CN113604405A - 一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途，属于微生物领域。其中，所述屎肠球菌的保藏编号为CGMCC No.18047，具有抗逆性强的特点，具备较高的耐酸、耐胆盐、耐高温以及粘附性强等特性，且该菌株具有显著的抑菌性和菌株活力，发酵液活菌数高，能够达到5.0×1010CFU/mL以上，在进行喷雾干燥后仍具有显著的菌剂活性。在利用该菌制备的微生物饲料添加剂中，其活菌数较高，且保存期长，大幅度降低了生产成本，具有良好的应用前景。
Description
本申请是以下申请的分案申请：申请日为2019年11月29日，申请号为201911202532.2，发明名称为一种屎肠球菌、其菌剂及其菌剂的制备方法与用途。
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途。
背景技术
屎肠球菌(Enterococcus faecium)，革兰氏阳性，圆形或卵圆形，单个，成对或短链状排列，无芽孢，无鞭毛。生长温度为30-40℃，适宜pH为5.0-7.5，最适生长温度为35-38℃。屎肠球菌是兼性厌氧的乳酸菌，代谢产生有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，这些物质具有抑制病原菌和腐败菌，提高免疫力、改善畜产品品质等生理功效。
其中代谢产生的细菌素可有效治疗养殖场中常见的顽固疾病，如对葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌有拮抗作用，并且不留有药残。代谢产生大量乳酸，可以显著降低动物肠道pH，保持肠道的酸性环境，抑制病原菌的生长，对致病菌痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，过氧化氢能抑制和杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌如假单胞菌属、大肠杆菌类、沙门氏菌属。
由于乳酸菌的抗逆性差，易失活的特性，必须辅以严格的生产后处理工艺保证其活性，如真空冷冻干燥工艺、微胶囊包被工艺，这就造成了乳酸菌高昂的生产成本。
发明内容
本发明提供一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途。该屎肠球菌具有抗逆性强，不易失活，具有显著的抑菌性，且具有较高的耐酸、耐胆盐、耐高温以及粘附性强等特性，发酵液活菌数高，能够达到5.0×1010CFU/mL以上，在进行喷雾干燥后仍具有显著的菌剂活性，而且，用于制备的微生物饲料添加剂活菌数高，保存期长，大幅度降低了生产成本。发酵液中的酸和细菌素都有很好的抑菌作用，而且该菌株的抗药性强，具有很好的应用前景。本发明中的百分号(％)未特殊说明的均为质量百分比。
为达到此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种屎肠球菌(Enterococcus faecium)，于2019年6月27日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18047，命名为屎肠球菌EF-sj19。
所述菌株发酵性能显著，菌株活力较高，其生长迟滞期短，接入培养基中即可生长，生长3小时后菌数成倍数增加，即进入对数生长期，生长10小时后菌数几乎不再变化，即进入稳定期，稳定期保持时间长达20小时以上。
本发明的第二个目的是提供所述屎肠球菌制备获得的屎肠球菌菌剂，具体为菌体干粉。
本发明的第三个目的是提供所述屎肠球菌菌剂的制备方法，具体如下：
取活菌浓度为105-107CFU/mL的屎肠球菌种子液，按照接种量2-5％接种于发酵培养基中，32-38℃条件下，静置培养20-24小时，得到发酵液；向所述发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。
优选地，所述屎肠球菌菌剂的制备方法，具体如下：
(1)一级种子液制备；挑取所述屎肠球菌菌落，接入一级种子培养基中，32-38℃条件下静置培养20-24小时，得到一级种子液；
(2)二级种子液制备：将所述一级种子液按照接种量2-4％接入二级种子培养基中，32-38℃条件下静置培养20-24小时，得到二级种子液；
(3)发酵罐发酵：将所述二级种子液按照接种量2-5％接入发酵培养基中，在温度32-38℃，风量0.5-1L/min，转速80-120rpm，发酵过程中维持pH6.0-7.0，控制发酵时间16-20小时；
(4)向所述步骤(3)得到的发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。
