CN107174653B - 一种促进毛囊再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进皮肤毛囊再生的方法，其中包括肿瘤坏死因子蛋白及其功能性多肽的使用。利用该方法可以促进毛囊的重新再生，从而用于帮助解决生发、皮肤大面积烧伤后皮肤毛囊再生及组织工程皮肤毛囊再生问题。

Description

一种促进毛囊再生的方法
技术领域
本发明涉及皮肤毛发再生医学领域，具体地，涉及皮肤毛囊再生的方法，更具体地，涉及TNF-α蛋白及其功能性肽段在促进毛发再生中的使用方法，利用及其功能性肽段在促进皮肤损伤后毛囊再生的具体使用方法。
背景技术
人类在胚胎发育的早中期，皮肤具有完全再生能力，受损的皮肤在修复后不遗留疤痕。在出生后，皮肤的再生修复能力大幅缺失，严重损伤的皮肤不能够完全再生，而以瘢痕修复，损失的皮肤附属器官如毛囊、皮脂腺、汗腺等结构不能够重新形成。皮肤附属器官的缺失，不但影响皮肤的外观，还影响皮肤的诸多功能。毛囊由上皮和间充质细胞构成(位于毛乳头)，其中蕴藏干细胞，并有皮脂腺等结构的附着，结构比较复杂。因此，毛囊再生是实现皮肤附属结构再生的关键。
研究证明，成人的皮肤存在表皮干细胞(epidermal stem cells)，它们主要位于表皮的基底层和毛囊外根鞘膨凸部(bugle)。基底层的表皮干细胞主要增值、分化形成角质上皮细胞，更新衰老和损伤的表皮，维持表皮的结构完整性；而毛囊膨凸部位的表皮干细胞，又称为毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSC)，其功能主要是对毛囊进行周期性更新；但当皮肤受损时，毛囊干细胞快速增值并向上迁移，参与伤口愈合过程新的上皮的形成以及伤口中毛囊的再生。
毛囊在胚胎发育过程中形成，出生后经历增长(Anagen)，退行(Catagen)和休止(Telogen)的反复循环周期。在生长期，毛母细胞(Matrix)迅速增殖，分化成毛干及毛囊内根鞘；退行期毛囊的隆凸(Bulge)部位以下结构凋亡消失，毛乳头(Dermal papilla,DP)向上移位；当毛发进入休止期后毛乳头到达隆凸部位，直到下一个生长期后毛乳头随着新生成的毛囊胚芽(Germ)向下移动。毛囊发育和周期性再生是错综复杂的分子调控过程，通过控制复杂的分子网络，以及不同的信号通路，以达到促进毛囊生长因子和抑制毛囊生长因子的严格平衡，并传递信息到毛囊和周围组织中，从而决定毛囊发育启动或休止及毛囊细胞有丝分裂速率的调整。
TNF-α(肿瘤坏死因子)是一种多功能的细胞因子。TNF家族的成员在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答调节和炎症反应。二十年前肿瘤坏死因子发现以来一直被认为是抗癌剂。TNFR(肿瘤坏死因子受体)超家族的成员可同时给细胞发送的生存和死亡的信号。TNF-子通过两种受体，TNFR1(TNF受体1)和TNFR2(TNF受体-2)发挥作用。TNFR1在所有人体组织中表达，是TNF-α的主要信号受体。TNFR2是主要在免疫细胞中表达，介导的生物反应较少。迄今未见TNF-促进毛囊再造的研究报道。
目前最先进的组织工程皮肤虽然有和正常皮肤类似的真皮和表皮层，但因为缺乏毛囊、汗腺和皮脂腺等附属器官，特别是毛囊和皮脂腺结构，使组织工程皮肤的功能、外形、韧性和机械性能等明显低于天然正常皮肤。因此，实现皮肤附属器官的再生，特别是毛囊的再生，是解决上述问题的关键。
发明内容
本发明旨在解决毛囊再生的问题。为此，本发明的一个目的在于提出一种促进毛囊干细胞增殖和毛囊再造的方法。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
既往研究证明，在年龄较小(3-4周)的小鼠中，较大面积的皮肤损伤(直径为1cm)后，其愈合的伤口中有毛囊的再生。发明人研究发现，在TNF-α缺失的小鼠，伤口中新生毛囊的数量显著减少，提示TNF-α促进毛囊再造。在毛囊重组实验室中，发明人进一步发现，在TNF-α缺失的情况下，毛囊重组实验生成的毛囊数量明显减少，而补充TNF-α后新生毛囊的数量会有显著地回升，再次证明TNF-α促进毛囊再造。发明人进一步的观察发现，再生的毛囊有正常的生长周期。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可以促进损伤皮肤毛囊再生的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：用TNF-α促进毛囊再造，如将该药用于伤口中。根据本发明的实施例，本申请促进伤口中毛囊再生的方法，操作简单、方便快捷、容易控制、易于临床实践应用。
