CN113662966A - 一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其药物用途 - Google Patents

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Abstract

一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其药物用途，胎盘脱细胞基质水凝胶为负载促炎细胞因子激活的3D MSC‑EV的胎盘脱细胞基质水凝胶。其中促炎细胞因子为TNF‑α和IL‑1α。通过如下步骤制备：S1，促进毛囊再生功效的3D细胞球培养与TNF‑α/IL‑1α引入；S2，TNF‑α/IL‑1α预处理的MSC胞外囊泡的分离提取；S3，负载MSC‑EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶的制备。本发明的胎盘脱细胞基质水凝胶能够促进毛发再生，具有安全有效的特点。

Description

一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其药物用途
技术领域
本发明涉及毛发再生技术领域，特别是涉及一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其在作为促进毛发再生的药物中的用途。
背景技术
脱发是影响男性和女性的非常常见的医学问题。脱发影响容颜、美观，由脱发引起的损伤或病理造成的毛囊损失不仅影响患者的心理健康，而且还危及皮肤的某些固有功能。此外，脱发患者还易出现指甲缺陷，患上眼疾、白癜风、甲状腺功能减退症等并发症。近年来，随着生活节奏的加快和工作压力的加大，脱发问题困扰着越来越多的人群，脱发患者逐年增多且趋于年轻化。重新生长头发的愿望在全球具有极大的需求，然而，几乎没有真正安全有效的治疗方法。目前，脱发治疗主要有药物治疗及及手术治疗。然而，药物治疗(如非那雄胺，米诺地尔)仅提供短期的改善防止脱发，但不会刺激新的头发生长，并在停止治疗时会导致快速脱发。自体卵泡和滤泡单位移植算是可靠的手术选择，但供体卵泡的数量有限，并且在收获毛囊时，其中一部分毛发发生凋亡导致进一步脱落。因此，如何开发安全高效的治疗脱发产品及研究安全高效的脱发新策略成为当今研究的热点。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)广泛存在于多种组织和器官中，是一种具有自我更新和多种分化潜能的成体干细胞，被认为是细胞治疗的理想来源，在再生医学领域有着重要的作用。大量研究证明，间充质干细胞具有强大的分泌因子的能力，能够分泌多种促进组织修复与再生的因子，在组织修复再生治疗中显示巨大临床应用前景。这种旁分泌能力代表了创新再生医学策略发展的一个有吸引力和有用的工具。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EV)被认为是MSC旁分泌机制中参与组织修复再生的关键介质。细胞外囊泡(EV)是一种纳米囊泡，可由不同类型的细胞产生，含有复杂的物质，包括蛋白质、脂质和核酸，并携带不同种类的调控蛋白，如mRNA和miRNA。它们在调节细胞间通讯方面发挥了重要作用，参与介导细胞反应和生物过程。从转化的角度来看，间充质干细胞来源的胞外囊泡(MSC-EV)是一种诱人的现成的先进治疗药物，可以通过体外培养系统的规模化生产。因此，它可以提供一个巨大的优势，即病人需要的时候都可以迅速获取使用。此外，EV具有易于储存、无免疫排斥、易于控制其浓度等优点，可以克服细胞治疗相关的限制和担忧，包括供体细胞移植、免疫相容性和提供大量需要移植的细胞的成本效率高、耗时的程序等。因此，胞外囊泡为基础的治疗作为一种无细胞疗法，比直接移植或输注干细胞更加安全、快捷与高效，能更好地发挥干细胞的治疗潜能，在再生医学领域具有更好的前景。
然而，这种应用的一个主要问题是胞外囊泡在靶向位点的移植受限。EV体内的不稳定性和移植后短期滞留率阻碍了基于EV的治疗发展。此外，间充质干细胞来源的胞外囊泡(MSC-EV)尽管在诸多组织修复再生中有巨大的治疗前景，然而在毛发再生医学领域的研究应用甚少。这主要是由于体内激活不足，MSC激活真皮乳头(Dermal Papilla,DP)细胞促进毛囊再生或增强毛发生长的功能尚有不足，阻碍了间充质干细胞来源的胞外囊泡(MSC-EV)作为毛发再生无细胞疗法的应用发展。
因此，针对现有技术不足，提供一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其用途以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶及其药物用途，该促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶能够显著促进毛囊再生，具有安全有效的特点。
本发明的目的通过以下技术措施实现。
提供一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，为负载促炎细胞因子激活的3DMSC-EV的胎盘脱细胞基质水凝胶。
优选的，上述促炎细胞因子为TNF-α和IL-1α。
优选的，上述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，通过如下步骤制备：
S1，促进毛囊再生功效的3D细胞球培养与TNF-α/IL-1α引入；
S2，TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡的分离提取；
S3，负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶的制备。
优选的，上述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，
S1通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×106/ml—1.2×106/ml，以每滴30-40μl的体积把细胞悬液均匀加到8-10cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养20-30小时后看到3D细胞球形成于液滴中，30-40小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时按照80ng/ml-120ng/ml的比例加入TNF-α、按照40ng/ml-60ng/ml的比例加入IL-1α，继续培养20h-28h后，收集培养上清液待用；
S2通过如下工艺进行：
