CN1136450C - 具有荧光共振能量转移特征的成对蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有荧光共振能量转移(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，蛋白A是作为能量供体且带有荧光物质或化学发光物质的抗原，蛋白B是作为能量受体且带有荧光物质的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能与同一抗体分子特异结合的共同抗原决定簇，由蛋白A、B和适当的缓冲液组成的均相免疫检测药盒，及它们用于检测标本中抗体存在的用途，尤其在艾滋病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体的检测方面的用途。

Description

具有荧光共振能量转移特征的成对蛋白及其用途

本发明涉及具有荧光共振能量转移(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，蛋白A是作为能量供体且带有荧光物质或化学发光物质的抗原，蛋白B是作为能量受体且带有荧光物质的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能与同一抗体分子特异结合的共同抗原决定簇，由蛋白A、B和适当的缓冲液组成的均相免疫检测药盒，及它们用于检测标本中抗体存在的用途，尤其在艾滋病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体的检测方面的用途。

免疫测定利用抗原抗体反应检测标本中的微量物质，基于抗原抗体反应的特异性和敏感性，免疫测定的应用范围遍及医学检验的各个领域，由于它在医学检验中的地位日益重要，近年来新方法、新技术不断出现，从总体上说，其进展主要在自动化和简便化两个方面。目前基因工程、细胞工程和酶工程技术开发的重组抗原、单克隆抗体及酶技术已逐步取代原有免疫诊断试剂，为各种疾病的诊断增加了新型的有效试剂盒。在现有的免疫检测方法中，固相免疫法以放射免疫检测法(RIA)和酶免疫检测法(EIA)的应用最为广泛，通常包括包被(抗原或抗体)、封闭、多次孵育和洗涤以及检测等过程，最快的也需2小时以上。而液相法的免疫反应和信号测定在溶液中一步完成，没有固相的参与，因此反应速度比固相法快得多，操作程序也简单得多，其中均相荧光免疫测定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)应用最为广泛，但目前多只限于小分子药物的测定，这主要是由于自然标本通常存在较广泛、复杂的荧光背景以及化学标记技术的不成熟导致的。Ulman等人首先提出基于荧光共振能量传递(FRET)的hFIA，即均相荧光共振免疫测定(Homogeneous Fluorescence resonanceimmunoassay，hFRIA)，实现了抗原-抗体反应的均相测定。

光谱重叠的两个荧光分子之间存在着一种荧光共振能量转移(FRET)过程，即一个受激发的荧光物质(能量供体，energy donor)将其激发态能量转移给一个光吸收分子(能量受体，energy acceptor)的过程。如果受体的激发波长与前者的发射波长重叠，那么用供体的激发光激发，检测到的就会是受体的发射光，同时供体自身的发射光强度就会大大减弱。这一过程与它们之间的距离密切相关，只有当距离足够近时才能发生。

目前均相荧光共振免疫测定已应用于检测血清中的抗原。Ueda等[Ueda H，Kubota K，Wang Y，et al.Biotechniques，27(4)：738-742(1999)]用琥珀酰亚胺脂和荧光黄-X分别标记抗体的重链和轻链，两者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗体的特异结合，使琥珀酰亚胺脂与荧光黄-X靠近，用490nm波长激发琥珀酰亚胺脂，检测到520nm发射光减弱，605nm的发射光增强，随着抗原量的增加，605nm的荧光亦增强。Stenroos等[Stenroos K，Hurskainen P，Eriksson S，et al.Cytokine，10(7)：495-499(1998)]用铕的螯合物标记重组人白介素2(IL-2)、用Cy5标记单克隆抗体，进行时间分辨荧光免疫测定。Blomberg等分别用铽和罗丹明标记抗体，检测血清中人绒毛膜促性腺素的βCG，结果能量转移信号与样品中的βhCG浓度成正比。

现有的均相荧光共振免疫测定都必须用有机合成荧光染料或稀土元素对检测试剂进行标记，将作为能量供受体对的两种荧光物质分别偶联在抗体的不同部位上或不同的抗体分子上，更多的是将它们分别偶联在抗原和抗体上，在溶液中，通过抗原抗体的特异性结合而拉近两个荧光分子之间的距离，从而发生FRET现象。这些方法虽然满足了快速检测的需要，但都要求获得高纯度的抗体和抗原，使检测前期工作繁杂，由于无法达到百分之百的纯度，荧光标记时难免产生非特异标记，在检测中极易出现假阳性，而针对每种免疫反应都提取到抗体是极其困难的。而且到目前为止的诊断试剂对抗原的纯度要求都很高，因而对生产工艺的要求也相应很高。这些不足给它们的实际推广应用带来了许多局限。为改变以上不足，本发明建立了一类新型的均相荧光共振免疫测定试剂及方法，以使生产工艺简单，抗体检测中假阳性的出现减少，检测能够快速、准确地进行。这一新型的均相荧光共振免疫测定方法利用了荧光蛋白及发光蛋白的光学特性。

