CN113633609A - 抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法，该制剂包括下述配比的组分：抗寄生虫病药物1‑80g、生物可降解高分子材料1‑100g、分散介质2‑300mL和增溶剂0‑50g；所述抗寄生虫病药物的含量为1‑800mg/mL。该制剂对给药对象只用药1次，即可维持长期防控效果，保护其长时间不受病原感染，可以经济有效地控制寄生虫病传播，材料安全性高，简化了市售抗寄生虫病药物的处方，提高了给药对象依从性，降低防控成本。同时本发明创新性使用WHO的灭螺药‑氯硝柳胺制备皮下注射缓释制剂，达到预防日本血吸虫感染的效果。该抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法简单，稳定性好，易于应用和推广。

Description

抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法
本发明是申请日为2017年9月11日申请号为201710813925.1、发明创造名称为“抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法。
背景技术
目前，国内外抗寄生虫药物缓释制剂主要有口服缓释制剂、透皮缓释制剂、植入缓释制剂及注射用缓释制剂这几种剂型。
对口服缓释制剂来说，由于抗寄生虫病药物每日口服用量比较大，且需持续缓释，辅料用量更大，一般制成大丸剂，如：辉瑞公司已上市的瘤胃巨丸剂Paratect Bolus，可以持续释放药物达90天；梅里亚动物保健有限公司的浓缩剂(Ivomec SR Bolus)的伊维菌素大丸剂可以持续释药达135天；用于预防羊寄生虫病的芬苯达唑长效释丸，至少可以预防90天；氟苯哒唑控释丸，其药物作用时间可达105天以上；国内目前应用较广的伊维菌素控释胶囊，药物作用时间可以达到90-100天。然而，口服缓释制剂仍有很多不足：(1)剂型巨大，对给药带来困难；(2)胃内环境复杂，对释放的影响因素较大，个体差异较大；(3)经过首过效应，生物利用度降低；(4)缓释制剂要求制剂的完整性，不能咀嚼，给药困难。
透皮制剂是指经皮肤给药，药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度而起到全身治疗或预防作用的一类制剂。透皮制剂不仅可以避免首过效应，还可以延长药物作用时间，同时给药方便。如吡喹酮霜剂皮肤给药后12小时，对血吸虫感染的防护效果可达100％。但透皮制剂附于皮肤上，受到外界影响因素较多，尤其对于动物来说，如水、皮肤代谢等，容易造成皮肤上药物的减少。因此现有透皮制剂均存在药物作用期短，需反复使用等缺陷，一般仅有几天的作用。
动物用抗寄生虫植入性缓释制剂有犬用吡喹酮缓释包埋剂(PSRI)32和犬用吡喹酮缓释药棒的报道。研究表明吡喹酮的缓释药棒植入小鼠(2根/鼠)，4周后感染尾蚴，感染后28天解剖，其预防保护率为40.2％。植入剂的不足之处在于：(1)制备通常需要高温，不适合不耐热的药物；(2)给药过程复杂，需要手术，顺应性差；(3)给药后有明显异物感，易在植入部位产生不适；(4)若非生物可降解材料，还需将其取出，耗费大量人力物力。
注射用缓释制剂可以避免首过效应、给药方便、剂量准确及受外部影响因素小，越来越受到人们的关注。抗寄生虫药物的应用中，仅有伊维菌素注射用乳酸/羟基乙酸共聚物(PLA/PGA)长效微球的报道，其体外释药时间达到57天，动物试验中，93天仍可有75.90％到80.42％的减卵率。但文献中提及的伊维菌素微球制剂与本发明中的原位固化缓释剂虽然均属于缓释制剂，但微球载药量比较低，高分子材料与药物的比为3.3，比较适合给药量比较低的药物，且该制剂工艺复杂，成本较高，使用过程中会使用部分有毒性的有机溶剂，如二氯甲烷等。
原位固化注射剂是近年来缓控型注射剂领域的研究热点，它是将药物和聚合物溶于适宜的溶剂中，局部皮下注射，在给药部位，聚合物在生理条件下凝固而形成半固体或固体药物贮库。该新型给药系统目前大多用于抗癌药，以用于对人进行相关疾病的治疗。其优势在于：(1)克服了普通乳剂、脂质体、微球和胶束制备工艺复杂，灭菌困难等缺点；(2)避免植入剂手术植入时的痛苦，注射剂用药方便；(3)缓慢释放药物，降低给药剂量和药物不良反应；(4)制备工艺简单，剂量准确；(5)由于生物降解性，无须手术取出残体。目前，采用AkigelTM技术已上市的产品为醋酸亮丙瑞林制剂，醋酸亮丙瑞林属于多肽类。而蛋白质药物等水溶性药物在有机溶剂中稳定性很差，PLGA降解时的酸性环境对许多蛋白质药物有破环作用，为此使用时再将醋酸亮丙瑞林与PLGA溶液混合再注射，操作顺应性差，且制剂中药物浓度只有3％-6％，药物释放1-4个月。
当前，用于寄生虫病防控的原位固化缓释注射剂尚无报道，且无论是抗寄生虫缓释微球还是原位固化缓释注射剂都无商品问世。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有的抗寄生虫药物制剂的载药量低、使用材料安全性低、制备工艺复杂等的技术问题，提供一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂及其制备方法。本发明的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂对传染源只给药1次，即可维持长期的防控效果，能够保护动物在感染季节甚至更长的时间不受病原侵染，并且可以经济有效控制寄生虫病传播，阻断动物传播寄生虫的传播链，并且，本发明的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的材料安全性高；此外，该抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂简化了市售抗寄生虫病防治药物的处方，提高了给药对象的依从性，降低疾病防控成本。该抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法简单，稳定性好，易于现场应用和推广。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其包括下述配比的组分：抗寄生虫病药物1-80g、生物可降解高分子材料1-100g、分散介质2-300mL和增溶剂0-50g；所述抗寄生虫病药物在所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂中的含量为1-800mg/mL。
其中，所述生物可降解高分子材料可为本领域常规使用的生物可降解高分子材料，末端基团种类较佳地为羧基端、羟基端和酯封端中的一种或多种，例如海藻酸钠(SA)、壳聚糖(CTS)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)、聚羟基乙酸(PGA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基丁酸羟基戊酸共聚物(PHBV)、聚原酸酯(POE)和聚酸酐类化合物(如马来酸酐甲基乙烯酯共聚物)中的一种或多种，更佳地为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乳酸、聚三亚甲基碳酸酯、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基丁酸羟基戊酸共聚物和聚原酸酯中的一种或多种。
其中，所述生物可降解高分子材料的不同单体比例为0:100-90:10。
其中，所述生物可降解高分子材料的重均分子量较佳地为10000-150000。所述生物可降解高分子材料的重均分子量可以根据不同的缓释时间进行选择，当需要药物缓释时间较长时，倾向于选择分子量较高的生物可降解高分子材料，如重均分子量为100000-150000；当药物缓释时间无需很长时，倾向于选择分子量较低的生物可降解高分子材料，如重均分子量为16000。
其中，所述抗寄生虫病药物为本领域常规的抗寄生虫病药物，如吡喹酮、左旋吡喹酮、氯硝柳胺、苯并咪唑类抗寄生虫病药物(如芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑或三氯苯达唑)或伊维菌素等抗寄生虫病药物。
其中，所述分散介质可为本领域常规使用的分散介质，较佳地为N-甲基吡咯烷酮(NMP)、聚乙二醇、三乙酸甘油酯、N-N二甲基乙酰胺、二甲基亚砜(DMSO)和油酸中的一种或多种。按本领域常识，采用聚乙二醇作为分散剂时，通常选择分子量较低的聚乙二醇，如聚乙二醇200、聚乙二醇400等。
其中，所述的增溶剂可为本领域常规使用的增溶剂，较佳地为吐温80、司盘80、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。按本领域常识，采用聚乙二醇作为增溶剂时，通常选择分子量较低的聚乙二醇，如聚乙二醇400、聚乙二醇600等。
在本发明的一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由下述配比的组分组成：所述抗寄生虫病药物1-80g、所述生物可降解高分子材料1-100g、所述分散介质2-300mL和所述增溶剂0-50g。
