CN113599369B - 一种抗氧化应激纳米试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种抗氧化应激纳米试剂及其制备方法和应用，该方法包括：制备二硒酸溶液、N‑羟基琥珀酰亚胺溶液和1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液并混合；将蛋白溶液加入到上述溶液中混合，然后加入缓冲液，再加入虾青素溶液，混合搅拌20‑24h。该方法简单、易于操作、且产量和产率均较高，可大批生产；虾青素被紧紧地包裹在亲水性的二硒酸和蛋白形成的空腔结构中，提高了虾青素在水性、脂性溶剂中的溶解度、稳定性、和生物安全性以及载药量，提高了可治疗剂量和生物利用率；该纳米试剂同时具备靶向炎症部位、药物释放可控性、双重抗氧化的优势，极大地提高了抗炎的效率，可减轻临床抗生素的滥用，提高炎症治愈率且降低复发率。

Description

一种抗氧化应激纳米试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗氧化应激纳米试剂及其制备方法和应用，属于生物医学纳米材料领域。
背景技术
解除病因，对症治疗，控制感染是目前临床上炎症治疗的主要原则。目前，使用抗生素是最重要和最主要的治疗方式。长期不当使用抗生素会影响患者疾病的治疗。近年来，炎症免疫微环境中的氧自由基的破坏机制，引起了越来越多的关注。通常，在急性炎症反应期间，活化的吞噬细胞，如粒细胞和巨噬细胞会产生一定量的氧自由基，来杀死病原体或消化外来颗粒，起到保护作用。但当炎症不可控，持续的氧化应激、会导致持续的氧自由基释放，这些活性物种会与蛋白质、核酸和脂质等发生反应，造成不可逆的组织和器官损伤，炎症的迁移。因此，从尝试清除氧自由基，解除氧化应激破坏入手，寻找一种理想的抗炎、抗氧化剂进行治疗。
虾青素(AST)，一种生物来源性的物质，因其优越的抗炎抗氧化特性和无毒性，吸引大家的关注。虾青素在我们熟知的海藻、虾蟹鱼、甚至动物的羽毛中均存在。其分子结构式中的13个不饱和双键决定了其优良的抗氧化作用。虾青素在抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗癌、神经保护和免疫调节作用等药物作用已逐渐被证实。
但是，天然虾青素具有稳定性差，不溶于水，溶解度小等缺点，因此生物利用度低，应用有限，不利于治疗炎症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性高、溶解度好且具有双重抗氧化的抗氧化应激纳米试剂及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗氧化应激纳米试剂的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将二硒酸溶解于二甲基亚砜中形成浓度为30-50mg/mL的二硒酸溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中形成30-50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于二甲基亚砜中形成30-50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液；
S2、将所述二硒酸溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液混合搅拌1-5h，得到溶液A，其中，所述二硒酸、所述N-羟基琥珀酰亚胺、和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量比为1：1-3：1-3；
S3、将蛋白溶解于缓冲液中形成蛋白溶液；在氮气保护、避光条件下，将虾青素溶解于二甲基亚砜得到虾青素溶液；
S4、在避光条件下，将所述蛋白溶液加入到所述溶液A中混合搅拌0.5-2h，其中，所述蛋白和所述二硒酸的物质的量比为1：10-20，加入缓冲液继续搅拌，搅拌5-20min后，再向反应体系中加入所述虾青素溶液，其中，所述虾青素和所述二硒酸的物质的量比为1：1-3，混合搅拌20-24h；
S5、将整个反应体系进行透析和离心分离，得到抗氧化应激纳米试剂。
进一步地，所述蛋白为脱铁转铁蛋白或牛血清白蛋白。
进一步地，所述蛋白溶液的浓度为1-5mg/mL；所述虾青素溶液的浓度为 0.5-1mg/mL。
进一步地，在所述步骤S2中，所述溶液A在室温下制备得到，所述搅拌速度为500-800rpm。
