CN104560717A - 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法 - Google Patents

一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104560717A
CN104560717A CN201410775019.3A CN201410775019A CN104560717A CN 104560717 A CN104560717 A CN 104560717A CN 201410775019 A CN201410775019 A CN 201410775019A CN 104560717 A CN104560717 A CN 104560717A
Authority
CN
China
Prior art keywords
freeze
drying
protective material
faecium
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410775019.3A
Other languages
English (en)
Inventor
乔琳
姚宏明
冯媛媛
高长斌
刘蕊
金忠辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Vica Shengbang Biological Technology Co., Ltd.
Original Assignee
BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201410775019.3A priority Critical patent/CN104560717A/zh
Publication of CN104560717A publication Critical patent/CN104560717A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一株饲用屎肠球菌真空冷冻干燥处理的保护剂和冻干制剂的制备方法。利用本发明提供的冻干保护剂及冻干制剂的制备方法，屎肠球菌(Enterococcus？faecium)WEI-10CGMCC？No.7746的高密度发酵液经真空冷冻干燥处理后，冻干菌粉的活菌数最高达到8.2×1011CFU/g，冻干保护率为98％。冻干制剂在-20℃保存一年，活菌损失率低于5％；室温条件保存6个月，活菌损失率低于10％。实现了饲用屎肠球菌高产量、耐贮藏冻干制剂的生产。

