CN101819191B - 二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法，属医药技术领域。本发明主要是对二甲双胍格列吡嗪制剂的格列吡嗪有关物质的质量检测。该方法专属性强、重现性好、精密度高、操作方便，不受其他主药及辅料的干扰，能够很好地检测二甲双胍格列吡嗪制剂的质量，真正确保了临床用药的安全、有效、可控。本发明还可以结合其他方法共同检测其质量。
Description
技术领域
一种二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法，属医药技术领域。
背景技术
我国现有糖尿病患者约3000万，其中Ⅱ型占90％以上。据国外分析家最新的报告显示，全世界糖尿病的流行及治疗糖尿病Ⅰ型和Ⅱ型新药的飞速发展，将使糖尿病药物的市场每年增长16％。
格列吡嗪片用于治疗Ⅱ型糖尿病，格列吡嗪与盐酸二甲双胍联合用药用于Ⅱ型糖尿病患者的一线及二线治疗，为新型复方制剂，两药的降血糖作用机制互补，疗效确切。
中国药典2010版“格列吡嗪”、“格列吡嗪片”、“格列吡嗪胶囊”标准中对有关物质进行检测，检测波长均为225nm，但是没有含有格列吡嗪的复方制剂的质量检测方法。
二甲双胍格列吡嗪制剂中格列吡嗪相对盐酸二甲双胍的用量较小，现有技术中格列吡嗪有关物质的质量检测方法不适用于复方制剂中格列吡嗪有关物质的检测，且格列吡嗪的有关物质对患者造成严重不良影响，因此，发明一种科学合理、方法有效的二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法势在必行。
发明内容
本发明提供了一种二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法。
本发明主要是通过如下技术方案实现的：
二甲双胍格列吡嗪制剂的格列吡嗪有关物质的高效液相色谱测定方法所述检测波长是270-280nm；优选是275nm。
本发明所述流动相采用磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合溶液。
本发明所述磷酸二氢铵溶液-乙腈的比例为80∶20～90∶10；优选为80∶20～85∶15；更优选为84∶16。
本发明所述磷酸二氢铵溶液是磷酸二氢铵和磺酸盐混合溶液。
本发明二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法优选如下：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃；
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％；精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍；供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
本发明二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法优选如下：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定；
格列吡嗪有关物质检测方法
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃；
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％；精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍；供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
盐酸二甲双胍有关物质检测方法
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为225nm；柱温：30℃；
测定法 取本品的细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍25mg)，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使主药溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取双氰胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，作为双氰胺对照品溶液；分别精密量取上述两种溶液各1ml，置同一100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氰胺色谱峰峰高约为满量程的5％；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至盐酸二甲双胍峰保留时间的3倍；供试品溶液的色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之前出现的杂质峰，如有与双氰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照溶液中双氰胺的峰面积(0.04％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积(1.0％)。
本发明二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法专属性强、重现性好、精密度高、操作方硬，不受其他主药及辅料的干扰，能够很好的检测二甲双胍格列吡嗪制剂的质量，真正确保了临床用药的安全、有效、可控；本发明适用于二甲双胍格列吡嗪的口服制剂、注射制剂，还可以结合其他方法共同检测其质量，本发明同样可以测定格列吡嗪原料及其单方制剂的质量。
4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺为格列吡嗪的特殊杂质，以下4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺简称“有关物质A”。
有益的技术效果
通过如下试验例和实施例对本发明的技术方法作进一步的描述，但不作为对本发明的限制。
试验例1检测波长的确定
以二甲双胍格列吡嗪片为例，进行本发明试验例研究。
分别取两种主药及其特殊杂质适量，加流动相配制成浓度相当于含二甲双胍5μg/ml、格列吡嗪5μg/ml、双氰胺5μg/ml、有关物质A 5μg/ml的溶液。分别于200～400nm波长范围内扫描，四种物质均在218-235nm附近有最大吸收，常规质量检测方法建立过程中技术人员则会直接选择将波长定为218-235nm，但是本发明人经过破坏试验发现盐酸二甲双胍对格列吡嗪和其有关物质A影响很大，严重影响格列吡嗪的质量检测。本发明人对格列吡嗪进一步进行研究，格列吡嗪和有关物质A在265-285nm均有次强吸收，而二甲双胍和双氰胺在265-285nm均没有强吸收。选定格列吡嗪有关物质的检测波长为218-235nm和265-285nm进行破坏试验，进一步试验优化测定方法。
