CN113322253B - 一种基于磁性材料提取基因组dna的试剂盒及应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒及应用方法，该试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，所述磁珠悬浮液中的磁珠为Fe3O4@UiO‑66复合材料；所述洗脱液为TE缓冲液；本发明选用Fe3O4@UiO‑66复合材料作为DNA吸附材料，通过锆离子与四氧化三铁之间的相互作用形成具有孔隙的复合材料，通过孔隙吸附，在磁场作用下实现核酸分离，对核酸提取相关研究具有较大意义。本发明还提供了该试剂盒的应用方法，该方法具有成本低、提取效率高、提取的核酸纯度高的特点，且不仅适用于细菌核酸提取，还可应用于其他病原微生物及生物组织核酸的提取。
Description
技术领域
本发明涉及基因组DNA提取技术领域，更具体地，涉及一种基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒及应用方法。
背景技术
DNA提取的质量是进行生物检测的基础，关系到检测以及科研方面的准确性与时效性。目前DNA提取的方法多采用传统DNA提取方法，应用酚氯仿等有机溶剂进行提取，而酚氯仿存在毒害危险；采用过柱的方式提取DNA，虽然能够得到一定纯度的DNA溶液，但需要多次离心，且不能进行大批量样本进行同时抽提；采用碱法提取细菌DNA，虽然方法简单快速，但得到核酸纯度和浓度都不高，难以达到检测和科研的目的。
磁珠法是一种通过磁珠表面的孔径吸附核酸并进行包裹，在磁力作用下将核酸与混合液分离的方法，该方法快速简便，且所得核酸浓度相比其他的核酸提取技术相对要高。但现有的磁珠法，所使用的磁珠制备过程复杂，而且对DNA的提取效果不佳。
发明内容
基于现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种基于磁性材料提取细菌基因组DNA的试剂盒，使用该试剂盒可快速对生物样本中多种细菌核酸进行提取，而且得到的核酸洗脱液可直接用于PCR或定量PCR技术检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，所述磁珠悬浮液中的磁珠为Fe3O4@UiO-66复合材料；所述洗脱液为TE缓冲液。
在一些实施方式中，所述磁珠悬浮液中磁珠浓度为80-150mg/mL，磁珠大小为110-120nm。
在一些实施方式中，所述Fe3O4@UiO-66复合材料采用热溶剂法制备，具体为：将四氧化三铁、四氯化锆和对苯二甲酸溶解在DMF中，再加入乙酸，混合均匀，然后在130～150℃下加热进行反应，反应完成后，冷却至室温，用水和乙醇交替清洗，并干燥，即得Fe3O4@UiO-66复合材料。
在一些实施方式中，所述裂解液包括盐酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、二硫苏糖醇、Triton-100和柠檬酸，所述裂解液pH6.0-7.0，盐酸胍浓度为5-7.4mol/L。优选的，所述十六烷基三甲基溴化铵体积浓度为2-5％，Triton-100体积浓度为1-3％，柠檬酸浓度为20-35mmol/L，二硫苏糖醇体积浓度为0.1-0.2％，其余为水。
在一些实施方式中，所述结合液包括异丙醇；所述洗涤液包括第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液包括盐酸胍和乙醇，所述第二洗涤液包括乙醇；所述洗脱液包括Tris-HCl和EDTA。
在一些实施方式中，所述第一洗涤液中盐酸胍浓度为3-5mol/L，乙醇和盐酸胍按体积比1:1添加；所述第二洗涤液中，乙醇为80％乙醇；所述洗脱液中，Tris-HCl浓度为5-10mol/L，EDTA浓度为1.5-3.0mmol/L。
本发明的目的之二在于提供一种提取细菌基因组DNA的方法，该方法使用上述任一实施方式的试剂盒进行基因组DNA提取。
在一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
S1、将菌液进行离心分离，去除上层清液，留下菌体；
S2、在所述菌体中加入所述裂解液和蛋白酶K，进行裂解和酶解；
S3、接着加入所述磁珠悬浮液和结合液，振荡，去除裂解混合物；
S4、加入第一洗涤液或第二洗涤液，振荡，静置，去除上层清液；再加入第二洗涤液或第一洗涤液，振荡，静置，去除上清液；
S5、最后加入洗脱液，振荡，静置，转移洗脱液，得到含有核酸的洗脱液，即为核酸溶液。
需要说明的是，当步骤S1中的菌体小于200μL时，无需离心；当菌体大于200μL时，需离心去除上清液。
