CN113476321B - 一种用异甜菊醇制备皮肤美白和抗黑色素生成的化妆品制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种异甜菊醇在制备皮肤美白和抑制皮肤色素生成的新用途，比现有制剂具有更显著的效果和更低的毒性。

Description

一种用异甜菊醇制备皮肤美白和抗黑色素生成的化妆品制剂 的应用

技术领域

本发明涉及异甜菊醇在制备皮肤美白和抗黑色素生成的化妆品制剂的应用，具体涉及日化领域中的化妆品应用。

背景技术

黑色素是一类不规则的类多酚聚合体，由酪氨酸或左旋多巴经一系列酶促反应得到。毛发、皮肤、眼睛，乃至是动物的外壳的颜色，在很大程度上取决于其黑色素的数量和分布浓度比。黑色素具有多种生物学功能，可以调节温度，保护皮肤免受紫外线、自由基和活性氧的影响。人体皮肤中的色素沉着过度会引起雀斑、黑斑、日晒斑、黄褐斑和老年斑等皮肤病。这些会对个体外表造成影响，情况严重的还可能导致负面情绪和心理问题，从而降低生活质量。迄今为止，临床上用于改善色素过度沉着的药物主要是黑色素生成抑制剂，如皮质类固醇，维甲酸和对苯二酚等。因为抑制黑色素生成的效果显著，这些成分在过去很长一段时间内被添加到美白产品中。但长期使用后，不少人开始出现皮肤敏感、发热或是接触性皮炎等副作用。因此，迫切需要开发更多安全有效的黑色素生成抑制剂。

异甜菊醇是一种来自甜菊糖的贝叶烷二萜类化合物。甜菊糖是广为熟知的南美洲的传统药物，具有甜味以及对心血管系统的功效(Geuns JMC.Stevioside.Phytochemistry.2003；64(5):913-21)。先前的研究表明，异甜菊醇有抗氧作用(Tan,US Patent,11/596,514,2006)。

在此发明中，我们首次提出异甜菊醇，对于酪氨酸酶具有很好的抑制活性，还可以通过抑制黑色素合成关键基因mitfb、tyr、tyrp1b和trp2抑制黑色素的合成，降低细胞中的黑色素含量，并可以作为化妆品新原料，用于化妆品中的增白剂。

发明内容

本发明旨在提供新型的黑色素生成抑制剂，揭示异甜菊醇在制备抑制皮肤色素增加、色素过度沉着和增白化妆品中的应用。本发明也发现，在安全浓度范围内，异甜菊醇对小鼠皮肤黑色素瘤B16F10细胞内的黑色素生成过程表现出显著抑制作用。且在相同浓度下异甜菊醇和Arbutin的抑制黑色素生成能力相当，且异甜菊醇对细胞的毒性明显低于Arbutin和PTU。

本发明所使用的异甜菊醇是溶解度较好的异甜菊醇钠盐。

此化合物制剂可使用的药学上可接受的盐包括常规的药学上可接受的无机或有机酸，例如：硫酸氢盐，磷酸二氢盐，甲磺酸盐，溴化物，甲基硫酸盐，乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，2-萘磺酸盐，葡糖酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，乳酸盐，丙酮酸羟乙基磺酸盐，苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。

异甜菊醇可以和固体辅料包括如糖、聚维酮和交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、淀粉、沉淀二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸镁、微晶纤维素、硫酸钙、苯二甲酸醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、直接压片混合材料、丙烯酸树脂系列五个产品、聚醚F68、玉米、羧甲基淀粉钠、预胶化淀粉、泊洛沙姆系列产品、蔗糖脂肪酸醋、低取代纤维素、乙基纤维素、卡伯波、海藻酸钠、β-环湖精、十六烷醇、十八烷醇、食用铝色淀、二氧化钛等混合制备具有作用的制剂。

异甜菊醇可以和医用液体敷料包括β-葡聚糖、血清白蛋白、透明质酸钠、银耳提取物等制成具修复、保湿、促进胶原蛋白合成的作用制剂。

异甜菊醇可以和油性成分原料混合，包括有油脂类(橄榄油，茶花油等)，蜡(荷荷巴油，棕榈蜡)类，高级油脂(硬脂酸等)类，高级乙醇(鲸蜡醇，异丙醇等)类，烃(角鲨烯)类，酯(异丙基等)类，硅类等，制备成作用制剂，防止皮肤水分流失。

异甜菊醇可以和界面活性剂，包括大豆中提取的卵磷脂、从植物性糖分中分离出的黄原胶(Xanthan Gum)、从椰子和棕榈中提取的可可和棕榈类成分、或甘蔗和橄榄油混合物总提取成分，将皮脂等污垢溶于水中卸掉。

