CN113667622B - 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途 - Google Patents

一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113667622B
CN113667622B CN202111089489.0A CN202111089489A CN113667622B CN 113667622 B CN113667622 B CN 113667622B CN 202111089489 A CN202111089489 A CN 202111089489A CN 113667622 B CN113667622 B CN 113667622B
Authority
CN
China
Prior art keywords
oryzanol
weight
ferulic acid
solution
temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111089489.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113667622A (zh
Inventor
孟永宏
胡永员
郭建琦
牛永洁
杨璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Original Assignee
Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd filed Critical Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Priority to CN202111089489.0A priority Critical patent/CN113667622B/zh
Publication of CN113667622A publication Critical patent/CN113667622A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113667622B publication Critical patent/CN113667622B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一珠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1‑07及其在制备阿魏酸中的用途。该阿魏酸制备方法包括制备粗酶粉、水解谷维素与分离步骤。本发明阿魏酸制备方法的谷维素转化率达到67％，该制备方法的产率可达56％以上，所得阿魏酸产品的纯度是以重量计22～31％。因此，本发明阿魏酸制备方法操作简便，生产效率高，对环境友好，具有良好的工业化应用前景。

Description

一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07及其用途
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一珠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)A1-07，还涉及它在制备阿魏酸中的用途。
【背景技术】
阿魏酸，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是一种桂皮酸的衍生物，广泛存在于植物细胞壁骨架中，在自然界中大多以酯结构存在。阿魏酸具有良好的药理和生物活性，因而在医药、保健品、化妆品原料中有很高的价值。
谷维素是由阿魏酸环木菠萝醇酯类和阿魏酸甾醇酯类组成的混合物，它在米糠油精炼副产品中非常丰富，目前已有成熟的工艺制取，且已在国内形成产业化。
目前有几种方法制备阿魏酸。水解法是将富含阿魏酸的当归、麦麸、米糠等原料进行水解(酸碱催化或酶催化)，然后经富集制备得到纯度较高的产品；化学合成法是以香兰素和丙二酸为原料通过Kno-evngael反应合成得到阿魏酸；生物合成法是使用微生物将阿魏酸前体物质经过转化得到阿魏酸。
化学合成法存在反应时间长、副反应多、需要溶剂量大等缺点。生物合成法是一种清洁生产方法，如陈洋等人在题目“阿魏酸的制备及在食品工业中应用的研究进展”，《杭州化工》，44(04)，pp12-15(2014)中描述了采用微生物法将丁子香酚肉桂酸酯转化为阿魏酸的方法，但该方法得率较低，难以实现工业化生产。张宸等人在题目“解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究”，《食品工业科技》，35(22)，pp189-192+198(2014)中公开了以解脂亚罗酵母脂肪酶水解谷维素制备阿魏酸的研究。但是，该菌种所产酶对于水解谷维素产阿魏酸活力非常有限，阿魏酸产率仅为2.87％。
目前，生产阿魏酸的主要方法是采用化学法水解谷维素制取阿魏酸，即先用碱对谷维素进行深度水解，生成阿魏酸盐，再用酸处理阿魏酸盐而得到阿魏酸。这种方法操作简便，生产效率高，已实现工业化。邓红等人，在题目“响应曲面法优化碱水解谷维素制取阿魏酸的工艺”，《食品工业科技》，34(16)，pp245-249(2013)中描述了利用碱水解谷维素制备阿魏酸的方法，得率可达71.33％。但是，这种方法产生大量酸碱废水，对环保处理造成了较大压力。
针对现有技术存在的这些技术缺陷，本发明人在总结现有技术基础之上，通过大量实验研究与分析总结，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)A1-07。
本发明的另一个目的是提供所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07在制备阿魏酸中的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)A1-07，该菌株已于2021年07月28日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.22974。
本发明还涉及所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07在制备阿魏酸中的用途。
根据本发明的一种优选实施方式，该制备阿魏酸的制备步骤如下：
A、制备粗酶粉