目前报道的荧光蛋白主要有绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、紫外激发绿色荧光蛋白(GFPuv)等，它们都衍生自来源于水母的绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)是一个非常稳定的蛋白质，全长238肽，分子量约为27kDa，第65-67位的三个氨基酸能够形成一种独特的丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸(Ser65-dehydroTyr66-Gly67)环化结构，这一结构使得GFP具有较强的荧光性。GFP荧光结构的形成是一个自催化的过程，仅由其一级结构决定，而无需特殊的酶或辅助因子参与，因此可以进行多种异源表达。GFP的N端和C端都可以与其他蛋白进行嵌合表达而保留其荧光活性，与GFP融合表达对许多蛋白的活性基本上也没有影响。GFP的荧光很稳定，不易被光漂白。这些优点使得GFP成为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。Heim等通过突变筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的GFP变异型，这些变异型与野生型GFP只有几个氨基酸的差别。在其它物种中也分离并克隆表达出了一些荧光蛋白，如来自珊瑚虫的红色荧光蛋白DrFP583(DsRed)[Matz MV，Fradkov AF，Labas YA，et al，NatBiotechnol，17(12)：969-973(1999)]。1996年Mitro等成功地观察到两个GFP变异型BFP5和RSGFP4之间的FRET现象[Mitra RD，Silva CM，Youvan DC，Gene 173：13-17(1996)]。BFP和GFP之间的FRET已被应用于检测细胞编程死亡、线粒体中Bcl-2和Bax之间的相互作用等研究中[Mahajan NP，Linder K，Berry G，et al，Nat Biotechnol，16(6)：547-552(1998)]。

GFP的各种变异型可组成多组能量供受体对：S65G/V68L/S72A/T203Y变异型(激发峰513nm，发射峰527nm的黄色荧光蛋白，YFP)和F64L/S65T变异型(激发峰488nm，发射峰507nm，EGFP)；Y66H变异型(激发峰382nm，发射峰448nm的蓝色荧光蛋白，BFP)和EGFP，T203I/S72A/Y145F变异型(激发峰395nm，发射峰509nm，GFPuv)和S65G/S72A/K79R/T203Y变异型(激发峰513nm，发射峰527nm，EYFP)等[Heim R，Prasher DC and Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：12501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373：663-664(1995)]。将它们分别与一种抗原嵌合表达，其产物既有免疫原性又具备荧光特性，在体系中是特异存在的，经过初步纯化就不会出现干扰检测、造成假阳性的因素，可以应用为检测试剂。

在维多利亚水母体内自然存在着一种FRET现象，即水母发光蛋白(apoaequorin)和绿色荧光蛋白(wtGFP)之间的能量转移。水母发光蛋白是一种生物发光蛋白，当Ca²⁺达到足够的浓度并与之发生结合后，它将发生氧化反应并发射蓝光，其最大发射波长是466nm，与wtGFP的最大发射波长470nm临近，在水母体内，由于两种蛋白之间距离极小，必然发生能量的转移，最后以wtGFP发射绿色荧光(最大发射波长504nm)的形式体现出来。目前这两种蛋白都得到了分离并在多种异源生物种活性表达，在GFP被改造利用的同时，发光蛋白也出现了多种变异型，包括生物活性提高的类型[Casadei J，Powell MJ，KantenJH，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：2047-2051(1990)，Zenno S，Inouye S，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171：169-174(1990)，Nomura M，Inouye S，Ohmiya Y，et al.FEBS Lett.，295：63-66(1991)，Shimomura O，Inouye S，Musicki B，et al.Biochem.，J.270：309-312(1990)，Kurose K，Inouye S，Sakaki Y，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：80-84(1989)]，将二者分别与一种抗原嵌合表达，加入Ca²⁺作为诱发剂，其产物既有免疫原性又具备荧光特性，在体系中是特异存在的，经过初步纯化就不会出现干扰检测、造成假阳性的因素，而且还需要加入诱导剂才能检测FRET，使检测反应更加精确，也能构成一套灵敏的检测试剂。

蛋白质、酶、核酸、糖等生物大分子，可通过双功能交联剂，在生物大分子之间或与药物、半抗原等生物小分子进行共价连接，可以制备酶标抗体、人工抗体、酶标抗原、抗体导向药物、免疫毒素、核酸探针、固定化酶、生物亲和色谱材料、修饰性酶分子等。各种同型和异型双功能交联剂都已陆续开发出来。化学合成的荧光物质经交联剂修饰后可标记在纯化抗原的氨基、羧基或巯基上；以双功能基团螯合剂与稀土离子Eu³⁺等形成螯合物，可与纯化抗原结合得到荧光抗原[Evangelista RA，et al，Clin.Biochem，21：173(1988)，DiamandisEP，Clin.Biochem.，21：139(1988)，Diamandis EP，et al，J.Immunol.Methods，112：43(1988)，Diamandis EP，et al，Anal.Chem.，61：48(1989)]。标记蛋白配合融合表达荧光蛋白的蛋白构成能量供受体对。虽然这一步操作较为复杂、存在非特异性，但荧光蛋白/发光蛋白融合蛋白的存在将使非特异性大大降低，试剂生产工艺简单化，并仍保持抗原、抗体的特异反应和FRET距离依赖性，检测结果灵敏而特异。