Description

一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于饲用屎肠球菌真空冷冻干燥处理的保护剂及冻干制剂的制备方法。
背景技术
真空冷冻干燥是一种实现活性乳酸菌长期保藏的常用的、有效的方法。但是，在冷冻干燥过程中，乳酸菌细胞会受到各种各样的损伤，主要包括冰晶体的形成，细胞膜受到机械破坏，细胞膜渗透压的改变，胞内失水，溶质浓度升高，产生溶质效应，敏感蛋白变性和失活，水分的损失影响到细胞内许多亲水性大分子物质的功能，此外，还会导致细胞内外pH的动态平衡被破坏，甚至出现DNA的损伤，这些损伤必然造成冷冻干燥过程中细胞存活率的损失。为了减少真空冷冻干燥处理对乳酸菌细胞造成的损失，提高冻干存活率，必须采取各种有效的措施对乳酸菌加以保护。
各种保护措施中，最有效的是使用冻干保护剂。通常来说，用于乳酸菌真空冷冻干燥的保护剂主要分为3类：一、可以渗透进入细胞壁和细胞膜的保护剂，称为渗透保护剂(例如一些单糖、二糖和甘油等)；二、只能渗透进入细胞壁，不能进入细胞膜的保护剂，也可以称为半渗透保护剂(例如一些寡糖、氨基酸和低分子聚合物)；三、无法渗透进入细胞壁，或者不能直接和细胞表面作用的保护剂(例如高分子聚合物和多糖等)。不同类型保护剂对细胞产生的保护作用不尽相同：渗透保护剂可以增强细胞膜的可塑性，进入细胞质后易与溶液中的水分发生水合作用，减少细胞过度脱水，降低溶质的毒性作用，减缓冰晶的形成，从细胞内部实现保护作用；半渗透保护剂聚集于细胞膜和细胞壁之间，可以在冷冻前诱导细胞的胞浆分离，而且能够在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲带，阻止冰晶带来的机械伤害，从而保护了细胞膜及内部的结构；非渗透保护剂无法进入细胞内部，只能吸附于细胞表面，形成粘滞层，阻止冰晶的形成速度，从细胞外部实现保护作用。很多报道表明，上述3类保护剂中任何一类保护剂的单独使用都很难实现理想的保护效果，只有将3类保护剂复合使用才能实现理想的保护。除冻干保护剂外，菌悬液的预冻条件、菌泥与保护剂的混合比例、冻干制剂的贮藏条件等因素也会影响到乳酸菌冻干过程的存活率。
目前市售冻干乳酸菌制剂的活菌数大多在2×1011-5×1011CFU/g的范围，极少有超过5×1011CFU/g的水平，而且其中大部分产品属于人用产品，将真空冷冻干燥的方法用于生产饲用乳酸菌活菌制剂的研究和应用都比较少，原因主要是成本较高，冻干制剂的贮藏条件较严格，而且目前该工艺主要用于乳酸杆菌，很少针对乳球菌开发出优良的冻干制剂。因此，开发一种用于饲用乳球菌真空冷冻干燥处理的低成本、高产量、耐贮藏的冻干保护剂和冻干工艺是十分有意义的。
发明内容
(一)发明目的：
本发明针对上述不足，提供了一种用于屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCCNo.7746真空冷冻干燥处理的保护剂和冻干制剂的制备方法，从而减少真空冷冻干燥处理对屎肠球菌带来的损伤，获得低成本、高活菌数、耐贮藏的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂。
(二)技术方案：
本发明的目的通过如下方案获得实现：
1.本发明提供了一种用于屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746真空冷冻干燥的保护剂，其成分及含量(质量百分比)如下：脱脂奶粉5-15％、山梨醇1-3％，甘氨酸0.02-0.2％，低聚半乳糖0.2-2％，麦芽糖0.2-2％，其余成分为蒸馏水。配制方法如下：称取50-150g脱脂奶粉，10-30g山梨醇，2-20g低聚半乳糖和2-20g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取2-20g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用(下同)。
2.本发明提供的保护剂与菌泥的混合比例为：每克菌泥与3-5mL保护剂混合。
3.本发明提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂的制备方法如下：
(1)高密度发酵后的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746经管式离心机在10000-15000rpm条件下离心收集菌体。
(2)将保护剂与收集的菌泥混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min。
(3)采用以下任一预冻方式：其一、将匀浆液直接置于不锈钢托盘中(每盘中匀浆液厚度不高于2厘米)，将托盘于-80℃预冻4-6h；其二、将匀浆液用5毫升枪头逐滴加入盛有液氮的容器中，使之冷冻成为球状，待液氮完全挥发后，将冷冻的球状物转至不锈钢托盘中。
(4)将托盘放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序为：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束。
(5)冻干后的固体菌粉经粉碎后装入样品袋，并于-20℃或常温贮藏。
(三)意义：
本发明提供了一种用于屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746真空冷冻干燥的保护剂及冻干制剂的制备方法。优选的保护剂中脱脂奶粉属于非渗透保护剂，其中的乳蛋白可以在细胞表面形成保护壳，从而稳定细胞膜的组成，防止细胞受到损害；山梨醇作为乳酸菌细胞冻干和贮藏的保护剂可以和细胞膜发生相互作用，阻止膜受到伤害；与胞内蛋白形成复合物，稳定蛋白的结构和功能；山梨醇具有抗氧化性，可以保护细胞脂类免受氧化；甘氨酸和低聚半乳糖属于半渗透保护剂，聚集于细胞膜和细胞壁之间，可以在冷冻前诱导细胞的胞浆分离，而且能够在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲带，阻止冰晶带来的机械伤害，从而保护了细胞膜及内部的结构；麦芽糖具有多个羟基，这些羟基可以与细胞膜上的磷酸连接形成氢键，阻止膜因失水而融合，同时降低相变温度，使细胞不易发生凝胶相变；另外，糖类的羟基还可与胞内蛋白质形成氢键以取代干燥时失去的水分子，保证大分子蛋白质失水后仍维持天然结构和功能。应用本发明提供的保护剂及冷冻干燥工艺获得的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂存活率最高达到98％，活菌数最高达到8.2×1011CFU/g，远远高于国内市场上屎肠球菌冻干制剂的活菌数含量(5×1011CFU/g)。此外，应用本发明获得的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂贮减期长，-20℃保存一年，活菌损失率低于5％；室温条件保存6个月，活菌损失率低于10％，可以满足市场推广的需要。
附图说明
图1为脱脂奶粉和低聚半乳糖交互作用的响应曲面图。
图2为脱脂奶粉和低聚半乳糖交互作用的平面图。