本发明中，所述抗寄生虫病药物和所述生物可降解高分子材料的质量比较佳地为0.06-1。所述分散介质与所述生物可降解高分子材料的体积质量比较佳地为(1.2-4.375)mL/g。所述增溶剂与所述生物可降解高分子材料的质量比较佳地为0-0.75。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由下述配比的组分组成：所述抗寄生虫病药物0.4g、生物可降解高分子材料0.4g和N-甲基吡咯烷酮0.8mL；所述生物可降解高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯或聚三亚甲基碳酸酯；所述生物可降解高分子材料的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为吡喹酮。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚己内酯和N-甲基吡咯烷酮组成；聚己内酯和所述抗寄生虫病药物的质量比为1.0-2.0；N-甲基吡咯烷酮和聚己内酯的体积质量比为1.5-2.5mL/g；聚己内酯的重均分子量为10000-80000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为吡喹酮；所述聚己内酯的重均分子量较佳地为45000-80000。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、所述生物可降解高分子材料、所述分散介质和所述增溶剂组成；所述抗寄生虫病药物与所述生物可降解高分子材料的质量比为3:20；所述分散介质和所述生物可降解高分子材料的体积质量比为3mL/g；所述增溶剂和所述生物可降解高分子材料的质量比为1:2；所述生物可降解高分子材料由质量比为(0-90)：(10-100)的重均分子量为16000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和重均分子量为150000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物组成。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为氯硝柳胺；所述分散介质较佳地为N-甲基吡咯烷酮；所述增溶剂较佳地为吐温80。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮组成；所述抗寄生虫病药物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:(10-3)；所述分散介质和所述生物可降解高分子材料的体积质量比为(1.2-2)mL/g；聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为吡喹酮。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮组成；所述抗寄生虫病药物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为2:1；所述分散介质和所述生物可降解高分子材料的体积质量比为3mL/g；聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为左旋吡喹酮。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述分散介质和所述增溶剂组成；所述抗寄生虫病药物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为(15-34.5)：(80-120)；所述分散介质和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的体积质量比为(25-35)mL/(8-12)g；所述增溶剂和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为(2-3)：(4-6)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为氯硝柳胺；所述分散介质较佳地为N-甲基吡咯烷酮；所述增溶剂较佳地为吐温80。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚己内酯和N-甲基吡咯烷酮组成；聚己内酯和所述抗寄生虫病药物的质量比为50:3；N-甲基吡咯烷酮和聚己内酯的体积质量比为2mL/g；聚己内酯的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为伊维菌素。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚己内酯、N-甲基吡咯烷酮和吐温80组成；聚己内酯和所述抗寄生虫病药物的质量比为5:1；N-甲基吡咯烷酮和聚己内酯的体积质量比为2mL/1.5g；聚己内酯和和吐温80的质量比为7.5：1；聚己内酯的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为甲苯达唑。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫病药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和、N-甲基吡咯烷酮组成；所述抗寄生虫病药物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:5；N-甲基吡咯烷酮和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的体积质量比为2mL/g；聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。其中，所述抗寄生虫病药物较佳地为阿苯达唑。
本发明中，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂中的各组分的实际用量不限于上述配比中所使用的“g”和“mL”，只要其中各组分的用量配比在相应范围内，即为本发明的技术方案。
本发明还提供了一种所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法，其包括下述步骤：将所述抗寄生虫病药物、所述高分子材料、所述分散介质和所述增溶剂混合，即得；
或者，其包括下述步骤：将所述抗寄生虫病药物、所述高分子材料和所述分散介质混合，即得。
其中，所述混合的方法和条件为本领域的常规方法和条件，一般以混合均匀为准。按本领域常识，可采用搅拌、超声分散、涡旋振荡等方式获得混合均匀的所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂。
其中，所述抗寄生虫病药物、高分子材料、分散介质和增溶剂的优选物质种类和用量均同前所述。
本发明中，所制得的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂为均一的溶液或者混悬液。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂对传染源只给药1次，即可维持长期的防控效果，能够保护动物在感染季节甚至更长的时间不受病原侵染，并且可以经济有效控制寄生虫病传播，阻断动物传播寄生虫的传播链，并且，本发明的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的材料安全性高；此外，该抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂简化了市售抗寄生虫病防治药物的处方，提高了给药对象的依从性，降低疾病防控成本。该抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法简单，稳定性好，易于现场应用和推广。
附图说明
图1为实施例1的吡喹酮释放结果。
图2为实施例2的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的体外释放结果；图2a-2c以Sigma Plot进行数据分析，图2e-2f以Excel进行数据分析(excel分析中不同时间的间隔是相等的，如1-4天与222-336天的坐标间隔一致，导致2a和图2d的前336天的图形差异较大)；其中，图2a和图2d为实施例2中样品编号1-5的体外释放结果，图2b和图2e为实施例2中样品编号6-10的体外释放结果；图2c和图2f为实施例2中样品编号11-15的体外释放结果。
图3为实施例3的氯硝柳胺原位固化缓释注射剂的体外药物释放结果。
图4为实施例4的吡喹酮原位固化缓释注射剂的累积释放率结果。
图5为实施例5的6个月吡喹酮原位固化缓释注射剂的累积释放率。