本发明的目的是寻找并提供具有FRET特征的检测试剂。

本发明人经研究发现具有荧光共振能量转移该检测(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，其可用于检测标本中抗体的存在，且该检测具有简单、快速，特异性高的特点，因此，该成对蛋白可用于疾病的检测中。

本发明第一方面涉及具有荧光共振能量转移特征的由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，其中，蛋白A是作为能量供体且带有荧光物质或化学发光物质的抗原，蛋白B是作为能量受体且带有荧光物质的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能与同一抗体分子特异结合的共同抗原决定簇。

本发明第一方面涉及由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白作为检测试剂的用途。

本发明还涉及用于疾病检测的试剂盒，其包括(1)由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，(2)缓冲液，及(3)供选择使用的离子溶液和/或表面活性剂。

本发明另一方面涉及用于检测标本中抗体存在的方法，该方法包括：(a)将本发明所提供的任一成对蛋白与待测标本中抗体相互接触，形成抗原抗体复合物；(b)检测该抗原抗体复合物的存在，该抗原抗体复合物的存在指示该标本中与该成对蛋白共同抗原特异结合的抗体的存在。

根据本发明，本发明的成对蛋白中的蛋白A可选自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其它具有抗原决定簇的物质。

根据本发明，本发明的成对蛋白中的蛋白B可选自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其它具有抗原决定簇的物质。

根据本发明，本发明的荧光物质可选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素、淬灭物质等。

根据本发明，本发明的化学发光物质可选自发光蛋白或鲁米诺、过氧草酸盐等化学合成发光物质。

根据本发明，本发明的荧光蛋白可选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白及其它荧光蛋白。

根据本发明，本发明的发光蛋白可选自水母发光蛋白及它的各种变异型。

根据本发明，本发明的成对蛋白中融合荧光蛋白或发光蛋白与抗原决定簇片段的融合蛋白既保留了与原抗体分子特异结合的抗原决定簇，又具有荧光蛋白或发光蛋白的光学特性，纯化要求简单，成对蛋白与特异抗体反应后将导致荧光光谱的明显变化，易检测发现。加入特殊的均相荧光免疫反应添加剂的缓冲液还有助于扩大光谱变化的程度，因此可以作为检测试剂，用于检测标本中的特异抗体，如艾滋病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体。

以基因工程的各种方法可以将荧光蛋白或发光蛋白基因与编码某种抗原的基因嵌合在一起，置于合适的载体中进行表达。该抗原可以是病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其它有抗原决定簇的物质。在基因工程中，利用大肠杆菌生产外源蛋白的技术已十分成熟，嵌合蛋白可以通过调整表达条件，以可溶性蛋白形式出现，而且是表达体系中唯一既有免疫原性、又能发射荧光或进行化学发光的抗原蛋白，略加纯化就可用作检测试剂。在均匀液相体系中，光学特性恰好构成一对能量供受体对的成对蛋白其相同的抗原决定簇分别结合特异抗体的两臂，利用抗体本身的独特构相，使它们之间的距离拉近，达到发生FRET的距离要求以内，即1-10nm内，发生荧光共振能量转移，出现荧光光谱的明显变化，这种明显的变化在20分钟内就可以发生，通过相应的荧光检测仪器如荧光全谱仪或肉眼进行判定，证实待测样品中特异抗体的存在，以此为检测指标对疾病作出诊断。由于成对蛋白存在的特异性，只有存在特异抗体的体系中才能出现FRET，在非阳性的样品溶液中，成对蛋白游离在溶液中，它们之间的距离不足以发生FRET。本发明的这一对蛋白中至少有一个涉及融合表达的荧光蛋白或发光蛋白，避免了使用化学方法进行标记操作的繁杂和以往免疫检测中难以避免的假阳性，因此保证了检测试剂生产的简易性和应用的简单、快速和准确性。

本发明采用的均相荧光免疫反应添加剂基于抗体本身具有极性，在溶液中加入离子或表面活性剂后轻微改变溶液的极性，相应改变抗体的构相，使抗体两臂之间的距离更加接近，结合在抗体两臂上的荧光抗原之间的距离也更近，从而提高能量传递效率和检测的灵敏度。

本发明根据检测对象—血清的自身荧光特性，选择最大发射波长在500nm以上的荧光蛋白来构建成对蛋白。例如，为验证血清中的绿色荧光蛋白GFPuv的抗体的存在，将绿色荧光蛋白GFPuv和黄色荧光蛋白EYFP分别定作蛋白A和蛋白B，它们之间95.8％的同源性确保了它们相似的免疫原性，而前者的最大发射波长(509nm)与后者的最大激发波长(513nm)十分接近，可以作为一对能量供受体对，它们与血清中的特异抗体反应后，形成免疫复合物，其中GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式将会发生FRET，以GFPuv的激发光(395nm)激发，20分钟内，其最大发射波长509nm处的荧光强度将比加入血清前的大大降低而EYFP最大发射波长527nm处的荧光强度将增强。