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机进行离心分离，得到的离心分离液使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1:0.01～0.1：5～50：0.05～0.1，将谷维素与粗酶粉溶于溶剂中，得到的均匀溶液在温度15～45℃与转速150～200rpm的条件下进行恒温酶解反应20～28h，采用高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与阿魏酸含量，当反应液中的谷维素含量不再降低，阿魏酸含量不再增加时就停止加热终止反应，得到谷维素水解液；
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液经真空旋转蒸发脱除溶剂后，得到所述的阿魏酸产品。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述液体产酶培养基制备方法如下：
分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用无机碱或无机酸将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机碱水溶液是浓度为0.1～0.4N的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液；所述的无机酸水溶液是浓度为0.1～0.4N的硝酸、盐酸、硫酸或磷酸水溶液。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，得到的培养液在转速2500～3500rpm的条件下进行离心分离8～12min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，得到的离心分离液在温度-60℃下冷冻干燥10～30h。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的溶剂是一种或多种选自丙酮、丁酮或乙酸乙酯的溶剂。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，在步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力≤100Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述阿魏酸产品的纯度是以重量计22～31％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)A1-07，该菌株已于2021年07月28日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.22974。
本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07是发明人于2020年11月5日由陕西省西安市长安区陕西师范大学校园内在格物楼后落叶下腐殖土壤中筛选分离得到的，具有能利用谷维素唯一碳源生长繁殖的能力。
本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07是通过下述筛选方法分离得到的：
I、初筛
(i)微生物来源与菌悬液制备
以新鲜屠宰的牛胃液、来源于陕西省西安市长安区陕西师范大学校园内在格物楼后落叶下腐殖土壤作为样品；
称取1g样品，往其中加入10ml无菌生理盐水，混合震荡1min，静置30min，移取1ml上清液，往其中加入99ml无菌生理盐水，混合均匀，得到浓度为10-3的菌悬液。
(ii)涂布培养
初筛培养基制备方法如下：
将0.3gNaCl、1.3g(NH4)2SO4、0.3gMgSO4·7H2O、0.3gK2HPO4、20g琼脂与20mL饱和谷维素二甲基亚砜溶液溶于1000mL蒸馏水中，得到的水溶液使用0.1～0.4N无机酸或无机碱水溶液将其pH调节至7.0，接着使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，然后趁热倒在位于无菌操作台上的平板上，静置，冷却凝固，得到所述的初筛培养基。
采用本技术领域技术人员熟知的平板涂布法，移取100μl上述步骤(i)得到的菌悬液涂布在所述的初筛培养基上，在温度30℃下培养3天。
II、复筛
(i)初筛菌落纯化
将步骤(ii)得到的在初筛培养基上所有菌落分别在新初筛培养基平板上划线2-3次进行纯化，直至每个平板只有一种微生物菌落，并对所有菌落进行编号。
(ii)复筛
复筛培养基制备方法如下：
将5g葡萄糖、0.3gNaCl、1.3g(NH4)2SO4、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g K2HPO4、20g琼脂、20mL饱和谷维素二甲基亚砜溶液溶于1000mL蒸馏水中，得到的水溶液使用0.1～0.4N无机酸或无机碱水溶液将其pH调节至7.0，接着使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，然后趁热倒在位于无菌操作台上的平板上，静置，冷却凝固，得到所述的复筛培养基。
将上述各菌株分别划线到复筛培养基平板上，在温度30℃下培养3～5天，然后往每个平板上均匀喷洒显色剂，再静置30min。如果在复筛培养基平板上出现显色反应，由此说明该平板的菌株能够产生阿魏酸，这个菌株确定为复筛菌株。
上述的显色剂是由A液和B液组成的，其中A液是浓度为以重量计3％的三氯化铁水溶液；B液是浓度为以重量计1％的铁氰化钾水溶液。在使用显色剂时，需要将A液与B液按照等体积混合均匀，然后装入喷壶中备用。
III、复筛菌株水解谷维素产阿魏酸的能力试验
(i)配制液体培养基：
液体培养基制备方法如下：
5g葡萄糖、0.3gNaCl、1.3g(NH4)2SO4、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g K2HPO4、20mL饱和谷维素二甲基亚砜溶液溶于1000mL蒸馏水中，得到的水溶液使用0.1～0.4N无机酸或无机碱水溶液将其pH调节至7.0，接着使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，然后移取100ml分装到锥形瓶中。
(ii)接种
挑取单菌落，将上述复筛菌株接种到装有液体培养基的锥形瓶中，每个株菌设置两个平行组。与此同时，取两个装有所述液体培养基的锥形瓶作为空白对照组。