优选地，所述步骤(1)中，一级种子培养基组成为：葡萄糖1-3％，胰蛋白胨0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1mL％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
优选地，所述步骤(2)中，二级种子培养基组成为：葡萄糖1-2％，糖蜜1-2％，胰蛋白胨0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1mL％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
优选地，所述步骤(3)中，发酵培养基组成为：葡萄糖1-4％，糖蜜1-4％，胰蛋白胨1-3％，酵母浸粉1-3％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1mL％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
本发明的发酵培养基组成相较于MRS肉汤培养基的组成，原料更为廉价，更适用于菌株的工业化生产，而本发明菌株可以更好地利用发酵培养基进行发酵增殖。
优选地，所述步骤(3)中，在发酵过程中，发酵至第5-7h时开始流加补料培养基，补料体积为发酵培养基体积的5-10％，流加速度为35-45mL/h；所述补料培养基组成为：葡萄糖浓度为10-15％，糖蜜浓度为15-20％，余量为水。所述百分比均为质量百分比。
优选地，所述步骤(4)中，保护剂组成为：脱脂奶粉3-5％，大豆油0.5-1％，桃胶0.5-1％，水溶性淀粉5-10％(所述百分比为保护剂中各组分占比所述发酵液的质量/体积百分比)。
优选地，所述步骤(4)中，喷雾干燥工艺的进风温度为130-160℃，出风温度60-90℃，流速300-400mL/h。
经过喷雾干燥后，所述屎肠球菌菌剂中的活菌数达到7.0×1011CFU/g以上，菌种存活率达到95％以上。且在常温下保存，菌数可以保持18个月数量级不变。
本发明的第四个目的是提供所述屎肠球菌在饲料中的用途。
优选地，所述菌剂在饲料中的添加量为1011-1012CFU/t日粮。
有益效果：
本发明研究了一株屎肠球菌，该菌抗逆性强、菌株发酵产酸产细菌素的抑菌作用强，菌株抗药性强，发酵活菌数高，能够达到5.0×1010CFU/mL以上，用于制备的微生物饲料添加剂活菌数高，保存期长，具有很好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实验例4的屎肠球菌的培养液pH值随时间变化图；
图2是本发明实施例1、2和对比例1的屎肠球菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。若无特殊强调，本发明内容和实施例中的百分号除特殊说明之外均为质量百分比。
实验例1屎肠球菌的抗逆性实验
(1)培养方法：
取活菌浓度106CFU/mL的屎肠球菌EF-sj19种子液，按照接种量3％接种于MRS肉汤培养基中，37℃静置培养20h，得到菌液，取菌液1mL进行10倍梯度稀释，涂布于MRS平板上，37℃倒置培养过夜进行计数，此为原始菌液。
MRS肉汤培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1mL/L，pH 6.2±0.2，121℃，20min。下文所述的MRS培养基组成均与之相同。
(2)耐温性测定：
取来自(1)培养方法中的原始菌液于无菌试管中，分别置于70℃、80℃、90℃、100℃的水浴锅中，每个温度分组中添加的原始菌液均为5mL，分别经过对应不同温度加热处理10分钟，取出再次进行平板计数，比较加热前后的菌数结果，如表1所示，该菌在100℃的温度下加热处理10分钟，菌数存活率80.3％，90℃的温度下加热处理10分钟，菌数存活率92.5％，80℃的温度下加热处理10分钟，菌数存活率96.3％，70℃的温度下加热处理10分钟，菌数存活率98.5％。由此可见本发明的屎肠球菌具有显著的耐温性能，可以耐受制粒时的高温，可在高温制粒后仍然保持菌株的活力，作为饲料添加剂具有更为显著的应用前景。
表1屎肠球菌经过不同温度处理的菌活力
| 处理方法 | 菌数(CFU/mL) | 存活率(％) |
| 原始菌液 | 5.9×10<sup>6</sup> | 100 |
| 70℃ | 5.8×10<sup>6</sup> | 98.5 |
| 80℃ | 5.6×10<sup>6</sup> | 96.3 |
| 90℃ | 5.4×10<sup>6</sup> | 92.5 |
| 100℃ | 4.4×10<sup>6</sup> | 80.3 |
(3)耐酸性测定
另取来自(1)培养方法中的原始菌液分别加入99mL的pH2.0、3.0、4.0的稀盐酸配置的胃液中，每个pH分组分别添加的原始菌液均为1mL，100r/min震荡培养4h，分别取出1mL进行活菌计数，与原始菌液活菌数做对比，存活率分别是34％，86％、98％。
