CN112587503B - 一种刺激响应型虾青素纳米颗粒及其制备方法和在线粒体靶向、缓解结肠炎症方向的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虾青素纳米颗粒及其制备方法和应用，包括酪蛋白含量为58％～68％w/w，壳聚糖‑TPP复合物含量为7％～11％w/w，海藻酸钠含量为24％～28％w/w，虾青素含量为0.5％～7％w/w。本发明利用酪蛋白对虾青素进行初级包埋，进一步使壳聚糖‑TPP复合物和海藻酸钠通过静电相互作用进行层层自组装，构建形成具有pH响应型和线粒体靶向型纳米颗粒；本发明能够实现胃酸逃逸，提升虾青素在肠道中的释放率，相比于游离的虾青素能够集中富集于小鼠结肠部位，缓解小鼠结肠炎症，并对细胞线粒体具有靶向作用，本方法的包埋保护方式，构建了功能特性纳米载运体系，充分提升营养素的吸收利用度。
Description
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，具体涉及一种具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
虾青素(3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素)是一种酮式类胡萝卜素，虾青素外观为红色固体粉末，其具有脂溶性，不溶于水，虾青素多以单酯和双酯的形式存在，游离形式的虾青素存在量较低，多存在于微藻和水生动物中，具有显色作用。其具有多种生物活性如抗氧化、抗炎、抗脂质过氧化、抗衰老和保护神经等，尤其是抗氧化是虾青素最为突出的生物活性，这主要是由于虾青素具有多不饱和共轭双键结构，且分子链两端有酮基和羟基，这种分子结构赋予了虾青素非凡的抗氧化活性。
但虾青素由于其脂溶性导致其在极性溶剂中分散低，严重限制了虾青素的吸收利用度。并且由于其具有很强的抗氧化活性，导致其极易遭受外界环境的破坏，因此提升虾青素的溶解分散性和稳定性，增强虾青素的肠道吸收利用度是至关重要的。
目前主要通过构建载运体系实现对营养功能因子的保护、传递及控释，常见的载运体系类型主要包括乳液、纳米颗粒、Pickering乳液、脂质体、固体脂质纳米颗粒和水凝胶等。但上述传统型载运体系不具备刺激响应型载运能力，也难以做到营养功能因子实现靶向集中定位释放，无法促使营养功能因子活性得以充分发挥。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，通过酪蛋白、壳聚糖-TPP和海藻酸钠之间的静电层层自组装具备刺激响应型载运能力，保护虾青素逃逸胃酸极端环境的破坏，促进虾青素在肠道部位的集中富集释放，增进虾青素的吸收利用度；并通过TPP的靶向修饰增强虾青素对于线粒体的靶向作用，增强虾青素抗氧化作用的发挥。
为实现上述目的，本发明提供了一种刺激响应型虾青素纳米颗粒，包括以下组分：酪蛋白含量为58～68％w/w，壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物含量为7～11％w/w，海藻酸钠含量为24～28％w/w，虾青素含量为0.5～7％w/w。
优选的，包括以下组分：酪蛋白含量为66.22％w/w，壳聚糖-TPP复合物含量为8.27％w/w，海藻酸钠含量为24.83％w/w，虾青素含量为0.66％w/w。
一种刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
S1、将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于浓度为0.1～0.2M，pH为4.0～7.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，使所述(3-羧丙基)三苯基溴化膦的终浓度为4～8mg/mL，搅拌至充分溶解；再加入浓度为4～8mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为2～4mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应3～5h，得到(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液；
S2、将壳聚糖充分溶解于冰乙酸溶液中，使所述壳聚糖终浓度为4～8mg/mL；再加入步骤S1所述(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液中，搅拌反应时6～10h；反应结束后透析2～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物；
S3、40～50℃水浴条件下，将酪蛋白充分溶解于去离子水中，使所述酪蛋白终浓度为4～8mg/mL；再加入虾青素浓度为1～10mg/mL的虾青素乙醇溶液，在4～5℃冰浴条件下剪切破碎，得到酪蛋白和虾青素的剪切液；
S4、将步骤S2中所述壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物溶解于冰乙酸溶液中、将海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，再将二者加入到步骤S3中所述酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，搅拌反应1～2h，反应结束后冷冻干燥，即得到虾青素纳米颗粒。
