CN108732290A - 一种格列吡嗪基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents

一种格列吡嗪基因毒性杂质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用气相色谱法测定格列吡嗪中基因毒性杂质‑环己基氨基甲酸乙酯含量的新方法，属于医药技术领域。本发明的技术方案：一种格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，其特点是采用气相色谱法（GC‑FID）测定格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量。采用气相色谱仪和FID检测器，采用直接进样方式。本发明提供了一种简单、灵敏、高效的气相色谱法（直接进样模式），用于格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯的残留检测。

Description

一种格列吡嗪基因毒性杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种用气相色谱法测定格列吡嗪中基因毒性杂质-环己基氨基甲酸乙酯含量的新方法，属于医药技术领域。
背景技术
基因毒性杂质：在以可与DNA反应物质为主要研究对象的体内/体外试验中，发现它们对DNA有潜在的破坏性。基因毒性物质在任何摄入量水平上对DNA都有潜在的破坏性，这种破坏可能导致肿瘤的产生，所以必须严格控制。
研究发现，氨基甲酸乙酯（Ethylcarbonate，EC）会引发诸如肝癌、肺癌等恶性肿瘤，对患者的免疫系统也造成严重损伤。2007年国际癌症研究机构已经将其提升为2A类致癌物。美国、加拿大、日本等国都对其最高允许含量做了限制。在中国，EC已成为目前国内食品安全重要监测项目之一。
环己基氨基甲酸乙酯是合成格列吡嗪过程中产生的具有遗传毒性致癌性警示结构的杂质，为氨基甲酸乙酯类似物。格列吡嗪（5-甲基-N-[2-[4-[[[（环己基氨基）羰基]氨基]磺酰基]苯基]-吡嗪甲酰胺）的结构式如下：
分子式为C21H27N5O4S，分子量：445.54。
环己基氨基甲酸乙酯的结构式如下：
分子式为C9H17NO2，分子量：171.24，沸点：267.47℃。
为保证格列吡嗪原料药及其制剂产品的质量，环己基氨基甲酸乙酯的残留量亦应严格控制，故亟需建立一种专属性强、准确度高、重现性及耐用性好的分析方法用于格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯残留量的检测。目前，尚无环己基氨基甲酸乙酯残留量的检测报道，其类似物氨基甲酸乙酯的检测常见于食品（主要为酒、酱油等发酵食品）中的残留控制，各类报道的氨基甲酸乙酯的检测方法很多，我国出口酒对氨基甲酸乙酯的检测方法为液/液萃取法，但是该种方法操作较为繁琐而且重现性较差、准确度不高；近年来，虽然关于固相微萃取-气质联用法或液质联用法测定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的研究较多，但是由于固相微萃取影响因素较多，普遍反映出该方法有重现性较差的缺点，同时，质谱检测器价格昂贵，大大增加了使用成本。另外，也有研究采用高效液相色谱仪对衍生化后的黄酒进行组分分离检测进而计算氨基甲酸乙酯的含量，但其体系复杂，基质干扰较多、专属性不强，极大的限制了其应用。类似于衍生化法，有研究者采用特定酶构建双酶偶联体系将氨基甲酸乙酯转化成还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）后进而采用分光光度法或电化学分析法进行检测，该方法体系构建较繁琐，不适用于化学药物的工业化快速检测。亦无氨基甲酸乙酯在医药领域的残留检测应用。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，提供一种成本低，重现性好，专属性强，应用广泛的格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法。
技术方案：一种格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，其特点是采用气相色谱法（GC-FID）测定格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量。采用气相色谱仪和FID检测器，采用直接进样方式。
本发明技术方案的特点在于，色谱柱选自型号为CP-Volamines毛细管色谱柱、TG-5MS毛细管色谱柱或TG-WAX毛细管色谱柱。
色谱条件为设置：柱温控制选自恒温法或程序升温法。
恒温法色谱柱柱温为170~190℃，优选为180℃。采用程序升温法：色谱柱初始温度为170~190℃，维持3分钟，然后以10℃/min的速率升到220℃，维持8min。
本发明所述格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，柱温控制优选恒温法。
本发明所述格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，载气流速为1.0~2.0ml/min，优选为1.5ml/min。进样口温度为220~240℃，优选为230℃。检测器温度为240~260℃，优选为250℃。分流比为5:1，载气为氮气、氦气、氢气。
本发明所述格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，载气选自氮气、氦气、氢气之一，优选为安全、价廉、易得的氮气。
本发明所述格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，进样量为1μL。
本发明所涉及的环己基氨基甲酸乙酯对照品的制备、结构确证及标定信息如下：
杂质环己胺基甲酸乙酯是由环己胺为起始物料，经酰胺化反应制备得到的。合成路线如下：
环己胺11.0g（110 .6mmol）、DMF50mL加入到250mL三口烧瓶中，控温50oC以下，滴加氯甲酸乙酯10.0g（92.2 mmol），加毕自然降至室温搅拌反应1h。加入水250mL，体系pH=2~3，二氯甲烷萃取100mL×2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物。
上述油状物柱层析纯化，用石油醚：乙酸乙酯=10:1作为淋洗，收集洗脱液浓缩，再40oC鼓风干燥得到白色固体4.7g，收率25%。
结合各种结构确证手段，对环己基氨基甲酸乙酯的化学结构进行确证，包括1H-NMR，13C-NMR，MS，具体如下：
化学名称：环己胺基甲酸乙酯
分子式：C9H17NO2
分子量：171.24
详见以下解析数据和杂质的结构确证图谱。
核磁共振氢谱（1H-NMR）与碳谱（13C-NMR）
仪器型号：Varian INOVA-600 核磁共振波谱仪
测定条件：CDCl3作溶剂
测定数据如下：
1H NMR (400 MHz, CDCl3)：4.62 (br, 1H, R-NH-CO2Et), 4.10 (q, 2H, J = 6.8Hz, -CO2CH2 -CH3), 3.47 (m, 1H, R-CH-NHCO2Et), 1.90~1.95 (m, 2H,cyclohexane),1.67~1.73 (m, 2H, cyclohexane),1.57~1.62 (m, 1H, cyclohexane),1.28~1.40 (m, 2H, cyclohexane), 1.24 (t, 3H, J = 7.2 Hz, -CO2CH2CH3), 1.08~1.19 (m, 3H, cyclohexane).
13C NMR (100MHz, CDCl3) δ: 155.85 (C=O), 60.44 (-CO2CH2CH3), 49.69 (R-CH-NHCO2Et), 33.45 (cyclohexane), 25.49 (cyclohexane), 24.79 (cyclohexane),14.63 (-CO2CH2CH3).
结果表明：样品的核磁共振结果与杂质环己胺基甲酸乙酯分子结构一致。
质谱（MS）
仪器型号：Agilent Technonlgies 6520 Accuratr-Mass Q-TOF；
测试条件：离子源：Dual ESI 毛细管电压4000 V ESI (+)；
测定数据：质谱测得本品的分子离子峰[M+H]+，其质荷比m/z为172.1315，与杂质环己胺基甲酸乙酯（分子式：C9H17NO2，分子量：171.24）的分子离子峰一致。
综合分析
综合核磁共振氢谱（1H-NMR），核磁共振碳谱（13C-NMR）及高分辨质谱（MS），确证样品分子结构与杂质环己胺基甲酸乙酯分子结构一致。
对照品标定信息