图6为实施例6的9个月吡喹酮原位固化缓释注射剂的累积释放率。
图7为实施例7的左旋吡喹酮原位固化缓释注射剂的累积释放率；其中，图7a为实施例7中a制备方法的累积释放率，图7b为实施例7中b制备方法的累积释放率。
图8为实施例8的氯硝柳胺原位固化缓释注射剂的体外释药曲线。
图9为实施例9的伊维菌素原位固化缓释注射剂的累积释放率结果。
图10为实施例10的甲苯达唑原位固化缓释注射剂的累积释放率结果。
图11为实施例11的阿苯达唑原位固化缓释注射剂的累积释放率结果。
图12为效果实施例1的吡喹酮原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中药物浓度的药时曲线。
图13为效果实施例1的吡喹酮原位固化缓释注射剂的剩余药量。
图14为效果实施例2的吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中药物浓度的药时曲线。
图15为效果实施例2的吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂的剩余药量。
图16为效果实施例3的吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在犬血浆中药物浓度的药时曲线，图16a表示0-50天的药时曲线，16b表示60-180天的药时曲线。
图17为效果实施例4的氯硝柳胺在血浆、肌肉和皮肤中的药时曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，选用了吡喹酮及左旋吡喹酮、氯硝柳胺、苯并咪唑类药物(包括阿苯达唑、甲苯达唑、芬苯达唑和奥芬达唑等)和伊维菌素等作为抗寄生虫病药物，分别制备了不同释放时间的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，用于包虫病、血吸虫病和蜱传寄生虫病及其它疾病的防治。
体外释放度测试方法：以50mL释放介质的测试条件为例，在离心管中加入抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂和50mL释放介质，释放介质为0.5％吐温80磷酸盐缓冲液(pH7.4)，于37.0±0.5℃的恒温水浴振荡器中水平振荡，将转速设定为100r/min，每隔一段时间将释放介质全部取出，同时补充相同体积的新鲜释放介质，释放液经稀释后采用HPLC的方法进行含量测定，计算累积释放率。
Figure BDA0003208825180000091
其中，Cn和Cn-1分别表示第n和n-1天释放介质中的药物浓度。
下述实施例中，所提到的分子量均为重均分子量。
实施例1
选择不同种类高分子聚合物制备不同释放期的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂。
药物选用吡喹酮及左旋吡喹酮、氯硝柳胺、苯并咪唑类(包括阿苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑、芬苯达唑和奥芬达唑)和伊维菌素，选择PLGA、PCL、PTMC为释放骨架，其重均分子量均为16000，测定药物的释放速度。
抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：称取0.4g药物，分别加入PLGA、PCL和PTMC各0.4g，NMP 0.8mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到溶液或混悬液。
取抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂0.2mL加入15mL去离子水，37℃摇床中，定时取样，取续滤液经HPLC检测。根据峰面积换算缓释制剂的释放浓度C，由C计算缓释制剂的累积释放率(Cumulative release rate％)。
各种药物的释放速度稍有差异，但趋势一致。以吡喹酮为例，图1为吡喹酮释放结果。根据试验结果(不同高分子材料的释放速度不同，PLGA注射剂最先释放完，9个月释放了89.4％；其次PMTC注射剂12个月释放了93.4％，前三个月释放速率最快，后期释放明显放慢，而PCL的注射剂释放最慢，19个月释放67％，预估可释放24个月或更长时间。
实施例2
采用不同处方配比制备抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其中，采用的聚合物为PCL，分散剂为NMP，制备方法同实施例1。
以聚合物分子量(A)、聚合物药物比(B)、溶剂浓度(C)为考察因素，凝胶粘度、遇水固化时间和药物体外释放时间为响应指标，因素与水平参数见表l。由Design Expert 8.0软件中的Box-Behnken设计得到15个处方，制备不同处方的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂(平行3份)，并进行体外释放试验，结果见图2a-图2f(图中，处方1-15对应样品编号1-15)，其中，图2a-2c以Sigma Plot进行数据分析，图2e-2f以Excel进行数据分析。
表1抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂配方
Figure BDA0003208825180000101
Figure BDA0003208825180000111
*处方3、处方7和处方8未完全释放。
取上述原位固化缓释注射剂0.2mL加入15mL去离子水，37℃摇床中，定时取样，取续滤液经HPLC检测。根据峰面积换算缓释制剂的释放浓度C，由C计算缓释制剂的累积释放率(Cumulative release rate％)。
以吡喹酮为例，根据试验结果图2，不同配方的释放速度不同。按释放速度由快到慢排序，样品编号(1、2、9、11、12和14)>(4、13和15)>(5、6和10)>(3、7和8)。释放时间均达到7个月以上。样品编号7的注射剂释放最慢，519天释放了72％。可以推断，采用该配方，其保护期大约可达20个月。因此，按样品1配比到样品15配比制备缓释注射剂，其保护期预期可从7个月以上到20个月以上。可以根据不同的释放时间需求选择不同配方配比。
实施例3
不同分子量的PLGA联用调节释放时间。
将分子量15万的PLGA(LA/GA质量比为90/10)与分子量1.6万的PLGA(LA/GA质量比为75/25)的两种PLGA按照不同比例联合使用作为骨架材料，通过调整不同降解速率的高分子材料之间的比例来控制药物的释放时间。
选择分子量为15万的PLGA(90/10)和分子量为1.6万的PLGA(75/25)，分别按照重量比100/0、90/10、80/20、70/30、50/50、30/70、20/80和10/90联合使用，见表2。
表2两种PLGA联合使用配比
样品编号 PLGA(90/10，Mw＝15万) PLGA(75/25，Mw＝1.6万)
联1 100 0
联2 90 10
联3 80 20
联4 70 30
联5 50 50
联6 30 70
联7 20 80
联8 10 90
以氯硝柳胺(NCA)为例，按照PLGA联合使用总量为100mg，NCA 15mg，NMP 0.3mL，吐温80为50mg制备氯硝柳胺原位固化剂。观察累计释放率(％)与PLGA联合使用比例、释放天数三者之间的关系，绘制趋势图。
分子量15万的PLGA(90/10)和分子量1.6万的PLGA(75/25)按照不同配比制备氯硝柳胺原位固化剂缓释注射剂的体外药物释放情况见图3。
由实验结果可知，分子量15万的PLGA(90/10)所占的比例越大，药物释放越缓慢，释放时间越长。其中，联用样品1在300天释放不足50％，联用样品8在300天释放90％左右。通过改变两者之间的配比，可达到控制药物释放时间的目的。
实施例4
2个月释放期的吡喹酮原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取15mg吡喹酮，加入PLGA(重均分子量为16000)150mg和NMP 0.3mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液。重复制备3份制剂。
每份注射剂中加入10mL去离子水，37℃放置，定时取样，取续滤液在263nm处测定OD值。精密称取吡喹酮对照品，制备0.2mg/mL的对照溶液，同样在263nm处测定OD值，计算累积释放率，结果见图4。
结果表明：3份制剂均可以达到2个月的缓释效果。
实施例5
6个月体外释放期的吡喹酮原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取1g吡喹酮，加入PLGA(重均分子量为16000)3g，NMP3.6mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液。
分别取上述吡喹酮缓释注射剂2、3、4mL加入50mL去离子水，37℃定时取样，取续滤液在263nm处测定OD值。根据OD值换算缓释制剂的释放浓度C，由C计算缓释制剂的累积释放率(Release％)。
