CN113913349A

CN113913349A - 一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法

Info

Publication number: CN113913349A
Application number: CN202111430345.7A
Authority: CN
Inventors: 潘冬梅; 杨传伦; 蔡颖辉; 张心青; 苏士岗; 王红霞; 田杰伟; 李静; 和富明
Original assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Current assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-01-11

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法。该方法所用到的载体为麦饭石‑壳聚糖复合吸附剂，保护剂为谷氨酸钠和乳糖，菌粉水分含量低于1%，利用该方法制备的菌粉含菌量高，常温储藏1年，存活率达到80%以上，解决了屎肠球菌发酵液较难保存的问题。与其他技术相比，具有成本低、易操作、保藏效果突出的特点。

Description

一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法。

背景技术

在传统的养殖过程中，抗生素被大量使用，虽然提高了养殖动物的经济价值，但带来了一定的危害，如细菌耐药性的增强，动物免疫机能下降等。而人类食用大量的“有抗食品”则严重影响着人类的健康，诱导人类抗药性增强，将来一旦患病，将会无药可治。有益肠道微生物，作为抗生素的替代物，则可很好的起到改善的效果，其作为有益因子，可维持肠道菌量平衡，增加动物免疫力。

屎肠球菌属于乳酸菌的一种，是肠道共生菌，对多数抗生素敏感，属于安全菌株。其作用机理如下：(1)分泌抑菌肽，防治病害发生可在动物肠粘膜上生长繁殖，通过分泌细菌素、有机酸等物质来抑制有害菌吸附和增殖，用来调节肠道环境微生态平衡；(2)分泌消化酶，促进饲料转化提高大可分解部分蛋白质成酰胺和氨基酸，提高饲料的吸收转化率；(3)增强细胞免疫可增强巨嗜和单核细胞的活性，促进抗体产生，提高免疫力，降低腹泻率及死亡率；其作为微生态制剂可与其他益生菌复配使用，也可以单独使用，在畜禽养殖和水产养殖中具有广泛用途和发展前景。

该类菌株虽然具有良好的应用前景，但艰难储藏。固体保藏方式可大大延长保藏时间，但大多数厂家产品还是以低温保藏为主，无法实现常温保藏或高温保藏，同时，制备工艺复杂，设备投入成本高，保藏效果不稳定的现象，因此，急需寻找一种价格低廉且保藏效果好的保藏方法。

发明内容

针对现有屎肠球菌的常温保藏技术的不足，本发明提供了一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法。该方法所用到的载体为麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，保护剂为谷氨酸钠和乳糖，菌粉水份含量低于1％，利用该方法制备的菌粉含菌量高，常温储藏1年，存活率达到80％以上，解决了屎肠球菌发酵液较难保存的问题。与其他技术相比，具有成本低、易操作、保藏效果突出的特点。

本发明的技术方案为；

一种屎肠球菌固体保藏用组合物，该组合物包含麦饭石-壳聚糖复合吸附剂、保护剂。所述的保护剂进一步优选为谷氨酸钠、乳糖两者的组合。

其中麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的制备方法为：将麦饭石中有机物等杂质去除并洗至中性，干燥、粉碎至80目以上；将脱乙酰度为85％～95％的壳聚糖溶解于醋酸溶液中；将粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液混合，浸润，烘干，得麦饭石-壳聚糖复合吸附剂。

上述制备方法中，麦饭石中有机物等杂质去除方法优选采用盐酸溶液浸泡过滤去除，采用去离子水将麦饭石洗至中性。

上述制备方法中，所采用的醋酸溶液优选为3％～5％的醋酸溶液，壳聚糖溶液的质量分数优选为0.5％～1％，粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液的质量比优选为1:1～2。

粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液混合，浸润，烘干后优选进一步粉碎研细至150目以上。

上述屎肠球菌固体保藏用组合物的保护剂选择谷氨酸钠、乳糖两者的组合时，两者的比例为1:3～3:1，优选1:1。

利用上述组合物固体保藏屎肠球菌的方法，包括：

(1)屎肠球菌发酵完成的发酵液中加入1％～3％(m/v，g/ml)麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，搅拌吸附10min～30min，在5000rpm条件下离心处理获得离心重液；