将步骤S1收集的培养上清液在3-5℃条件下、以300×g离心8-12分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在3-5℃条件下、将上清继续以2,000×g离心25-35分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在3-5℃条件下、将上清继续以100,000×g离心1.5-2.5小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液；
S3通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM46-50h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在36-37.5℃下熏蒸1.5-3小时，然后再通风条件下，以紫外照射10-15小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照1.2-2.0％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％-2％胃蛋白酶溶液消化溶解45-50h，以3000r/min离心10-30min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用NaOH溶液调PH至7.4，保持温度在3-5℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.008％-0.015％浓度的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。
进一步的，S1具体通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，以每滴35μl的体积把细胞悬液均匀加到9cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴左右，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养24小时后看到3D细胞球形成于液滴中，36小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时按照100ng/ml的比例加入TNF-α、按照50ng/ml的比例加入IL-1α，继续培养24h后，收集培养上清液待用。
进一步的，S2具体通过如下工艺进行：
将步骤S1收集的培养上清液在4℃条件下、以300×g离心10分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在4℃条件下、将上清继续以2,000×g离心30分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在4℃条件下、将上清继续以100,000×g离心2小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液。
进一步的，S3具体通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM48h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在37℃下熏蒸2小时，然后再通风条件下，以紫外照射12小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照1.5％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％胃蛋白酶溶液消化溶解48h，以3000r/min离心15min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用0.1mol/L的NaOH调PH至7.4，保持温度在4℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.01％浓度的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；其中，胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液的提交比为2:1，壳聚糖溶液的浓度为2％；
最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。
本发明还提供上述胎盘脱细胞基质水凝胶在作为促进毛发再生的药物中的用途。
优选的，上述胎盘脱细胞基质水凝胶为可注射凝胶。
本发明的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，为负载促炎细胞因子激活的3DMSC-EV的胎盘脱细胞基质水凝胶。本发明在MSC 3D培养体系中引入促炎细胞因子IL-1α或TNF-α，激活MSC的活性与功能，诱导MSC分泌具有促进毛囊再生功效的特定EV群体，具有显著增强EV在毛发再生中的功效。人胎盘来源的脱细胞细胞外基质ECM水凝胶(HPECM)，作为MSC-EV的缓释递送载体，负载TNF-α/IL-1α激活的3D MSC-EV的可注射胎盘脱细胞基质水凝胶，能够增强EV的稳定性和固位性，最终提高EV的持续释放的长期效果。故本发明的胎盘脱细胞基质水凝胶能够促进毛发再生，具有安全有效的特点。
说明书附图
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是采用梯度连续离心法将2D MSC培养上清及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC培养上清中的囊泡收集提取，并采用可控电阻式脉冲传感技术(Tunable Resistive Pulsesensing，TRPS)检测得到不同培养条件下的MSC释放囊泡的浓度结果。
图2是2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV处理下毛囊干细胞增殖细胞核抗原的免疫染色结果。
图3是对图2的照片用Image J软件统计Ki67阳性细胞所占百分比的结果示意图。
图4是将P2代人头皮来源DP细胞，加入2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV培养3天后，收集DP细胞，吸取适量DP细胞悬液滴加于载玻片上，置于甩片机上1500rpm，8min甩片后，用4％多聚甲醛固定；完成碱性磷酸酶染色后，光学显微镜观察下的拍照结果。