由此可见本发明的屎肠球菌具有显著的耐酸性能，可以耐受胃酸对于微生物的抑制或杀菌作用，更为有效地促进胃肠道的代谢功能，同时有效抑制病原菌和腐败菌，提高机体的免疫力，从而具有显著改善畜产品品质等生理功效。通过下文实施例5屎肠球菌在母猪方面的临床中试应用中可以看出，利用本发明菌剂可以显著提高母猪抵抗能力，有效发挥屎肠球菌促进母猪的胃肠道的代谢功能，从而影响提高仔猪的存活率，显著降低仔猪的腹泻率，详见表6。
表2屎肠球菌经过不同酸处理的菌活力
| pH | 菌数(CFU/mL) | 存活率(％) |
| 原始菌液 | 5.9×10<sup>6</sup> | 100 |
| 2.0 | 2.0×10<sup>6</sup> | 34 |
| 3.0 | 5.1×10<sup>6</sup> | 86 |
| 4.0 | 5.8×10<sup>6</sup> | 98 |
(4)耐胆盐性测定
另取来自(1)培养方法中的原始菌液分别加入99mL的猪胆盐浓度为0.2％、0.6％、1.0％的MRS肉汤中，每个猪胆盐浓度分组中各添加的原始菌液均为1mL，37℃100r/min震荡培养24h，分别取出进行活菌计数，与原始菌液活菌数做对比，存活率分别是99.6％，92.5％、86.7％。
由此可见本发明的屎肠球菌同样具有显著的耐胆盐性能，胆盐本身是肠道乳酸菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素，而本发明的屎肠球菌可以在耐受胆盐的条件下，保证菌株的活力，发挥菌株促进代谢，提高机体免疫力的功能。
表3屎肠球菌经过不同胆盐浓度处理的菌活力
| 胆盐浓度 | 菌数(CFU/mL) | 存活率(％) |
| 原始菌液 | 5.9×10<sup>6</sup> | 100 |
| 0.2％ | 5.8×10<sup>6</sup> | 99.6 |
| 0.6％ | 5.4×10<sup>6</sup> | 92.5 |
| 1.0％ | 5.1×10<sup>6</sup> | 86.7 |
(5)粘附性测定
该菌株的粘附性很强，利用辣根过氧化物酶标记的粘蛋白Mucin(Mucin-HRP，Sigma公司)做粘附实验，辣根过氧化物酶标记的牛血清白蛋白(BSA-HRP)作对照，用ELISA方法(Repentigny L，2000)测定该菌株对粘蛋白的粘附性，结果显示，其OD450可以达到0.09255，与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，结果详见见表4。
由此可见本发明的屎肠球菌具有显著的粘附性能，可以很好地附着于胃肠道内壁中，从而可以有效发挥菌株的功能。
表4屎肠球菌粘附性试验结果
注：与对照相比*：p＜0.05
实验例2屎肠球菌发酵产酸产细菌素抑菌性能
将实验室保存的屎肠球菌EF-sj19于-80℃甘油管放入37℃水浴中溶化，取500μl接种到100mL MRS肉汤中，37℃静置培养24小时，之后以2％的比例接种到另外一瓶MRS肉汤中，37℃静置培养24小时，菌数约5.0×106CFU/mL，将发酵液经12000rpm下离心10分钟去掉沉淀，得到的即为发酵上清液，将发酵上清液平均分为8组，每组5mL，每组三个平行，并进行以下处理：
A组：发酵上清液
B组：加入蛋白酶K 5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
C组：加入胃蛋白酶5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
D组：加入胰蛋白酶5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
所述B、C、D组在加入酶后，均在37℃温育1小时后，并用氨水调节混合液pH至7.0。
E组：加入蛋白酶K 5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
F组：加入胃蛋白酶5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
G组：加入胰蛋白酶5mg,使得蛋白酶的终浓度均为1mg/mL；
所述E、F、G组在加入酶后，均在37℃温育1小时后，不作pH的调节，pH值均在4.0-5.0的范围内；
H组：取发酵上清液，氨水调节发酵原液pH至7.0。
采用牛津杯法测定抑菌性。
致病菌选择大肠杆菌和沙门氏菌，将大肠杆菌和沙门氏菌的-80℃甘油管放入37℃水浴中溶化，接种到NB培养基中，37℃170r/min培养15小时，菌数稀释到约5×109CFU/mL后取1mL加入到温度为45℃左右的20mL NA培养基中，致病菌浓度约为2.5×108CFU/mL，混匀，快速倒入灭好菌的平板中，待琼脂凝固后，放置牛津杯，每个培养皿放4个，轻轻加压，使牛津杯底部与培养基表面没有缝隙，在牛津杯中加入200μl待试液，在4℃冰箱中扩散4小时，放入培养箱中37℃正置培养24小时，观察抑菌圈大小。