(2)在离心重液中加入0.4％～1.5％保护剂，充分混合均匀静置一段时间后，进行干燥处理，然后常温保存。

上述步骤(2)中干燥方式可以为中温干燥，具体的干燥温度可以为40℃～55℃；干燥后含水量低于1％。

麦饭石是一种药用矿石，具多孔结构，有生理活性和良好的吸附、离子交换特性，壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，其大分子链上含有众多氨基和羟基，对金属离子、有机物、蛋白质等具有良好的吸附、絮凝作用。麦饭石-壳聚糖复合吸附剂即壳聚糖分子进入麦饭石内部孔腔,改变了麦饭石的内部结构、撑大了其层间距,增强了麦饭石和壳聚糖单独吸附屎肠球菌菌体的能力。

发明人经过研究发现谷氨酸钠中的-NH2、α-COOH和γ-COOH对微生物起到保护作用，乳糖对屎肠球菌磷脂膜有很强的结合力，在干燥和储藏过程中，麦饭石-壳聚糖复合吸附剂作为一种赋形剂，为干粉提供大量的多孔无定型结构，谷氨酸钠与乳糖增效、协同取代水分子吸附在磷脂、蛋白质、无定型结构表面，与磷脂双分子层相互作用，促进屎肠球菌干粉玻璃态的形成，提高屎肠球菌干粉的回收率；此外谷氨酸钠还具有抗氧化作用，抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，以防止对细胞膜造成不可逆转的破坏，提高屎肠球菌干粉的存活率。

另外，在研究实验中还发现在麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，保护剂为谷氨酸钠、乳糖两者的组合时，保藏效果更佳，其他任意吸附剂与保护剂组合无法获得此效果。

所述的一种提高屎肠球菌存活率的固体保藏方法，干燥方式为中温干燥，干燥温度为40℃～55℃，最终水分含量为低于1％。较低水分，可维持屎肠球菌的休眠状态，延长保藏时间。

本发明的有益效果为：

本发明所采用的固体保藏的组合物种菌种载体为麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，麦饭石、壳聚糖均为天然产物环境友好材料,麦饭石和壳聚糖的内部结构结合增强了其单独吸附屎肠球菌菌体的能力，吸附效率大幅提高。

谷氨酸钠、乳糖与麦饭石-壳聚糖复合吸附剂协同增效提高屎肠球菌干粉的回收率和存活率。

利用本发明公开的发酵培养基和发酵方法及保藏方法可常温下维持较高的菌量和菌活，稳定性很高；且能够在菌体干燥过程中可采用中温干燥，设备工艺要求简单，能够大大节约低温干燥的生产成本和设备投入成本。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

本发明中以下实施例中所采用的屎肠球菌发酵液均为以下方法获得：

(1)种子液的制备：从-20℃去取出菌种后，在MRS培养基中进行一级活化，获得一级种子液，并按5％的比例进行二次转接，获得二级种子液。

(2)上罐发酵：发酵培养基配方为：葡萄糖3％，蔗糖3％，玉米粉2.3％，酵母粉5％，硫酸铵1％，碳酸钙0.1％，乙酸钠0.8％，硫酸锰0.006％。

将发酵培养基置于发酵罐内进行灭菌处理，温度冷却至30℃时，按5％(v/v)进行接种，调节初始pH为6.0，发酵过程中每1h利用氨水调节一次pH，每2h通气5min，通气量1:2。当发酵液pH维持在6.0，停止发酵，作为发酵终点。

获得屎肠球菌发酵液菌量约为9.3×10⁹cfu/mL。

实施例1麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的制备

将麦饭石用1:3(m/v，g/mL)的0.1mol/L HCl溶液浸泡24h,过滤除去有机物等杂质,用去离子水将麦饭石洗至中性,干燥,粉碎至80目。用5％(v/v)的醋酸溶液缓慢溶解脱乙酰度为90％的壳聚糖,配制成0.5％的壳聚糖溶液。将80目麦饭石与壳聚糖溶液按1：1.3质量比混合调成糊状,使之充分浸润，将此糊状物置于烘箱中，加热干燥，研细，过150目筛，即得麦饭石-壳聚糖复合吸附剂。