根据试验结果(图5)，不同注射剂量的释放速度不同，2mL的注射剂释放最快，6个月释放了90％；4mL的注射剂释放最慢，6个月释放了63％。根据不同的释放时间需求选择注射剂用量。
实施例6
9个月体外释放期的吡喹酮原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取6g左旋吡喹酮和3g PLGA(重均分子量为150000)至15mL加盖玻璃管中，加入9mL的NMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用。
取上述药物缓释制剂0.1mL加入15mL去离子水，37℃摇床中，定时取样，取续滤液经LC-MS检测。根据峰面积换算缓释制剂的释放浓度C，由C计算缓释制剂的累积释放率(Cumulative release rate％)。结果见图6。9个月释放82％。
实施例7
左旋吡喹酮原位固化缓释注射剂，采用两种制备方法：
(a)称取6g左旋吡喹酮和3g PLGA(重均分子量为150000)至15mL加盖玻璃管中，加入9mL的NMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用。
(b)称取4g左旋吡喹酮和2g PLGA(重均分子量为16000)至15mL加盖玻璃管中，加入6mL的NMP，升温使聚合物溶解，涡旋混匀，冷至室温，备用。
取上述(a)(b)制备方法得到的药物缓释制剂各0.1mL加入15mL去离子水，37℃摇床中，定时取样，取续滤液经LC-MS检测。根据峰面积换算缓释制剂的释放浓度C，由C计算缓释制剂的累积释放率(Cumulative release rate％)。结果见图7a和图7b。图7a释放9个月左右，图7b释放8个月左右。
实施例8
不同释放时间的氯硝柳胺原位固化缓释注射剂。
高分子材料以PLGA(重均分子量为16000)为例。选取4个影响因素：即PLGA用量、氯硝柳胺理论载药量、NMP用量和吐温80用量。每个因素分为3个水平，因素与水平见表3，正交试验表见表4。
表3因素-水平表
Figure BDA0003208825180000141
表4正交试验表
Figure BDA0003208825180000151
结果可知(图8)，A(PLGA用量)、B(NCA理论载药量)、C(NMP用量)和D(吐温80用量)4个因素对首日释放率的影响均不显著(P＞0.05)，而A、B、C、D这4个因素对104日、211日和350日累积释放率的影响较为显著，均有统计学意义(P＜0.05)。
因此，可结合现场用药保护周期的需要选择不同处方。若针对肉牛，氯硝柳胺原位固化缓释注射剂的释放有效期不需太长，则最佳处方工艺为A3B3C3D3，即按比例为PLGA120mg、NCA 34.5mg、NMP 0.35mL和吐温80 60mg制备的缓释注射剂。若针对耕牛，希望氯硝柳胺原位固化缓释注射剂的释放有效期更长一些，则最佳处方工艺为A1B1C1D1，即按比例为PLGA 80mg、NCA 15mg、NMP 0.25mL和吐温80 40mg制备的缓释注射剂。而且，从实验可知，PLGA的用量越大、NMP和吐温用量越小的情况下，释放速度越慢。由此还可选择释放时间更长，保护期更长的注射剂配方。
实施例9
2个月释放期的伊维菌素原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取6mg伊维菌素，加入PCL(重均分子量为16000)100mg和NMP0.2mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液。重复制备3份制剂。
每份注射剂中加入10mL去离子水，37℃放置，定时取样，取续滤液进高效液相色谱(HPLC)测定峰面积，计算累积释放率，结果见图9。
结果表明：3份制剂均可以达到2个月的缓释效果。
实施例10
3个月释放期的甲苯达唑原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取30mg甲苯达唑，加入PCL(重均分子量为16000)150mg、NMP0.2mL和吐温8020mg，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液。重复制备3份制剂。
每份注射剂中加入10mL去离子水，37℃放置，定时取样，取续滤液进高效液相色谱(HPLC)测定峰面积，计算累积释放率，结果见图10。3个月累积释放80％以上。
实施例11
2个月释放期的阿苯达唑原位固化缓释注射剂，其制备方法如下：
称取20mg阿苯达唑，加入PLGA(重均分子量为16000)100mg和NMP0.2mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液。重复制备3份制剂。
每份注射剂中加入10mL去离子水，37℃放置，定时取样，取续滤液进高效液相色谱(HPLC)测定峰面积，计算累积释放率，结果见图11。2个月累积释放90％左右。
结果表明：3份制剂均可以达到2个月的缓释效果。
效果实施例1
LC-MS法测定吡喹酮原位固化缓释注射剂在小鼠体内药代动力学
采用LC-MS法建立了吡喹酮的体内分析方法，测定了皮下注射原位固化缓释注射剂后小鼠血浆吡喹酮中的代谢情况，以期获得本制剂在小鼠体内的分布、代谢和消除相关数据，为防治犬棘球绦虫奠定基础。
血浆样品处理：取血浆样品0.5mL，加入0.5mL去离子水稀释，涡旋混合1min，然后分别加入10μL内标溶液，20μL 0.1M NaOH溶液和10μL甲酸，每次加样后各涡旋混合0.5min。
使用Waters C18柱对药物进行固相萃取。将C18固相萃取柱置于配有真空泵的固相萃取仪上，依次用2mL甲醇和2mL去离子水平衡。随后加入上述处理的血浆样品1mL，用2mL5％甲醇水溶液洗脱，弃去洗脱液。再用2mL甲醇溶液洗脱药物，收集洗脱液。洗脱液用N2气吹干，加入1mL流动相溶解残留物。
原位固化缓释注射剂含量测定方法：吸取0.1mL PZQ缓释制剂，置入10mL容量瓶中，加入2mL乙腈，水浴加热使PZQ缓释制剂溶解，冷却至室温后加入流动相直至容量瓶刻度，摇均，吸取5mL混悬液转移至PE离心管中，以8,000rpm离心15min，取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取吡喹酮对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
给药方案及生物样品的采集：称取2g吡喹酮和3gPCL至15mL加盖玻璃管中，加入6mLNMP，升温使PCL溶解，涡旋混匀，冷至室温，备用。
小鼠及服药方案：N只雌性昆明小鼠，体重35～40g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，小鼠皮下注射缓释制剂，剂量1g·kg-1。
血样采集：上述小鼠于皮下注射缓释制剂后2小时、10、30、45、60天，各取3只鼠自眼眶取血，分别滴放置在含有肝素的1.5mL离心管中，3000r·min-1离心10min，分离血浆，-20℃冰箱中保存、备用。
原位固化制剂剩余药量：小鼠血样采集完毕，处死，取出皮下制剂，按照“原位固化缓释注射剂含量测定方法”，测试制剂剩余药物含量。
实验结果：吡喹酮原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中的药代动力学：吡喹酮原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中药物浓度的药时曲线和剩余药量如图12-13所示。
由图12-13表明，该处方原位固化制剂，小鼠体内药物释放2个月左右，小鼠血浆浓度范围24.2-3319.8ng/mL，制剂中剩余药量百分率由2h的98.4％，降低至4.6％。
效果实施例2
LC-MS法测定吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在小鼠体内药代动力学
采用LC-MS法建立了吡喹酮手性异构体的体内分析方法，测定了皮下注射原位固化缓释注射剂后小鼠血浆中吡喹酮手性异构体的代谢情况，以期获得本制剂在小鼠体内的分布、代谢和消除相关数据，为防治犬棘球绦虫奠定基础。
血浆样品处理：取血浆样品0.5mL，加入0.5mL去离子水稀释，涡旋混合1min，然后分别加入10μL内标溶液，20μL 0.1M NaOH溶液和10μL甲酸，每次加样后各涡旋混合0.5min。
使用Waters C18柱对药物进行固相萃取。将C18固相萃取柱置于配有真空泵的固相萃取仪上，依次用2mL甲醇和2mL去离子水平衡。随后加入上述处理的血浆样品1mL，用2mL5％甲醇水溶液洗脱，弃去洗脱液。再用2mL甲醇溶液洗脱药物，收集洗脱液。洗脱液用N2气吹干，加入1mL流动相溶解残留物。
原位固化缓释注射剂含量测定方法：