含量/纯度标定由威海迪素制药有限公司自行标定。结果如下：
按峰面积归一化法计算，含环己胺基甲酸乙酯99.8%。
本发明所述格列吡嗪中基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯含量的测定方法，包括以下4个步骤：
（1）称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，得对照品储备溶液；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
（2）精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液；
（3）色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；柱温：180℃；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
（4）分别取步骤（1）中对照品溶液、步骤（2）中供试品溶液1μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。
色谱方法的方法学验证结果如下表：
附图说明
图1是专属性试验空白溶剂色谱图。
图2是专属性试验选择性溶液色谱图。
图3是实施例1中典型对照品溶液色谱图。
图4是实施例1中典型供试品溶液色谱图。
图5是实施例2中典型对照品溶液色谱图。
图6是实施例2中典型供试品溶液色谱图。
图7是实施例3中典型对照品溶液色谱图。
图8是实施例3中典型供试品溶液色谱图。
图9是实施例4中典型对照品溶液色谱图。
图10是实施例4中典型供试品溶液色谱图。
图11是实施例5中典型对照品溶液色谱图。
图12是实施例5中典型供试品溶液色谱图。
图13是实施例6中典型对照品溶液色谱图。
图14是实施例6中典型供试品溶液色谱图。
有益效果：本发明提供了一种简单、灵敏、高效的气相色谱法（直接进样模式），用于格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯的残留检测。该方法操作简便，成本低廉，专属性强、准确度高、重复性及耐用性均较好，并首次采用气相色谱法将氨基甲酸乙酯类基因毒性杂质的检测用于医药领域，具有显著的创新性及经济学优势，可为医药领域氨基甲酸乙酯类基因毒性杂质的定量检测提供有效参考。
以下实施例中，所述三批样品均为小试验证批次，批号分别为GL-01、GL-02、GL-03。
实施例1 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取技术方案部分所述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取三批供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得三批样品的供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；柱温：180℃；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图3，典型供试品溶液色谱图见附图4。
实施例2 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取三批供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：TG-5MS（30m×0.32mm×0.25μm）；柱温：180℃；流速：0.9ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图5，典型供试品溶液色谱图见附图6。
实施例3 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：TG-WAXMS（30m×0.32mm×0.5μm）；升温程序：色谱柱初始温度：185℃，维持3分钟，然后以10℃/min的速率升到220℃，维持8min；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图7，典型供试品溶液色谱图见附图8。
实施例4 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：TG-5MS（30m×0.32mm×0.25μm）；升温程序：色谱柱初始温度：180℃，维持3分钟，然后以10℃/min的速率升到220℃，维持8min；流速：1.1ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图9，典型供试品溶液色谱图见附图10。
实施例5 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；升温程序：色谱柱初始温度：180℃，维持3分钟，然后以10℃/min的速率升到220℃，维持8min；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图11，典型供试品溶液色谱图见附图12。
实施例6 三批格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的测定
称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
分别精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；升温程序：色谱柱温度：180℃；流速：1.5ml/min；进样口温度：240℃，检测器温度：250℃；
精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。三批格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯测定结果均为未检出。典型对照品溶液色谱图见附图13，典型供试品溶液色谱图见附图14。
通过对不同实施例的结果进行对比分析，发现采用CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）时目标峰峰形最佳，此现象应归结于该色谱柱为胺类化合物检测用色谱柱，其对带有氨基的化合物的保留及分离效果均优于其他类型的色谱柱；另外，采用恒温法较程序升温法条件下采集的基线更为平整，结果重复性更佳（程序升温法重复性RSD约为9%（n=6））。
对照例 液液萃取-气相色谱法测定格列吡嗪样品中环己基氨基甲酸乙酯的含量。
溶液配制：
（1）17.5g/l盐酸溶液的配制：移取盐酸42.0ml，加水稀释至1000ml，即得；
（2）12g/l氢氧化钠溶液的配制：称取氢氧化钠24.0211g氢氧化钠，加水溶解并稀释至2000ml，即得；
（3）内标溶液的配制：精密称取氨基甲酸乙酯12.5mg，置25ml量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度；精密移取5.0ml至500ml量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，即得；
（4）环己基氨基甲酸乙酯对照品溶液的配制：精密称取环己基氨基甲酸乙酯对照品12.5mg，置100ml量瓶中，加17.5g/L盐酸溶液稀释至刻度，即得；
（5）空白溶剂：取12g/l氢氧化钠溶液50ml，置125ml分液漏斗中，用二氯甲烷提取2次，每次5.0ml，合并下层，摇匀，即得；
（6）对照品溶液：精密量取杂质B对照品溶液1.0ml，置125ml分液漏斗中，加12g/L氢氧化钠溶液50ml，用内标溶液提取2次，每次5ml，合并下层，即得；
（7）供试品溶液（a）：称取供试品约1.0g，置125ml分液漏斗中，加12g/l氢氧化钠溶液50ml使溶解，用二氯甲烷提取2次，每次5.0ml，合并下层，混匀，即得；
（8）供试品溶液（b）：称取供试品约1.0g，置125ml分液漏斗中，加12g/l氢氧化钠溶液50ml使溶解，用内标溶液提取2次，每次5.0ml，合并下层，混匀，即得；
色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；柱温：180℃；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
精密量取上述空白溶剂、供试品溶液（a）、供试品溶液（b）各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。
由于采用液液萃取方法操作繁琐，同时存在环己基氨基甲酸乙酯在水溶液中缓慢降解的问题，导致其萃取效果不理想，重现性偏差较大(RSD达24.6%)，使其无法有效的进行目标物的定量控制，故该方法不适用于格列吡嗪中环己基氨基甲酸乙酯的测定。