根据本发明的一个具体实施方案，为检测血清中是否存在HIV病毒抗体，选择重组HIV-1包膜蛋白ENV2与荧光蛋白GFPuv、EYFP的嵌合蛋白ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP分别作为蛋白A和蛋白B，由它们构成检测试剂，当加入存在HIV-1病毒抗体的待测血清时，20分钟内将检测到FRET现象，即以GFPuv的最大激发光395nm激发，GFPuv的509nm处最大发射光强度较加入血清前降低而EYFP527nm处的最大发射光强度较加入血清前升高。而加入HIV-1抗体阴性血清观察不到这种变化。上述蛋白A和蛋白B构成的成对蛋白因此可以应用在艾滋病检测中。

根据本发明的另一个优选实施方案，本发明还构建另一套HIV-1抗体检测试剂，其以嵌合蛋白ENV2-GFPuv作为蛋白A，标记荧光素BODIPY507/545的蛋白作为蛋白B，它们都有共同的抗原决定簇——重组HIV-1包膜蛋白ENV2，GFPuv的最大发射波长(509nm)与BODIPY507/545的最大激发波长(507nm)十分接近，是一对能量供受体对，当加入存在HIV-1病毒抗体的血清时，20分钟内将检测到FRET现象，出现极其显著的光谱变化，即以GFPuv的最大激发光395nm激发，液相系统最大发射波长由加入血清前的507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗体阴性血清的体系最大发射波长几乎不移动。这一系统在艾滋病检测中具有更高的灵敏度和准确性。

本发明中应用的成对蛋白都是基因工程产物，利用大肠杆菌构建和表达质粒pGFPuv、pEYFP、pRSETB-env2、pRSETB-env2-gfpuv、pRSETB-env2-eyfp，分别得到蛋白GFPuv、EYFP、ENV2、ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP。以基因工程中常用的或熟知的纯化技术纯化表达产物，ENV2通过巯基反应标记上BODIPY507/545，就可以分别配对，组成成对蛋白中的蛋白A和蛋白B。

本发明提供的药盒选择极性缓冲液(10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，可以轻微改变抗体的构象和有机荧光物质的量子产率，有利于蛋白A、B和特异抗体反应、形成免疫复合物后FRET的检测。根据本发明，优选以缓冲液稀释等摩尔蛋白A和蛋白B，即可作为试剂盒检测样品中特异抗体的存在。

免疫检测的对象一般都是血清，对多份血清进行荧光全谱扫描发现以紫外光激发常常会出现最大发射波长在450nm左右的发射峰并有很长的尾峰。在本发明中为避免血清中的背景的干扰，选择检测试剂的最大发射光谱都在500nm以上。在现有的GFP各种突变型以及化学合成的荧光试剂中，选择了GFPuv和EYFP，GFPuv和BODIPY507/545作为能量供受体对。

GFPuv的发射光波长(509nm)与EYFP的激发光波长(513nm)几乎相重叠，二者在足够近的距离内(10nm)可以发生荧光共振能量传递(FRET)，即以GFPuv的激发光(395nm)激发，GFPuv获得的能量以无辐射的方式传递给近距离的EYFP，作为后者的激发能量，最后这一能量以527nm的光辐射形式发射，表现为黄色荧光。GFPuv与EYFP之间有95.8％的同源性，以GFPuv为免疫原免疫动物获得的抗血清对EYFP也有良好的免疫反应。阳性抗血清中抗体的两臂能将这两种荧光蛋白拉近，发生FRET。检测荧光光谱的变化情况可以反映免疫反应的强弱。将同一种抗原分别与这两种荧光蛋白嵌合表达，利用抗体两臂将两种荧光抗原拉近的作用，使它们之间发生FRET现象。检测这时液相中荧光光谱的变化可以测定抗原抗体间是否发生了结合。

Molecular probe公司的荧光物质BODIPY 507/545能与蛋白质中的巯基发生反应，共价结合标记于蛋白质上，使后者获得最大激发波长507nm和最大发射波长530nm的荧光性质并保留大部分生物活性。以BODIPY 507/545标记纯化抗原。这一荧光抗原与GFPuv嵌合表达的同种抗原构成一对能量供受体对，共同结合于同一抗体的两臂上后，以GFPuv的激发光(395nm)激发，GFPuv获得的能量以无辐射的方式传递给近距离的BODIPY 507/545，则可发生FRET，检测到530nm的光强的增加。以FRET的发生与否可以作为特异抗体存在与否乃至疾病是否发生的标准。

以基因工程表达荧光蛋白/发光蛋白融合抗原的技术已十分成熟，它们一般以上清的形式出现，纯化便利，活性高，易生产，检测时利用抗体本身的特殊构象将它们拉近而发生FPET，反应快速而准确，适合大规模检测的需要，是一种很有应用前景的检测方法。

pGFPuv、pEYFP分别是两种荧光蛋白GFPuv和YFP的表达载体，将这两种质粒分别转化E.coli表达菌株BL21，低温诱导表达以保证荧光蛋白的正确折叠和荧光活性。表达上清为可溶性成分，荧光明显。由于GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有高于95％的同源性，取经分子排阻高效液相层析纯化的GFPuv免疫小鼠，可获得对这些荧光蛋白都有很强的免疫反应的抗体。