进一步地，所述二硒酸为基于3、3-二苯二烷基二丙酸活化的二硒酸，所述二硒酸的制备方法为：将硒粉(3mmol/mL)和硼氢化钠(6mmol/mL)混合在水中，得到无色溶液；然后再加入硒粉(3mmol/mL)，加热至105℃，反应20min，直到溶液变成红褐色，得到溶液B；配制3-氯丙酸水溶液(浓度为4mmol/mL)，并调节pH至8.0，在氮气保护和室温下保持过夜，得到溶液C；将所述溶液B 和溶液C混合搅拌4h，并暴露在大气中，然后灭菌，得到产物；调节所述产物的上清液的pH至3-4，并用乙酸乙酯提取有机层；将得到的有机层用水洗涤、干燥、灭菌、再结晶，得到二硒酸。
进一步地，将得到的所述抗氧化应激纳米试剂在避光、氮气保护的条件下保存。
进一步地，将得到的所述抗氧化应激纳米试剂先在-80℃冷冻，再使用真空冻干机冻干，然后在避光、氮气保护，-20℃条件下长久保存。
进一步地，在所述步骤S5中，将整个反应体系进行透析和离心分离的具体步骤为：整个反应体系转移至截留分子量为3500的透析袋中，透析4-8h；用超滤管进行离心，转速为3000-5000rpm、时长为5-10min，去除沉淀，吸取上清液。
本发明还提供一种如上所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法制备得到的抗氧化应激纳米试剂。
本发明的有益效果在于：抗氧化应激纳米试剂的制备方法简单、易于操作、且产量和产率均较高，可大批生产；将虾青素包裹在亲水性的蛋白中，通过将二硒酸与蛋白紧密交联，形成一个亲水的空腔结构，在缓慢的交联的过程，虾青素被紧紧地包裹在亲水性的空腔结构中，提高了虾青素在水性、脂性溶剂中的溶解度、稳定性、和生物安全性以及载药量，提高了可治疗剂量和生物利用率；该纳米试剂同时具备靶向炎症部位、药物释放可控性、双重抗氧化的优势，极大地提高了抗炎的效率，可减轻临床抗生素的滥用，提高炎症治愈率且降低复发率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为实施例一制备得到的纳米颗粒的电镜图；
图2为实施例一制备得到的纳米试剂的氧化应激响应性能示意图；
图3为实施例一制备得到的纳米试剂清除自由基RNS(-DPPH·)的能力示意图；
图4为实施例一制备得到的纳米试剂清除自由基ROS(-OH·)的能力示意图；
图5为实施例一制备得到的纳米试剂对正常细胞3T3的毒性作用示意图；
图6为实施例一制备得到的纳米试剂对免疫细胞巨噬细胞的毒性作用示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供一种抗氧化应激纳米试剂的制备方法，该制备方法包括：
S1、将二硒酸溶解于有机溶剂中形成浓度为30-50mg/mL的二硒酸溶液；将 N-羟基琥珀酰亚胺溶解于有机溶剂中形成30-50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于有机溶剂中形成 30-50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液；
S2、将二硒酸溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液混合搅拌1-5h，得到溶液A，其中，二硒酸、N-羟基琥珀酰亚胺、和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量比为1： 1-3：1-3；
S3、将蛋白溶解于缓冲液中形成蛋白溶液；在氮气保护、避光条件下，将虾青素溶解于有机溶剂得到虾青素溶液；
S4、在避光条件下，将蛋白溶液加入到溶液A中混合搅拌0.5-2h，其中，蛋白和二硒酸的物质的量比为：1：10-20，加入缓冲液继续搅拌，搅拌5-20min后，再向反应体系中加入虾青素溶液，其中虾青素和二硒酸的物质的量比为：1：1-3，混合搅拌20-24h；
S5、将整个反应体系进行透析和离心分离，得到抗氧化应激纳米试剂。
其中，蛋白为脱铁转铁蛋白(AFT)，但不仅限于此，蛋白还可以为牛血清白蛋白等水溶性的蛋白质或多肽，在此不做具体限定。脱铁转铁蛋白具有靶向中性粒细胞的功能。
有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。但不仅限于此，有机溶剂还可以为四氢呋喃或乙醇，在此不一一列举。
溶液A中，二硒酸、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的物质的量比为1:1-3:1-3，从而更好地发生脱水缩合反应。
蛋白溶液的浓度为1-5mg/mL；虾青素溶液的浓度为0.5-1mg/mL。