图3为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746的发酵离心菌泥与保护剂不同比例混合对冻干效果的影响。
图4为不同预冻条件对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干效果的影响。
图5为不同冻干程序对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干效果的影响。
具体实施方式
下列具体实施例可以更好地说明本发明，但本发明的应用范围并不仅限于以下实施例。
实施例一、保护剂成分的单因素优化实验
1、保护剂成分的选择及配制：
分别配制浓度为7％的脱脂奶粉溶液，1％的麦芽糊精、低聚半乳糖、蔗糖、乳糖、、海藻糖、麦芽糖和甘油溶液，0.1％的谷氨酸钠、甘氨酸和赖氨酸溶液，2％的山梨醇和甘露醇溶液，灭菌后进行单因素试验(其中氨基酸类保护剂过滤除菌，其余保护剂灭菌条件为115℃，20min)。
2、菌泥的收集：
高密度发酵的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746发酵液经管式离心机在10000-15000rpm下离心收集菌泥，离心速率控制在40-60L/h。
3、分别取30mL已灭菌的上述保护剂溶液与6g屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCC No.7746菌泥混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min，获得菌悬液。
4、将菌悬液置于不锈钢托盘中，-80℃预冻5h后放入冻干机中于-40℃进行真空冷冻干燥，冻干时间为44h。
5、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，与发酵液活菌数相比较，计算存活率。
存活率＝(单位冻干菌粉活菌数×冻干菌粉总重量)/(单位发酵液活菌数×发酵液总体积)
6、结果分析：脱脂奶粉、山梨醇、甘氨酸、低聚半乳糖和麦芽糖作为保护剂时，细胞的存活率达到50％-70％，而其它保护剂的存活率则低于45％(表1)。所以选择以上五种成分做进一步优化。
表1.屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干保护剂单因素优化实验
实施例二、保护剂成分的响应面优化实验
响应面试验设计可以整合试验结果中多因素间的相互作用，借助统计软件拟合二次函数模型方程，寻求最佳的优化方案。以5个显著影响因子浓度为自变量，存活率为响应值，采用Box-Behnken设计法设计5因素3水平的46组试验。根据单因素试验结果，5个因素的编码水平见表2。5因素3水平46组的Box-Behnken试验设计及结果见表3，其中40组试验为析因点，其余6组试验为零点，自变量取中心点，用于估计试验误差。菌泥的收集、与不同保护剂混合，预冻、冻干等过程与实施例一相同；配制保护剂时，凡是有甘氨酸的保护剂，均先溶解其它组分，115℃灭菌20min，甘氨酸通过过滤灭菌后加入已灭菌的复合保护剂溶液中。
表2.Box-Behnken试验因素水平表
表3.Box-Behnken试验设计及结果
对Box-Behnken试验结果进行二次多项回归拟合，得到回归方程：Y＝-1.06100+0.083881X1+0.33304X2+8.74250X3+0.67308X4+0.70892X5+0.013143X1X2+0.011429X1X3+0.032000X1X4+5.71429E-003X1X5+0.36000X2X3+0.024000X2X4+0.034000X2X5-0.040000X3X4+0.48000X3X5+0.17600X4X5-9.70068E-003X1 2-0.12117X2 2-45.80000X3 2-0.52467X4 2-0.47933X5 2，其中，Y为存活率预测响应值。
对二次多项回归拟合方程进行方差分析(表4)可知：二次回归模型极显著(P＜0.001)。失拟项不显著，说明模型与试验不相符的概率较低，模型可信。模型相关系数R2＝0.9238，说明预测值与真实值之间有良好的拟合度，信噪比为11.396(＞4)，模型可用于预测。
分析模型一次项、二次项、交互项可知：一次项X1(脱脂奶粉)、X2(山梨醇)、X3(甘氨酸)、X4(低聚半乳糖)和X5(麦芽糖)对存活率影响极其显著(P＜0.01)；二次项X1 2、X2 2、X3 2、X4 2和X5 2对存活率影响极其显著(P＜0.01)；交互项中，X1X4对存活率影响显著(P＜0.05)，X1X2、X1X3、X1X5、X2X3、X2X4、X2X5、X3X4X3X5、X4X5对存活率影响不显著(P＞0.05)，说明脱脂奶粉与低聚半乳糖对存活率的影响产生交互作用，而其它因素对存活率的影响不会产生交互作用。
表4.Box-Behnken试验设计的回归及方差分析
固定5因素之一在中心点，根据上述拟合方程做另外4因素对存活率的响应曲面图。由图1可见，脱脂奶粉与低聚半乳糖交互作用对存活率影响的响应曲面坡度均较陡，说明脱脂奶粉与低聚半乳糖对存活率影响显著；由图2的脱脂奶粉与低聚半乳糖的交互作用的平面图，可直接看出这两个因素间的互作效应。其它因素交互作用对存活率的影响不显著，响应曲面图略。
响应曲面图均有最高点，根据拟合方程存在极值的必要条件，即Y分别对X1，X2，X3，X4，X5偏导为零，对拟合出的二次方程求导，得出方程组，解方程组得出5个解：X1＝7.44，X2＝2.36，X3＝0.12，X4＝1.04，X5＝1.04，即脱脂奶粉7.44％，山梨醇2.36％，甘氨酸0.12％，低聚半乳糖1.04％，麦芽糖1.04％。预测最大存活率为90.128％。
为了验证上述优化结果的可靠性，根据筛选出的最佳冻干保护剂，进行了两次平行实验，冻干菌粉的存活率分别为90.42％和90.14％。实验值和理论值基本一致，说明上述优化方法具有较好的实用性和可靠性。
综上，优化出的最佳保护剂配方为：脱脂奶粉7.44％，山梨醇2.36％，甘氨酸0.12％，低聚半乳糖1.04％，麦芽糖1.04％。
实施例三、保护剂与菌泥不同混合比例对冻干效果的影响
1、按照最佳保护剂配方，将发酵后收集的菌泥与保护剂分别按照1∶1、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20的比例(W/V)混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min。
2、分别取36g菌悬液置于不锈钢托盘上，-80℃预冻5h后放入冻干机中于-40℃进行真空冷冻干燥，冻干时间为44h。
3、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，按照实施例一的方法计算存活率。
4、结果分析：由图3的结果可知，当菌泥与保护剂的比例为1∶3和1∶5时，可以获得90％左右的存活率，高于其它混合比例。
实施例四、不同预冻方式对冻干效果的影响