吸取0.1mL PZQ缓释制剂，置入10mL容量瓶中，加入2mL乙腈，水浴加热使PZQ缓释制剂溶解，冷却至室温后加入流动相直至容量瓶刻度，摇均，吸取5mL混悬液转移至PE离心管中，以8,000rpm离心15min，取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取吡喹酮对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
给药方案及生物样品的采集：
分别称取3g吡喹酮消旋体、左旋吡喹酮、右旋吡喹酮和1.5g聚合物至15mL加盖玻璃管中，加入4.5mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用。
小鼠及服药方案：N只雌性昆明小鼠，体重35～40g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，小鼠皮下注射缓释制剂，剂量1g·kg-1。
血样采集：上述小鼠于皮下注射缓释制剂后2小时、15、45、75、130天，各取3只鼠自眼眶取血，分别滴放置在含有肝素的1.5mL离心管中，3000r·min-1离心10min，分离血浆，-20℃冰箱中保存、备用。
原位固化缓释注射剂剩余药量：小鼠血样采集完毕，处死，取出皮下制剂，按照“原位固化缓释注射剂含量测定方法”，测试制剂剩余药物含量。
实验结果：吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中的药代动力学：吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在小鼠血浆中药物浓度的药时曲线和剩余药量如图14-15所示。
由图14-15表明，该处方原位固化制剂，小鼠体内药物释放4个月左右，吡喹酮消旋体、左旋吡喹酮和右旋吡喹酮原位固化缓释注射剂的剩余药量百分率分别由2h的95.8％、98.4％和78.3％，在130天降低至0.2％、0.05％和0.001％，特别是吡喹酮消旋体和左旋吡喹酮的原位固化缓释注射剂的2h体内残留含量均超过95％，未发生突释现象。消旋吡喹酮原位固化缓释注射剂小鼠血浆中左旋吡喹酮浓度范围43.3-971.1ng/mL，消旋吡喹酮原位固化缓释注射剂小鼠血浆中右旋吡喹酮浓度范围38.2-929.2ng/mL，消旋吡喹酮原位固化缓释注射剂小鼠血浆中消旋吡喹酮浓度范围81.5-1900.3ng/mL左旋吡喹酮原位固化缓释注射剂小鼠血浆中左旋吡喹酮浓度范围48.0-3870.8ng/mL，右旋吡喹酮原位固化缓释注射剂小鼠血浆中右旋吡喹酮浓度范围53.8-3224.0ng/mL。
效果实施例3
LC-MS法测定吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在犬体内药代动力学
采用LC-MS法建立了吡喹酮手性异构体的体内分析方法，测定了皮下注射原位固化缓释注射剂后犬血浆中吡喹酮手性异构体的代谢情况，以期获得本制剂在犬体内的分布、代谢和消除相关数据，为防治犬棘球绦虫奠定基础。
血浆样品处理：取血浆样品0.5mL，加入0.5mL去离子水稀释，涡旋混合1min，然后分别加入10μL内标溶液，20μL 0.1M NaOH溶液和10μL甲酸，每次加样后各涡旋混合0.5min。
使用Waters C18柱对药物进行固相萃取。将C18固相萃取柱置于配有真空泵的固相萃取仪上，依次用2mL甲醇和2mL去离子水平衡。随后加入上述处理的血浆样品1mL，用2mL5％甲醇水溶液洗脱，弃去洗脱液。再用2mL甲醇溶液洗脱药物，收集洗脱液。洗脱液用N2气吹干，加入1mL流动相溶解残留物。
原位固化缓释注射剂含量测定方法：
吸取0.1mL PZQ缓释制剂，置入10mL容量瓶中，加入2mL乙腈，水浴加热使PZQ缓释制剂溶解，冷却至室温后加入流动相直至容量瓶刻度，摇均，吸取5mL混悬液转移至PE离心管中，以8,000rpm离心15min，取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取吡喹酮对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
给药方案及生物样品的采集：
称取12g吡喹酮消旋体、左旋吡喹酮、右旋吡喹酮分别和6g聚合物至50mL加盖玻璃管中，加入18mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用。
犬及服药方案：6只比格犬，雌雄各半,体重8～12kg，购自上海交通大学农学院，犬皮下注射缓释制剂，剂量100mg·kg-1。
血样采集：上述犬于皮下注射缓释制剂后2小时、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、180天，各取6只犬静脉血，分别置在含有肝素的采血管中，移至EP管中，3000r·min-1离心10min，分离血浆，-20℃冰箱中保存、备用。
实验结果：吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在犬血浆中的药代动力学：吡喹酮手性异构体原位固化缓释注射剂在犬血浆中药物浓度的药时曲线如图16所示，图16a表示0-50天的药时曲线，16b表示60-180天的药时曲线。
由图16表明，该处方原位固化制剂，犬体内药物目前释放180天，消旋PZQ的血浆浓度范围10-1040ng/mL。给药后2h，R-PZQ的最高血药浓度为321ng/mL，180天后R-PZQ降至13ng/mL。鉴于PZQ对绦虫的驱虫效果具有浓度和时间依赖性，即绦虫暴露于较高药物浓度和/或较长时间是充分治疗寄生虫感染的必要条件。5mg/kg PZQ固体纳米粒治疗犬棘球绦虫，减卵率和减虫率均为100％，而相应体内PZQ最高血药浓度为113.7ng/mL，96h后降低至约10ng/mL。为此本研究制备的PZQ原位固化长效注射剂有望防治犬棘球绦虫6个月。
效果实施例4
LC-MS法测定氯硝柳胺在小鼠体内药代动力学及最低灭蚴浓度
采用LC-MS法建立了氯硝柳胺的体内分析方法，测定了口服氯硝柳胺在小鼠中的代谢情况，以期获得氯硝柳胺在小鼠皮肤和肌肉的分布、代谢和消除相关数据，为皮肤及肌肉中氯硝柳胺含量与抗尾蚴侵袭保护作用的相关性分析奠定基础。
给药方案及生物样品的采集：精密称取1g西黄蓍胶，加入1mL 95％乙醇，搅拌成糊状后加入100mL去离子水，搅拌后静置24h，备用。取20mL西黄蓍胶混悬液，加入400mg氯硝柳胺原料药，放入球磨机中混匀，配制成药物浓度分别为20mg/mL的氯硝柳胺混悬液。
将小鼠随机分为14组，每组3只。先对小鼠进行称重，按照0.2mL/20g确定灌胃体积，小鼠灌胃前禁食12h,不禁水。给药剂量为200mg/kg，于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、144和168h取眼眶血、大腿内侧肌肉和腹部及背部皮肤组织。
生物样品处理：取小鼠血浆0.4mL，加10μl内标溶液(16μg/mL)，混合1min,加入丙酮沉淀蛋白，1888×g离心15min,取上清液50℃下氮气流(N2)挥干，加1mL甲醇溶液，涡旋1min，用2.2μm微孔滤膜过滤，取3μl进行LC/MS分析。
取0.5g肌肉和0.25g皮肤样品，分别置于匀浆器中，加入1mL生理盐水研磨均匀，取0.4mL匀浆液做后续处理，方法与血浆一致。
氯硝柳胺在小鼠血浆、肌肉和皮肤中的药代动力学：血浆、肌肉和皮肤中的药物浓度和药时曲线如表5-7和图17所示。
氯硝柳胺经口给药后，在小鼠皮肤中的含量较高。从半衰期来看，氯硝柳胺在肌肉中停留的时间最长，半衰期达到45h；从最大药物浓度及药时曲线下面积(即AUC，表明生物利用度的高低)来看，在皮肤中含量最高；达峰时间的快慢依次为血浆＞肌肉＞皮肤，药物在皮肤中达峰时间最慢，为17.3h。在24h到48h间，小鼠体内药物含量急剧下降，但皮肤和肌肉中的含量仍远高于血浆中的含量，血浆中血药浓度约为(1.91±1.06)ng/mL，而皮肤和肌肉中分别为(52.58±64.73)ng/g和(36.479±49.20)ng/g；至120h，血浆中含量已降至(0.28±0.14)ng/mL，但皮肤和肌肉中仍达(6.17±0.54)和(3.01±0.36)ng/g。
表5氯硝柳胺口服给药后在小鼠血浆、皮肤和肌肉中的药物浓度(200mg/kg)
Figure BDA0003208825180000221
根据药时曲线(图16)，采用梯形法计算AUC0-t值，由消除相的末端四点计算药物的生物半衰期T1/2、最高血药浓度Cmax和达峰时间Tmax。其主要动力学参数如表6所示。
表6小鼠口服200mg/kg剂量氯硝柳胺的主要药动学参数
Figure BDA0003208825180000231
a：参数单位血药浓度以体积(mL)表示，肌肉及皮肤中的药物分布以质量(g)表示。
氯硝柳胺药物浓度和抗尾蚴侵袭的相关性研究：氯硝柳胺200mg/kg剂量下不同时间点接种尾蚴的减虫率与氯硝柳胺200mg/kg剂量下不同时间点的药物浓度结合起来，得出氯硝柳胺药物浓度和抗尾蚴侵袭的相关性，整理成表7。
表7氯硝柳胺药物浓度和抗尾蚴侵袭的相关性(200mg/kg)
Figure BDA0003208825180000232