NB培养基组成为蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2±0.2，121℃，20min。
NA培养基组成为蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH 7.2±0.2，121℃，20min。
试验结果见表5。
表5屎肠球菌产酸产细菌素的抑菌性试验结果(平均值)
| 组别 | 大肠杆菌抑菌圈直径(mm) | 沙门氏菌抑菌圈直径(mm) |
| A | 22 | 27 |
| B | 0 | 11 |
| C | 19 | 12 |
| D | 0 | 13 |
| E | 9 | 23 |
| F | 18 | 25 |
| G | 10 | 26 |
| H | 16 | 11 |
本实施例的目的是提供上述菌株的抑菌性能。上清液中加入1mg/mL的蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，37℃温育1小时，目的是酶解上清液中的蛋白质类物质，将以上处理液分为两组，一组用氨水调节pH至7.0，消除酸的影响，另一组不处理，和原始上清液一起做待试液，采用牛津杯法测定抑菌圈的大小。致病菌选择大肠杆菌、沙门氏菌。实验结果显示在该菌上清液中加入蛋白酶K或胰蛋白酶处理，并调节了pH，此时上清液对大肠杆菌的抑菌消失，说明在消除了酸对致病菌的作用后，上清液中对大肠杆菌有抑制作用的是可以被这两类蛋白酶分解的物质；而另外一组加入胃蛋白酶并调节pH后，对大肠杆菌的抑菌性仍然存在，抑菌性能比未加胃蛋白酶的上清液稍微减弱，说明酸在该菌对大肠杆菌的抑菌性中起较小的部分，大部分来源于能被蛋白酶K或胰蛋白酶分解的物质，这种物质就是细菌素，它不能被胃蛋白酶分解，因此可以顺利通过胃部到达动物肠道，发挥抑制大肠杆菌的作用，维护肠道健康。
上清液在调节pH消除了酸的影响后，对大肠杆菌的抑菌性仍然存在，这进一步证实了该菌的菌液中存在蛋白类的抑菌物质——细菌素。
对沙门氏菌起抑菌作用的主要是酸，分别加入3种蛋白酶后，该菌菌液的抑菌圈都没有明显变化，只有pH较低的待试液的抑菌圈较大，说明酸在该菌对沙门氏菌的抑菌作用中起主要作用。
实验例3屎肠球菌的抗药性
本实验例的目的是提供上述菌株的抗药性。将一定浓度的常用兽药阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋、土霉素、金霉素、杆菌肽、盐霉素、莫能霉素、粘菌素、吉他霉素、红霉素、替米考星、维吉尼亚霉素、那西肽、酒石酸泰乐菌素、硫酸安普霉素、新霉素、黄霉素分别添加到MRS培养基中制成平板，将该菌的菌液均匀涂布在平板上，37℃倒置培养48小时，菌落存活率高。
将实验室保存的屎肠球菌EF-sj19于-80℃甘油管放入37℃水浴中溶化，取500μl接种到100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24小时，之后以2％的比例接种到另外一瓶MRS液体培养基中，37℃静置培养24小时，菌数约5.0×106CFU/mL，将菌液稀释至适当浓度，取1mL加入无菌的平皿中，使平皿中的菌落数在30-300之间。将配好的MRS培养基中加入一定浓度的抗生素并混匀，添加抗生素的浓度来源于临床中的应用(饮水或拌料中)，保温在50℃，倒入培养皿中，与菌液混匀，待培养基凝固后，37℃倒置培养48小时。结果如表6。
表6屎肠球菌耐抗生素实验结果
实验例4屎肠球菌的生长曲线测定
将实验室保存的屎肠球菌EF-sj19于-80℃甘油管放入37℃水浴中溶化，取500μl接种到100mL MRS液体培养基中，混匀后静置37℃培养24小时，之后以2％的比例接种到50根每根含有10mLMRS液体培养基的试管中，混匀，37℃静置培养24小时，从第0小时开始每隔2小时取出3只试管，测定每根试管的pH值，取平均值，以时间为横轴，pH值为纵轴，绘制pH值随时间变化图，参照附图1。从图1中可以看出，该株屎肠球菌生长迟滞期短，稳定期长，3小时开始pH快速下降，说明菌数成倍增长，即进入对数生长期，10小时pH几乎不变，即进入稳定期，稳定期可以维持至24小时以后，最终维持在4.0左右。
所述菌株发酵性能显著，菌株活力较高，其生长迟滞期短，接入培养基中即可生长，生长3小时后菌数成倍数增加，即进入对数生长期，生长10小时后菌数几乎不再变化，即进入稳定期，稳定期保持时间长达20小时以上。
实施例1屎肠球菌的不补料发酵
具体的发酵方法，包括如下的步骤：
1、屎肠球菌一级种子液培养：
取屎肠球菌EF-sj19(保藏编号为CGMCC No.18047)平板单菌落4-5个，接种于一级种子培养基中，装液量10mL/试管，37℃静置培养24小时，得到一级种子液；