1、按照最佳保护剂配方，分别取36g制好的菌悬液(菌泥与保护剂比例为1∶5)置于不锈钢托盘中，分别在-20℃、-50℃、-80℃预冻5h；此外，再取36g制好的菌悬液用5毫升枪头逐滴加入盛有液氮的容器中，使之迅速冷冻成为球状，置于不锈钢托盘中。
2、将以上四种预冻方式获得的样品放入冻干机中于-40℃进行真空冷冻干燥，冻干时间为44h。
3、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，按照实施例一的方法计算存活率。
4、结果分析：液氮预冻方式对细胞的保护作用最好，存活率达95.2％；而-80℃预冻更利于生产，且存活率达到90.6％(见图4)。因此，选择液氮预冻和-80℃预冻两种预冻方式预冻菌悬液。
实施例五、不同冻干程序对冻干效果的影响
1、按照最佳保护剂配方，将制好的菌悬液(菌泥与保护剂比例为1∶5)平均分成5份，每份36g。
2、将上述5份样品分别置于不锈钢托盘上，-80℃预冻5h后放入冻干机中，分别选用以下五种程序进行冻干：
a、-20℃冻干44h。
b、-40℃冻干44h。
c、-40℃条件下3h，之后每隔3h升高5℃，并在相应条件下保持3h，直至最后温度升高至25℃(确认一下该程序是否为44h)，并在25℃下保持5h，共计44h。
d、-40℃条件下2h，之后每隔2h升高3℃，并在相应条件下保持2h，直至最后温度升高至23℃(确认一下该程序是否为44h)，并在23℃下保持2h，共计44h。
e、-40℃条件下5h，之后每隔5h升高8℃，并在相应条件下保持5h，直至最后温度升高至24℃(确认一下该程序是否为44h)，并在24℃下保持4h，共计44h。
3、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，按照实施例一的方法计算存活率。
4、结果分析：采用渐进变温冻干的方法，效果明显好于恒温冻干的方式。而在变温冻干方式中，又以+5℃/3h即程序c的方法获得的菌粉的存活率最高，达到95.8％(见图5)。
实施例六、屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂的制备
1、保护剂的成分、含量及配制方法：称取74.4g脱脂奶粉，23.6g山梨醇，10.4g低聚半乳糖和10.4g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取12g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用。
2、将高密度发酵的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746发酵液转移至管式离心机中，在10000-15000rpm条件下离心收集菌体，离心速率控制在40-60L/h。
3、离心后的菌泥称重后与保护剂按照1∶5的质量体积比混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min，获得菌悬液。
4、将菌悬液直接置于不锈钢托盘中(每盘中匀浆液厚度不高于2厘米)，-80℃预冻5h后放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序如下：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束。
5、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，按照实施例一的方法计算存活率，并装入样品袋保存。
6、结果分析：冻干后的样品色泽乳白，粉碎后粒度均一，流动性好，存活率达到96％，活菌检测结果为7.5×1011CFU/g，远高于市售的其它乳酸菌冻干菌粉。
实施例七、屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂的制备
1、保护剂的成分、含量及配制方法：称取74.4g脱脂奶粉，23.6g山梨醇，10.4g低聚半乳糖和10.4g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取12g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用。
2、将高密度发酵的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746发酵液转移至管式离心机中，在10000-15000rpm条件下离心收集菌体，离心速率控制在40-60L/h。
3、离心后的菌泥称重后与保护剂按照1∶5的质量体积比混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min，获得菌悬液。
4、将菌悬液用5毫升枪头逐滴加入盛有液氮的容器中，使之冷冻成为球状，待液氮完全挥发后，将冷冻的球状物转至不锈钢托盘中，放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序如下：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束。
5、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，按照实施例一的方法计算存活率，并装入样品袋保存。
6、结果分析：冻干后的样品色泽乳白，粉碎后粒度均一，流动性好，存活率达到98％，活菌检测结果为8.2×1011CFU/g，为目前已知市售产品中最高。
实施例八、屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂的贮藏实验：
1、保护剂的成分、含量及配制方法：称取74.4g脱脂奶粉，23.6g山梨醇，10.4g低聚半乳糖和10.4g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取12g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用。
2、将高密度发酵的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746发酵液转移至管式离心机中，在10000-15000rpm条件下离心收集菌体，离心速率控制在40-60L/h。
3、离心后的菌泥称重后与保护剂按照1∶5的质量体积比混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min，获得菌悬液。
4、将菌悬液直接置于不锈钢托盘中(每盘中匀浆液厚度不高于2厘米)，-80℃预冻5h后放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序如下：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束。
5、冻干后的固体粉碎后进行活菌计数，平均分成六份，分别装入样品袋中，其中3袋于室温保存，另外3袋于-20℃保存，每隔1个月测定活菌数。
6、结果分析：冻干菌粉-20℃保存一年，活菌损失率低于5％；室温条件保存6个月，活菌损失率低于10％。