例如，将GFPvu和EYFP等摩尔混合，稀释后加入免疫小鼠的血清，检测前后的荧光变化，可以验证被免疫的小鼠是否产生了抗体及抗体产生的强弱。当两种荧光蛋白与荧光蛋白抗体的比例恰好是1∶1∶2时，应该有50％的抗原、抗体复合物以GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式存在，抗体的两臂将GFPuv和EYFP的距离拉近，产生FRET。以395nm光对整个液相系统进行激发，荧光光谱的变化在20分钟内达到稳定。可以看到，加入GFPvu抗体阳性血清的系统里，GFPuv的发射光峰值明显下降，而阴性血清中没有特异的抗体将两种荧光蛋白拉近，不发生FRET。由于加入血清造成荧光背景的变化一般都在500nm之前，可以忽略。

艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合症)对人类的威胁正在激增，检测试剂的研制也显得及其重要。EIA是目前最普及的HIV检测手段，主要是基于HIV env基因编码的镶嵌于包膜的糖蛋白gp120、gp41和gag基因编码的衣壳蛋白p24的免疫原性来研制的。根据本发明，本发明可以荧光共振能量传递均相检测法来检测艾滋病。

具体讲，以分子克隆的方式构建出能够融合表达荧光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表达质粒。质粒pRSETB-env2能在大肠杆菌中表达出具有较强抗原活性的重组艾滋病毒包膜蛋白，从含有gfpuv基因的质粒pGFPuv(购自Clonetech公司)中以限制性内切酶切出750bp的gfpuv基因片段，连入env2基因3`端，获得重组质粒pRSETB-env2-gfpuv(2U)。同样，连接来自于质粒pEYFP的750bp eyfp基因于env2基因的3`端，获得重组质粒pRSETB-env2-eyfp(2Y)。

构建的质粒2U、2Y转化大肠杆菌表达菌株BL21，低温诱导表达2U、2Y以保证融合表达的荧光蛋白和ENV2构相和功能的正确，取超声裂解的菌体上清用于检测。荧光检测及免疫检测发现，融合蛋白保存了荧光蛋白和重组艾滋病毒包膜蛋白的生物学和化学活性，但略低于单独表达的这两种蛋白质。

将2Y和2U等摩尔混合，稀释后加入血清，检测前后的荧光变化。当两种荧光抗原2U、2Y与包膜蛋白抗体的比例恰好为1∶1∶2时，理论上将有50％的抗原、抗体结合形式为2U-Ig-2Y，其余50％是等比例的2U-Ig-2U和2Y-Ig-2Y，也就是将有50％的抗原、抗体复合物会发生FRET。以GFPuv的激发光对整个液相系统进行激发，荧光光谱的变化在20min内达到稳定。加入HIV-1抗体阳性血清的体系中，GFPuv的发射光峰值明显下降，这是其吸收的激发光能量传递给EYFP所引起的。加入HIV-1阴性血清的体系测不到GFPuv发射光峰值的明显下降，也即没有特异的抗体将两种荧光抗体拉近，不发生FRET。以稀释液取代血清加入到检测体系中，观察由于加入血清造成的整个反应体积的变大、蛋白浓度降低，从而降低荧光强度的影响。但实验发现这一影响很小，低于1％，可以忽略。

另外对纯化的HIV-1重组包膜蛋白ENV2进行了化学荧光标记。Molecular probe公司生产的荧光探针可对蛋白质、多肽、核酸等进行标记，形成稳定的共价键。BODIPY 507/545是该公司生产的巯基反应荧光探针，以DMSO溶解成10mmol/l的储备液。已纯化的HIV-1重组包膜蛋白ENV2，标记前先对PB(pH＝7.3)透析，并以PEG10000浓缩成2mg/ml存于PB中的溶液，在室温、避光、不停震荡的条件下以1∶100(V/V)的比例缓慢加入BODIPY507/545储备液(现配现用)，隔绝氧气，维持室温、避光、震荡反应3小时，最后对PB(pH＝7.3)透析终止反应，获得ENV2-BODIPY507/545(2D)。检测得知其荧光光谱不变，荧光强度及抗原活性略有下降，可作为FRET检测试剂。

根据本发明，在合适的反应缓冲液中按相等的抗原活性加入2U和2D组成检测体系，再加入相应滴度的血清，以GFPuv的激发光激发，扫描500-550nm的发射光，对比加入血清前后发射光谱的变化，发现20分钟后，加入HIV-1抗体阳性血清的体系最大发射波长由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗体阴性血清的体系最大发射波长几乎不移动。即以FRET检测到了HIV-1ENV2的特异性抗原、抗体反应，可应用于艾滋病检测中(见图3、图4)。

绿色荧光蛋白现已发展出多种变异型，它们的特性包括激发光谱、发射光谱的移动，量子产率的变化以至荧光强度的变化，更易于表达等[(Heim R，Prasher DC，Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：12501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373：663-664(1995)]。随着生物学技术的发展，X-衍射分析、蛋白质结构的预测、定点突变、DNA shuffling等技术应用于蛋白质的设计和改造中，可能产生出更多的GFP突变型，以供选择成为FRET能量供受体对。从其它物种中也分离并克隆出了一些荧光蛋白，如珊瑚虫荧光蛋白等。将荧光蛋白基因和抗原的核苷酸序列以分子克隆技术在氨基末端或羧基末端相连，可以制备融合蛋白，获得荧光抗原。生物表达的荧光抗原，荧光蛋白作为分子探针高度特异地标记在特定的抗原上，可以避免纯化工艺不足造成的检测时的干扰，其理化性质也是很稳定的。

