5 \mug/ml), M.
tuberculosis (10 \mug/ml) o SP26 (1 \mug/ml) a 1 x 10^{6}
células/ml en matraces de cultivo de tejidos de 75 cm^{2} durante
48 horas en un incubador con CO_{2} al 5% / aire al 95%
humidificado a 37ºC. Se recogen los sobrenadantes tras
centrifugación y se congelan a -70ºC. Se mide la
IFN-\gamma usando una ensayo ELISA en fase
sólida. Se incuba el
anti-IFN-\gamma (Pharmigen, San
Diego, CA) sobre placas de microtitulación de 96 pocillos de
plástico de polivinilo con tampón de carbonato 0,01 M (pH 9,6)
durante la noche a 4ºC. Se bloquearon las placas con albúmina de
suero bovino al 3% (BSA) en PBS durante 3 horas. Se añaden cien
\mul de los sobrenadantes a distintas diluciones, que se
encuentran en la parte lineal de la curva de absorbancia /
concentración, por triplicado y se incuban durante 1 hora a
temperatura ambiente. Una vez que se lava la placa 5 veces con PBS
Tween (0,05%) se añade durante 60 minutos 100 \mul de anticuerpo
monoclonal de IFN-\gamma conjugada con peroxidasa
(con un determinante epitópico diferente al primer anticuerpo usado
para recubrir la placa de polivinilo) a una concentración de 1:1000.
A continuación se añade el diclorhidrato de
o-fenilendiamina del sustrato de peroxidasa y se
mide la absorbancia a 450 nm. Se generan curvas patrón con
distintas cantidades de IFN-\gamma.
Se sacrifican ratas mediante perfusión con
solución salina con anestesia de pentobarbital el día 20 tras la
inmunización. Se extrae la cauda equina y se divide. Se fija la
parte distal en paraformaldehído al 2,5% / glutaraldehído al 2,5%
en PBS durante 4-6 horas, se trata con osmio durante
la noche en tetróxido de osmio al 2%, se deshidrata y se embebe en
Epon. Se preparan de cuatro a cinco bloques de raíces lumbosacras
inferiores a partir de cada animal. Se colorearon secciones
representativas de 0,5 micrómetros de cada bloque con azul de
toluidina.
La evaluación histológica de la desmielinización
e inflamación en cada raíz se lleva a cabo usando la siguiente
escala (Hahn y col., 1991): desmielinización 1+ = unos
pocos axones desmielinizados perivenularmente o dispersos; 2+ =
muchos focos de desmielinización perivenular; 3+ = desmielinización
extensiva perivenular y confluente; inflamación 1+ = unas
pocas células inflamatorias mononucleares dispersas frecuentemente
subperineurial; 2+ = recubrimiento perivenular con células
inflamatorias mononucleares; 3+ = recubrimiento perivenular
multifocal extensiva e inflamación endoneurial extendida. Se
calculan las valoraciones por animal dividiendo el número total
para la desmielinización e inflamación por el número de raíces
nerviosas en las secciones. Se leen los portaobjetos por un
investigador (MP) que no conocía la inmunización o protocolo de
tratamiento que tuvo lugar con los especímenes.
La parte próxima a la cauda equina (\pm 2 cm)
se congela instantáneamente en metilbutano enfriado con nitrógeno
líquido y se almacena a -70ºC. Se cortan secciones transversales de
ocho micrómetros en un criostato, se fijan en éter enfriado con
hielo y se usan para la inmunocitoquímica.
Se lleva a cabo la inmonocitoquímica usando los
siguientes anticuerpos: ED1 1:1000 (macrófagos), W3/13 (linfocitos;
Harlan Bioproducts for Science, IN), CD11b/c 1:100 (CR3 sobre
macrófagos, granulocitos, células dendríticas; Pharmingen, CA),
IFN-\gamma 1:10 (Genzyme, MA). Se bloquean
secciones congeladas de ocho micrómetros en suero de conejo normal
durante 30 minutos, luego se incuban con el anticuerpo primario
durante una hora, se lavan con PBS, se incuban con anticuerpo
secundario biotinilado durante una hora, se lavan en PBS, se
incuban con peroxidasa ABC (Vectastatina) durante 45 minutos, se
lava y se desarrollan con diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno.