试验例2格列吡嗪破坏试验
1)样品溶液的制备
格列吡嗪原料：称取格列吡嗪约2.5mg，置25ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅰ：取实施例1所用片20片，研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅱ：取实施例5所用片20片，研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅲ：取实施例13所用胶囊20粒，研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅳ：取实施例2所用胶囊20粒，研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，共称取6份。
二甲双胍与空白辅料：称取处方量的空白辅料和盐酸二甲双胍(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，共称取6份。
2)测试液的配制方法
将上述样品分别进行不破坏及酸、碱、氧化、高温及光照等强力破坏试验，各测试液的配制方法如下：
(1)不破坏样品：取上述各1份样品，加乙腈10ml，超声使主药溶解，流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
(2)酸破坏试验：取上述各1份样品，加入1ml1mol/L盐酸溶液，放置约15小时，加乙腈10ml，超声使溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至中性，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
(3)碱破坏试验：取上述各1份样品，加入1ml1mol/L氢氧化钠试液，放置约5小时，加乙腈10ml，超声使溶解，用1mol/L盐酸溶液调pH值至中性，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
(4)氧化破坏试验：取上述各1份样品，加入1ml30％的双氧水，放置约5小时，加乙腈10ml，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
(5)高温破坏试验：取上述各1份样品，置105℃烘箱中放置约15小时后取出，加乙腈10ml，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
(6)光破坏试验：取上述各1份样品，置4500Lx±500Lx照度下放置约15小时后取出，乙腈10ml，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液待测。
3)测定法
取上述测试液各20μl，注入液相色谱仪，以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；柱温：30℃；分别在波长225nm和275nm处测定，记录格列吡嗪色谱图至格列吡嗪主峰保留时间的2倍。
不同波长下格列吡嗪有关物质破坏性试验
由上表可见，盐酸二甲双胍在225nm处有强吸收，出峰时间达10分钟以上，并且有拖尾现象，有关物质A包括在二甲双胍主峰范围内，无法分离。破坏试验的结果：在225nm二甲双胍对格列吡嗪和有关物质A的干扰相当大，而在275nm二甲双胍对格列吡嗪和有关物质A无干扰，结合波长扫描结果和破坏试验结果，为了避免盐酸二甲双胍对格列吡嗪和有关物质A测定的干扰，因此选定在格列吡嗪和有关物质A次强吸收波长265-285nm之间进一步研究。
4)不同波长下的对比试验
因为格列吡嗪和有关物质A在225nm附近和275nm附近均有强吸收，为了尽量减少二甲双胍对格列吡嗪和有关物质A测定的干扰，选用225nm和275nm进行对比试验。
色谱条件：以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长225nm和275nm；柱温：30℃。
称取二甲双胍格列吡嗪片细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，作为供试品溶液，取有关物质A对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；分别在225nm和275nm波长处测定其含量，具体结果见下表
有关物质A对比试验结果
| 波长 | 对照品峰面积 | 供试品峰面积 | 有关物质A含量(％) |
| 275nm | 20.6 | 19.9 | 0.48 |
| 225nm | 45.2 | 37.9 | 0.42 |
由上表可见，不同检测波长并未对有关物质A的测定结果产生明显影响，在275nm波长处避免了盐酸二甲双胍和其有关物质双氰胺对格列吡嗪及其有关物质A测定的干扰。
试验例3格列吡嗪波长的筛选试验
色谱条件：以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；柱温：30℃；分别在波长265nm、270nm、273nm、275nm、278nm、280nm、285nm处测定，记录格列吡嗪色谱图至格列吡嗪主峰保留时间的2倍。
称取格列吡嗪2.5mg置25ml量瓶中，作为格列吡嗪对照品溶液，取有关物质A对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为有关物质A对照品溶液。
有关物质A最小检测限的测定：取有关物质A适量，加乙腈溶解，作为储备液，分别移取适量储备液，加流动相配制成含有关物质A0.05μg/ml的溶液，进样20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，以灵敏度为评价指标，结果见下表：
波长筛选试验结果
由上表可见，在270-280nm之间峰响应值较高，最小检测限度很低；在265nm和285nm处峰响应值较低，且最小检测限度明显高于270-280nm之间。因此，将格列吡嗪检测波长定在270-280nm之间，优选为275nm。
试验例4流动相的筛选试验
1)磷酸盐种类的筛选
供试品溶液 取二甲双胍格列吡嗪片(2.5∶250mg)研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐溶液(称取2.5mmol、5mmol、10mmol磷酸盐和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