对于化学合成荧光物质和稀土元素的研究已有很长的历史，许多基团或稀土元素的荧光特性都已得到了充分的了解，经双功能交联剂修饰后即可对病毒蛋白或多肽的氨基、羧基或巯基等基团进行标记，纯化后获得荧光抗原。它们的特点是荧光的量子产率高，反应后荧光光谱的变化很明显，易于检测。

根据本发明，可以荧光抗原为检测试剂，建立一个均匀液相反应体系，加入可能含有特异抗体的血清，一旦发生抗原、抗体的特异反应，抗体两臂将检测试剂中的这对荧光能量供受体拉近，就能观察到FRET。加入某些特殊的添加剂，如Triton、金属离子等，可能轻微改变溶液的电性从而改变蛋白质的构相，将抗体两臂间的距离拉得更近。由于FRET的发生与距离的六次方成反比，更近的距离将使FRET的发生更加明显，从而提高检测的灵敏度。

根据本发明，可以化学发光的抗原和荧光抗原为检测试剂，建立均匀液相反应体系，加入可能含有特异抗体的血清，一旦发生抗原、抗体的特异反应，抗体两臂将检测试剂中的这对荧光能量供受体拉近，只要加入合适的诱发剂，就能观察到FRET。由于化学发光需要诱导条件，可以用于设定检测时间、控制测量值的大小，更有利于标准化操作和测定。

以下参照表格、附图及描述实例以更详细地说明本发明。

表格中：

表格1显示检测试剂GFPuv、EYFP体系中加入阴、阳性血清前后GFPuv荧光强度的比较

表格2显示检测试剂2U、2Y体系中加入阴、阳性血清前后GFPuv荧光强度的比较

表格3显示检测试剂2U、2D体系中加入阴、阳性血清前后体系的荧光高峰比较

附图说明：

图1显示GFPuv、EYFP检测体系中加入阳性血清前后的荧光强度变化

图2显示GFPuv、EYFP检测体系中加入阴性血清前后的荧光强度变化

图3显示检测试剂2U、2Y体系中加入阳性血清前后的荧光强度变化

图4显示检测试剂2U、2Y体系中加入阴性血清前后的荧光强度变化

图5显示检测试剂2U、2D体系中加入阳性血清前后荧光光谱的变化

图6显示检测试剂2U、2D体系中加入阴性血清前后荧光光谱的变化

术语解释荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)指一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)对，它们之间的距离达到1-10nm的范围内时，由于偶极-偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量hν可能被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子hν’(hν＞hν’)而松弛。由Frster于1948年首先提出该理论。均相荧光免疫测定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)指在同一个均匀溶液系统中一步完成免疫反应和信号的测定，检测方法包括夹心法和竞争法两种，都是由抗原、抗体复合物的形成导致其中的标记物荧光信号的改变而进行检测的。实施例1 GFPuv和EYFP作为成对蛋白用于检测血清中抗体的是否存在pGFPuv、pEYFP分别是两种荧光蛋白GFPuv和YFP的表达载体，将这两种质粒分别转化E.coli表达菌株BL21，挑取单克隆30℃摇菌至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震荡培养24hr。离心菌体以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mMNaCl，pH＝8.0)吹起，超声破碎，12000rpm离心10分钟，上清荧光明显，用于检测。

以俄罗斯Lumex公司产荧光全谱仪(FLUORAT-02 PANORAMA)检测表达上清，GFPuv激发波长395nm，发射波长507nm；EYFP激发波长513nm，发射波长527nm，荧光强度相当。

PSA软件分析结果显示，GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有很高的同源性，都在95％以上(GFPuv：EGFP 96.7％，GFPuv：EBFP95.8％，GFPuv：EYFP95.8％，EGFP：EBFP99.2％，EGFP：EYFP97.9％)。基于这一点，取GFPuv免疫小鼠，以获得荧光蛋白抗体。将GFPuv表达上清以饱和硫铵沉淀，其中50％饱和硫铵沉淀中。GFPuv的含量在60％以上。用PBS(20mMNaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4，pH7.4)重悬浮后，对PBS透析，取透析产物进行分子排阻高效液相层析(TSK-GELHPLC，BECKMAN)，产物纯度在95％以上。以MBA-2000核酸、蛋白检测仪测定并调整浓度到2mg/ml，取30μl与等体积的福氏佐剂混匀，四肢肌肉等量注射免疫小鼠，并在2周和7周后分别以同样剂童加强免疫一次。免疫前后都剪鼠尾采血，分离血清用于免疫检测。EIA测定发现，GFPuv、EYFP表达上清以碳酸缓冲液1∶2000稀释包被，仍有良好的免疫反应，与阴性血清对比P/N值都在10以上，适用于FRET检测。