优选的，步骤S2中所述透析使用500～1000Da的透析袋。
优选的，步骤S3中所述剪切条件为6000～8000rpm，时长3～6min。
优选的，步骤S4中氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0～9.0；所述壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦在所述冰乙酸中浓度为1～2mg/mL，所述海藻酸钠在所述氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3～4mg/mL。
优选的，步骤S2、S4中所述冰乙酸浓度为0.05～0.1％w/v，pH为4.0～6.0。
优选的，步骤步骤S1、S2、S4所述搅拌的转速为600～800rpm。
一种刺激响应型虾青素纳米颗粒的应用，用于对线粒体的靶向作用。
一种刺激响应型虾青素纳米颗粒的应用，用于抑制结肠炎症。
本发明的有益效果是：
本发明利用酪蛋白对虾青素进行初级包埋，进一步使壳聚糖-TPP复合物和海藻酸钠通过静电相互作用的层层自组装构建了具有pH响应型的虾青素纳米颗粒。本发明能够保护虾青素逃逸胃酸极端环境，增强虾青素在肠道内的集释放率，与游离的虾青素相比虾青素纳米颗粒能够更显著的缓解小鼠的结肠炎症；并且，经TPP修饰后增强的虾青素对线粒体的靶向作用，增强虾青素抗氧化活性的发挥。本方法的包埋保护方式，构建具有功能特性的纳米载运体系，充分提升营养素的吸收利用度。
附图说明
图1为实施例1中虾青素纳米颗粒SEM扫描电镜图(×100K)；
图2为实施例1中虾青素和虾青素纳米颗粒在水溶液中的分散照片；
图3为实施例1中虾青素纳米颗粒在模拟胃液和模拟肠液中的释放率；
图4为实施例1中虾青素纳米颗粒在模拟唾液中的SEM扫描电镜图(×7K)；
图5为实施例1中虾青素纳米颗粒在模拟胃液中的SEM扫描电镜图(×7K)；
图6为实施例1中虾青素纳米颗粒在模拟肠液中的SEM扫描电镜图(×7K)；
图7为对比例1中丽丝胺罗丹明B染料在RAW264.7巨噬细胞中的荧光分布图；
图8为对比例1中负载丽丝胺罗丹明B染料的纳米颗粒在RAW264.7巨噬细胞中的荧光分布图；
图9为对比例2中载体、虾青素和虾青素纳米颗粒对小鼠结肠炎症缓解的肠道组织呈像；
图10为对比例2中小鼠结肠长度结果图；
图11为对比例2中小鼠血清中白介素1β检测结果图；
图12为对比例2中小鼠血清中白介素-6检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。其中，(3-羧丙基)三苯基溴化膦缩写为TPP，2-(N-吗啡啉)缩写为MES。
一种具有pH响应、线粒体靶向和抑制、缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备TPP羧基活化液：称取(3-羧丙基)三苯基溴化膦(TPP)溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，使得TPP的终浓度为4～8mg/mL，磁力搅拌600～800rpm，充分溶解；再向TPP溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌600～800rpm，反应时长3h～5h；
S2、制备壳聚糖-TPP复合物：称取壳聚糖充分溶解于冰乙酸溶液中，使得壳聚糖终浓度为4～8mg/mL；将壳聚糖溶液逐步加入到步骤S1所述的TPP羧基活化液中，磁力搅拌600～800rpm，反应时长6～10h；反应结束后将壳聚糖-TPP复合物置于500～1000Da的透析袋进行透析2～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-TPP复合物；
其中，步骤S1所述TPP羧基活化液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为4～8mg/mL、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2～4mg/mL，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液浓度为0.1～0.2M，pH为4.0～7.0；步骤S2中所述冰乙酸浓度为0.05～0.1％w/v，pH为4.0～6.0；
S3、制备具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒：称取酪蛋白于40～50℃水浴中充分溶解于去离子水中，使得酪蛋白终浓度为4～8mg/mL；向酪蛋白溶液中加入虾青素乙醇溶液1～2mL，在4～5℃冰浴条件下进行剪切破碎处理，剪切条件为6000～8000rpm，处理时长3～6min；将壳聚糖-TPP复合物溶解于冰乙酸溶液中，海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，将二者加入到酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，磁力搅拌600～800rpm，反应时长1h～2h，反应结束后对样品进行冷冻干燥处理；
其中，步骤S3所述虾青素乙醇溶液中虾青素浓度为1～10mg/mL，冰乙酸浓度为0.05～0.1％w/v，pH为4.0～6.0，氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0～9.0；壳聚糖-TPP在冰乙酸中浓度为1～2mg/mL，海藻酸钠在氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3～4mg/mL；