根据本发明的实施例，发明人证实，在小鼠皮肤损伤模型中，TNF-α是伤口中毛囊再生的必要条件，在TNF-α缺失的条件下，伤口中毛囊再生的数量显著减少，以此证明了TNF-α在伤口中毛囊再生的重要作用(见附图1)。同时根据本发明的实施例，发明人进一步的在毛囊重组实验中证明了TNF-α可以增加毛囊重组实验中的毛囊再生的数量(见附图2)。毛囊重组实验室是利用小鼠的表皮干细胞和真皮干细胞在裸鼠的背部移植后得到的。因此本发明提出了一种可以促进干细胞毛囊再生的方法。
根据本发明的实施例，在毛囊重组实验中，来源于皮肤表皮的表皮干细胞和来源于皮肤真皮的真皮细胞与Matrigel(Growth factor reduced)一起移植到伤口中，添加了在TNF-α后新生毛囊数量增加(见附图2)。Matrigel为一种细胞支持材料，主要成分为胶原蛋白、层粘蛋白(laminin)等。发明人发现，用类似的支持材料如I型胶原蛋白替代Matrigel也获得类似的效果。鉴于胶原蛋白为组织工程皮肤的主要支持材料，本发明中用TNF-α促进毛囊再生的方法也可用于组织工程皮肤及类似产品，以促进毛囊的形成。
根据本发明的实施例，在表皮干细胞和真皮干细胞存在的情况下，给予TNF-α后新生毛囊数量增加。因此，对于表皮干细胞和真皮干细胞存在，但毛囊(发)形成不足的病人，可通过使用TNF-α的方法(如局部注射或外用)促进毛囊再生。
根据本发明的实施例，本发明为一种促进伤口中毛囊再生的方法，其中包括TNF-α蛋白及功能性的多肽片段及其使用方法。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性的多肽片段，可以用于与移植细胞的混合使用，也可以直接用于皮肤表面涂抹。
根据本发明的实施例，其中TNF-α蛋白及其功能性的肽段与细胞混合使用的浓度为50ng/ml-100ug/ml。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，也可以直接用于伤口表面喷涂，用于体表涂抹的TNF-α剂量为100ng-200ug每CM2皮肤。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，也可以直接用于皮肤，如皮下或皮内注射，皮肤表面喷涂等，用于促进毛发再生，体表涂抹的TNF-α剂量为100ng-200ug/CM2皮肤。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，可以用与皮肤细胞混合使用，也可以直接用于伤口或皮肤的表面涂抹，用于皮肤表面涂抹时，可以包括TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，及其可以促进TNF-α多肽吸收的透皮吸收剂。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，可以与支持材料如胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖等一切使用，用于促进毛囊再生或组织工程皮肤。
根据本发明的实施例，其所述的TNF-α蛋白及其功能性多肽片段，TNF-α可以是完整的TNF-α蛋白，也可以是TNF-α蛋白中的任意活性片段。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示在3-4周年龄的正常小鼠(Wild type)，伤口直径为1cm的皮肤损伤，其愈合的伤口中有毛囊的再生。但是在TNF-α缺失(TNFA-/-)小鼠，伤口中的毛囊数量明显减少。