所述的一级种子液培养基包括葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温800.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5。
2、屎肠球菌二级种子液培养：
将步骤1培养的屎肠球菌一级种子液接种于二级种子培养基中，装液量80mL/250mL，接种量2％，37℃静置培养24小时，得到二级种子液；
所述二级种子液培养基包括葡萄糖2％，糖蜜1％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温800.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5。
3、屎肠球菌液体发酵：
将发酵培养基经灭菌后，通冷却水保温至37℃，接入步骤2中的二级种子液，接种量4％，调节pH至6.5，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.8L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH6.5，发酵16小时后得到发酵液，所述发酵液中活菌数为3.5×108CFU/mL。
其中，发酵培养基包括葡萄糖2％，糖蜜3％，胰蛋白胨2％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温800.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5，培养基配好后121℃20分钟灭菌。
实施例2屎肠球菌的发酵罐补料发酵
具体的发酵方法，包括如下的步骤：
1、屎肠球菌一级种子液培养：
取屎肠球菌EF-sj19(保藏编号为CGMCC No.18047)平板单菌落4-5个，接种于一级种子培养基中，装液量10mL/试管，37℃静置培养24小时，得到一级种子液；
所述的一级种子液培养基包括葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温800.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5。
2、屎肠球菌二级种子液培养：
将步骤1培养的屎肠球菌一级种子液接种于二级种子培养基中，装液量80mL/250mL，接种量2％，37℃静置培养24小时，得到二级种子液；
所述的二级种子液培养基包括葡萄糖2％，糖蜜1％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温80 0.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5。
3、屎肠球菌液体发酵：
发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入步骤2中的二级种子液，接种量4％，调节pH至6.5，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.8L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH6.5。
发酵当pH不再下降时流加葡萄糖和糖蜜的补料培养基，以40mL/h流加，补料培养基的补充体积为200mL，发酵16小时，活菌数5.5×1010CFU/mL。
其中，发酵培养基组成为葡萄糖2％，糖蜜3％，胰蛋白胨2％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温800.1mL％，碳酸钙0.075％，余量为水，pH6.5，培养基配好后121℃，20分钟灭菌。
补料培养基的组成为：葡萄糖10％，糖蜜15％，余量为水。
对比例1屎肠球菌的常规发酵
具体的发酵方法，包括如下的步骤：
1、屎肠球菌一级种子液培养：
取屎肠球菌EF-sj19(保藏编号为CGMCC No.18047)平板单菌落4-5个，接种于一级种子培养基中，装液量10mL/试管，37℃静置培养24小时，得到一级种子液；
所述的一级种子液培养基是MRS培养基，pH6.5。
2、屎肠球菌二级种子液培养：
将步骤1培养的屎肠球菌一级种子液接种于二级种子培养基中，装液量80mL/250mL，接种量2％，37℃静置培养24小时，得到二级种子液；
所述的二级种子液培养基是MRS培养基，pH6.5。
3、屎肠球菌液体发酵：
发酵培养基是MRS培养基，培养基配好后121℃20分钟灭菌，灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入步骤2中的种子液，接种量4％，调节pH至6.5，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.8L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH6.5，发酵16小时，活菌数5.0×106CFU/mL。