所述具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒是通过酪蛋白、壳聚糖-TPP和海藻酸钠通过静电相互作用层层自组装构建而成，包括组分：酪蛋白含量为58～68％w/w，壳聚糖-TPP复合物含量为7～11％w/w，海藻酸钠含量为24～28％w/w，虾青素含量为0.5～7％w/w。
实施例1
一种具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒，包括下述组分：酪蛋白含量为66.22％w/w，壳聚糖-TPP复合物含量为8.27％w/w，海藻酸钠含量为24.83％w/w，虾青素含量为0.66％w/w。
所述具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备TPP羧基活化液：称取(3-羧丙基)三苯基溴化膦(TPP)溶解于0.1MpH 5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，使TPP的终浓度为8mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌溶解；再向TPP溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐终浓度为8mg/mL和N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为4mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌反应5h；
S2、制备壳聚糖-TPP复合物：称取壳聚糖溶解于0.1％w/v pH 5.0的冰乙酸溶液中，使得壳聚糖终浓度为8mg/mL；将壳聚糖溶液逐步加入到步骤S1所述的TPP羧基活化液中，在600rpm条件下搅拌反应10h；反应结束后将壳聚糖-TPP复合物置于500Da的透析袋内进行透析2～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-TPP复合物；
其中，步骤S1所述TPP羧基活化液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为8mg/mL、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为4mg/mL，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液浓度为0.1M，pH为5.0；步骤S2中所述冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0；
S3、制备具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒：称取酪蛋白于40℃水浴中充分溶解于去离子水中，使得酪蛋白终浓度为4mg/mL；向酪蛋白溶液中加入虾青素乙醇溶液1mL，在4℃冰浴条件下进行剪切破碎处理，在7000rpm剪切条件下处理5min；将壳聚糖-TPP复合物溶解于冰乙酸溶液中，海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，将二者加入到酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，在600rpm的磁力搅拌条件下反应1h，反应结束后对样品进行冷冻干燥处理；
其中，步骤S3所述虾青素乙醇溶液中虾青素浓度为1mg/mL，冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0，氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0；壳聚糖-TPP在冰乙酸中浓度为1.23mg/mL，海藻酸钠在氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3.75mg/mL。
对比例1
一种具有pH响应、线粒体靶向的丽丝胺罗丹明B纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备TPP羧基活化液：称取(3-羧丙基)三苯基溴化膦(TPP)溶解于0.1M的pH5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，使TPP的终浓度为8mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌溶解；再向TPP溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐终浓度为8mg/mL和N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为4mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌反应5h；