异甜菊醇可以和外泌体、干细胞混合制成作用制剂，增强递送作用。

异甜菊醇也可以和脂质体、自然中的天然聚合物、化学物处理天然聚合物生产的半合成聚合物、单体合成的合成聚合物混合制成易于透皮的制剂，来调节成分粘度或保持产品安全性。

所述的化妆品包括但不仅限于洗面奶、面霜、手霜、乳液、面膜等。

为了更好地说明本发明的方法和技术，以下将给出实施案例，以便可以由本领域技术人员执行。

在以下实施例中详细提供了本发明的方法和实施方式。

附图说明

图1：异甜菊醇给药后的细胞内黑色素小体的电镜形态。

具体实施方式

下文描述了关于确定和鉴定本发明中异甜菊醇的药物和治疗用途的详细方法、技术、流程和特点。案例提供了用于支持及验证本发明所使用的动物模型的实验方法和结果。

涉及的案例均使用了适当的对照组实验及统计分析方法。

以下的案例均用于描述而非限制本发明的应用。

本发明中列举的案例用于支持本发明的实验方法和结果，并验证本发明中使用的斑马鱼模型和细胞。

实施例1：斑马鱼胚胎黑色素含量及酪氨酸酶实验

收集2小时内产下的斑马鱼胚胎。观察计数，剔除死亡和未成功受精的斑马鱼胚胎。将清洗后的健康胚胎(n＝100-150枚)转移到含有12mL的0.0002％(w/v)亚甲基蓝胚胎培养液的100mm无菌培养皿中。待斑马鱼胚胎在28±1℃发育到23小时，并在光学显微镜下剔除死亡，发育不同步和形态学有缺陷的胚胎，得到实验用的受精24小时的斑马鱼完整的胚胎。对于实验用去绒毛膜胚胎，用1mg/mL的链霉蛋白酶消化斑马鱼胚胎的绒毛膜。2-3分钟后，绒毛膜开始脱落，则用Holt buffer冲洗胚胎以去除所有的绒毛膜，得到健康的受精24小时的斑马鱼去绒毛膜胚胎。

黑色素相对含量＝(OD₄₅₀药物组/蛋白浓度)/(OD₄₅₀对照组/蛋白浓度)×100％。

表1斑马鱼胚胎的黑色素生成含量(X±SEM)。N＝3，与正常组相比，***p<0.001，与对照组相比，###p<0.001。200μM PTU作阳性对照。

表2不同浓度的异甜菊醇对斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的影响(X±SEM)。与正常组相比**p<0.01，***p<0.001，与对照组相比，#p<0.05。200μM PTU作阳性对照。

实施例2：qRT-PCR测定黑色素生成相关基因表达水平

获得24hpf去绒毛膜胚胎和胚胎分组及给药，收集经2mL药液处理24小时后的胚胎，用无菌PBS反复清洗3次后，进行总RNA提取，逆转录cDNA及qRT-PCR实验，测定黑色素生成相关基因的转录产物水平。

异甜菊醇可下调mitfb、tyr、tyrp1b和trp2基因的表达，从而减少黑色素的生成含量。阳性对照组PTU是酪氨酸酶活性直接抑制剂，对基因表达水平没有影响。

实施例3：小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞实验

取9-11代的B16-F10细胞进行实验，分为4个组别：正常组Control、给药组异甜菊醇和阳性对照组Arbutin和PTU。检测异甜菊醇对B16F10细胞黑色素毒性、生成及酪氨酸酶活性的影响。

表3异甜菊醇对B16-F10细胞细胞增殖率/毒性的影响(X±SEM)。N＝3，与正常组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表3异甜菊醇对B16-F10细胞内黑色素生成含量的影响(X±SEM)。N＝3，与正常组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

常规培养48小时，弃上清培养基，PBS洗涤1次，每孔加入100μL的酶促反应底物溶液。培养箱孵育4小时后，475nm波长处测定OD值。按公式计算：

酪氨酸酶活性＝(加药组OD₄₇₅-空白孔OD₄₇₅)/(正常组OD₄₇₅-空白OD₄₇₅)×100％

给药48小时后，以L-DOPA为底物的酪氨酸酶酶促反应率。

表4异甜菊醇对B16F10细胞内酪氨酸酶活性的影响。N＝3，每组三个重复孔，与正常组相比较，*p<0.05，***p<0.001。

Claims (6)

1.异甜菊醇钠盐作为皮肤黑色素生成抑制剂在制备皮肤美白制剂中的用途，所述皮肤美白制剂为皮肤给药制剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的皮肤美白制剂能够降低个体细胞黑色素水平和整体皮肤黑色素的水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的皮肤美白制剂能够减少细胞内黑色素的生成和黑色素小体的数目和大小。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的皮肤美白制剂能够使酪氨酸酶的活性下降。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的皮肤美白制剂为膏剂、霜剂、贴剂、凝胶剂、喷剂、脂质体、面膜、手膜、脚膜或者眼膜。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的皮肤美白制剂是化妆品。