将所有锥形瓶放入温度为30℃的恒温摇床中进行培养。
(iii)复筛菌株对比
培养时间达到6h就从锥形瓶取样采用现有高效液相色谱法检测培养基中的阿魏酸含量，然后每隔6h取样检测一次，以这样方式持续检测120h，其检测结果列于下表1中。
表1：复筛菌株产出阿魏酸含量检测结果
Figure BDA0003266842900000061
Figure BDA0003266842900000071
由表1可以知道，每个菌株都有一个最高阿魏酸含量，通过对比分析，可以将阿魏酸含量最高的菌株确定作为目的菌株。
本发明所筛选的最优菌株编号为A1-07。
(iv)菌种鉴定
采用本技术领域技术人员熟知的16S rDNA鉴定法，提取A1-07菌株的DNA，经上海生工生物工程有限公司测序，该菌株16S rDNA序列列于本申请说明书后面。
经NCBI序列比对，将A1-07菌株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)。
IV、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07形态特征和生化特征
菌体形态特征：该菌株呈白色至浅黄色，圆形，表面湿润、稍微凸起，边缘整齐。菌体呈短杆状，单个或成对排列，革兰氏阴性。
菌体形态特征参见附图1。
菌体生化特征：
甘露醇、卵磷脂酶、O/F试验(氧化型)、肌醇、葡萄糖、柠檬酸盐利用、果糖、硝酸盐还原、精氨酸、木糖、尿素、石蕊牛乳、半乳糖、阿拉伯糖试验均为阳性；在37℃下生长；
氧化酶、靛基质、V-P、MR试验、H2S产生试验为阴性、在5℃下不生长、在41℃下不生长。
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)A1-07已于2021年07月28日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.22974。
本发明还涉及唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07在制备阿魏酸中的用途。
根据本发明，制备阿魏酸的制备步骤如下：
A、制备粗酶粉
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机进行离心分离，得到的离心分离液使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
所述液体产酶培养基制备方法如下：
分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用无机碱或无机酸水溶液将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基。
得到的培养液接着使用离心机在转速2500～3500rpm的条件下进行离心分离8～12min，得到离心分离液上清液，即发酵液。
得到的离心分离液通常先在温度-80℃下预冷冻4h，然后使用冷冻干燥机在温度-20℃下冷冻干燥10～30h。离心分离液预冷冻的基本作用是使得分离液冷冻形成共结晶固体。预冷冻离心分离液进行冷冻干燥的主要目的在于除去离心分离液中的水分获得粗酶粉。冷冻干燥步骤应该达到其水含量为以重量计0.5％以下。
所述的无机碱水溶液是浓度为0.1～0.4N的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液；所述的无机酸水溶液是浓度为0.1～0.4N的硝酸、盐酸、硫酸或磷酸水溶液。
本发明使用的葡萄糖、NaCl、硫酸铵、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、谷维素与二甲基亚砜都是目前市场上销售的产品。本发明使用的离心机、冷冻干燥机、灭菌设备都是目前市场上销售的产品，例如由湖南凯达科学仪器有限公司以商品名实验室常温高速离心机KH19A销售的离心机、由北京四环起航科技有限公司以商品名真空冷冻干燥机销售的冷冻干燥机、由上海申安医疗器械厂以商品名立式压力蒸汽灭菌器销售的灭菌设备。
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1：0.01～0.1：5～50：0.05～0.1，将谷维素与粗酶粉溶于溶剂与水混合物中，得到的均匀溶液在温度15～45℃与转速150～200rpm的条件下进行恒温酶解反应20～28h，采用常规高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与阿魏酸含量，当反应液中的谷维素含量不再降低，阿魏酸含量不再增加时就停止加热终止反应，得到谷维素水解液；
谷维素与粗酶粉的酶解反应如下：
Figure BDA0003266842900000091
式中R代表：
Figure BDA0003266842900000092
本发明使用的溶剂是一种或多种选自丙酮、丁酮或乙酸乙酯的溶剂。
在本发明中，谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比是1：0.01～0.1：5～50：0.05～0.1。谷维素、溶剂与水的用量在所述范围内时，如果粗酶粉的用量低于0.01，则酶用量太低可能无法反应；如果粗酶粉的用量高于0.1，则酶用量过高无法均匀分散在水解体系中；因此，粗酶粉的用量为0.01～0.1是合理的，优选地是0.03～0.08；谷维素、粗酶粉与水的用量在所述范围内时，如果溶剂的用量低于5，则谷维素可能无法全部溶解；如果溶剂的用量高于50，则酶的浓度与底物浓度过低，反应会比较慢；因此，溶剂的用量为5～50是恰当的，优选地是16～40；谷维素、粗酶粉与溶剂的用量在所述范围内时，如果水的用量低于0.05，则可能由于体系内水分过少导致底物无法水解；如果水的用量高于0.1，则可能会由于水分过多与溶剂形成两相体系影响水解反应进程；因此，水的用量为0.05～0.1是合适的，优选地是0.06～0.08。
所述的均匀溶液在温度15～45℃与转速150～300rpm的条件下进行恒温酶解反应20～28h。在这个恒温酶解反应中，转速与恒温酶解反应时间是在所述范围内时，如果恒温酶解反应温度低于15℃，则酶水解反应速率非常低；如果恒温酶解反应温度高于45℃，则可能导致酶失活；因此，恒温酶解反应温度为15～45℃是可取的，优选地是20～38℃。恒温酶解反应温度与恒温酶解反应时间是在所述的范围内时，如果转速低于150rpm，则反应体系传质效果不够；如果转速高于300rpm，则可能由于转速过高，导致酶遭到物理性破坏，反应速率比较低；因此，转速为150～300rpm是合适的，优选地是180～250rpm。恒温酶解反应温度与转速在所述范围内时，如果恒温酶解反应时间少于20h，则酶解反应不够充分；如果恒温酶解反应时间长于28h，则是不必要的，经过多次验证，该酶解反应28h内已经达到反应平衡；因此，恒温酶解反应时间为20～28h是合适的；优选地是20～28h。