S2、制备壳聚糖-TPP复合物：称取壳聚糖溶解于0.1％w/v pH 5.0的冰乙酸溶液中，使得壳聚糖终浓度为8mg/mL；将壳聚糖溶液逐步加入到步骤S1所述的TPP羧基活化液中，在600rpm条件下搅拌反应10h；反应结束后将壳聚糖-TPP复合物置于500Da的透析袋内进行透析2d～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-TPP复合物；
其中，步骤S1所述TPP羧基活化液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为8mg/mL、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为4mg/mL，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液浓度为0.1M，pH为5.0；步骤S2中所述冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0；
S3、制备具有pH响应、线粒体靶向的丽丝胺罗丹明B纳米颗粒：称取酪蛋白于40℃水浴中充分溶解于去离子水中，使得酪蛋白终浓度为4mg/mL；向酪蛋白溶液中加入丽丝胺罗丹明B乙醇溶液1mL，在4℃冰浴条件下进行剪切破碎处理，在7000rpm剪切条件下处理5min；将壳聚糖-TPP复合物溶解于冰乙酸溶液中，海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，将二者加入到酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，在600rpm的磁力搅拌条件下反应1h，反应结束后对样品进行冷冻干燥处理；
其中，步骤S3所述丽丝胺罗丹明B乙醇溶液中丽丝胺罗丹明B浓度为1mg/mL，冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0，氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0；壳聚糖-TPP在冰乙酸中浓度为1.23mg/mL，海藻酸钠在氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3.75mg/mL。
对比例1与实施例1所述的具有pH响应、线粒体靶向的丽丝胺罗丹明B纳米颗粒和具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒的制备方法，区别仅在于，对比例1向步骤S3所述的乙醇溶液中加入丽丝胺罗丹明B替代虾青素，除了丽丝胺罗丹明B外，与所述具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒的其余各组分完全相同，对比例1加入丽丝胺罗丹明B是实现对纳米颗粒进行荧光标记，用于细胞实验，对所述具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒能够进入细胞并且靶向作用于线粒体进行验证。
对比例2
一种具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒，包括下述组分：酪蛋白含量为62.5％w/w，壳聚糖-TPP复合物含量为7.81％w/w，海藻酸钠含量为23.43％w/w，虾青素含量为6.25％w/w。
所述具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备TPP羧基活化液：称取(3-羧丙基)三苯基溴化膦(TPP)溶解于0.1MpH 5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，使TPP的终浓度为8mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌溶解；再向TPP溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐终浓度为8mg/mL和N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为4mg/mL，在600rpm条件下充分搅拌反应5h；
S2、制备壳聚糖-TPP复合物：称取壳聚糖溶解于0.1％w/v pH 5.0的冰乙酸溶液中，使得壳聚糖终浓度为8mg/mL；将壳聚糖溶液逐步加入到步骤S1所述的TPP羧基活化液中，在600rpm条件下搅拌反应10h；反应结束后将壳聚糖-TPP复合物置于500Da的透析袋内进行透析2d～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-TPP复合物；
其中，步骤S1所述TPP羧基活化液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为8mg/mL、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为4mg/mL，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液浓度为0.1M，pH为5.0；步骤S2中所述冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0；