最低灭蚴浓度：实验结果可知，氯硝柳胺口服剂量为200mg/kg，给药0.25h后进行尾蚴攻击，减虫率达79.1％，可将此时血浆、皮肤和肌肉中的浓度作为最低灭蚴浓度的参考值，为后续的氯硝柳胺原位固化剂的研究奠定基础。由实验结果可知，氯硝柳胺给药剂量为200mg/kg，给药时间为0.5h时，血浆、皮肤和肌肉中的药物浓度为889.122±1015.461ng/mL，2369.013±495.618ng/g和230.54±61.789ng/g。
效果实施例5
吡喹酮和氯硝柳胺原位固化缓释注射剂对小鼠感染日本血吸虫的药效作用
考虑到小鼠接种剂量小于<0.2mL为宜，为此按照表8处方制备了吡喹酮(PZQ)和氯硝柳胺(NCA)原位固化缓释注射剂，进行了小鼠抗血吸虫尾蚴侵袭的药效试验。
表8原位固化缓释注射剂配方
Figure BDA0003208825180000241
动物：昆明鼠15±2g左右，雌性鼠，按随机数目表随机分组，每组4-5只。分别皮下注射NCA和PZQ原位长效注射剂，与给药后的不同时间接种尾蚴，并设对照组。
给药及感染尾蚴：首先剪去所有小鼠下腹部1.5xl.5cm2时的毛。所有小鼠均仰卧固定于木板上，将完整无损的尾蚴40±2条置于1/4盖玻片上，并将其贴在剪毛处，15分钟后取下玻片。
成虫检获喂养35天后，断头处死，检获成虫。
Figure BDA0003208825180000242
表9原位固化缓释注射剂药效
Figure BDA0003208825180000243
Figure BDA0003208825180000251
原位固化缓释注射剂药效结果见表9，NCA原位长效注射剂在57天时可以达到100％的减虫率，PZQ原位长效注射剂在43天仍可以达到80％的减虫率。二者的原位长效注射剂抗血吸虫尾蚴侵袭作用明显。
效果实施例6
氯硝柳胺原位固化缓释注射剂对耕牛感染日本血吸虫的药效作用现场试验
实验室制备原位固化缓释注射剂的配方如表10。
表10氯硝柳胺原位固化缓释注射剂配方
Figure BDA0003208825180000252
结合实验小鼠剂量小鼠2个月剂量15mg/20g，换算到现场动物(牛)一个较窄的用药剂量范围(5.8-20.7)g/300kg，暂定约为10g/牛。
现场选择：在湖沼型血吸虫病流行区，选择散放牛较多、家畜血吸虫感染率较高和阳性螺点较多的流行村或洲滩为现场。
研究对象：以无感染血吸虫、牛龄2～3岁的水牛为观察对象，施药组4头、对照组6头。要求身体健康、无患其它较严重疾患。
试验药物：氯硝柳胺长效注射制剂。
试验分组：将筛查的阴性牛编号，分为2组。
检验方法：干预前，对试验范围内的牛采用塑料杯顶管粪孵法进行血吸虫感染情况筛查(三送九检)，将三检均阴性者列为试验对象。然后，分别于干预后的1、3、6月进行采粪孵化(一送三检)，观察施药组和对照组耕牛的副反应和感染血吸虫的情况。
统计方法和观察指标：1.各组血吸虫感染数；2.副反应：反刍、食欲、体重等。
表11氯硝柳胺原位固化缓释注射剂药效
Figure BDA0003208825180000261
结果如表11所示，三个月的结果可以看出，给药组全部阴性，表明给药组水牛没有受到感染；而未给药组的水牛感染率为50％(6头水牛中有3头结果为阳性)。说明硝柳胺原位固化缓释注射剂的疗效可以维持3个月耕牛不感染血吸虫。6个月结果中，对照组有一只牛感染，与前感染牛相加，总计有4头牛感染；而给药组均无感染。说明硝柳胺原位固化缓释注射剂的疗效可以维持6个月耕牛不感染血吸虫。
效果实施例7
氯硝柳胺原位固化缓释注射剂对耕牛感染日本血吸虫的药效作用-扩大
现场试验
制剂处方同表10。
现场选择：在湖沼型血吸虫病流行区，选择散放牛较多、家畜血吸虫感染率较高和阳性螺点较多的流行村或洲滩为现场。
研究对象：以无感染血吸虫的水牛为观察对象，施药组50头、对照组51头。要求身体健康、无患其它较严重疾患。
试验药物：氯硝柳胺长效注射制剂。
试验分组：将筛查的阴性牛编号，分为2组。
检验方法：干预前，对试验范围内的牛采用塑料杯顶管粪孵法进行血吸虫感染情况筛查(三送九检)，将三检均阴性者列为试验对象。然后，分别于干预后的1、2、3、4、5、6和8月进行采粪孵化(一送三检)，观察施药组和对照组耕牛的副反应和感染血吸虫的情况。
统计方法和观察指标：1.各组血吸虫感染数；2.副反应：反刍、食欲、体重等。
表12氯硝柳胺原位固化缓释注射剂药效
Figure BDA0003208825180000271
结果如表12所示，1-4个月的结果可以看出，给药组全部阴性，表明给药组水牛没有受到感染；而未给药组的水牛1-4个月的阳性率分别为2.0％，3.9％，7.8％和9.8％。5-8个月结果待测定。说明硝柳胺原位固化缓释注射剂的疗效至少可以维持6个月耕牛不感染血吸虫。
效果实施例8
吡喹酮原位固化缓释注射剂对包虫病的药效作用
原位固化缓释注射剂的制备：按照处方称取1000mg吡喹酮加入3.6mL的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，混匀后加入3g的聚(DL-丙交酯-乙交酯)(PLGA，重均分子量为16000)，搅拌直至得到均一的溶液或混悬液。
试验方法
犬的分组：按犬主的居住位置，选择100只犬，将100只犬随机分为两组，实验组和对照组，每组50只，并在犬的颈部配带标识卡。
缓释药物注射：对实验组每只犬皮下注射6mL缓释药物，并做好登记。对照组的犬不做任何处理。本项目执行期内，两组的犬的投药改为喂食安慰剂。
犬粪抗原检测：实验前，采集两组犬粪。药物注射1周后，采集实验组犬粪。此后，每月收集两组犬粪一次，连续6个月，存放于-80℃灭活保存，并对犬粪做包虫抗原检测。方法如下：取1g粪样加5mL粪便处理液(0.3％PBS-T20)，充分混匀1-2min，2000r/min离心20min，取上清液作为粪抗原待测液。按照康百得包虫病检测试剂盒(犬粪)说明书的操作步骤，对2组粪抗原进行检测。计算犬感染率，并逐月比较犬粪抗原阳性率。
表13吡喹酮原位固化缓释注射剂药效
Figure BDA0003208825180000281
结果见表13，第4个月对照组50份犬粪样本中仅有1份为阳性，其余所有犬粪样本均为阴性。

Claims (37)

1.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，其包括下述配比的组分：抗寄生虫药物1-80g、生物可降解高分子材料1-100g、分散介质2-300mL和增溶剂0-50g；所述抗寄生虫药物在所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂中的含量为1-800mg/mL；
所述生物可降解高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
所述分散介质为N-甲基吡咯烷酮；
所述抗寄生虫药物为吡喹酮、左旋吡喹酮、氯硝柳胺或苯并咪唑类抗寄生虫药物。
2.如权利要求1所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述生物可降解高分子材料的不同单体比例为0:100-90:10，但不为0。
3.如权利要求1或2所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述生物可降解高分子材料的重均分子量为10000-150000；
和/或，所述的增溶剂为吐温80、司盘80、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述苯并咪唑类抗寄生虫药物为芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑或三氯苯达唑。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，其由下述配比的组分组成：所述抗寄生虫药物1-80g、所述生物可降解高分子材料1-100g、所述分散介质2-300mL和所述增溶剂0-50g。
6.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物和所述生物可降解高分子材料的质量比为0.06-1；
和/或，所述分散介质与所述生物可降解高分子材料的体积质量比为(1.2-4.375)mL/g；
和/或，所述增溶剂与所述生物可降解高分子材料的质量比为0-0.75。
7.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由下述配比的组分组成：所述抗寄生虫药物0.4g、生物可降解高分子材料0.4g和N-甲基吡咯烷酮0.8mL；所述生物可降解高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯或聚三亚甲基碳酸酯；所述生物可降解高分子材料的重均分子量为16000。
8.如权利要求7所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为吡喹酮。