本发明采用的高效液相色谱法是一种常规高效液相色谱法，具体参见文献朱琳等人，题目“高效液相色谱法测定米糠油中谷维素”，《粮油食品科技》,2016,24(05):38-43。
在本发明中，该酶解反应进程可以由下式得到的谷维素转化率R进行评价：
Figure BDA0003266842900000101
式中：
C谷维素初始代表反应体系中初始谷维素浓度，单位为μg/ml；
C阿魏酸代表该反应体系在取样时间点时的阿魏酸浓度，单位为μg/ml；
0.322是谷维素完全转化成阿魏酸的系数。
由R值可以判断该酶解反应进行的程度，R值越接近其最大值，该酶解反应就越接近完成，本发明实验研究结果表明，谷维素转化率R可达到67％。
C、分离
在步骤B得到的谷维素水解液经真空旋转蒸发脱除溶剂后，得到所述的阿魏酸产品。
在这个步骤中，在步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力≤100Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下。
所述的谷维素水解液进行真空干燥的绝对压力与温度超过所述的范围都是不可取的，因为可能会导致阿魏酸分解。
本发明进行真空干燥所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由上海亚荣生化仪器厂以商品名旋转蒸发器RE52CS销售的真空旋转蒸发器。
采用常规红外光谱分析方法对采用本发明制备方法制备得到的产物进行了检测，其红外光谱结果列于附图2中，附图2的结果与阿魏酸标准红外光谱数据是吻合的，于是可以确定采用本发明制备方法制备得到产物是阿魏酸。
根据参考文献袁文洪等人，题目“HPLC法测定安康颗粒中阿魏酸的含量”，《中国民族民间医药》,2019,28(19):42-43.分析方法检测，所得到阿魏酸产品的纯度是以重量计22～31％。
根据下述公式计算本发明制备方法的产率：
Figure BDA0003266842900000111
本发明阿魏酸制备方法的产率可以达到56％以上。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明阿魏酸制备方法的谷维素转化率R可达到67％，阿魏酸制备方法的产率可达56％以上，阿魏酸粗产品的纯度是以重量计22～31％。因此，本发明阿魏酸制备方法操作简便，生产效率高，对环境友好，具有良好的工业化应用前景。
【附图说明】
图1是唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07的菌体形态特征图；
图2是采用本发明制备方法制备得到产物的红外光谱图；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明由谷维素制备阿魏酸
该实施例的实施步骤如下：
A、制备粗酶粉
制备液体产酶培养基：分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用0.3N氢氧化钠水溶液或0.2N硝酸水溶液将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基；
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到所述的液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机在转速2500的条件下进行离心分离12min，得到的离心分离液使用冷冻干燥机在温度-60℃下冷冻干燥16h，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1：0.04：5：0.08，将谷维素与粗酶粉溶于丙酮溶剂与水混合物中，得到的均匀溶液在温度45℃与转速150rpm的条件下进行恒温酶解反应20h，停止加热终止反应得到谷维素水解液。采用常规高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与和阿魏酸含量。
根据本申请说明书描述的方法，由检测的谷维素与和阿魏酸含量确定，该步骤的谷维素转化率R是57.3％。
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力95Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下，得到所述的阿魏酸产品。
根据本申请说明书描述的方法检测，该实施例制备阿魏酸产物的纯度是以重量计25.4％；该实施例制备阿魏酸的产率是56.8％。
实施例2：本发明由谷维素制备阿魏酸
该实施例的实施步骤如下：
A、制备粗酶粉
制备液体产酶培养基：分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用0.4N氢氧化钾水溶液或0.3N盐酸水溶液将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基；
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到所述的液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机在转速2800rpm的条件下进行离心分离11min，得到的离心分离液使用冷冻干燥机在温度-60℃下冷冻干燥10h，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1：0.08：50：0.05，将谷维素与粗酶粉溶于丁酮溶剂与水混合物中，得到的均匀溶液在温度25℃与转速180rpm的条件下进行恒温酶解反应26h，然后停止加热终止反应，得到谷维素水解液。采用常规高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与和阿魏酸含量。
根据本申请说明书描述的方法，由检测的谷维素与和阿魏酸含量确定，该步骤的谷维素转化率R是63.3％。