参照附图2可以看出实施例1、2以及对比例1中，屎肠球菌的菌体浓度变化趋势对比。
实施例3屎肠球菌菌株菌剂活力性能对比
将不同来源的屎肠球菌菌液进行分组，并进行喷雾干燥，测定菌剂存活率，分组如下：
实验组1：由本发明实施例2制备的屎肠球菌菌液，只添加水溶性淀粉15％(所述百分比为成分占比发酵液的质量浓度百分比m/v)，进行喷雾干燥；
实验组2：由本发明实施例2制备的屎肠球菌菌液，按照脱脂奶粉4％，大豆油0.5％，桃胶0.5％，水溶性淀粉10％(所述百分比为成分占比发酵液的质量浓度百分比m/v)，将保护剂和菌液混合均匀，进行喷雾干燥；
对照组1：选择常规屎肠球菌CCTCC No.M2016297，按照本发明实施例2的发酵方法制备屎肠球菌菌液，只添加水溶性淀粉15％(所述百分比为成分占比发酵液的质量浓度百分比m/v)，进行喷雾干燥；
对照组2：选择常规屎肠球菌CCTCC No.M2016297，按照本发明实施例2的发酵方法制备屎肠球菌菌液，并等比例添加实验组2的保护剂。
将以上四组菌液混合物进行喷雾干燥的工艺条件为：进风温度160℃，出风温度80℃，流速400mL/h。
活菌计数：分别取1g菌粉溶于99mL生理盐水中，200r/min震荡20分钟，活菌计数。
菌体存活率％＝(菌粉活菌数//喷干前总活菌数)×100％。
实验组1：喷雾干燥菌粉活菌数：3.5×109CFU/g，原始菌液活菌数：5.5×1010CFU/g，活菌存活率47％。
实验组2：喷雾干燥菌粉活菌数：7.0×1011CFU/g，原始菌液活菌数：5.5×1010CFU/g，活菌存活率95％。
对照组1：喷雾干燥菌粉活菌数：3.2×104CFU/g，原始菌液活菌数：1.3×105CFU/g，活菌存活率0.3％。
对照组2：喷雾干燥菌粉活菌数：2.2×106CFU/g，原始菌液活菌数：1.3×105CFU/g，活菌存活率8％。
通过实验组1和2的比较可以看出，添加有本发明保护剂的菌剂具有更好的隔热保护作用，在进行高温喷雾干燥后可以显著保护菌株活力。
通过实验组1和对照组1的比较可以看出，在添加相同保护剂的前提下，本发明实验组1的活菌存活率显著高于对照组，由此可以看出，本发明的屎肠球菌具有显著的耐高温性，可以在高温喷雾干燥的过程中仍然保持较好的菌株活力。
实施例4屎肠球菌菌粉的稳定性试验
将实施例3的实验组2和对照组1、对照组2的菌粉平均分成几等份，密封常温保存，每隔一段时间取出一袋进行活菌计数，结果如表7。
表7屎肠球菌菌粉的稳定性试验
实施例5屎肠球菌在母猪方面的临床中试应用
实验动物：选择妊娠母猪135只，栏养，定量采食，自由饮水，共分为3组，每组15只，每组设置三个平行，共计每组45只。
使用方案：日粮中添加混合型饲料添加剂：屎肠球菌菌剂，从母猪妊娠后第70天开始连续应用75天，直到仔猪断奶，仔猪断奶后再继续饲喂母猪10天。菌剂的添加量保持在1011CFU/t日粮，共饲喂85天。
将菌剂进行以下分组：
实验组：来源：本发明实施例3的实验组2制备的菌剂，菌剂的添加量为：1011CFU/t日粮；
对照组：来源：本发明实施例3的对照组2制备的菌剂，菌剂的添加量为：1011CFU/t日粮；
空白对照组：基础日粮。
应用结果：
对于仔猪断奶后再继续饲喂母猪10天的目的是：有利于改善母猪肠道健康，增加免疫力，促进母猪再发情。
使用前：仔猪死亡率较高，母猪有便秘情况，母猪采食量低；使用后：仔猪腹泻降低20％左右，死亡率极低；母猪便秘少，采食增加，精神好；仔猪平均初生窝重、初生个体重以及断奶体重较空白对照组以及对照组显著提高。由此说明本发明制备的屎肠球菌菌剂具有显著的提高母猪抵抗能力、促进代谢和提高其饲料利用率的功能，从而有效改善母猪繁殖能力，提高仔猪质量的作用。
表8日粮组成及营养成分(风干基础)
| 项目 | 空白对照组 | 实验组 | 对照组 |
| 日粮组成/重量份 | |||
| 玉米 | 68.18 | 68.18 | 68.18 |
| 去皮豆粕 | 5.00 | 5.00 | 5.00 |
| 小麦麸 | 19.00 | 19.00 | 19.00 |
| 鱼粉 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 磷酸氢钙 | 1.40 | 1.40 | 1.40 |
| 石粉 | 0.90 | 0.90 | 0.90 |
| 食盐 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 氯化胆碱 | 0.20 | 0.20 | 0.20 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 0.23 | 0.23 | 0.23 |