将GFPvu和EYFP等量混合，取2ul以1∶50的比例稀释成100ul(稀释液：10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入5ul血清，检测前后的荧光变化。以395nm光对整个液相系统进行激发，荧光光谱的变化在20min内达到稳定。可以看到，加入GFPvu抗体阳性血清后，GFPuv的发射光峰值明显下降，达17％以上，这是其发射光能量被EYFP吸收所引起的。由于其尾峰的掩盖，527nm处EYFP的发射光峰值的增加一般不能看到。阴性血清中没有特异的抗体将两种荧光抗体拉近，不发生FRET。加入阴性血清后GFPuv发射光也有下降，低于5％，这可能是由一些假阳性的抗原抗体反应引起。但可以体现出阴、阳性血清之间的差别。由于加入血清造成的整个反应体积的变大、蛋白浓度降低，从而荧光强度降低的影响很小，低于1％，可以忽略。(见表1，图1、图2)

实施例2 ENV2-GFPuv(2U)和ENV2-EYFP(2Y)作为成对蛋白检测血清中是否存在HIV-1抗体

已检测到多数血清都存在以紫外光激发后产生的450nm左右的发射光，构建荧光抗原时避开了最大发射光在448nm的EBFP；同时为避免能量供体的激发光直接为能量受体提供激发能量，也避开了最大激发光波长与最大发射光波长之间距离很近的EGFP(EX＝488nm，EM＝507nm)，选择了GFPuv(EX＝395nm，EM＝509nm)作为能量供体，EYFP作为能量受体(EX＝513nm，EM＝527nm，以分子克隆的方式构建出能够融合表达荧光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表达质粒。质粒pRSETB-env2能在大肠杆菌中表达出具有较强抗原活性的重组艾滋病毒包膜蛋白，以限制性内切酶PstI/KpnI处理，切去其终止密码前的一小段碱基。同时将含有gfpuv基因的质粒pGFPuv(购自Clonetech公司)也以限制性内切酶PstI/KpnI处理，回收750bp的gfpuv基因片段，连入env2基因3`端，获得重组质粒pRSETB-env2-gfpuv(2U)。同样，以限制性内切酶BamHI/KpnI同时处理质粒pRSETB-env2和pEYFP，连接750bp的eyfp基因于env2基因的3`端，获得重组质粒pRSETB-env2-eyfp(2Y)。

构建的质粒转化Ecoli BL21菌株，30℃摇菌至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震荡培养24hr。离心菌体以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mM NaCl，pH＝8.0)吹起，超声破碎，12000rpm离心10分钟，取上清用于检测。

以12％SDS-PAGE观察，2Y、2U均为43KD(ENV2 16KD，GFPuv、EYFP27KD)，含量约占上清的20％。以荧光全谱仪FLUORAT-02(俄罗斯产)分别检测2Y、2U的荧光，2U最大激发光波长Ex＝395nm，最大发射光波长Em＝509nm，2Y最大激发光波长Ex＝513nm，最大发射光波长Em＝527nm，与单独表达的GFPuv、EYFP相同，但荧光强度相对减弱。EIA检测二者均有较强的免疫学活性，但低于单独的ENV2。

将2Y和2U等量混合，取100ul以1∶30的比例稀释成3ml(稀释液：10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入50ul血清，检测前后的荧光变化。以395nm光对整个液相系统进行激发，荧光光谱的变化在20min内达到稳定。可以看到，加入HIV-1抗体阳性血清后，GFPuv的发射光峰值明显下降，达14％以上，这是其发射光能量被EYFP吸收所引起的。由于其尾峰的掩盖，527nm处EYFP的发射光峰值的增加一般不能看到，但强阳性血清与抗原的反应比例合适而充分时，也有增强的现象。阴性血清中没有特异的抗体将两种荧光抗体拉近，不发生FRET。加入阴性血清后GFPuv发射光也有下降，低于5％，这可能是由一些假阳性的抗原抗体反应引起。但可以体现出阴、阳性血清之间的差别。由于加入血清造成的整个反应体积的变大、蛋白浓度降低，从而荧光强度降低的影响很小，低于1％，可以忽略。(见表2，图3、图4)

实施例3 2u和ENV2-BODIPY 507/545(2D)作为成对蛋白用于检测血清中是否存在HIV-1抗体。

对纯化的HIV-1重组包膜蛋白ENV2进行了化学荧光标记。荧光物质购于Molecular probe公司。BODIPY 507/545为红色固体粉末，避光、干燥、保存于-20℃。标记前挑取适量干粉，溶于200μl DMSO成红色溶液，测其在507nm激发光下的吸光值A。根据公式C＝A/ε(ε＝69000)算出BODIPY 507/545的实际浓度，再加DMSO调整浓度到10mM。纯化的HIV-1重组包膜蛋白ENV2，纯度达95％，浓度为0.5mg/ml，保存于Tris-Cl缓冲液中，标记前先对PB(pH＝7.3)透析，并以PEG10000浓缩成为2mg/ml存于PB中的溶液。将抗原ENV2等分，每200μl到-0.5ml eppendorf管中，室温下避光、不停震荡、缓慢加入2μl稀释好的BODIPY507/545溶液(现配现用)，盖好管盖，维持室温、避光、震荡反应3小时。反应后，溶液对PB(pH＝7.3)透析终止反应，获得ENV2-BODIPY507/545(2D)。检测其荧光光谱及抗原性。光谱为激发光504nm，发射光530nm，EIA检测抗原活性下降10％，可作为FRET检测试剂。