图5是对图4的拍照图片用Image J软件统计AP阳性区域所占百分比。
图6是将DP细胞接种于96孔板中，分别加入2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3DMSC-EV，培养3天后取出，加入CCK8试剂，孵育3小时后，于450nm波长处测量其吸光值的结果。**，P<0.01；表与+2D-EV组相比有极其显著差异。
图7是对顽固休止期(7周龄)小鼠，脱毛后，于皮内注射100μl含100μg的TNF-α/IL-1α-3DMSC-EV的HPECM/CS水凝胶，注射含等量2DMSC-EV的Matrigel作为对照，3周后，对两个不同组中注射部位的毛发生长初期毛囊数量的统计结果。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，为负载促炎细胞因子激活的3D MSC-EV的胎盘脱细胞基质水凝胶，其中促炎细胞因子为TNF-α和IL-1α。
该促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，通过如下步骤制备：
S1，促进毛囊再生功效的3D细胞球培养与TNF-α/IL-1α引入；
S2，TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡的分离提取；
S3，负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶的制备。
S1通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×106/ml—1.2×106/ml，以每滴30-40μl的体积把细胞悬液均匀加到8-10cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养20-30小时后看到3D细胞球形成于液滴中，30-40小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时按照80ng/ml-120ng/ml的比例加入TNF-α、按照40ng/ml-60ng/ml的比例加入IL-1α，继续培养20h-28h后，收集培养上清液待用。
S2通过如下工艺进行：
将步骤S1收集的培养上清液在3-5℃条件下、以300×g离心8-12分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在3-5℃条件下、将上清继续以2,000×g离心25-35分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在3-5℃条件下、将上清继续以100,000×g离心1.5-2.5小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液。
S3通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM46-50h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在36-37.5℃下熏蒸1.5-3小时，然后再通风条件下，以紫外照射10-15小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照1.2-2.0％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％-2％胃蛋白酶溶液消化溶解45-50h，以3000r/min离心10-30min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用NaOH溶液调PH至7.4，保持温度在3-5℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.008％-0.015％浓度的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。
本发明在MSC 3D培养体系中引入促炎细胞因子IL-1α或TNF-α，激活MSC的活性与功能，诱导MSC分泌具有促进毛囊再生功效的特定EV群体，具有显著增强EV在毛发再生中的功效。人胎盘来源的脱细胞细胞外基质ECM水凝胶(HPECM)，作为MSC-EV的缓释递送载体，负载TNF-α/IL-1α激活的3D MSC-EV的可注射胎盘脱细胞基质水凝胶，能够增强EV的稳定性和固位性，最终提高EV的持续释放的长期效果。故本发明的胎盘脱细胞基质水凝胶能够促进毛发再生，具有安全有效的特点。
实施例2。
一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，具体通过如下工艺制备。
其中，S1具体通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，以每滴35μl的体积把细胞悬液均匀加到9cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴左右，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养24小时后看到3D细胞球形成于液滴中，36小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时加入TNF-α和IL-1α，继续培养24h后，收集培养上清液待用。所加入的TNF-α的量按照加入后TNF-α的含量为100ng/ml的比例加入，所加入的IL-1α的量按照加入后IL-1α的含量为50ng/ml的比例加入。
S2具体通过如下工艺进行：将步骤S1收集的培养上清液在4℃条件下、以300×g离心10分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在4℃条件下、将上清继续以2,000×g离心30分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在4℃条件下、将上清继续以100,000×g离心2小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液。