在步骤S2中，溶液A在室温下制备得到，搅拌速度为500-800rpm。搅拌可使用磁力搅拌，在不仅限于此，还可以使用其他搅拌方式，在此不一一列举。
在步骤S1中，二硒酸的制备方法为：将硒粉(3mmol/m)和硼氢化钠 (6mmol/mL)混合在水中，得到无色溶液；然后再加入硒粉(3mmol/mL)，加热至105℃，反应20min，直到溶液变成红褐色，得到溶液B；配制3-氯丙酸水溶液(浓度为4mmol/mL)，并调节pH至8.0，在氮气保护和室温下保持过夜，得到溶液C；将溶液B和溶液C混合搅拌4h，并暴露在大气中，然后灭菌，得到产物；调节产物的上清液的pH至3-4，并用乙酸乙酯提取有机层；将得到的有机层用水洗涤、干燥、灭菌、再结晶，得到二硒酸。
在步骤S5中，将整个反应体系进行透析和离心分离的具体步骤为：整个反应体系转移至截留分子量为3500的透析袋中，透析4-8h；用超滤管进行离心，转速为3000-5000rpm、时长为5-10min，去除沉淀，吸取上清液。
将得到的抗氧化应激纳米试剂在避光、氮气保护的条件下保存，从而避免虾青素在光照条件下分解。
若需要将该纳米试剂长期保存，则需要将得到的抗氧化应激纳米试剂先在 -80℃冷冻，再使用真空冻干机冻干，然后在避光、氮气保护，-20℃条件下长久保存。
二硒酸为基于3、3-二苯二烷基二丙酸活化的二硒酸(DSeDPA)，二硒酸中的二硒键的键能较低，能够被炎症微环境中释放的自由基诱导断裂，具有氧化应激响应性特点。
该制备方法简单、易于操作、且产量和产率均较高，可大批生产。
通过水溶性的蛋白包裹虾青素，虾青素具有疏水性，通过亲疏水作用，将疏水的虾青素包裹在亲水的蛋白中，从而提高虾青素在水性、脂性溶剂中的溶解度、以及稳定性和生物安全性。
具体的，通过合理控制反应体系中N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的比例，即控制-NHS与-NH2的比例，使其充分发挥脱水缩合反应，将二硒酸与蛋白紧密交联在一起，形成一个亲水的空腔结构。二硒酸与蛋白的交联是一个缓慢的过程，在这一过程中，加入疏水的虾青素，在亲疏水作用下，亲水的蛋白将疏水的虾青素包裹在空腔结构中，同时交联愈加紧密，空腔结构不断缩小，将虾青素紧紧地包裹在其中，从而提高了虾青素的负载量，即提高了载药量，提高了可治疗剂量和虾青素的生物利用率。反应一定时间后，可形成大小均一的纳米颗粒。在虾青素外周包上一层亲水性的壳，增加了水溶性、稳定性，并维持抗氧化能力。
该制备方法得到的纳米颗粒可作为抗氧化应激纳米试剂，还具有双重抗氧化的作用，包括虾青素抗氧化、二硒键抗氧化，进一步增强了该试剂的抗炎和抗氧化能力。同时，因脱铁转铁蛋白具有靶向中性粒细胞的功能，从而，该抗氧化应激纳米试剂在免疫微环境中靶向能够释放的自由基的中性粒细胞，直接作用于中性粒细胞，抑制自由基的释放，具有靶向炎症微环境能力。
即，该纳米试剂同时具备靶向炎症部位、药物释放可控性、双重抗氧化的优势，极大地提高了抗炎的效率，可减轻临床抗生素的滥用，提高炎症治愈率且降低复发率。
下面以具体实施例对上述制备方法进行详细说明：
实施例一
步骤一、将2.37g硒粉和2.27g硼氢化钠混合在10mL水中，得到无色溶液；然后再加入2.37g硒粉，加热至105℃，反应20min，直到溶液变成红褐色，得到溶液B；配制3-氯丙酸水溶液(6.50g，浓度为4mmol/mL，15mL水)，并调节pH至8.0，在氮气保护和室温下保持过夜，得到溶液C；将溶液B和溶液C 混合搅拌4h，并暴露在大气中，然后灭菌，得到产物；调节产物的黄色上清液的pH至3-4，并用乙酸乙酯提取有机层；将得到的有机层用水洗涤、用无水硫酸镁干燥、灭菌、用乙酸乙酯再结晶，得到6.00g二硒酸。
步骤二、将二硒酸溶解于二甲基亚砜中形成浓度为40mg/mL的二硒酸溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中形成40mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于二甲基亚砜中形成 40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液；
步骤三、将二硒酸溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液混合搅拌1-5h，得到溶液A，其中，二硒酸溶液、 N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积分别为10.8μL，12.3μL，20.5μL；