Claims (5)

1.一种用于饲用屎肠球菌真空冷冻干燥的保护剂，所述饲用屎肠球菌为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCC No.7746，所述保护剂的主要成分及含量(质量百分比)如下：脱脂奶粉5-15％，山梨醇1-3％，甘氨酸0.02-0.2％，低聚半乳糖0.2-2％，麦芽糖0.2-2％，其余成分为蒸馏水。
2.权利要求1所述的保护剂，其特征在于配制方法如下：
称取50-150g脱脂奶粉，10-30g山梨醇，2-20g低聚半乳糖和2-20g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取2-20g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用。
3.权利要求1所述的保护剂，其特征在于保护剂与菌泥的混合比例为：每克菌泥加入3-5mL保护剂。
4.权利要求1-3所述的保护剂用于制备屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCCNo.7746冻干制剂的方法，其特征在于主要步骤如下：
(1)高密度发酵后的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCC No.7746经管式离心机在10000-15000rpm条件下离心收集菌体；
(2)将保护剂与菌泥混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min；
(3)将匀浆液置于不锈钢托盘中(每盘中匀浆液厚度不高于2厘米)，-80℃预冻4-6h后放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序如下：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束；
(4)冻干后的固体粉碎后装入样品袋保存，并于-20℃或常温贮藏。
5.权利要求1-3所述的保护剂用于制备屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCCNo.7746冻干制剂的方法，其特征在于主要步骤如下：
(1)高密度发酵后的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10CGMCC No.7746经管式离心机在10000-15000rpm条件下离心收集菌体；
(2)将保护剂与菌泥混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min；
(3)将匀浆液用5毫升枪头逐滴滴加入盛有液氮的容器中，使之冷冻成为球状，待液氮完全挥发后，将冷冻的球状物转至不锈钢托盘中，放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序如下：-40℃条件下3h，之后每隔3h温度升高5℃，并在该温度下维持3h，直至温度升至25℃，在25℃条件下保持5h后冻干结束；
(4)冻干后的固体粉碎后装入样品袋保存，并于-20℃或常温贮藏。
CN201410775019.3A 2014-12-15 2014-12-15 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法 Pending CN104560717A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410775019.3A CN104560717A (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410775019.3A CN104560717A (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104560717A true CN104560717A (zh) 2015-04-29