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力92Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下，得到所述的阿魏酸产品。
根据本申请说明书描述的方法检测，该实施例制备阿魏酸产物的纯度是以重量计28.1％；该实施例制备阿魏酸的产率是61.9％。
实施例3：本发明由谷维素制备阿魏酸
该实施例的实施步骤如下：
A、制备粗酶粉
制备液体产酶培养基：分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用0.1N碳酸钠水溶液或0.1N硫酸水溶液将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基；
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到所述的液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机在转速3200rpm的条件下进行离心分离10min，得到的离心分离液使用冷冻干燥机在温度-60℃下冷冻干燥30h，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1：0.01：18：0.10，将谷维素与粗酶粉溶于乙酸乙酯溶剂与水混合物中，得到的均匀溶液在温度15℃与转速200rpm的条件下进行恒温酶解反应28h，然后停止加热终止反应，得到谷维素水解液。采用常规高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与和阿魏酸含量。
根据本申请说明书描述的方法，由检测的谷维素与和阿魏酸含量确定，该步骤的谷维素转化率R是56.4％。
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力99Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下，得到所述的阿魏酸产品。
根据本申请说明书描述的方法检测，该实施例制备阿魏酸产物的纯度是以重量计22.1％；该实施例制备阿魏酸的产率是57.1％。
实施例4：本发明由谷维素制备阿魏酸
该实施例的实施步骤如下：
A、制备粗酶粉
制备液体产酶培养基：分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用0.2N碳酸氢钠水溶液或0.4N磷酸水溶液将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基；
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到所述的液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机在转速3500rpm的条件下进行离心分离8min，得到的离心分离液使用冷冻干燥机在温度-60℃下冷冻干燥24h，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1：0.10：34：0.06，将谷维素与粗酶粉溶于丙酮溶剂与水混合物中，得到的均匀溶液在温度35℃与转速180rpm的条件下进行恒温酶解反应24h，然后停止加热终止反应，得到谷维素水解液。采用常规高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与和阿魏酸含量。
根据本申请说明书描述的方法，由检测的谷维素与和阿魏酸含量确定，该步骤的谷维素转化率R是67.3％。
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力90Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1％以下，得到所述的阿魏酸产品。
根据本申请说明书描述的方法检测，该实施例制备阿魏酸产物的纯度是以重量计30.8％；该实施例制备阿魏酸的产率是67.8％。
序列表
<110> 陕西海斯夫生物工程有限公司
<120> 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S rDNA(Burkholderia gladioli)
<400> 1
tcggcttgcc tttaccatgc aagtcgaacg gcagcacggg tgcttgcacc tggtggcgag 60
tggcgaacgg gtgagtaata catcggaaca tgtcctgtag tgggggatag cccggcgaaa 120
gccggattaa taccgcatac gatctacgga tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgct 180
atagggttgg ccgatggctg attagctagt tggtggggta aaggcccacc aaggcgacga 240
tcagtagctg gtctgagagg acgaccagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aattttggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg 360
cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa gcacttttgt ccggaaagaa atcctgaggg 420
ctaatatcct tcggggatga cggtaccgga agaataagca ccggctaact acgtgccagc 480
agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc 540
aggcggtttg ttaagaccga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattggtga 600
ctggcaagct agagtatggc agaggggggt agaattccac gtgtagcagt gaaatgcgta 660
gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc agccccctgg gccaatactg acgctcatgc 720
acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccc taaacgatgt 780
caactagttg ttggggattc atttccttag taacgtagct aacgcgtgaa gttgaccgcc 840
tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt 900
ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg acatggtcgg 960
aatcctggag agatccggga gtgctcgaaa gagaaccgat acacaggtgc tgcatggctg 1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080
tagttgctac gcaagagcac tctagggaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg tagggcttca cacgtcatac aatggtcgga 1200
acagagggtc gccaacccgc gagggggagc taatcccaga aaaccgatcg tagtccggat 1260
tgcactctgc aactcgagtg catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggtttt 1380
accagaagtg gctagtctaa ccgcaaggag gacgttcacc acggttgg 1428

Claims (9)

1.一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli） A1-07，该菌株已于2021年07月28日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.22974。
2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07在制备阿魏酸中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于制备阿魏酸的制备步骤如下：
A、制备粗酶粉
挑取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌A1-07单菌落接种到液体产酶培养基中，在温度35℃下培养72h，得到的培养液接着使用离心机进行离心分离，得到的离心分离液使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，其固体经粉碎得到所述的粗酶粉；
B、水解谷维素
按照谷维素、粗酶粉、溶剂与水的重量比1:0.01～0.1：5～50：0.05～0.1，将谷维素与粗酶粉溶于溶剂中，得到的均匀溶液在温度15～45℃与转速150～200rpm的条件下进行恒温酶解反应20～28h，采用高效液相色谱法检测在反应液中的谷维素与阿魏酸含量，当反应液中的谷维素含量不再降低，阿魏酸含量不再增加时就停止加热终止反应，得到谷维素水解液；
C、分离
步骤B得到的谷维素水解液经真空旋转蒸发脱除溶剂后，得到所述的阿魏酸产品。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤A中，所述液体产酶培养基制备方法如下：
分别称取10重量份葡萄糖、0.3重量份NaCl、1.3重量份硫酸铵、0.3重量份七水合硫酸镁、0.3重量份磷酸氢二钾，接着添加0.5重量份饱和谷维素二甲基亚砜溶液，再将它们添加到1000重量份蒸馏水中溶解，得到的均匀溶液使用无机碱或无机酸将其pH调节至7.0，再使用灭菌设备在温度121℃下灭菌20min，得到所述的液体产酶培养基。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤A中，得到的培养液在转速2500～3500rpm的条件下进行离心分离8～12min。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤A中，得到的离心分离液在温度-60℃下冷冻干燥10～30h。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤B中，所述的溶剂是一种或多种选自丙酮、丁酮或乙酸乙酯的溶剂。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤C中，在步骤B得到的谷维素水解液在绝对压力≤100Pa与温度80℃的条件下真空干燥至水含量为以重量计0.1%以下。
9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤C中，所述阿魏酸粗产品的纯度是以重量计22～31%。
CN202111089489.0A 2021-09-16 2021-09-16 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途 Active CN113667622B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111089489.0A CN113667622B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111089489.0A CN113667622B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113667622A CN113667622A (zh) 2021-11-19
CN113667622B true CN113667622B (zh) 2022-02-01

Family

ID=78549537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111089489.0A Active CN113667622B (zh) 2021-09-16 2021-09-16 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113667622B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642851A (zh) * 2013-12-10 2014-03-19 江南大学 一种双酶法从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法