S3、制备具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒：称取酪蛋白于40℃水浴中充分溶解于去离子水中，使得酪蛋白终浓度为4mg/mL；向酪蛋白溶液中加入虾青素乙醇溶液1mL，在4℃冰浴条件下进行剪切破碎处理，在7000rpm剪切条件下处理5min；将壳聚糖-TPP复合物溶解于冰乙酸溶液中，海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，将二者加入到酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，在600rpm的磁力搅拌条件下反应1h，反应结束后对样品进行冷冻干燥处理；
其中，步骤S3所述虾青素乙醇溶液中虾青素浓度为10mg/mL，冰乙酸浓度为0.1％w/v，pH为5.0，氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0；壳聚糖-TPP在冰乙酸中浓度为1.23mg/mL，海藻酸钠在氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3.75mg/mL。
对比例2与实施例1所述的具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒制备方法，区别仅在于所负载的虾青素含量不同。
一、取实施例1步骤S3所述的“具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒进行“SEM扫描电镜呈像”。如附图1所示，SEM扫面电镜呈像结果，虾青素纳米颗粒形态接近球形，粒径在500nm左右。如附图2所示，为虾青素纳米颗粒动态光散射结果，结果表明虾青素纳米颗粒尺寸集中分布于450nm，与SEM扫描电镜呈像结果一致。
二、取实施例1步骤S3所述的“具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒20mg，将其分散于10mL的模拟唾液中，将该体系置于37℃，100rpm的摇床中反应10min。再向反应体系中加入40mL的模拟胃液，在37℃，100rpm的摇床中反应2h，每隔30min吸出4mL的上清液进行测定虾青素含量，同时再向体系中补足4mL新鲜的模拟胃液。待反应2h后，向体系中加入50mL的模拟肠液，在37℃，100rpm的摇床中反应5h，并每隔30min吸出4mL上清液测定虾青素含量，同时向反应体系中补足4mL新鲜的模拟肠液。
如附图3所示，为虾青素纳米颗粒在模拟胃液和模拟肠液中对于虾青素的释放量，结果表明，虾青素在模拟胃液消化2h内对于虾青素释放量很缓慢，有微弱的释放；表明海藻酸钠在胃酸环境下质子化，导致纳米颗粒絮集保护虾青素减少释放量；在模拟肠液处理5h，虾青素的释放量随着处理时间的增长释放率逐渐增加，表明海藻酸钠去质子化，纳米颗粒间斥力增加，导致海藻酸钠向水相中扩散，破坏了海藻酸钠与壳聚糖-TPP之间的静电组装左右，使得纳米颗粒逐渐崩解释放虾青素。如附图4、图5和图6所示，分别为具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒在模拟唾液、模拟肠液和模拟胃液中处理10min，2h和5h的SEM呈像结果图。结果表明，在模拟唾液(图4)中虾青素纳米颗粒依旧维持着球形颗粒状，并且分散性较好，说明纳米颗粒没有发生明显的破坏；在模拟胃液中(图5)虾青素纳米颗粒发生了显著的絮凝现象，形成微米级的颗粒状，说明虾青素在模拟胃液中发生了明显的絮凝，同时保护虾青素免受胃液环境的破坏；在模拟肠液中(图6)虾青素纳米颗粒又恢复成均匀分散的球状结构，并且纳米颗粒出现了明显的破裂；说明在模拟肠液中虾青素得以从纳米颗粒中释放出来。
三、取RAW264.7小鼠源单核巨噬细胞按照下述方法进行细胞实验：以1×106细胞/mL接种于6孔板中，置于37℃下5％的CO2细胞培养箱静置孵育24h，带细胞完全贴壁后分别孔板中加入丽丝胺罗丹明B和对比例1中步骤S3所述的具有pH响应、线粒体靶向的丽丝胺罗丹明B纳米颗粒100μL(相当于加入0.1μg的丽丝胺罗丹明B)，置于37℃下5％的CO2细胞培养箱静置孵育6h；孵育结束后向培养液中加入0.2μM的Mito-Tracker Green和10μg/mL的Hoechest 3334染料各100μL，再置于37℃下5％的CO2细胞培养箱中孵育处理细胞30min，孵育结束后吸出培养基并用PBS缓冲液清洗细胞3次，置于荧光倒置显微镜下观察。附图7为丽丝胺罗丹明B对RAW264.7巨噬细胞孵育后的荧光叠加图片；附图8为丽丝胺罗丹明B纳米颗粒对RAW264.7巨噬细胞孵育后的荧光叠加图片；结果表明，经丽丝胺罗丹明B纳米颗粒孵育后的RAW264.7巨噬细胞内罗丹明B的荧光强度更显著，并且能够与Mito-Tracker Green线粒体染料有明显重合(如图8箭头所示)，说明了丽丝胺罗丹明B纳米颗粒对于线粒体的靶向特性。并对具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒能够进入细胞并且靶向作用于线粒体进行了验证。