在100μl反应缓冲液(含10％牛血清、0.5％酪蛋白、2％BSA、5‰TritonX-100、1ppm氨基吡啉)中加入5μl 2U和5μl 2D，装入酶联免疫检测微孔板的微孔中，再加入3μl血清，检测前后的荧光光谱变化。以395nm光激发，扫描500-550nm的发射光，对比加入血清前后发射光谱的变化，发现20分钟后，体系的荧光强度整体提高，可能是TritonX-100提高了荧光团的荧光效率的结果。加入HIV-1抗体阳性血清的微孔最大发射波长由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗体阴性血清的微孔最大发射波长几乎不移动，在510nm左右。即以FRET检测到了HIV-1ENV2的特异性抗原、抗体反应，可应用于艾滋病检测中，以寻找最大发射波长的位置确定血清中是否含有阳性抗体(见表3、图5、图6)。

表1.加入不同血清前后507nm荧光强度的比较

加入样品		GFPuv荧光强度		GFPuV发射峰下降百分比
					加血清前	加血清后
		缓冲液					0.00561	0.00539	3.92
抗GF血Puv清阳性	G2531			0.00706	0.00577	18.27
		G3531	0.0076				0.00577	24.08
	G255			0.0066	0.00494	25.15
		G355	0.00687				0.00475	30.86
	抗GFPuv阴性血清			Co	0.00784	0.00747			4.72
182		0.00795	0.00681				14.34
				183	0.00736	0.00708		3.80
184		0.00687	0.00693				-0.87
				185	0.00731	0.00715		2.19
186		0.00657	0.00675				-2.74
				187	0.00681	0.00679		0.294
190		0.00615	0.00518				15.77

表2.加入阴、阳性血清的509nm荧光强度比较50ul 2Y+50ul2U稀释→3000ul                            激发光Ex＝395nm

加入样品	加入前	加入后	GFPuv发射峰下降百分比
				缓冲液	0.021569	0.021401	0.776
HIV-1(+)C46	0.028322	0.02468	12.9
				HIV-1(-)BD15	0.025702	0.024084	6.29
HIV-1(-)BD23	0.0232	0.02216	4.48
				HIV-1(-)BD33	0.02225	0.021739	2.30
HIV-1(-)BD35	0.023009	0.02253	2.08

        表3.加入不同血清前后荧光最大发射波长的变化

         Ex＝395nm            扫描Em 480~550nm

加入血清		加血清前		加血清后
						最大激发波长(nm)	荧光强度	最大发射波长(nm)	荧光强度
		无血清对照		509	0.00315					509	0.00361
HIV-1抗体阳性血清	C46					510	0.00166	525	0.00425
		P/40	508	0.00298	529					0.00582
	FJ4					508	0.00344	528	0.00512
		HIV-1抗体阴性血清	BD7	508	0.0029					513	0.00421
BD8	508					0.0032	500	0.0111
			BD9	507	0.00313				504	0.00737
158	510					0.00164	516	0.00647
			162	506	0.00196				513	0.0022
180	510					0.00167	519	0.00746
			181	507	0.00167				519	0.00612
182	510					0.00164	519	0.0063
			184	513	0.00163				519	0.00539
185	507					0.00163	519	0.00586
			187	507	0.00166				480	0.0203
189	510					0.00164	519	0.00573
			191	510	0.00166				519	0.00598

Claims (10)

1、具有荧光共振能量转移特征的由蛋白A和蛋白B组成的成对蛋白，其中蛋白A是作为能量供体且带有荧光物质或化学发光物质的抗原，蛋白B是作为能量受体且带有荧光物质的抗原，而且蛋白A和蛋白B分别与同一抗体分子的两臂特异性结合，并具有共同抗原决定簇。

2、根据权利要求1的成对蛋白，其中蛋白A选自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体或肿瘤相关抗原。

3、根据权利要求1的成对蛋白，其中蛋白B选自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体或肿瘤相关抗原。

4、根据权利要求1-3任一要求的成对蛋白，其中荧光物质选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素或淬灭物质。

5、根据权利要求1-3任一要求的成对蛋白，其中化学发光物质选自发光蛋白和选自鲁米诺或过氧草酸盐的化学合成发光物质。

6、根据权利要求4的成对蛋白，其中荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

7、根据权利要求5的成对蛋白，其中发光蛋白选自水母发光蛋白及它的各种变异型。

8、一种用于检测标本中抗体存在的方法，该方法包括：(a)权利要求1-7任一要求的成对蛋白与待测标本中的抗体相互接触，形成抗原、抗体复合物；(b)检测该抗原抗体复合物的存在，该抗原抗体复合物的存在指示该标本中与该成对蛋白共同抗原特异结合的抗体的存在。

9、权利要求8的方法，其中待测抗体为艾滋病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体或丙型肝炎病毒抗体。

10、一种检测盒，其包括(1)权利要求1-7任一要求的成对蛋白，(2)缓冲液，及(3)供选择使用的离子溶液和/或表面活性剂。

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