9.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚己内酯和N-甲基吡咯烷酮组成；所述聚己内酯和所述抗寄生虫药物的质量比为1.0-2.0；所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为1.5-2.5mL/g；所述聚己内酯的重均分子量为10000-80000。
10.如权利要求9所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为吡喹酮；
和/或，所述聚己内酯的重均分子量为45000-80000。
11.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、所述生物可降解高分子材料、所述分散介质和所述增溶剂组成；所述抗寄生虫药物与所述生物可降解高分子材料的质量比为3:20；所述分散介质和所述生物可降解高分子材料的体积质量比为3mL/g；所述增溶剂和所述生物可降解高分子材料的质量比为1:2；所述生物可降解高分子材料由质量比为(0-90)：(10-100)的重均分子量为16000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和重均分子量为150000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物组成。
12.如权利要求11所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为氯硝柳胺；
和/或，所述增溶剂为吐温80。
13.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮组成；所述抗寄生虫药物与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:(10-3)；所述分散介质和所述生物可降解高分子材料的体积质量比为(1.2-2)mL/g；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。
14.如权利要求13所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为吡喹酮。
15.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述分散介质和所述增溶剂组成；所述抗寄生虫药物与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为(15-34.5)：(80-120)；所述分散介质和所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的体积质量比为(25-35)mL/(8-12)g；所述增溶剂和所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为(2-3)：(4-6)；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。
16.如权利要求15所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为氯硝柳胺；
和/或，所述增溶剂为吐温80。
17.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚己内酯和N-甲基吡咯烷酮组成；所述聚己内酯和所述抗寄生虫药物的质量比为50:3；所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2mL/g；所述聚己内酯的重均分子量为16000。
18.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚己内酯、N-甲基吡咯烷酮和吐温80组成；所述聚己内酯和所述抗寄生虫药物的质量比为5:1；所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2mL/1.5g；所述聚己内酯和所述吐温80的质量比为7.5：1；所述聚己内酯的重均分子量为16000。
19.如权利要求18所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为甲苯达唑。
20.如权利要求1-4中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由所述抗寄生虫药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮组成；所述抗寄生虫药物与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:5；所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的体积质量比为2mL/g；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。
21.如权利要求20所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为阿苯达唑。
22.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由抗寄生虫药物1-80g、聚乳酸-羟基乙酸共聚物1-100g和N-甲基吡咯烷酮2-300mL组成；所述抗寄生虫药物在所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂中的含量为1-800mg/mL；
所述抗寄生虫药物与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为2:1；所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的体积质量比为3mL/g；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为16000。
23.如权利要求22所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物为左旋吡喹酮。
24.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂由6g左旋吡喹酮、3g聚乳酸-羟基乙酸共聚物和9mL N-甲基吡咯烷酮组成；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为150000。
25.一种如权利要求1-24中任一项所述的抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：将所述抗寄生虫药物、所述生物可降解高分子材料、所述分散介质和所述增溶剂混合，即得；
或者，其包括下述步骤：将所述抗寄生虫药物、所述高分子材料和所述分散介质混合，即得。
26.如权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述混合的方法为搅拌、超声分散或涡旋振荡。
27.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：称取0.4g药物，加入高分子材料0.4g，N-甲基吡咯烷酮0.8mL，涡旋振荡直至所述高分子材料完全溶解，得到溶液或混悬液；
所述高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯或聚三亚甲基碳酸酯，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯或所述聚三亚甲基碳酸酯的重均分子量均为16000；
所述药物选自吡喹酮、左旋吡喹酮、氯硝柳胺或苯并咪唑类，所述苯并咪唑类包括阿苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑、芬苯达唑和奥芬达唑。
28.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如权利要求27所述；所述药物为吡喹酮，所述高分子材料为聚己内酯，分散剂为N-甲基吡咯烷酮；