图2显示了在毛囊重组实验中，TNF-α缺少组的小鼠毛囊形成数量远低于正常小鼠组，而补充TNF-α后其毛囊形成数量明显增加。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本申请的实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下面详细描述本发明的实施例，如无特殊说明，下面所述实施例中的TNF-α为重组人肿瘤坏死因子蛋白，购买于Biolegend公司。3-5周龄的TNF-α缺失的小鼠(TNFA-/-)用于TNF-α缺失条件下的伤口毛囊再生研究。用于毛囊重组实验的裸鼠为5-10周的Balbc-nu/nu小鼠。下述实施例中离体皮肤干细胞从C57小鼠的皮肤或人的头皮组织分离并培养；真皮干细胞培养基组成为DMEM/F12(3:1)(购买于Invitrogen公司)，含2％B27(购买于Invitrogen公司)，40ng/μL bFGF(Peprotech)和20ng/μL EGF(Peprotech)；Accutase购于sigma；3M膜为TegadermTM Film；悬浮细胞培养皿，购自于广州杰特生物过滤制品有限公司，货号为MCD-000-090。贴壁细胞培养皿，购自于Corning公司。Matrigel购自于BD公司。实验动物均购自广东省医学实验动物中心。
实施例1
TNF-α缺失对伤口中毛囊再生的影响，具体过程如下：
(1)将3-5周的TNFA-/-小鼠用戊巴比妥钠麻醉。
(2)用皮肤打孔器在小鼠背部切取直径为1cm的全层皮肤。
(3)野生型小鼠也做同样的处理，作为对照。
(4)将小鼠放回正常的饲养环境中饲养。
(5)两周开始用解剖显微镜观察伤口中的毛囊再生的数量。
(6)三周后将小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用脱毛膏将小鼠背部的毛发去除干净，将小鼠处死，将伤口连同其周围的部分皮肤一起取下，AP(碱性磷酸酶)染色后，解剖显微镜下观察真皮面毛囊形成情况，并计数伤口内毛囊数量(附图1)。
(7)根据发明者的实验，TNF-α缺失的小鼠其伤口中的毛囊数量明显低于野生型小鼠的毛囊数量(附图1)。
实施例2
TNF-α缺失对毛囊重组实验中毛囊生成的影响，具体如下：
(1)表皮干细胞的分离和培养过程具体如下：取新生鼠全层皮肤，加入质量浓度0.25％dispase II酶4℃过夜。剥离表皮，将表皮剪碎后加入质量浓度0.25％胶原酶，37℃消化30min后终止反应。将获得的细胞过80目筛网，然后300×g离心10min，弃上清后以CnT-07(由CELLnTEC公司生产)培养基悬浮细胞，并接种于铺有小鼠I型胶原的10CM细胞培养板上，孵育60min后，以0.01mol/L HBSS洗涤细胞2次，再加入CnT-07培养。待原代细胞长至60％～80％融合时，用Accutase酶消化，然后按1∶2比例传代。
(2)真皮干细胞分离过程：收集上述过程中去除表皮后的皮肤(真皮)，将真皮剪碎，加入质量浓度0.25％胰蛋白酶，37℃消化20～40min后终止反应，获得消化后的细胞，将细胞过200目筛网，然后300×g离心10min，弃上清后，以真皮干细胞培养基悬浮细胞，并接种于不贴壁培养皿中。待不贴壁培养皿中出现较多细胞球后，将真皮干细胞按1∶2比例传代。
(3)利用表皮干细胞和真皮干细胞进行毛囊形成(重组)实验，具体过程如下：培养表皮干细胞，将表皮干细胞用Accutase酶消化后，制备100万的表皮干细胞/PBS(磷酸缓冲液)悬液。制备100万真皮干细胞/PBS悬液。将两种细胞悬液混合，300g离心5min。取离心后的细胞，弃上清，在细胞沉淀中加入10微升Matrigel(或I型胶原蛋白)，混匀，待用。其中，TNF-α补充组，在上述的Matrigel(或I型胶原蛋白)和细胞悬液中加入终浓度为50μg/ml的TNF-α。将BALB/c裸鼠用1％的戊巴比妥钠麻醉，用打孔器在其背部皮肤上制造面积约7mm2的伤口。小鼠分为正常组、TNF-α缺少组和TNF-α补充组(TNF-α缺少鼠在伤口移植物内添加了TNF-α)。将制备获得的混有皮肤干细胞的Matrigel(或I型胶原蛋白)分别移植到裸鼠皮肤伤口表面。用3M膜覆盖裸鼠伤口表面，然后用绷带将裸鼠伤口包扎。正常饲养裸鼠，3周后拆开绷带去除3M膜，观察移植细胞区域的毛生长情况，照相，并计数每个伤口内毛的数量(附图2)。

Claims (2)

1.TNF-α与移植细胞在制备促进全层皮肤伤口毛囊再生的产品中的应用；所述移植细胞包括表皮干细胞和真皮干细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TNF-α与所述移植细胞混合联用，
所述TNF-α在混合物中的浓度为50mg/ML。
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