El bloqueo con peróxido de hidrógeno al 0,01% precedió a la
incubación con anticuerpos primarios para la
IFN-\gamma. Se valora la intensidad y distribución
del tintado en las raíces del nervio como 1+, ligero; 2+, moderado
y 3+, fuerte.
Las ratas comienzan a perder de peso el día 10
tras la inmunización y los primeros síntomas neurológicos aparecen
el día 12 mientras que la recuperación comienza el día 16 o
posteriormente. Once de las 22 ratas (50%) desarrollaron neuritis
alérgica experimental grave con una valoración clínica de 4
(paraparesia grave) o superior y de 2 de los 11 animales alimentados
con IFN fingida murieron el día 14 y 15 tras la inmunización,
mientras que ninguno de los animales alimentados con
IFN-\alpha/\beta murieron. La valoración
clínica en las ratas alimentadas con IFN fingida (n = 11, valoración
4,1 \pm 2,4; neuritis alérgica experimental \pm SD) fue
significativamente superior que en las ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta (n = 11, valoración 3,3 \pm
1,4; p = 0,03, ensayo de clasificación de Wilcoxon). Más ratas en el
grupo alimentado con IFN fingida desarrollaron una valoración
clínica de 4 o superior (figura 9A). De forma similar más animales
alimentados con IFN fingida perdieron más de un 25% de su peso
corporal que animales alimentados con
IFN-\alpha/\beta (figura 9B).
La proliferación de células del bazo frente a
ConA en animales alimentadas con
IFN-\alpha/\beta disminuye en comparación con
los animales alimentados con IFN fingida (bazo: IFN fingida 118.114
\pm 5.194 frente a IFN-\alpha/\beta de rata
835 \pm 94, media \pm SEM, p < 0,006, ensayo t).
La producción de IFN-\gamma
tras estimulación con SP26 por parte de células del nódulo
linfático y del bazo en ratas alimentadas con IFN fingida es mucho
mayor que la producción de IFN-\gamma por parte de
las células de nódulo linfático y del bazo de ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta, según medida por ELISA, pero
la diferencia no llega a tener significación estadística (nódulo
linfático: 18,9 \pm 2,4 ng/ml frente 11,9 \pm 3,8 ng/ml; bazo:
11,9 \pm 0,4 ng/ml frente a 6,3 \pm 1,8 ng/ml, media \pm SEM,
rata alimentada con IFN fingida frente a rata alimentada con
IFN-\alpha/\beta, p < 0,08). No se observa
diferencia en la producción de IFN-\gamma tras la
estimulación con ConA o M. tuberculosis.
La histología de las secciones embebidas en Epon
muestra que la desmielinización es significativamente menos grave
en ratas alimentadas con IFN-\alpha/\beta de
rata (valoración 0,88 \pm 0,11, media \pm SD) en comparación con
las ratas alimentadas con IFN fingida (valoración 1,1 \pm 0,26; p
< 0,05, ensayo t) pero la inflamación no era significativamente
diferente en ambos grupos de animales (valoración 1,0 \pm 0,2
frente a 1,18 \pm 0,24).
La inmunocitoquímica con anticuerpo CD11bc
muestra números grandes de células inflamatorias tanto
perivasculares como infiltradas de forma difusa en las raíces del
nervio de la cauda equina tanto en ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta de rata como alimentadas con
IFN fingida cuando se sacrifican el día 20. La mayoría de estas
células eran macrófagos positivos ED1 fagocíticos y no se
observaban diferencias significativas entre ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta de rata y animales alimentados
con IFN fingida en la extensión de la inflamación.