S3具体通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM48h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在37℃下熏蒸2小时，然后再通风条件下，以紫外照射12小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照胎盘ECM粉末与胃蛋白酶溶液1.5％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％胃蛋白酶溶液消化溶解48h，以3000r/min离心15min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用0.1mol/L的NaOH调PH至7.4，保持温度在4℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.01％浓度(质量体积浓度，g/mL)的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；其中，胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液的提交比为2:1，壳聚糖溶液的浓度(质量体积浓度，g/mL)为2％；
最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。该水凝胶可以通过21G针头缓慢注射到皮下组织，在体温下可以完全成为凝胶状态，EV溶液交联到水凝胶中，从而提高EV的稳定性和固位性，最终提高EV的持续释放的长期治疗效果，最大程度发挥EV治疗脱发的巨大潜力。
本发明在MSC 3D培养体系中引入促炎细胞因子IL-1α或TNF-α，激活MSC的活性与功能，诱导MSC分泌具有促进毛囊再生功效的特定EV群体，具有显著增强EV在毛发再生中的功效。人胎盘来源的脱细胞细胞外基质ECM水凝胶(HPECM)，作为MSC-EV的缓释递送载体，负载TNF-α/IL-1α激活的3D MSC-EV的可注射胎盘脱细胞基质水凝胶，能够增强EV的稳定性和固位性，最终提高EV的持续释放的长期效果。故本发明的胎盘脱细胞基质水凝胶能够促进毛发再生，具有安全有效的特点。
对本发明的效果进行实验。
体外实验研究：
本发明采用梯度连续离心法将2D MSC培养上清及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC培养上清中的囊泡收集提取，并采用可控电阻式脉冲传感技术(Tunable Resistive Pulsesensing，TRPS)检测，得到不同培养条件下的MSC释放囊泡的浓度，结果显示如图1所示。从图1中可见，TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC分泌胞外囊泡EV量显著增加，是传统2D培养方法囊泡释放量的6倍左右，结果提示，TNF-α/IL-1α激活的3D培养策略将可用于临床并获得大规模用量囊泡的优越性
将本发明中TNF-α/IL-1α预处理培养的3D MSC来源的胞外囊泡通过体外细胞分子实验检测MSC-EV对毛囊干细胞激活和对DP细胞增殖、AP活性的影响。图2是2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV处理下毛囊干细胞增殖细胞核抗原的免疫染色结果。对图2的照片用Image J软件统计Ki67阳性细胞所占百分比，结果如图3所示。将P2代人头皮来源DP细胞，加入2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV培养3天后，收集DP细胞，吸取适量DP细胞悬液滴加于载玻片上，置于甩片机上1500rpm，8min甩片后，用4％多聚甲醛固定；完成碱性磷酸酶染色后，光学显微镜观察下的拍照，如图4所示。对图4的拍照图片用Image J软件统计AP阳性区域所占百分比，如图5所示。将DP细胞接种于96孔板中，分别加入2DMSC-EV及TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV，培养3天后取出，加入CCK8试剂，孵育3小时后，于450nm波长处测量其吸光值，结果如图6。**，P<0.01；表与+2D-EV组相比有极其显著差异。对DP细胞进行增殖细胞核抗原(Ki67；增殖标记物)的免疫染色，结果显示TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV促进DP细胞增殖，见图2、3。同时采用碱性磷酸酶AP活性分析MSC-EV对DP细胞AP活性的影响；AP染色实验结果显示，TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV明显促进AP的阳性表达率，见图4、5的结果。采用Cell Counting Kit-8，CCK-8细胞增殖检测试剂盒，分析MSC-EV对DP细胞增殖存活的影响，结果显示，TNF-α/IL-1α预处理的3D MSC-EV明显促进DP细胞的增殖存活，见图6所示。
体内实验研究：选用来自处于休止期阶段的7周龄C57BL/6小鼠，将其背部皮肤毛发用毛发修剪器剃毛。在脱毛后一天，于皮内注射100μl含100μg的TNF-α/IL-1α-3DMSC-EV的HPECM/CS水凝胶，注射含等量2DMSC-EV的Matrigel作为对照，标记注射部位。3周后在注射部位均观察到毛囊从休止期-生长期过渡，对两个不同组中注射部位的毛发生长初期毛囊数量进行量化，统计出毛发生长初期毛囊数量。结果如图7所示，根据图7结果显示，负载TNF-α/IL-1α-3DMSC-EV的HPECM/CS水凝胶显著促进毛囊再生。
综上所述，本发明在MSC 3D培养体系中引入促炎细胞因子IL-1α或TNF-α，激活MSC的活性与功能，诱导MSC分泌比传统2D方法更多并具有促进毛囊再生功效的特定EV群体，增强EV在毛发再生中的功效，建立一种增加间充质干细胞囊泡(MSC-EV)产出率,并显著增强MSC-EV激活毛囊中干细胞，促进毛囊再生功效的3D培养与TNF-α/IL-1α引入相结合的培养策略。该创新培养策略来源的间充质干细胞囊泡(MSC-EV)在增加胞外囊泡(EV)产出率的同时，显著改变EV包装内容物的特性，诱导MSC分泌含有多种促进毛囊再生因子的胞外囊泡，增强囊泡治疗脱发的功效。
其后，本发明开发一种脱细胞基质(dECM)水凝胶，人胎盘来源的脱细胞细胞外基质ECM水凝胶(HPECM)，作为上述优化培养策略来源MSC-EV的缓释递送载体，最终发明一种负载TNF-α/IL-1α激活的3D MSC-EV的可注射胎盘脱细胞基质水凝胶。该新型负载TNF-α/IL-1α激活的3D MSC-EV的可注射胎盘脱细胞基质水凝胶显著促进毛囊再生。
因此，本发明中的新型负载激活的囊泡水凝胶为EV疗法提供一个增强的传递平台，增强其稳定性和固位性，最终提高EV的持续释放的长期治疗效果，最大程度发挥EV治疗脱发的巨大潜力，具有安全有效的特点。