四、利用6周龄的BALB/c雄性小白鼠进行肠道炎症实验，实验分设为5组，分别为空白组、硫酸葡聚糖组、载体组、虾青素组和虾青素纳米颗粒组，利用硫酸葡聚糖构建小鼠肠炎模型。利用对比例2构建的虾青素纳米颗粒进行体内动物实验，动物实验的时间周期为13天，前8天向载体组、虾青素组和虾青素纳米颗粒组分别灌胃载体(即对比例2中步骤S3所述的具有pH响应、线粒体靶向和缓解结肠炎症的虾青素纳米颗粒，但纳米颗粒中不含有虾青素)250mg/kg/d、粗品虾青素250mg/kg/d(相当于灌胃虾青素250μg/只/d)和虾青素纳米颗粒250mg/kg/d(相当于灌胃虾青素250μg/只/d)；空白组和硫酸葡聚糖组前8天自由饮水。后5天供给硫酸葡聚糖组、载体组、虾青素组和虾青素纳米颗粒组小鼠含有5％w/v硫酸葡聚糖的去离子水，让小鼠自由饮水；同时，载体组、虾青素组和虾青素纳米颗粒组继续进行样品灌胃。在第14天对小鼠进行宰杀，收集小鼠血清，并解剖收集小鼠结肠组织。附图9为小鼠结肠的呈像图片，每组3个平行的结肠组织，结果表明，经虾青素纳米颗粒灌胃的小鼠结肠组织更长，说明虾青素纳米颗粒对小鼠结肠炎症有着一定的保护作用。附图10为小鼠结肠组织长度的结果图，结果表明，虾青素纳米颗粒处理组的小鼠结肠长度显著的长于载体组和虾青素组，并且与空白组的小鼠结肠长度相接近。附图11和附图12分别为小鼠血清中白介素1β和白介素-6的检测结果，结果表明，经虾青素纳米颗粒处理的小鼠血清中炎症因子相比于硫酸葡聚糖组显著降低，说明本发明构建的虾青素纳米颗粒能够显著的缓解小鼠结肠炎症，增进虾青素在小鼠肠道的吸收利用率。
附图10-12中以*符号标明显著性，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；***表示p小于0.001。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下组分：酪蛋白含量为58％～68％w/w，壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物含量为7％～11％w/w，海藻酸钠含量为24％～28％w/w，虾青素含量为0.5％～7％w/w；
具体地，包括以下步骤：
S1、将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于浓度为0.1～0.2M，pH为4.0～7.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，使所述(3-羧丙基)三苯基溴化膦的终浓度为4～8mg/mL，搅拌至充分溶解；再加入浓度为4～8mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为2～4mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应3～5h，得到(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液；
S2、将壳聚糖充分溶解于冰乙酸溶液中，使所述壳聚糖终浓度为4～8mg/mL；再加入步骤S1所述(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液中，搅拌反应时6～10h；反应结束后透析2～3d，再冷冻干燥获得壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物；
S3、40～50℃水浴条件下，将酪蛋白充分溶解于去离子水中，使所述酪蛋白终浓度为4～8mg/mL；再加入虾青素浓度为1～10mg/mL的虾青素乙醇溶液，在4～5℃冰浴条件下剪切破碎，得到酪蛋白和虾青素的剪切液；
S4、将步骤S2中所述壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦复合物溶解于冰乙酸溶液中、将海藻酸钠溶解于氢氧化钠碱性水溶液中，再将二者加入到步骤S3中所述酪蛋白和虾青素的剪切液中进行层层自组装，搅拌反应1～2h，反应结束后冷冻干燥，即得到虾青素纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下组分：酪蛋白含量为66.22％w/w，壳聚糖-TPP复合物含量为8.27％w/w，海藻酸钠含量为24.83％w/w，虾青素含量为0.66％w/w。
3.根据权利要求1所述的刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述透析使用500～1000Da的透析袋。
4.根据权利要求1所述的刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述剪切条件为6000～8000rpm，时长3～6min。
5.根据权利要求1所述的刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S4中氢氧化钠碱性水溶液pH为8.0～9.0；所述壳聚糖-(3-羧丙基)三苯基溴化膦在所述冰乙酸中浓度为1～2mg/mL，所述海藻酸钠在所述氢氧化钠碱性水溶液中的浓度为3～4mg/mL。
6.根据权利要求1所述的刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S2、S4中所述冰乙酸浓度为0.05％～0.1％w/v，pH为4.0～6.0。
7.根据权利要求1所述的刺激响应型虾青素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1、S2、S4所述搅拌的转速为600～800rpm。
8.一种权利要求1所述刺激响应型虾青素纳米颗粒在制备结肠炎症药物中的应用，其特征在于，用于对线粒体的靶向作用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于抑制结肠炎症。
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