磷酸盐种类的筛选结果
由上表可见，磷酸氢二铵和磷酸氢二钠拖尾；磷酸二氢铵和磷酸氢二钾的保留时间相对合理，分离度达到要求，峰形对称。
2)离子对试剂的筛选
供试品溶液 取二甲双胍格列吡嗪片(2.5∶250mg)研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和0.01mol、0.02mol、0.03mol下表所示离子对试剂，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
离子对试剂的筛选结果
由上表可见，不加离子对试剂的流动相峰形存在拖尾现象；加离子对试剂的流动相使分离度达到要求，选用0.03mol/L的离子对试剂时柱压明显升高，易损坏色谱柱，综上优选0.01-0.02mol/L的磺酸盐离子对试剂，最优选0.02mol/L的辛烷磺酸钠。
3)有机相的筛选
供试品溶液 取二甲双胍格列吡嗪片(2.5∶250mg)研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-有机相(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
有机相的筛选试验
| 有机相 | 格列吡嗪保留时间 | 柱压(bar) | 峰形 | 基线噪音 |
| 甲醇 | 48min | 183 | 对称 | 噪音大，基线相对不平稳 |
| 乙腈 | 41min | 162 | 对称 | 噪音小，基线平稳 |
由上表可见，乙腈相对甲醇作为流动相中的有机相，保留时间相对较短，噪音小，基线平稳，柱压低，对色谱柱的损耗相对较小。因此，优选乙腈作为有机相。
4)有机相比例的筛选
供试品溶液 取二甲双胍格列吡嗪片(2.5∶250mg)研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈为流动相，两者比例如下表所示；检测波长为275nm；柱温：30℃。
流动相的筛选
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 磷酸二氢铵溶液 | 70 | 80 | 82 | 84 | 85 | 88 | 90 | 95 |
| 乙腈 | 30 | 20 | 18 | 16 | 15 | 12 | 10 | 5 |
流动相的筛选试验结果
| 编号 | 分离度 | 保留时间(min) | 峰形 | 盐酸二甲双胍干扰 |
| 1 | 小于1.5 | 23 | 不对称 | 干扰 |
| 2 | 大于1.5 | 29 | 对称，略有拖尾，但不影响测定结果 | 不干扰 |
| 3 | 大于1.5 | 34 | 对称，基线波动稍大 | 不干扰 |
| 4 | 大于1.5 | 41 | 对称，无拖尾，峰尖且窄 | 不干扰 |
| 5 | 大于1.5 | 53 | 对称 | 不干扰 |
| 6 | 大于1.5 | 64 | 对称，峰展稍宽 | 不干扰 |
| 7 | 大于1.5 | 88 | 峰展稍宽 | 不干扰 |
| 8 | 大于1.5 | 95 | 峰展宽 | 不干扰 |
由上表可见，优选磷酸二氢铵溶液-乙腈为80∶20～90∶10之间分离度、峰形符合要求；优选磷酸二氢铵溶液-乙腈为80∶20～85∶15之间；最优选磷酸二氢铵溶液-乙腈为84∶16。
5)pH值筛选
供试品溶液 取二甲双胍格列吡嗪片(2.5∶250mg)研细，称取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，调节pH值至下表所示值)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
| pH值 | 分离度 | 峰形 | 盐酸二甲双胍干扰 |
| 2.0 | 小于1.5 | 峰展宽 | 干扰 |
| 3.0 | 小于1.5 | 峰展宽 | 干扰 |
| 4.0 | 小于1.5 | 峰展宽 | 干扰 |
| 5.0 | 小于1.5 | 峰展宽 | 干扰 |
| 6.0 | 大于1.5 | 有前沿 | 不干扰 |
| 7.0 | 大于1.5 | 对称 | 不干扰 |
| 8.0 | 大于1.5 | 对称 | 不干扰 |
由上表可见，当调节pH值在7.0-8.0时，有关物质测定结果最理想，操作过程简单，方法可行，考虑到pH值在8.0时对色谱柱损坏严重，可能会使色谱柱寿命缩短。因此，优选用三乙胺调节pH值至7.0。
综上所述，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃的色谱条件将二甲双胍格列吡嗪片经各种破坏试验后各降解产物与主峰格列吡嗪均得到良好分离，建立的此色谱条件最可行。
试验例5辅料干扰试验
称取实施例1-6中制剂各辅料，加流动相配制成浓度为0.1mg/1ml的溶液，分别进样20μl，结果见下表。
| 辅料种类 | 结果 |
| 实施例1 | 不干扰 |
| 实施例2 | 不干扰 |
| 实施例3 | 不干扰 |
| 实施例4 | 不干扰 |
| 实施例5 | 不干扰 |
| 实施例6 | 不干扰 |
由上表可见，不同制剂空白辅料不干扰本品的杂质检测。
试验例6限度的确定
本发明人对格列吡嗪各杂质的限度严格控制，并对比相关药典标准的限度见下表。
格列吡嗪杂质限度
由上表可见，格列吡嗪各杂质的限度相对现有技术严格控制，引入的已知杂质有关物质A的限度为小于1.0％；其余未知杂质中单杂的限度为小于0.5％；总杂的限度为小于1.0％。
试验例7有关物质测定方法的对比研究
方法1：色谱条件：采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×15cm，含5μm填料L7)；检测波长223nm；流速为1.0ml/min；采用梯度洗脱，流动相和色谱程序如下：
流动相：溶液A-水∶磷酸铵缓冲液(2.6g磷酸氢二铵加水至1000ml，用氨水调节pH至8.0)∶乙腈＝14∶5∶1(脱气)；溶液B-乙腈∶磷酸铵缓冲液∶水＝2∶1∶1；
色谱程序：
| 时间(min) | 溶液A(％) | 溶液B(％) | 洗提 |
| 0-3 | 100 | 0 | 等强度 |
| 3-18 | 100→0 | 0→100 | 线性斜率 |
| 18-20 | 0 | 100 | 等强度 |
| 20-22 | 0→100 | 100→0 | 线性斜率 |
| 22-30 | 100 | 0 | 重新平衡 |
测定方法：取不少于5片的样品，称取适量，置量瓶中，使格列吡嗪的浓度为0.0125mg/ml，加入适量60％乙腈，超声30min后振摇30min使其溶解，用水定容，过0.2μm的滤膜，取用续滤液，作为供试品溶液。进50μl供试品溶液，记录图谱和程序中峰反应，用于列公式计算片子中格列吡嗪有关物质A(相对保留时间约为0.92)和其他单杂的百分含量：