| 苏氨酸 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 色氨酸 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| 预混料<sup>①</sup> | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 大豆油 | 3.00 | 3.00 | 3.00 |
| 屎肠球菌菌剂 | 0.00 | 10<sup>11</sup>CFU/t | 10<sup>11</sup>CFU/t |
注：①预混料可为每千克全价料提供：维生素A 10000IU，维生素D3 2000IU，维生素E 24IU，维生素K 2mg，维生素B2 6mg，维生素B6 4mg，维生素B1 20.024mg，泛酸20mg，尼克酸30mg，生物素0.4mg，叶酸3.6mg，锌120mg，铁96mg，锰40mg，铜8mg，碘0.56mg，硒0.24mg，乙酰胆碱2mg。
表9对改善母猪繁殖性能的效果评价
| 空白对照组 | 实验组 | 对照组 | |
| 仔猪成活率 | 90％±2％ | 99.5％±0.5％ | 90.5％±1.5％ |
| 仔猪腹泻率 | 35％ | 2％ | 22％ |
| 初生窝重/kg | 13.3±0.1 | 16.38±0.31 | 13.8±0.22 |
| 初生个体重/kg | 1.33±0.01 | 1.72±0.01 | 1.35±0.01 |
| 断奶个体重/kg | 6.03±0.01 | 6.85±0.02 | 6.12±0.01 |
Claims (7)
1.一种屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的保藏编号为CGMCC No.18047，步骤如下：
(1)挑取所述屎肠球菌菌落，接入一级种子培养基中，32-38℃条件下静置培养20-24小时，得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液按照接种量2-4％接入二级种子培养基中，32-38℃条件下静置培养20-24小时，得到二级种子液；
(3)将所述二级种子液按照接种量2-5％接入发酵培养基中，于温度32-38℃，风量0.5-1L/min，转速80-120rpm，pH6.0-7.0，发酵16-20小时；
(4)向所述步骤(3)得到的发酵液中加入保护剂，经喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。
2.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)中，一级种子培养基组成为：葡萄糖1-3％，胰蛋白胨0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
3.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，
所述步骤(2)中，二级种子培养基组成为：葡萄糖1-2％，糖蜜1-2％，胰蛋白胨0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
4.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，
所述发酵培养基组成为：葡萄糖1-4％，糖蜜1-4％，胰蛋白胨1-3％，酵母浸粉1-3％，乙酸钠0.5-1％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，柠檬酸氢二铵0.1-0.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.001-0.005％，吐温80 0.05-0.1％，碳酸钙0.05-0.1％，余量为水，pH6.0-7.0。
5.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，
所述步骤(3)中，在发酵过程中，当发酵至第5-7h时开始流加补料培养基，所述补料培养基体积占发酵培养基体积的5-10％，流加速度为35-45ml/h；所述补料培养基组成为：葡萄糖浓度为10-15％，糖蜜浓度为15-20％，余量为水。
6.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，
所述保护剂组成为：脱脂奶粉3-5％，大豆油0.5-1％，桃胶0.5-1％，水溶性淀粉5-10％。
7.权利要求1～6任一项所述的制备方法得到的屎肠球菌菌剂在制备饲料中的用途。
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