Se sacrifican pronto un grupo de ratas tratadas
bien con IFN-\alpha/\beta de rata (n = 3) o con
IFN fingida (n = 3) en el curso de la enfermedad el día 13 antes de
la inmunización. Se lleva a cabo la inmunocitoquímica para evaluar
la producción de IFN-\gamma in situ, la
cual se ve sólo hasta el día 14 en neuritis alérgica experimental,
así como también la inflamación. La infiltración por parte de
macrófagos positivos ED1 y linfocitos positivos W3/13 fue mucho
menos grave en ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta que en los controles
alimentados con IFN fingida. El tintado por
IFN-\gamma estaba presente en zonas de
inflamación densa sobre la superficie de las células inflamatorias.
La figura 10 muestra que el tintado por
IFN-\gamma era marcadamente reducido en ratas
alimentadas con IFN-\alpha/\beta de forma
concomitante con una inflamación menos extensiva.
La administración de
IFN-\alpha/\beta específico de especie por vía
oral en comparación con IFN fingida reduce la gravedad de la
neuritis alérgica experimental, provocando una disminución
significativa en la valoración de la enfermedad clínica y menor
pérdida de peso. Los datos histológicos, recogidos el día 20 tras
la inmunización, cuando había comenzado la recuperación, mostraron
menor desmielinización en el grupo tratado con
IFN-\alpha/\beta sin alteración de la extensión
de la inflamación. El día 13 tras la inmunización se reduce la
producción de IFN-\gamma in situ junto con
la inflamación según se evalúa mediante la inmunocitoquímica. Los
estudios de proliferación de células del nódulo linfático de
drenaje y del bazo mostraron una proliferación reducida para ConA
en ratas con neuritis alérgica experimental alimentadas con
IFN-\alpha/\beta en comparación con los
controles alimentados con IFN fingida El análisis de la citoquina
revela una producción de IFN-\gamma reducida tras
la estimulación con SP26, un antígeno de la mielina de nervio
periférico capaz de inducir la neuritis alérgica experimental. En
combinación, la presente invención muestra mediante una reducción
en la producción de IFN-\gamma que la
administración por vía oral de IFN-\alpha/\beta
reduce la gravedad de la neuritis alérgica experimental. Así pues,
la presente invención muestra un efecto inmunomodulador de la
IFN-\alpha/\beta por vía oral en el sistema
inmune del huésped.
El mecanismo por el cual la
IFN-\alpha/\beta por vía oral actúa sobre el
sistema inmune es desconocido pero puede incluir efectos sobre los
parches de Peyer en el tejido linfoide asociado con el tubo
digestivo (GALT) en donde se pueden generar células reguladoras. La
IFN-\gamma puede inducir factores
inmunorreguladores derivados de linfocitos T CD8+ que son
responsables de la modificación de la enfermedad. La producción
reducida de IFN-\gamma asociada con
administración por vía oral de IFN-\alpha/\beta
sugiere una posible inhibición funcional de las linfocitos T
cooperadores tipo Th1 encontrados en EAE que producen
IFN-\gamma. Esto da lugar a una disminución de la
encefalitogenicidad de los linfocitos T de la enfermedad inducida de
forma activa o pasiva.
Se ha demostrado que la administración de
IFN-\gamma por vía parenteral aumenta la neuritis
alérgica experimental tanto inducida por mielina como mediada por
linfocitos T con mayores signos clínicos y anormalidades
histológicas y mayor ruptura oxidativa por parte de los macrófagos,
mientras se obtiene el efecto contrario mediante administración
parenteral de anticuerpo
anti-IFN-\gamma. La
IFN-\gamma también induce la expresión de MHC de
clase I y clase II en células Schawann in vitro. La
IFN-\gamma, una citoquina inflamatoria liberada
por los linfocitos T Th1 CD4+, puede regular la expresión de MHC
de clase II en macrófagos y células del endotelio y macrófagos
activados que juegan un papel importante en la fagocitosis de la
mielina. Se observa expresión de la IFN-\gamma
reducida e inflamación reducida al comienzo de la enfermedad
clínica en animales alimentados con
IFN-\alpha/\beta. La evaluación histológica al
final del proceso de la enfermedad, cuando había comenzado la
recuperación, mostró una reducción de la desmielinización pero no
de la inflamación en animales alimentados con
IFN-\alpha/\beta. Los menores niveles de
IFN-\gamma e inflamación en las primeras etapas y
desmielinización reducida en las últimas etapas de la enfermedad
sugiere un papel crítico para la IFN-\gamma en la
patogénesis de la neuritis alérgica experimental. La incapacidad
para disminuir la inflamación en las últimas etapas de la enfermedad
se puede deber a la eliminación parcial de la producción de la
IFN-\gamma, a la influencia de otras citoquinas y
mediadores inflamatorios y a la inducción de la neuritis alérgica
experimental más grave.