100(1/F)(ri/rs)
式中：F为每个杂质的反应因子，格列吡嗪有关物质A的反应因子为1.4，其他杂峰的反应因子为1.0；Ri为各个杂质的峰面积；Rs为所有峰面积之和；
方法2：按照2010年版《中国药典》中“格列吡嗪片”的有关物质检测标准；
方法3：按照实施例1中格列吡嗪有关物质标准；
采用以上方法分别对制剂Ⅰ、Ⅱ的有关物质A进行了测定。有关物质检查结果见下表：
不同方法对于同一样品有关物质A测定结果
| 有关物质A含量(％) | 方法1 | 方法2 | 方法3 |
| 制剂Ⅰ | 未检出 | 未检出 | 0.26 |
| 制剂Ⅱ | 未检出 | 未检出 | 0.26 |
不同方法各物质的出峰时间
| 出峰时间(min) | 方法1 | 方法2 | 方法3 |
| 有关物质A | 15.79 | 8.4 | 26.22 |
| 格列吡嗪 | 15.77 | 9.1 | 41.87 |
对格列吡嗪有关物质A的测定中，采用方法1的标准检测制剂Ⅰ、制剂Ⅱ中有关物质A均未检出；但经过本发明人的研究发现，在复方制剂中有关物质A未检出，是因为有关物质A和格列吡嗪出峰时间非常接近(相差0.02min)，在复方制剂中所出现的15分钟左右的峰其实是杂质有关物质A和格列吡嗪共同的峰，时间非常接近(相差0.02min)以至于两峰完全重叠，实际并未分离，分离度达不到要求。
对格列吡嗪有关物质A的测定中，采用方法2的标准检测制剂Ⅰ、制剂Ⅱ中有关物质A的出峰时间太早，导致分离度不理想，格列吡嗪有关物质A未检出，但实际上所检测的对象中是存在有关物质A的(同样的物质采用方法3可以检出有关物质A)，未检出的主要因素是二甲双胍有干扰，不能有效分离，《中国药典》中“格列吡嗪片”的标准不适用于复方制剂的检验。
试验例8有关物质A方法学验证试验
本发明人对格列吡嗪有关物质A进行方法学验证试验，其中以浓度(μg/ml)对峰面积进行线性回归，A＝47.937C-4.3876，r2＝0.9991，有关物质A在0.25～10μg/ml的浓度范围内，峰面积与浓度线性关系良好；以有关物质A0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml进行回收率试验，按外标法以峰面积计算格列吡嗪的回收率RSD分别为0.58％，0.21％，0.32％，用本发明方法测定吡嗪双胍片中有关物质A，准确性好，回收率高；对有关物质A进行精密度(RSD＝0.47％))和重现性(RSD＝0.71％))考察，准确性好，精密度高；考察有关物质A放置0，1，4，6，8和12小时后的稳定性，结果各峰面积的RSD＜2％(＝0.37％)，结果无显著差异，故格列吡嗪有关物质A在有关物质测定溶液中的稳定性良好。
高效液相色谱法测定格列吡嗪的有关物质，回收率高，准确性好，精密度高，样品溶液稳定性好，在测定浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好。
试验例9二甲双胍格列吡嗪制剂中盐酸二甲双胍色谱条件的建立
1)、色谱柱的筛选
初步确定采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
2)、流动相的筛选
初步确定采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，在下表所示色谱条件下检查二甲双胍格列吡嗪片的有关物质双氰胺，并在流动相系统中加入辛烷磺酸钠；选用磷酸二氢铵溶液与乙腈进行色谱条件研究。研究结果见下表：
| 编号 | 流动相 | 检测波长 | 柱温 | 结果 |
| a | 磷酸二氢铵溶液(称取1.15g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈80∶20 | 225nm | 30℃ | 制剂中两个组分与两个已知杂质的分离效果不够理想 |
| b | 磷酸二氢铵溶液(称取1.15g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈85∶15 | 225nm | 30℃ | 双氰胺出峰处有另一个杂质，且不能分开 |
| c | 磷酸二氢铵溶液(称取1.15g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈83∶17 | 225nm | 30℃ | 未解决，仍不能分开 |
| d | 磷酸二氢铵溶液(0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈83∶17 | 225nm | 30℃ | 供试中双氰胺出峰处与另一个杂质峰分离度仍达不到要求 |
| e | 磷酸二氢铵溶液(0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈84∶16 | 225nm | 30℃ | 供试中双氰胺出峰处与另一个杂质峰分离度达到要求； |
综上，本品的色谱条件定为：以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长225nm；柱温：30℃。
3)检测波长的确定
分别取两种主药及其特殊杂质适量，加流动相配制成浓度相当于含二甲双胍5μg/ml、格列吡嗪5μg/ml、双氰胺5μg/ml、有关物质A5μg/ml的溶液。分别于200～400nm波长范围内扫描，四种物质均在218-235nm附近有最大吸收。结合破坏试验结果，最终确定盐酸二甲双胍有关物质测定的检测波长为218-235nm，优选盐酸二甲双胍有关物质测定的检测波长为225nm。
4)盐酸二甲双胍破坏试验
a.样品溶液的制备
盐酸二甲双胍原料：称取盐酸二甲双胍约12.5mg，置50ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅴ：取实施例1所用片20片，研细，称取适量(约相当于盐酸二甲双胍12.5mg)置50ml量瓶中，共称取6份。
制剂Ⅵ：取实施例2所用胶囊20粒，研细，称取适量(约相当于盐酸二甲双胍12.5mg)置50ml量瓶中，共称取6份。
格列吡嗪与空白辅料：称取处方量的空白辅料和格列吡嗪(约相当于盐酸二甲双胍12.5mg)置50ml量瓶中，共称取6份。
b.测试液的配制方法
将上述样品分别进行不破坏及酸、碱、氧化、高温及光照等强力破坏试验，各测试液的配制方法同试验例2中2)测试液的配制方法。
c.测定法
取上述测试液各20μl，注入液相色谱仪，以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；柱温：30℃。分别在波长225nm处测定，记录盐酸二甲双胍色谱图至盐酸二甲双胍主峰保留时间的3倍。
盐酸二甲双胍破坏试验结果