实施例2麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的制备

将麦饭石用1:3.7(m/v，g/mL)的0.1mol/L HCl溶液浸泡24h,过滤除去有机物等杂质,用去离子水将麦饭石洗至中性,干燥,80目粉碎。用3％(v/v)的醋酸溶液缓慢溶解脱乙酰度为95％的壳聚糖,配制成0.8％的壳聚糖溶液。将80目麦饭石与壳聚糖溶液按1：1质量比混合调成糊状,使之充分浸润，将此糊状物置于烘箱中，加热干燥，研细，过150目筛，即得麦饭石-壳聚糖复合吸附剂。

实施例3麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的制备

将麦饭石用1:4(m/v，g/mL)的0.1mol/L HCl溶液浸泡24h,过滤除去有机物等杂质,用去离子水将麦饭石洗至中性,干燥,80目粉碎。用3.3％(v/v)的醋酸溶液缓慢溶解脱乙酰度为85％的壳聚糖,配制成1％的壳聚糖溶液。将80目麦饭石与壳聚糖溶液按1：2质量比混合调成糊状,使之充分浸润，将此糊状物置于烘箱中，加热干燥，研细，过150目筛，即得麦饭石-壳聚糖复合吸附剂。

实施例4～6

(1)屎肠球菌发酵液中加入实施例1所述的麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，搅拌吸附，在5000rpm条件下离心处理获得离心重液；

(2)在离心重液中加入保护剂，充分混合均匀静置一段时间后，进行40℃～55℃干燥处理至含水量低于1％，然后常温保存。

其他不同参数按照表1实施：

表1实施例参数表

实验例1吸附剂对比试验

采用相同量的屎肠球菌发酵液，对实施例1、2、3制备的麦饭石-壳聚糖复合吸附剂与常规的硅藻土吸附载体进行对比。

具体处理方法为：

处理1：在发酵液中加入质量体积比1％实施例1制备的麦饭石-壳聚糖复合吸附剂5000rpm条件下搅拌吸附20min，离心后按质量体积比0.5％比例在离心重液中加入谷氨酸钠粉末，充分混合均匀，静置1h后进行40℃干燥处理，最终水分含量为0.8％。

处理2：在发酵液中加入质量体积比3％实施例2制备的麦饭石-壳聚糖复合吸附剂5000rpm条件下搅拌吸附30min，离心后按质量体积比0.5％比例在离心重液中加入谷氨酸钠粉末，充分混合均匀，静置1h后进行45℃干燥处理，最终水分含量为0.6％。

处理3：在发酵液中加入质量体积(g/mL)比2％实施例3制备的麦饭石-壳聚糖复合吸附剂5000rpm条件下搅拌吸附10min，离心后按质量体积比0.5％比例在离心重液中加入谷氨酸钠粉末，充分混合均匀，静置1h后进行55℃干燥处理，最终水分含量为0.7％。

处理4：加入质量体积比3％的硅藻土5000rpm条件下搅拌吸附30min，离心后按质量体积比0.5％比例在离心重液中加入谷氨酸钠粉末，充分混合均匀后，静置1h后进行45℃干燥处理，最终水分含量为0.6％。

将制备的菌粉置于54℃进行加速试验，观察吸附载体对存活率的影响。试验结果如表2所示。

表2 54℃加速条件下不同处理对屎肠球菌存活率的变化影响

试验表明，在54℃加速条件下，处理1、2、3作为吸附载体稳定性较好，明显高于处理4的试验处理。说明麦饭石-壳聚糖复合吸附剂作为屎肠球菌的吸附载体菌体活力较强，明显优于常规吸附剂硅藻土。