其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2.5，所述聚己内酯的重均分子量为10000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为2，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为10000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为1.5，所述聚己内酯的重均分子量为80000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为2，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2.5，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为2，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为80000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2.5，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为2，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为1.5，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为1.5，所述聚己内酯的重均分子量为10000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为1.5，所述聚己内酯的重均分子量为45000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为80000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1.5，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2.5，所述聚己内酯的重均分子量为80000；
或，其中，所述聚己内酯和所述吡喹酮的比为1，所述N-甲基吡咯烷酮和所述聚己内酯的体积质量比为2，所述聚己内酯的重均分子量为10000。
29.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：将分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的两种PLGA按照不同比例联合使用作为骨架材料，按照PLGA联合使用总量为100mg，氯硝柳胺15mg，NMP0.3mL，吐温80 为50mg制备氯硝柳胺原位固化剂，所述分子量15万的PLGA中LA/GA质量比为90/10，分子量1.6万的PLGA中LA/GA质量比为75/25；
其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为100：0；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为90：10；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为80：20；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为70：30；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为50：50；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为30：70；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为20：80；
或，其中，所述分子量15万的PLGA与分子量1.6万的PLGA的比例为10：90。
30.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的处方为PLGA 120mg、NCA 34.5mg、NMP 0.35mL和吐温80 60mg；
或，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的处方为PLGA 80mg、NCA 15mg、NMP0.25mL和吐温80 40mg。
31.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：称取30mg甲苯达唑，加入PCL 150mg、NMP 0.2mL和吐温80 20mg，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液；所述PCL的重均分子量为16000。
32.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂制备方法如下：称取20mg阿苯达唑，加入PLGA 100mg和NMP0.2mL，涡旋振荡直至高分子材料完全溶解，得到均一的溶液；所述PLGA的重均分子量为16000。
33.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：称取2g吡喹酮和3g PCL至15mL加盖玻璃管中，加入6mL NMP，升温使PCL溶解，涡旋混匀，冷至室温，备用。
34.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的制备方法如下：称取3g吡喹酮消旋体和1.5g聚合物至15mL加盖玻璃管中，加入4.5mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或，称取3g左旋吡喹酮和1.5g聚合物至15mL加盖玻璃管中，加入4.5mL NMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或，称取3g右旋吡喹酮和1.5g聚合物至15mL加盖玻璃管中，加入4.5mL NMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或，称取6g左旋吡喹酮和3g PLGA至15mL加盖玻璃管中，加入9mL的NMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述PLGA的重均分子量为150000；
或，称取4g左旋吡喹酮和2g PLGA至15mL加盖玻璃管中，加入6mL的NMP，升温使聚合物溶解，涡旋混匀，冷至室温，备用；所述PLGA的重均分子量为16000；
或，称取12g吡喹酮消旋体和6g聚合物至50mL加盖玻璃管中，加入18mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或，称取12g左旋吡喹酮和6g聚合物至50mL加盖玻璃管中，加入18mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或，称取12g右旋吡喹酮和6g聚合物至50mL加盖玻璃管中，加入18mLNMP，使聚合物溶解，涡旋混匀，备用；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种。
35.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g吡喹酮消旋体：6g聚合物：18mL NMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或者，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g左旋吡喹酮：6g聚合物：18mL NMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或者，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g右旋吡喹酮：6g聚合物：18mLNMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种。
36.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g吡喹酮消旋体，6g聚合物，18mL NMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或者，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g左旋吡喹酮，6g聚合物，18mL NMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种；
或者，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：12g右旋吡喹酮，6g聚合物，18mLNMP；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚三亚甲基碳酸酯中的一种或多种。
37.一种抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂，其特征在于，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：氯硝柳胺15mg，PLGA 50mg，NMP 0.1mL，吐温80 50g；
或者，所述抗寄生虫药物原位固化缓释注射剂的配方如下：吡喹酮15mg，PLGA 50mg，NMP 0.1mL。
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