CN111592990A (zh) * 2020-03-24 2020-08-28 复旦大学 阿魏酸酯酶的重组表达菌株、制备方法及其应用
WO2021138549A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Inventure Renewables, Inc. Methods for the production of ferulic acid

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642851A (zh) * 2013-12-10 2014-03-19 江南大学 一种双酶法从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法
WO2021138549A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Inventure Renewables, Inc. Methods for the production of ferulic acid
CN111592990A (zh) * 2020-03-24 2020-08-28 复旦大学 阿魏酸酯酶的重组表达菌株、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacteriostatic stimulus of meropenem on allelochemical-metabolizing Burkholderia sp. LS-044 mitigates ferulic acid autotoxicity in rice (Oryza sativa ssp. japonica cv. Tainung 71);Asif Hameed，et al;《Plant Soil》;20190722;1-14 *
Lipase‑Catalyzed Esterification of Triterpene Alcohols and Phytosterols with Oleic Acid;Takashi Kobayashi,等;《J Am Oil Chem Soc》;20140824;第91卷;1885-1890 *
产阿魏酸酯酶菌株筛选、培养条件及酶学性质研究;李干;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20120515;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113667622A (zh) 2021-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110272839B (zh) 一株不动杆菌及其在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用
CN102321563B (zh) 一株拟无枝酸菌及利用其全细胞转化制备香草醛的方法
CN103509741A (zh) 布劳特菌auh-jld56及其在牛蒡苷元转化中的应用
CN111100827B (zh) 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
CN113980828B (zh) 一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株
CN111484954A (zh) 一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌
CN112522155A (zh) 一种地衣芽孢杆菌及其用途
CN115305227A (zh) 一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌zj-21及其应用
Zhang et al. Enzymatic in situ saccharification of herbal extraction residue by a medicinal herbal-tolerant cellulase
CN102363796B (zh) 一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法
CN106995789B (zh) 一株白藜芦醇发酵菌及其应用
CN113667622B (zh) 一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌a1-07及其用途
CN109136313B (zh) 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法
CN101457250B (zh) 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN113930358B (zh) 一种可分解海带的菌株
CN113403229B (zh) 一株将人参皂苷Rf转化至人参皂苷Rg1的沙雷氏菌HGS-487菌株及用途
CN105779363B (zh) 一种液化沙雷氏菌及其转化合成洋茉莉醛的方法
CN112143681B (zh) 一株可产阿魏酸酯酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN111019995B (zh) 一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法
CN109735473B (zh) 发酵法制水溶性姜黄素
Almalki Production of medically important lactic acid by Lactobacillus Pentosus: A biological conversion method
CN113817650A (zh) 一株产吡嗪高温放线菌、分离筛选及应用
CN113215024A (zh) 一株植物乳杆菌及一种发酵黄芩药渣的方法
CN110591968A (zh) 一种肉桂链霉菌产磷脂酶d的方法及磷脂酶d活性测定方法
CN110699263A (zh) 黑曲霉yh-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant