CN113552248A - 一种使用流通池法测定阿立哌唑微球的释放度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用流通池法测定阿立哌唑微球的释放度的方法，其以pH值不同的包含磷酸二氢钾、氢氧化钠和表面活性剂的PBS缓冲液分别作为第一释放介质和第二释放介质依次使阿立哌唑微球进行释放，其中所述第一释放介质的pH值比所述第二释放介质的pH值高出1.4‑3.4。所述方法相对于传统的释放方法更能模拟药物在体内的过程，具有良好的体内外相关性，也更适合难溶性制剂的测定，且换液时不会导致样品损失。

Description

一种使用流通池法测定阿立哌唑微球的释放度的方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其是涉及一种快速测定阿立哌唑微球的释放度的方法。

背景技术

阿立哌唑属于第三代抗精神分裂症药，是一种二氢喹啉酮类抗精神病药，可以用于治疗精神分裂症，对精神分裂症的阳性症状和阴性症状均有明显疗效，也能改善伴发的情感症状，降低精神分裂症的复发率。阿立哌唑具有起效快、安全性高及耐受性好等特性。由于其疗效好、副作用相对轻微，因而在临床上得到广泛应用。

临床上常用的阿立哌唑制剂有口服片剂、口服溶液、胶囊、注射剂和注射用混悬剂，这些普通剂型需每天定时服药或注射。但是由于精神分裂症患者的特殊性，在治疗过程中，患者对普通剂型的依从性低，经常导致中断治疗进而病情恶化。因此开发了以PLGA作为载体材料的注射用阿立哌唑微球，阿立哌唑微球与阿立哌唑的普通剂型相比，在体内缓慢且稳定释放活性成分阿立哌唑，减少用药次数，依从性得到提高。

与普通剂型一样，阿立哌唑微球需要在体内释放后达到一定的血药浓度后才能发挥药效，阿立哌唑微球释放度是影响体内药效的关键因素。微球释放度测定的常用方法主要有取样分离法、膜扩散法和流通池法。对于阿立哌唑微球，已经采用不同材质的滤袋进行了释放度考察，结果表明滤袋会影响样品释放，导致样品释放偏低。并且由于阿立哌唑微球在释放介质中溶解度很低，为了满足漏槽条件必须换液，而取样分离法不仅操作繁琐，在分离的过程中还可能会导致样品损失。

目前，有文献报道了阿立哌唑微球的长期释放测定方法。但是，由于阿立哌唑微球的释放周期长达4周，因此这些释放度测定方法具有周期长、在生产中难以及时进行质量控制的缺点。

因此，非常有必要建立一种快速可靠的、可以满足大生产放行检验和质量控制的需求的阿立哌唑微球的释放度的测定方法。

发明内容

本发明克服了现有技术中存在的不足，提供了一种使用流通池法快速测定阿立哌唑微球的释放度的全新方法，所述方法相对于传统的释放方法周期更短，更能模拟药物在体内的过程，具有良好的体内外相关性，也更适合难溶性制剂的测定，且换液时不会导致样品损失。

一方面，本发明提供了一种使用流通池法测定阿立哌唑微球的释放度的方法，其特征在于，以pH值不同的包含磷酸二氢钾、氢氧化钠和表面活性剂的PBS缓冲液分别作为第一释放介质和第二释放介质依次使阿立哌唑微球进行释放，其中所述第一释放介质的pH值比所述第二释放介质的pH值高1.4-3.4，优选高1.8-2.9，更优选高2.4。

优选地，所述第一释放介质的pH值为6.8至8.0，更优选地，所述第一释放介质的pH值为7.4；优选地，所述第二释放介质的pH值为4.0至6.0，更优选地，所述第二释放介质的pH值为5.0。发明人发现，第二释放介质的pH值从4.0升高至6.0时，阿立哌唑微球的释放变慢，在pH 5.0时释放速度适中，能更好的反映阿立哌唑微球在体内的释放行为。

优选地，在第0小时至第9小时使用所述第一释放介质使阿立哌唑微球进行释放，在第9小时至第48小时使用所述第二释放介质使阿立哌唑微球进行释放。

优选地，所述释放均在37±0.5℃的温度下进行。该温度是人体正常温度，在该温度下可以更好的模拟药物在体内的释放行为。

优选地，所述表面活性剂选自聚乙烯醇、泊洛沙姆、吐温20或吐温80中的一种或多种；更优选地，所述表面活性剂为吐温20或吐温80；进一步优选地，所述表面活性剂为吐温80。由于阿立哌唑几乎不溶于水，属于BCSⅡ类，对于这种难溶性药物来说，药物的溶解度是药物吸收的限速因素，因此在进行释放度考察时可加入少量表面活性剂来增加溶解度。其中，吐温80增溶效果最好，吐温20次之。

优选地，所述表面活性剂的体积为所述第一释放介质或所述第二释放介质的体积的0.2％至1.0％；更优选地，所述表面活性剂的体积为所述第一释放介质或所述第二释放介质的体积的0.5％。表面活性剂用量太低，增溶效果不显著，表面活性剂用量太高，可能会导致方法的区分力不足。

优选地，所述方法采用闭环式流通池法。

优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为4至16ml/min；更优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为8-12ml/min；最优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为8ml/min。

优选地，所述方法还包括使用HPLC法测定阿立哌唑微球的释放液。由于HPLC法具有专属性更强，受干扰可能性更低、精密度更高等优点，故选择HPLC法进行阿立哌唑微球释放度的检测。

优选地，在使用HPLC法测定之前，对所述释放液进行预处理；更优选地，所述预处理方法为高速离心、经聚四氟乙烯膜滤过或经聚醚砜膜滤过；进一步优选地，所述预处理方法为高速离心或经聚四氟乙烯膜滤过。经聚醚砜膜滤过必须弃去1ml以上对阿立哌唑才没有吸附，考虑到每次释放液的取样量只有1～2ml，经滤膜滤过弃去1ml后所得滤液比较少，因此优选高速离心或经聚四氟乙烯膜滤过。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(a)在流通池中使用第一释放介质和第二释放介质依次使阿立哌唑微球进行释放，取样，得到供试品溶液；优选地，在第0～9h使用所述第一释放介质使阿立哌唑微球进行释放，在第9～48小时使用所述第二释放介质使阿立哌唑微球进行释放；

(b)取阿立哌唑对照品，配制得到对照品溶液；优选地，用第一释放介质、第二释放介质或流动相配制所述阿立哌唑对照品；更优选地，用流动相配制所述阿立哌唑对照品；

(c)取供试品溶液和对照品溶液，使用HPLC法测定，并通过外标法计算释放度。

根据本发明的一个具体实施方案，所述测定阿立哌唑微球的释放度的方法包括以下步骤：

(a)取阿立哌唑微球，精密称定并置于流通池中，在37℃的温度下，采用闭环式流通池法，使第一释放介质或第二释放介质循环通过流通池，其中在第0～9h使用所述第一释放介质使阿立哌唑微球进行释放，在第9～48小时使用所述第二释放介质使阿立哌唑微球进行释放，将不同时间取得的样品离心或过滤作为供试品溶液；

其中所述第一释放介质为pH 7.4的PBS缓冲液，其制备方法如下：

0.68％的磷酸二氢钾(质量分数)、0.1625％的氢氧化钠(质量分数)和0.5％的吐温80(体积分数)的混合溶液，用氢氧化钠或磷酸溶液调节溶液pH值至7.4。

其中所述第二释放介质为pH 4.0至6.0的PBS缓冲液，其制备方法如下：

0.68％的磷酸二氢钾(质量分数)、0.1625％的氢氧化钠(质量分数)和0.5％的吐温80(体积分数)的混合溶液，用氢氧化钠或磷酸溶液分别调节溶液pH值至4.0至6.0。

(b)取阿立哌唑对照品，精密称定并置于量瓶中，加流动相配制成对照品溶液，优选地，所述对照品溶液中的阿立哌唑浓度为0.01mg/ml。

(c)取供试品溶液和对照品溶液，采用HPLC法测定，并通过外标法计算释放度。

根据本发明的释放度测定方法测得的阿立哌唑微球在9h的释放度应在10％～25％，在24h的释放度应在55％～85％，在48h的释放度应不得低于80％。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明的方法相对于传统的释放方法更能模拟药物在体内的过程，能很好的反映样品在体内的释放行为，具有良好的体内外相关性，也更适合难溶性制剂的测定，且换液时不会导致样品损失；

2、本发明的方法与传统的长期释放度测定方法相比，周期显著缩短，大大提高了释放度测定的效率，可以满足大生产放行检验和质量控制；

3、本发明的释放度测定方法具有区分不同工艺制备的产品的区分力，对工艺的开发具有一定指导意义；

4、本发明的释放度测定方法操作简单，具有良好的专属性、灵敏度、线性与范围、重复性、准确度、稳定性、释放均一性和释放重现性，为阿立哌唑微球的质量控制提供了可靠的方法。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了根据实施例8，空白微球和供试品溶液释放一定时间的叠加HPLC图；

图2显示了根据实施例10的阿立哌唑的释放度的方法学验证线性图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

除非特别说明，以下实施例中所用的阿立哌唑对照品来自中检院；阿立哌唑微球来自珠海市丽珠微球科技有限公司，通用色谱条件和溶液配制如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选自：Agilent SB-C18、KromasilC18、ODS-C18、Thermo Hypersil C18、Waters symmetry C18、Waters BEH C18、PhenomenexC18、YMC-Triart C18、Shimadzu ODS C18。

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：254nm；

进样体积：20μl；

流动相：pH 3.0的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾5.44g，溶于900ml水中，用磷酸调节pH值至3.0，加水至1000ml)-乙腈-甲醇(50：25：25)；

稀释液：pH 3.0的磷酸盐缓冲液；

对照品溶液配制：取阿立哌唑对照品适量，加流动相溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液作为对照品溶液。

供试品溶液：将不同时间取得的溶液离心或过滤，作为供试品溶液。

测定方法：精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算阿立哌唑微球在不同时间的释放度。

实施例1

本实施例提供了分别采用pH不同的含有吐温80的PBS缓冲液测定阿立哌唑微球释放度的方法，具体为：

1.释放介质的配制：0.68％的磷酸二氢钾、0.1625％的氢氧化钠和0.5％吐温80(体积分数)的混合溶液，分别用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.4和5.0作为不同阶段的释放介质。

2.释放方法：取阿立哌唑微球30mg，精密称定并置于流通池中，在37℃的温度下，采用闭环式流通池法在0～9h和9～48h分别使pH7.4和pH5.0的释放介质依次以8ml/min的流速通过，在不同时间取样1ml，离心，即得供试品溶液。

3.HPLC法测定：采用上述通用色谱条件测定释放液中阿立哌唑的浓度，精密吸取对照品溶液和不同时间的供试品溶液，分别进样，记录色谱图，结果见下表：

时间(h)	释放度(％)
		3	8
9	15
		12	29
24	65
		36	84
48	91

实施例2

其它条件同实施例1，区别在于表面活性剂不同，分别采用聚乙烯醇、泊洛沙姆和吐温20作为表面活性剂，结果见下表：

结果：可知聚乙烯醇、泊洛沙姆和吐温20增溶效果不如吐温80，无法达到完全释放，吐温80增溶效果最好，其次为吐温20，故优选吐温80作为表面活性剂。

实施例3

其它条件同实施例1，区别在于表面活性剂的百分含量不同，分别采用不含吐温80，含吐温80分别为0.2％、0.5％、1.0％和2.0％(体积比)，结果见下表：

结果：不含吐温80时，释放太慢，48h释放55％，无法达到完全释放；吐温80含量为2.0％时，释放太快，24h释放即可达到90％以上，可能会导致方法区分力不足；吐温80含量为0.2％～1.0％时，释放适中，故优选吐温80含量为0.2％～1.0％。但吐温80含量为0.2％～1.0％时，24h释放接近限度，故最优选吐温80含量为0.5％。

实施例4一次释放介质的实验探索

其它条件同实施例1，区别在于在0～48h分别采用pH 1.0的盐酸溶液以及pH分别为3.0、4.5、5.0、6.8、7.4和8.0的含有0.5％吐温80的PBS缓冲液，结果见下表：

结果：随着pH升高，释放变慢，在0～48h只采用一种pH的释放介质时，前期释放太快或者后期释放太慢，均不符合要求，故考虑采用两种或两种以上pH的释放介质。

实施例5

其它条件同实施例1，区别在于在第9～48h分别采用pH 6.0和pH 4.0的释放介质，结果见下表：

结果：第9～48h采用pH7.4的PBS缓冲液时，释放太慢，48h释放仅38％，采用pH4.0～pH6.0时，释放较为合适，均符合规定，但pH6.0和pH4.0释放均接近限度，采用pH5.0时，释放速率适中，方法更具有区分力。

实施例4

其它条件同实施例1，区别在于：

(1)条件1在0～9h采用pH6.8的释放介质，在9～48h采用pH5.0的PBS缓冲液；

(2)条件2在0～9h采用pH5.0的释放介质，在9～48h采用pH4.5的PBS缓冲液；

(3)条件3在0～9h采用pH7.4的释放介质，在9～24h采用pH5.0的PBS缓冲液；在24～48h采用pH4.5的PBS缓冲液；

(4)条件4在0～9h采用pH7.4的释放介质，在9～24h采用pH5.0的PBS缓冲液，在24～48h采用pH3.0的PBS缓冲液；

(5)条件5在0～9h采用pH6.8的释放介质，在9～24h采用pH5.0的PBS缓冲液，在24～48h采用pH4.5的PBS缓冲液；

(6)条件6在0～9h采用pH6.8的释放介质，在9～48h采用pH4.5的PBS缓冲液；

(7)条件7在0～9h采用pH7.4的释放介质，在9～48h采用pH4.5的PBS缓冲液；

(8)条件8在0～9h采用pH7.4的释放介质，在9～48h采用pH3.0的PBS缓冲液；

(9)条件9在0～9h采用pH7.4的释放介质，在9～48h采用pH5.0的PBS缓冲液。

结果见下表：

结果：在0～9h采用pH7.4和pH6.8的释放介质时，9h释放均符合要求，采用pH5.0的释放介质时，9h释放太快，不符合要求。故第一阶段释放介质为6.8≤pH≤7.4。条件1和条件3、4、5释放差异不大，而条件3、4、5均采用3种不同pH释放介质，较条件1的2种不同pH释放介质操作更为复杂繁琐，故优先选择采用两种释放介质。条件6、7、8、9在9～48h分别采用pH4.5、pH4.5、pH3.0和pH5.0的释放介质，条件8在24h释放太快，故确定第二阶段释放介质为4.5≤pH≤5.0。根据两个阶段的释放介质范围，有条件1、6、7、9四种组合，四种组合均符合限度，但条件1和条件6在9h时释放稍快，接近限度，条件7和条件9对比，条件7在12～24h释放比条件9稍快，条件9整体释放更平缓，不如条件7剧烈，故条件9更有区分力。

实施例5

其它条件同实施例1，区别在于改变释放介质的种类，条件1为苯二甲酸氢钾和氢氧化钠配制pH7.4和pH5.0的释放介质，条件2为柠檬酸钠和柠檬酸配制pH7.4和pH5.0的释放介质，条件3为醋酸和醋酸钠配制pH7.4和pH5.0的释放介质，条件4为磷酸氢二钾和磷酸二氢钠配制pH7.4和pH5.0的释放介质，结果见下表：

结果：不同种类的释放介质，数据无显著性差异。

但若采用条件1的苯二甲酸氢钾和氢氧化钠配制，则苯二甲酸氢钾需提前在干燥器中干燥24h，操作麻烦；条件2的柠檬酸和柠檬酸的最佳缓冲范围在3.0～6.6、条件3的醋酸和醋酸钠缓冲液的最佳缓冲范围在为3.6～5.8，均未包括人体体液的pH7.4；条件4磷酸氢二钾和磷酸二氢钠组成的缓冲液以及磷酸氢二钾和氢氧化钠组成的缓冲液的最佳缓冲范围均为5.8～8.0，均包括含人体体液pH7.4，故两种均为优。

实施例6

其它条件同实施例1，区别在于流速分别设定为4、12、16ml/min，结果见下表：

结果：随着流速从4ml/min升高至12ml/min，释放有所加快，但12ml/min和16ml/min下释放基本无显著性差异，表明流速太高可能会影响方法的区分力，故优选流速为8ml/min。

实施例7

分别采用不同孔径的水膜(聚醚砜PES)、不同孔径聚四氟乙烯膜(PTFE)和离心处理样品，考察不同材质滤膜对释放样品有无吸附结果见下表：

结果：与高速离心比较，聚四氟乙烯膜对阿立哌唑的吸附量均未超过2％，不影响释放结果的准确性，而0.22μm和0.45μm的聚醚砜膜必须弃去1ml以上对阿立哌唑才没有吸附。因此，采用聚四氟乙烯膜滤过或直接高速离心最佳。

实施例8

分别取空白辅料和样品在释放介质中释放一定时间的释放液，注入高效液相色谱仪，进行检测，记录色谱图，结果见图1，可知空白辅料溶液在主成分位置基本无吸收峰，不干扰本品释放检测。

实施例9释放度方法学验证—灵敏度

取对照品溶液逐步稀释，当阿立哌唑峰信噪比(S/N)≈10时，该溶液浓度即为定量限浓度，当阿立哌唑信噪比(S/N)≈3时，该溶液浓度即为检测限浓度，结果见下表。可知在选定的色谱条件下，阿立哌唑在浓度为0.09μg/ml时，6次测定的信噪比平均值为19.4，该浓度即为定量限，约相当于释放度为0.9％；当浓度为0.03μg/ml时信噪比测定结果为5.0，该浓度为检测限，约相当于释放度为0.3％，可满足检测要求。

实施例10释放度方法学验证—线性范围

取阿立哌唑对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量，用流动相进行稀释，配制成约1～11μg/ml浓度水平的系列线性溶液，各取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表和图2。

结论：阿立哌唑浓度在0.92μg/ml～11.54μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程Y＝34.904x+0.14486，r＝1.000(≥0.999)，Y轴截距(0.14486)在100％响应值的2％(6.43727)以内，响应因子的相对标准差为0.5％，满足释放度测定要求。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (9)

1.一种使用流通池法测定阿立哌唑微球的释放度的方法，其特征在于，以pH值不同的包含磷酸二氢钾、氢氧化钠和表面活性剂的PBS缓冲液分别作为第一释放介质和第二释放介质依次使阿立哌唑微球进行释放，其中所述第一释放介质的pH值比所述第二释放介质的pH值高1.4-3.4，优选高1.8-2.9，更优选高2.4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一释放介质的pH值为6.8至8.0，优选地，所述第一释放介质的pH值为7.4；

优选地，所述第二释放介质的pH值为4.0至6.0，更优选地，所述第二释放介质的pH值为5.0。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在第0小时至第9小时使用所述第一释放介质使阿立哌唑微球进行释放，在第9小时至第48小时使用所述第二释放介质使阿立哌唑微球进行释放。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述释放均在37±0.5℃的温度下进行。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自聚乙烯醇、泊洛沙姆、吐温20或吐温80中的一种或多种；优选地，所述表面活性剂为吐温20或吐温80；更优选地，所述表面活性剂为吐温80。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂的体积为所述第一释放介质或所述第二释放介质的体积的0.2％至1.0％；优选地，所述表面活性剂的体积为所述第一释放介质或所述第二释放介质的体积的0.5％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法采用闭环式流通池法；

优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为4至16ml/min；更优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为8至12ml/min；最优选地，所述第一释放介质和第二释放介质的流速分别为8ml/min。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用HPLC法测定阿立哌唑微球的释放液；优选地，在使用HPLC法测定之前，对所述释放液进行预处理；更优选地，所述预处理方法为高速离心、经聚四氟乙烯膜滤过或经聚醚砜膜滤过；进一步优选地，所述预处理方法为高速离心或经聚四氟乙烯膜滤过。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在流通池中使用第一释放介质和第二释放介质依次使阿立哌唑微球进行释放，取样，得到供试品溶液；优选地，在0～9h使用第一释放介质，在9～48h使用第二释放介质；

(b)取阿立哌唑对照品，配制得到对照品溶液；优选地，用第一释放介质、第二释放介质或流动相配制所述阿立哌唑对照品；更优选地，用流动相配制所述阿立哌唑对照品；

(c)取供试品溶液和对照品溶液，使用HPLC法测定，并通过外标法计算释放度。

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