Claims (10)

1.一种格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，用气相色谱法测定格列吡嗪中潜在的基因毒性杂质—环己基氨基甲酸乙酯的残留量，采用气相色谱仪和FID检测器，采用直接进样方式。
2.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，色谱柱选自型号为CP-Volamines毛细管色谱柱、TG-5MS毛细管色谱柱或TG-WAX毛细管色谱柱，柱温控制选自恒温法或程序升温法。
3.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，恒温法色谱柱温为170~190℃。
4.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，恒温法色谱柱温为180℃。
5.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，程序升温法柱温升温程序为：初始温度为170~190℃，维持3分钟，然后以10℃/min的速率升到220℃，维持8min。
6.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，载气流速为1.0~2.0ml/min，进样量为1uL，进样口温度为220~240℃，检测器温度为240~260℃，分流比为5:1，载气为氮气、氦气、氢气。
7.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，载气流速为1.5ml/min。
8.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，进样口温度为230℃。
9.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，检测器温度为250℃。
10.按照权利要求1所述格列吡嗪基因毒性杂质环己基氨基甲酸乙酯含量的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）称取环己基氨基甲酸乙酯对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，得对照品储备溶液；移取上述对照品储备溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
（2）精密称取供试品约1.0g，置10ml量瓶中，加适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液；
（3）色谱条件：色谱柱：CP-Volamines毛细管色谱柱（30m×0.32mm×5μm）；柱温：180℃；流速：1.5ml/min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
（4）分别取步骤（1）中对照品溶液、步骤（2）中供试品溶液1μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算环己基氨基甲酸乙酯的残留量。
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