由上表可见，二甲双胍格列吡嗪片经各种破坏试验后各降解产物与主峰格列吡嗪均得到良好分离，建立的色谱条件可行。
5)双氰胺最小检测限
取双氰胺适量，加流动相配制成每1ml含双氰胺0.005μg/ml的溶液，进样20μl，本法可检出0.1ng的双氰胺，灵敏度符合要求。
6)辅料干扰试验
称取适量空白辅料，加流动相配制成浓度为相当于每1ml含盐酸二甲双胍0.25mg的溶液与每1ml含格列吡嗪0.1mg的溶液，分别进样20μl，空白辅料不干扰本品的杂质检测。
7)限度的确定
本发明人对盐酸二甲双胍各杂质的限度严格控制，并对比相关药典标准的限度见下表。
盐酸二甲双胍杂质限度
确定由盐酸二甲双胍引入的已知杂质双氰胺的限度为小于0.04％；其余未知杂质中单杂的限度为小于0.5％；总杂的限度为小于1.0％。
8)有关物质测定方法的对比研究
方法4：色谱条件：采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×15cm，含3.5μm填料L11)；以水：50mM的己烷磺酸钠溶液(取9.41g己烷磺酸钠加入1000ml水，用三氟乙酸调节pH值到2.0)∶40％乙腈(50∶30∶20)为流动相；检测波长218nm；流速为1.0ml/min；
测定方法：取不少于5片的样品，称取适量，置量瓶中，使格列吡嗪的浓度为0.0125mg/ml，加入适量60％乙腈，超声30min后振摇30min使其溶解，用水定容，过0.2μm的滤膜，取用续滤液，用pH2.0的稀释液(水∶50mM的己烷磺酸钠溶液∶乙腈(63∶30∶7))配制成含有盐酸二甲双胍0.1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。进25μl供试品溶液，记录图谱和程序中峰反应，用于列公式计算片子中杂质的百分含量：
100(ri/rs)
式中：Ri为各个杂质的峰面积；Rs为所有峰面积之和；
方法5：按照实施例2项下“盐酸二甲双胍有关物质”检测方法；
对二甲双胍格列吡嗪片的有关物质进行了测定。有关物质检查结果见表。
二甲双胍格列吡嗪片有关物质双氰胺测定结果
对盐酸二甲双胍有关物质的测定中，采用方法4对制剂Ⅴ进行检测，有关物质双氰胺未检出，采用方法5对制剂Ⅴ中双氰胺进行检测，结果为0.002％，因此可以推断方法4不可行。
试验例10有关物质测定结果
二甲双胍格列吡嗪片有关物质检查结果见下表。
二甲双胍格列吡嗪片有关物质测定结果
由上表可见，三批样品稳定，双氰胺杂质峰面积不大于双氰胺对照溶液峰面积(0.04％)，有关物质A杂质峰面积不大于有关物质A对照溶液峰面积(1.0％)，盐酸二甲双胍和格列吡嗪的单个杂质峰的峰面积均不大于对照溶液主峰面积的1/2(0.5％)，各杂质峰面积的总和均不大于对照溶液主峰面积(1.0％)。
下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果
下列具体的实施例进一步描述本发明，但所述的实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1二甲双胍格列吡嗪片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
格列吡嗪有关物质：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例2二甲双胍格列吡嗪胶囊有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍500g、微晶纤维素297g、聚维酮K30 23.6g、羧甲基淀粉钠72g、硬脂酸镁4.9g按照常规工艺制成1000粒；
格列吡嗪有关物质：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品内容物的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
盐酸二甲双胍有关物质：
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为225nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍25mg)，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使主药溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取双氰胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，作为双氰胺对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各1ml，置同一100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至盐酸二甲双胍峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之前出现的杂质峰，如有与双氰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照溶液中双氰胺的峰面积(0.04％)。其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积(1.0％)。
实施例3二甲双胍格列吡嗪肠溶胶囊有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍500g、微晶纤维素297g、聚维酮K30 23.6g、羧甲基淀粉钠72g、硬脂酸镁4.9g按照常规工艺装入肠溶胶囊壳，制成1000粒；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品内容物的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例4格列吡嗪片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例5二甲双胍格列吡嗪片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍500g、微晶纤维素297g、聚维酮K30 23.6g、羧甲基淀粉钠72g、硬脂酸镁4.9g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g庚烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例6二甲双胍格列吡嗪分散片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、乳糖280g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠136g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(80∶20)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例7二甲双胍格列吡嗪泡腾片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠36g、碳酸氢钠15g、枸橼酸12.5g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