En resumen, la interferón por vía oral es un
modificador de la respuesta biológica efectivo en la modificación
de enfermedad en otra enfermedad autoinmune experimental, la
neuritis alérgica experimental. Los resultados de la presente
invención en neuritis alérgica experimental que muestran enfermedad
reducida en ratas alimentadas con
IFN-\alpha/\beta ilustra que la administración
de IFN-\alpha/\beta por vía oral sería útil en
el tratamiento de neuropatías inmuno-mediadas en
humanos, tal como el síndrome de Guillain-Barré o
la poliradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica
(CIDP).
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en
esta memoria descriptiva son indicativas de la cantidad de
especialistas en la técnica a los que la invención concierne. Todas
estas patentes y publicaciones se incorporan al presente documento
como referencia en la misma extensión que si cada publicación
individual fuese se indicase de forma específica e individualmente
para ser incorporada como referencia.
Un especialista en la técnica apreciará
fácilmente que la presente invención se adapta bien para llevar a
cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados.
Claims (12)
1. El uso de un interferón de tipo uno en la
producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de una
enfermedad autoinmune mediante administración por vía oral,
caracterizado porque dicho interferón se encuentra en una
dosificación de 50 UI/kg a 25.000 UI/kg y porque dicho interferón se
ingiere tras la administración.
2. Uso según se reivindica en la reivindicación
1, en el que dicho interferón se selecciona de
interferón-alfa e
interferón-beta.
3. Uso según se reivindica en la reivindicación 1
ó 2, en el que dicho interferón se selecciona de interferón
recombinante humano, interferón de rata e interferón de ratón.
4. Uso según se reivindica en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enfermedad autoinmune
se selecciona de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes
sacarina, soriasis, enfermedades autoinmunes específicas de
órganos, poliradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria
crónica y síndrome de Guillain-Barré
5. El uso de un interferón de tipo uno en la
producción de un medicamento para el uso en la disminución de la
gravedad o frecuencia de una recaída de la esclerosis múltiple en
un humano mediante administración oral, caracterizado porque
dicho interferón se ingiere tras la administración.
6. Uso según se reivindica en la reivindicación
5, en el que dicho interferón se selecciona de
interferón-alfa e
interferón-beta.
7. Uso según se reivindica en la reivindicación 5
o en la reivindicación 6, enel que dicho interferón se selecciona
de interferón recombinante humano, interferón de rata e interferón
de ratón.
8. El uso de un interferón de tipo uno en la
producción de un medicamento para el uso en la reducción de la
inflamación asociada con una enfermedad autoinmune mediante
administración por vía oral, caracterizada porque dicho
interferón se encuentra en una dosificación de 50 UI/kg a 25.000
UI/kg y porque dicho interferón se ingiere tras la
administración.
9. Uso según se reivindica en la reivindicación
8, en el que dicho interferón se selecciona de
interferón-alfa e
interferón-beta.
10. Uso según se reivindica en la reivindicación
8 o en la reivindicación 9, en el que dicho interferón se selecciona
de interferón recombinante humano, interferón de rata e interferón
de ratón.
11. Uso según se reivindica en alguna de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha enfermedad autoinmune se
selecciona de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes
sacarina, soriasis, enfermedades autoinmunes específicas de órganos,
poliradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y
síndrome de Guillain-Barré.
12. El uso de un interferón de tipo 1 en la
producción de un medicamento para el uso en la inhibición del
comienzo de una enfermedad autoinmune mediante administración por
vía oral, caracterizado porque dicho interferón se ingiere
tras la administración y porque dicho interferón se encuentra en una
dosificación de 50 UI/kg a 25.000 UI/kg.
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