实验例2保护剂对照实验

按照表3在10组发酵液中分别加入吸附剂进行吸附，离心后按表3中加入相应保护剂，充分混合均匀后，45℃干燥处理至含水量1％。

表3不同保护剂方案

以回收率和保藏效果作为评价指标：固体菌粉回收质量计为M，每克菌粉的菌量为A₁，发酵液菌量为A₂，制备该菌粉发酵液体积为V，回收率＝A₁×M/(A₂×V)；

菌落计数：试验均采用稀释涂布平板法计数，计数平板为加碳酸钙的MRS平板。

保护剂对照实验结果：

(1)不同保护剂干燥难易程度：

谷氨酸钠、酵母蛋白胨、麦芽糊精、乳糖较易干燥，海藻酸钠次之，山梨醇最难干燥。

(2)不同保护剂对菌粉回收率的影响：

表4 45℃条件下不同保护剂对屎肠球菌最终回收率的影响

如表4 45℃条件下不同保护剂对屎肠球菌最终回收率的影响：单种保护剂，处理1(谷氨酸钠)和处理6(乳糖)菌量存活率高最终回收率较高，处理4(麦芽糊精)和处理5(海藻酸钠)菌量存活率低回收效果不好；谷氨酸钠和乳糖同时使用作为保护剂与麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的组合使用，回收效果最佳。

实验例3加速试验菌剂稳定性

将实验例2中制备的各试验组固体菌粉进行等量分装，均放于54℃恒温培养箱中进行恒温培养，在0d、2d、5d、8d、11d、14d进行菌量检测，结果如表5所示。

表5 54℃加速条件下不同处理对屎肠球菌存活率的影响

利用实施例6中麦饭石-壳聚糖复合吸附剂作为屎肠球菌的吸附载体、用谷氨酸钠和乳糖1：1作保护剂制备的菌粉存活率明显高于其它对照组，14d时存活率为82.94％，相当于常温储存条件下1年质保期的菌剂存活率为82.94％，说明本发明的技术方案效果显著。

上述应用例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种屎肠球菌固体保藏用组合物，其特征在于，该组合物包含麦饭石-壳聚糖复合吸附剂、保护剂；所述的保护剂为谷氨酸钠、乳糖两者的组合。

2.根据权利要求1所述的屎肠球菌常温固体保藏用组合物，其特征在于，麦饭石-壳聚糖复合吸附剂的制备方法为：将麦饭石中有机物等杂质去除并洗至中性，干燥、粉碎至80目以上；将脱乙酰度为85%～95%的壳聚糖溶解于醋酸溶液中；将粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液混合，浸润，烘干，得麦饭石-壳聚糖复合吸附剂。

3.根据权利要求2所述的屎肠球菌固体保藏用组合物，其特征在于，麦饭石中有机物等杂质去除方法优选采用盐酸溶液浸泡过滤去除，采用去离子水将麦饭石洗至中性。

4. 根据权利要求2所述的屎肠球菌常温固体保藏用组合物，其特征在于，所采用的醋酸溶液为3%～5%的醋酸溶液，壳聚糖溶液的质量分数为0.5%～1% ，粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液的质量比优选为1:1～2。

5.根据权利要求2所述的屎肠球菌常温固体保藏用组合物，其特征在于，粉碎的麦饭石与壳聚糖溶液混合，浸润，烘干后进一步粉碎研细至150目以上。

6.根据权利要求1所述的屎肠球菌常温固体保藏用组合物，其特征在于，保护剂选择谷氨酸钠、乳糖两者的组合时，两者的比例为1:3～3:1。

7. 根据权利要求1所述的屎肠球菌常温固体保藏用组合物，其特征在于，保护剂选择谷氨酸钠、乳糖两者的组合时，两者的比例为1: 1。

8.利用权利要求1所述的组合物固体保藏屎肠球菌的方法，其特征在于，该步骤包括：

（1）屎肠球菌发酵完成的发酵液中加入1%～3%麦饭石-壳聚糖复合吸附剂，搅拌吸附10min～30min，离心处理获得离心重液；

（2）在离心重液中加入0.4%～1.5%保护剂，充分混合均匀静置一段时间后，进行干燥处理，然后常温保存。

9.根据权利要求7所述的固体保藏屎肠球菌的方法，其特征在于，步骤（2）中干燥方式为中温干燥。

10.根据权利要求7或8所述的固体保藏屎肠球菌的方法，其特征在于，干燥温度为40℃～55℃；干燥后含水量低于1%。