格列吡嗪有关物质：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为270nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰由面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
盐酸二甲双胍有关物质：
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为225nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍25mg)，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使主药溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取双氰胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，作为双氰胺对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各1ml，置同一100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至盐酸二甲双胍峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之前出现的杂质峰，如有与双氰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照溶液中双氰胺的峰面积(0.04％)。其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积(1.0％)。
实施例8二甲双胍格列吡嗪缓释片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠36g、羟丙甲基纤维素K100M 200g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(90∶10)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例9二甲双胍格列吡嗪肠溶片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、聚维酮K30 10g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g、肠溶包衣液20g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例10格列吡嗪有关物质测定
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取1.15g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品2.5mg，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例11二甲双胍格列吡嗪冻干粉针剂有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、甘露醇150g按照常规工艺制成1000支；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为277nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一敏的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例12二甲双胍格列吡嗪注射液有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g按照常规工艺制成1000支；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为274nm；柱温：30℃。
测定法 取本品适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例13二甲双胍格列吡嗪胶囊有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微品纤维素149g、羟丙甲纤维素钠10g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000粒；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品本品内容物的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例14格列吡嗪胶囊有关物质测定
格列吡嗪2.5g、微晶纤维素149g、羟丙甲纤维素钠10g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000粒；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品内容物适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例15二甲双胍格列吡嗪滴丸有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、PEG6000 600g按照常规工艺制成1000粒；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(83.5∶16.5)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例16二甲双胍格列吡嗪缓释胶囊有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、羟丙甲纤维素钠110g、羧甲基淀粉钠36g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000粒；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃。