Family

ID=53077799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410775019.3A Pending CN104560717A (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104560717A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002091A (zh) * 2015-08-25 2015-10-28 中农颖泰林州生物科园有限公司 一种屎肠球菌喷雾干燥保护剂及喷雾干燥方法
CN112725183A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 杭州娃哈哈科技有限公司 一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法
CN113913349A (zh) * 2021-11-29 2022-01-11 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法
CN116574611A (zh) * 2023-04-26 2023-08-11 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981116A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株屎肠球菌的培养方法及应用
CN103981117A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其培养方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981116A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株屎肠球菌的培养方法及应用
CN103981117A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其培养方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡曼: "两歧双歧杆菌培养及冻干保护剂的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002091A (zh) * 2015-08-25 2015-10-28 中农颖泰林州生物科园有限公司 一种屎肠球菌喷雾干燥保护剂及喷雾干燥方法
CN112725183A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 杭州娃哈哈科技有限公司 一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法
CN112725183B (zh) * 2020-12-30 2023-04-28 杭州娃哈哈科技有限公司 一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法
CN113913349A (zh) * 2021-11-29 2022-01-11 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种屎肠球菌固体保藏用组合物及保藏方法
CN116574611A (zh) * 2023-04-26 2023-08-11 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法
CN116574611B (zh) * 2023-04-26 2023-10-13 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Champagne et al. Effect of polymers and storage temperature on the stability of freeze-dried lactic acid bacteria
CN104560717A (zh) 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法
Jalali et al. Stability evaluation of freeze-dried Lactobacillus paracasei subsp. tolerance and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in oral capsules
BR112013033565B1 (pt) Composição seca, pó para recém-nascido, fórmula, leite, produto alimentício ou suplemento dietético
CN101893639B (zh) 稳定质控血清α-羟丁酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性的方法
CN105420111A (zh) 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法
CN105483007A (zh) 植物乳杆菌固定化制剂
CN105105146A (zh) 一种益生菌的活性保持方法及其在固态脂质食品中的应用
WO2020210431A1 (en) Methods and systems for stabilization and preservation of microbes
CN106754525A (zh) 冻干保护剂、副干酪乳杆菌n1115冻干粉发酵剂及其制备方法
Ahmad et al. Optimization of dehydration of lactobacillus salivarius using radiant energy vacuum
Papavasiliou et al. Production of freeze-dried kefir culture using whey
CN108998437A (zh) 一种纳豆激酶液态发酵方法
CN102260635A (zh) 一种冷冻干燥保护剂、制备方法及其应用
CN111286469B (zh) 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法
CN109055227B (zh) 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法
CN106754374A (zh) 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法
CN108546647A (zh) 一种双歧杆菌冻干制剂及其专用保护剂
CN105483008A (zh) 植物乳杆菌固定化制剂制备方法
Pyar et al. Effect of cryoprotective agents on survival and stability of Lactobacillus acidophilus cultured in food‐grade medium
Aschenbrenner et al. The Contribution of the Inherent Restricted Mobility of Glassy Sugar Matrices to the Overall Stability of Freeze-Dried Bacteria Determined by Low-Resolution Solid-State 1 H-NMR
Qi et al. Response surface optimization of lyoprotectant from amino acids and salts for bifidobacterium bifidum during vacuum freeze-drying
KR102364057B1 (ko) 커피부산물을 이용한 신규 미생물 동결 보호소재 활용 방법
You et al. Optimization of Protective Agents and Freeze-Drying Conditions for Lactobacillus casei LT-L614
CN104498360A (zh) 一种副干酪乳杆菌活菌制剂常温真空干燥保护剂及其应用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: BEIJING VICA SHENGBANG BIOLOG TECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20150910

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150910

Address after: 100085 Beijing city Haidian District Third Street No. 9 Jiahua building D block 803

Applicant after: Beijing Vicaren Biological Technology Co., Ltd.

Applicant after: Beijing Vica Shengbang Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 100085 Beijing city Haidian District Third Street No. 9 D803

Applicant before: Beijing Vicaren Biological Technology Co., Ltd.

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 100085 Beijing city Haidian District Third Street No. 9 Jiahua building D block 803

Applicant after: Beijing WIK biotechnology Limited by Share Ltd

Applicant after: Beijing Vica Shengbang Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 100085 Beijing city Haidian District Third Street No. 9 Jiahua building D block 803

Applicant before: Beijing Vica Group Co., Ltd.

Applicant before: Beijing Vica Shengbang Biological Technology Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150429