实施例3。
如实施例1或2的胎盘脱细胞基质水凝胶在作为促进毛发再生的药物中的用途。优选，胎盘脱细胞基质水凝胶为可注射凝胶。该胎盘脱细胞基质水凝胶作为促进毛发再生的药物用途，具有安全有效的特点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，其特征在于，为负载促炎细胞因子激活的3D MSC-EV的胎盘脱细胞基质水凝胶。
2.根据权利要求1所述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，其特征在于，所述促炎细胞因子为TNF-α和IL-1α。
3.根据权利要求2所述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，其特征在于，通过如下步骤制备：
S1，促进毛囊再生功效的3D细胞球培养与TNF-α/IL-1α引入；
S2，TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡的分离提取；
S3，负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶的制备。
4.根据权利要求3所述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，其特征在于，
S1通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×106/ml—1.2×106/ml，以每滴30-40μl的体积把细胞悬液均匀加到8-10cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养20-30小时后看到3D细胞球形成于液滴中，30-40小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时按照80ng/ml-120ng/ml的比例加入TNF-α、按照40ng/ml-60ng/ml的比例加入IL-1α，继续培养20h-28h后，收集培养上清液待用；
S2通过如下工艺进行：
将步骤S1收集的培养上清液在3-5℃条件下、以300×g离心8-12分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在3-5℃条件下、将上清继续以2,000×g离心25-35分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在3-5℃条件下、将上清继续以100,000×g离心1.5-2.5小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液；
S3通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM 46-50h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在36-37.5℃下熏蒸1.5-3小时，然后再通风条件下，以紫外照射10-15小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照1.2-2.0％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％-2％胃蛋白酶溶液消化溶解45-50h，以3000r/min离心10-30min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用NaOH溶液调PH至7.4，保持温度在3-5℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.008％-0.015％浓度的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。
5.根据权利要求4所述的促进毛发再生的含激活囊泡水凝胶，其特征在于，
S1通过如下工艺进行：
分离提取人胎盘来源的MSC，进行单层2D贴壁培养扩增，当早期4-6代次2D贴壁培养的MSC长至80％-90％融合的理想密度时，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，以每滴35μl的体积把细胞悬液均匀加到9cm直径的培养皿的上盖中，每板悬滴滴数控制在35-40滴，把培养皿盖倒转，让细胞悬滴垂直倒挂于皿盖中；再置于培养箱内，培养24小时后看到3D细胞球形成于液滴中，36小时后将3D细胞球转移至超低粘附non-treated培养皿中，同时按照100ng/ml的比例加入TNF-α、按照50ng/ml的比例加入IL-1α，继续培养24h后，收集培养上清液待用；
S2通过如下工艺进行：
将步骤S1收集的培养上清液在4℃条件下、以300×g离心10分钟，收集上清，去除底部细胞沉淀；然后在4℃条件下、将上清继续以2,000×g离心30分钟，收集上清，去除底部沉淀的细胞碎片及凋亡小体；最后在4℃条件下、将上清继续以100,000×g离心2小时，吸除上清，用PBS重悬底部胞外囊泡沉淀，按相同操作PBS洗两遍后，获得TNF-α/IL-1α预处理的MSC胞外囊泡，即EV溶液；
S3通过如下工艺进行：
首先切取新鲜人胎盘组织，PBS液洗净血液，制备得到脱细胞；冻干处理胎盘ECM 48h后，经冰冻球磨仪研磨得到胎盘ECM粉末；
将冻干胎盘ECM粉末置于密闭箱中用95％酒精、在37℃下熏蒸2小时，然后再通风条件下，以紫外照射12小时，得到无菌胎盘ECM粉末；
按照1.5％w/v的配比，将制备的胎盘ECM粉末、用1％胃蛋白酶溶液消化溶解48h，以3000r/min离心15min的工艺反复离心3次至上清液清澈，得到ECM成分的胶状混合物，然后用0.1mol/L的NaOH调PH至7.4，保持温度在4℃得到胎盘脱细胞基质；
用0.01％浓度的京尼平将胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液交联，制备得到HPECM/CS水凝胶；其中，胎盘脱细胞基质与壳聚糖溶液的提交比为2:1，壳聚糖溶液的浓度为2％；
最后将100μg的EV溶液与HPECM/CS水凝胶按1:1等体积混合，得到负载MSC-EV的复合胎盘脱细胞基质/壳聚糖水凝胶。
6.如权利要求1至5任意一项所述的胎盘脱细胞基质水凝胶在作为促进毛发再生的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述胎盘脱细胞基质水凝胶为可注射凝胶。
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