步骤四、将牛血清白蛋白(BSA)溶解于缓冲液中形成蛋白溶液，其中，牛血清白蛋白溶液的浓度为2mg/mL；在氮气保护、避光条件下，将虾青素溶解于二甲基亚砜得到浓度为1mg/mL的虾青素溶液；
步骤五、在避光条件下，将5mL的蛋白溶液加入到溶液A中混合搅拌0.5h，然后加入5mLPBS缓冲液，混合搅拌5min，再向反应体系中加入1mL的虾青素溶液，混合搅拌24h；
步骤六、整个反应体系转移至截留分子量为3500的透析袋中，透析4-8h，且每一小时换一次透析液，并不时晃动透析袋使其充分透析；收集透析后的液体进行离心，转速为3000rpm、时长为10min，去除沉淀，吸取上清液得到抗氧化应激纳米试剂，并在避光、氮气保护的条件下保存。
步骤七、将得到的抗氧化应激纳米试剂先在-80℃冷冻，再使用真空冻干机冻干，然后在避光、氮气保护，-20℃条件下长久保存。
实施例二
步骤一、将2.37g硒粉和2.27g硼氢化钠混合在10mL水中，得到无色溶液；然后再加入2.37g硒粉，加热至105℃，反应20min，直到溶液变成红褐色，得到溶液B；配制3-氯丙酸水溶液(6.50g，浓度为4mmol/mL，15mL水)，并调节pH至8.0，在氮气保护和室温下保持过夜，得到溶液C；将溶液B和溶液C 混合搅拌4h，并暴露在大气中，然后灭菌，得到产物；调节产物的黄色上清液的pH至3-4，并用乙酸乙酯提取有机层；将得到的有机层用水洗涤、用无水硫酸镁干燥、灭菌、用乙酸乙酯再结晶，得到6.00g二硒酸。
步骤二、将二硒酸溶解于二甲基亚砜中形成浓度为40mg/mL的二硒酸溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中形成40mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于二甲基亚砜中形成 40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液；
步骤三、将二硒酸溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液混合搅拌1-5h，得到溶液A，其中，二硒酸溶液、 N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积为10.8μL，12.3μL，20.5μL；
步骤四、将脱铁转铁蛋白(AFT)溶解于缓冲液中形成蛋白溶液，其中，脱铁转铁蛋白溶液的浓度为2mg/mL；在氮气保护、避光条件下，将虾青素溶解于二甲基亚砜得到浓度为1mg/mL的虾青素溶液；
步骤五、在避光条件下，将5mL的蛋白溶液加入到溶液A中混合搅拌0.5h，然后加入5mLPBS缓冲液，混合搅拌5min，再向反应体系中加入1mL的虾青素溶液，混合搅拌24h；
步骤六、整个反应体系转移至截留分子量为3500的透析袋中，透析4-8h，且每一小时换一次透析液，并不时晃动透析袋使其充分透析；收集透析后的液体进行离心，转速为4000rpm、时长为10min，去除沉淀，吸取上清液得到抗氧化应激纳米试剂，并在避光、氮气保护的条件下保存。
步骤七、将得到的抗氧化应激纳米试剂先在-80℃冷冻，再使用真空冻干机冻干，然后在避光、氮气保护，-20℃条件下长久保存。
请参见图1，实施例一制备得到的纳米颗粒的电镜图，可以得到纳米颗粒的晶粒尺寸为130nm左右。纳米颗粒的晶粒尺寸较小且均一。
请参见图2，实施例一制备得到的纳米试剂的氧化应激响应性能良好。
请参见图3，实施例一制备得到的纳米试剂清除自由基RNS(-DPPH·)的能力示意图，该纳米试剂能高效率清除自由基RNS(-DPPH·)。
请参见图4，实施例一制备得到的纳米试剂清除自由基ROS(-OH·)的能力示意图，该纳米试剂能高效率清除自由基ROS(-OH·)。
图5为实施例一制备得到的纳米试剂对正常细胞3T3的毒性作用示意图，图6为实施例一制备得到的纳米试剂对免疫细胞巨噬细胞的毒性作用示意图。可以看出我们制备了一种相对安全、具有良好ROS响应性，且抗氧化应激效果优越的大小均一的纳米颗粒。
本发明还提供一种如上所示的抗氧化应激纳米试剂的制备方法制备得到的抗氧化应激纳米试剂，该纳米试剂同时具备靶向炎症部位、药物释放可控性、双重抗氧化的优势，极大地提高了抗炎的效率，可减轻临床抗生素的滥用，提高炎症治愈率且降低复发率。
本发明还提供一种如上所示的抗氧化应激纳米试剂的制备方法制备得到的抗氧化应激纳米试剂在炎症治疗的应用，该纳米试剂可有效治疗炎症和肿瘤。
综上，抗氧化应激纳米试剂的制备方法简单、易于操作、且产量和产率均较高，可大批生产；将虾青素包裹在亲水性的蛋白中，通过将二硒酸与蛋白紧密交联，形成一个亲水的空腔结构，在缓慢的交联的过程，虾青素被紧紧地包裹在亲水性的空腔结构中，提高了虾青素在水性、脂性溶剂中的溶解度、稳定性、和生物安全性以及载药量，提高了可治疗剂量和生物利用率；该纳米试剂同时具备靶向炎症部位、药物释放可控性、双重抗氧化的优势，极大地提高了抗炎的效率，可减轻临床抗生素的滥用，提高炎症治愈率且降低复发率。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、将二硒酸溶解于二甲基亚砜中形成浓度为30-50mg/mL的二硒酸溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中形成30-50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于二甲基亚砜中形成30-50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液；
S2、将所述二硒酸溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液、和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液混合搅拌1-2h，得到溶液A，其中，所述二硒酸、所述N-羟基琥珀酰亚胺、和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量比为1：1-3：1-3；
S3、将蛋白溶解于缓冲液中形成蛋白溶液；在氮气保护、避光条件下，将虾青素溶解于二甲基亚砜得虾青素溶液；
S4、在避光条件下，将所述蛋白溶液加入到所述溶液A中混合搅拌0.5-2h，其中，所述蛋白和所述二硒酸的物质的量比为1：10-20，加入缓冲液继续搅拌，搅拌5-20min后，再向反应体系中加入所述虾青素溶液，其中，所述虾青素和所述二硒酸的物质的量比为1：1-3，混合搅拌20-24h；
S5、将整个反应体系进行透析和离心分离，得到抗氧化应激纳米试剂。
2.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白为脱铁转铁蛋白或牛血清白蛋白。
3.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白溶液的浓度为1-5mg/mL；所述虾青素溶液的浓度为0.5-1mg/mL。
4.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述溶液A在室温下制备得到，所述搅拌速度为500-800rpm。
5.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述二硒酸为基于3、3-二苯二烷基二丙酸活化的二硒酸，所述二硒酸的制备方法为：将硒粉和硼氢化钠混合在水中，得到无色溶液，其中硒粉的浓度为3mmol/mL，硼氢化钠的浓度为6mmol/mL；然后再加入硒粉使其浓度为6mmol/mL，加热至105℃，反应20min，直到溶液变成红褐色，得到溶液B；配制浓度为4mmol/mL的3-氯丙酸水溶液，并调节pH至8.0，在氮气保护和室温下保持过夜，得到溶液C；将所述溶液B和溶液C混合搅拌4h，并暴露在大气中，然后灭菌，得到产物；调节所述产物的上清液的pH至3-4，并用乙酸乙酯提取有机层；将得到的有机层用水洗涤、干燥、灭菌、再结晶，得到二硒酸。
6.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，将得到的所述抗氧化应激纳米试剂在避光、氮气保护的条件下保存。
7.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，将得到的所述抗氧化应激纳米试剂先在-80℃冷冻，再使用真空冻干机冻干，然后在避光、氮气保护，-20℃条件下长久保存。
8.如权利要求1所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤S5中，将整个反应体系进行透析和离心分离的具体步骤为：整个反应体系转移至截留分子量为3500的透析袋中，透析4-8h；用超滤管进行离心，转速为3000-5000rpm、时长为5-10min，去除沉淀，吸取上清液。
9.一种如权利要求1至8项中任一项所述的抗氧化应激纳米试剂的制备方法制备得到的抗氧化应激纳米试剂。
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