测定法 取本品内容物的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例17格列吡嗪控释片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、微晶纤维素149g、巴西棕榈蜡50g、聚乙二醇4000 100g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(80∶20)为流动相；检测波长为280nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)。
实施例18二甲双胍格列吡嗪控释片有关物质测定
格列吡嗪2.5g、盐酸二甲双胍250g、微晶纤维素149g、巴西棕榈蜡250g、聚乙二醇4000200g、硬脂酸镁2.5g按照常规工艺制成1000片；
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为225nm；柱温：30℃。
测定法 取本品的细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍25mg)，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使主药溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取双氰胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，作为双氰胺对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各1ml，置同一100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氰胺色谱峰峰高约为满量程的5％。精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至盐酸二甲双胍峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之前出现的杂质峰，如有与双氰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照溶液中双氰胺的峰面积(0.04％)。其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积(1.0％)。
Claims (3)
1.一种二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法，其特征在于所述格列吡嗪有关物质的高效液相色谱法中流动相采用磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合溶液，磷酸二氢铵溶液的浓度为2.5、5mmol/L，pH值为7.0±0.05，检测波长是275nm，所述流动相中磷酸二氢铵溶液是磷酸二氢铵和磺酸盐混合溶液，其流动相磷酸二氢铵溶液∶乙腈为84∶16。
2.根据权利要求1所述的二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法，其特征在于所述检测方法如下：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定；
格列吡嗪有关物质：
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为275nm；柱温：30℃；
测定法 取本品的细粉适量(约相当于格列吡嗪2.5mg)，置25ml量瓶中，加乙腈10ml，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品适量，精密称定，加适量乙腈超声使溶解，加流动相稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺色谱峰峰高约为满量程的5％；精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至格列吡嗪色谱峰保留时间的1.5倍；供试品溶液色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之后出现的杂质峰，如有与4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的峰面积(1.0％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中格列吡嗪峰面积(1.0％)；
盐酸二甲双胍有关物质：
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(称取0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05)-乙腈(84∶16)为流动相；检测波长为225nm；柱温：30℃；
测定法 取本品的细粉适量(约相当于盐酸二甲双胍25mg)，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使主药溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取双氰胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，作为双氰胺对照品溶液；分别精密量取上述两种溶液各1ml，置同一100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使双氰胺色谱峰峰高约为满量程的5％；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至盐酸二甲双胍峰保留时间的3倍；供试品溶液的色谱图中在盐酸二甲双胍主峰之前出现的杂质峰，如有与双氰胺保留时间一致的峰，其杂质峰面积不得大于对照溶液中双氰胺的峰面积(0.04％)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积的1/2(0.5％)，其它各杂质峰面积之和不得大于对照溶液中盐酸二甲双胍峰面积(1.0％)。
3.根据权利要求1所述的二甲双胍格列吡嗪制剂的质量检测方法，其特征在于所述检测方法适用于二甲双胍格列吡嗪的口服制剂、注射制剂。
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