步骤S4中，具体为：先加入第一洗涤液，振荡，静置，去除上层清液，再加入第二洗涤液，振荡，静置，去除上层清液；或者，先加入第二洗涤液，振荡，静置，去除上层清液，再加入第一洗涤液，振荡，静置，去除上层清液。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述裂解液、菌液和蛋白酶K的体积比为(30～35)：20:2；步骤S3中，所述磁珠悬浮液和所述结合液的体积比为(30～20)：1；步骤S4中，所述第一洗涤液和第二洗涤液与所述裂解液的体积比分别为(1～7)：(2～12)；步骤S5中，洗脱液与步骤S1中的所述菌液的体积比为(1～4)：(2～5)。优选的，步骤S2中，裂解液、菌液和蛋白酶K的体积比为35:20:2；步骤S3中，所述磁珠悬浮液和所述结合液的体积比为23:1；步骤S4中，所述洗涤液和所述裂解液的体积比为2:1；步骤S5中，所述洗脱液和步骤S1中的所述菌液体积比为2:5。
具体地，步骤S4中，第一洗涤液和裂解液的体积比为(1～7)：(2～12)，第二洗涤液和裂解液的体积比同样为(1～7)：(2～12)。
在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：
S1、将细菌和培养液混合，在1000r/min的速度下离心分离60s，去除上层细菌培养液，留下底部细菌菌体；
S2、向步骤S1所得菌体中加入裂解液和蛋白酶K，充分混匀，在56℃条件下孵育20-30min，得到菌液；
S3、将裂解后所得的菌液加入到96孔板的第1列和第7列中，第2列和第8列中加入磁珠悬浮液和无菌水或超纯水，在第3列和第9列加入第一洗涤液，第4列、第5列、第10列和第11列加入第二洗涤液，第6列和第12列加入洗脱液；
S4、将所述96孔板放入到核酸自动提取机中提取，等待程序运行结束后得到含有细菌核酸的洗脱液，即为核酸溶液。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述磁珠悬浮液与超纯水或无菌水的体积比为10-20μL：400-500μL，所述第一洗涤液和第二洗涤液均为500-750μL，所述洗脱液为80-100μL。
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明选用Fe3O4@UiO-66复合材料作为DNA吸附材料，通过锆离子与四氧化三铁之间的相互作用形成具有孔隙的复合材料，利用磁珠的孔隙吸附核酸，并在磁场作用下实现核酸分离。本发明对核酸提取相关研究具有较大意义。本发明的方法具有成本低、提取效率高、提取的核酸纯度高的特点，且不仅适用于细菌核酸提取，还可应用于其他病原微生物及生物组织核酸的提取。
除此之外，本发明还具有以下优点：
①本发明选用Fe3O4@UiO-66复合材料作为磁珠，该材料是一种新型磁性材料，对核酸吸附能力强；
②使用独特的裂解液，对各种细菌具有较强的裂解作用，应用范围广；
③使用本发明的试剂盒提取细菌DNA，可进行手动提取或自动提取，自动提取如通过核酸提取仪进行自动提取等，均能得到较高浓度的细菌核酸溶液；
④本发明的细菌DNA提取方法得到的核酸溶液可以直接用于PCR或荧光定量PCR实验中。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的Fe3O4@UiO-66复合材料的合成及结构示意图；
图2为实施例1制得的Fe3O4@UiO-66复合材料大小分布图；
图3为实施例1制得的Fe3O4@UiO-66复合材料的电镜分析图；
图4为本发明实施例2得到的核酸溶液进行定量PCR检验的效果图；
图5为本发明实施例2得到的核酸溶液进行定量PCR检验的效果图；
图6为本发明实施例3得到的核酸溶液用于荧光定量PCR的效果图；
图7为本发明实施例3得到的核酸溶液用于荧光定量PCR的效果图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种基于磁性材料提取细菌基因组DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠，磁珠为Fe3O4@UiO-66复合材料，洗脱液为TE缓冲液；洗涤液包括第一洗涤液和第二洗涤液。
具体地，磁珠、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液分别通过以下方法制备：
(1)磁珠的制备：采用热溶剂法进行制备，具体为：称取0.2g的四氧化三铁，0.15g四氯化锆和0.13g的对苯二甲酸溶解在80mL的DMF中，再加入4mL乙酸，超声10min，得到悬浮液；将悬浮液转移到100mL聚四氟乙烯高压釜中，然后在130℃下加热12h，冷却至室温；最后，用水和乙醇交替清洗3次，在70℃下干燥12-14h，得到Fe3O4@UiO-66复合材料，即磁珠，其合成过程及结构如图1所示。通过DLS测定，制得的Fe3O4@UiO-66复合材料平均大小为114nm(如图2所示)；再通过透射电镜对Fe3O4@UiO-66复合材料的形貌进行表征，表征结果如图3所示，由图3可知，该复合材料核壳结构的壳体平均厚度约为20-50nm。
磁珠悬浮液的配制：将制得的磁珠加入超纯水中，搅拌均匀，即得磁珠悬浮液。可根据所需浓度进行配制，下述的实施例中所用的磁珠悬浮液中磁珠浓度为100mg/mL。
(2)裂解液的配制：称取6.69g盐酸胍和0.2g十六烷基三甲基溴化铵于烧杯中，用少量的水溶解，加入500μL0.5mol/L的EDTA.2Na，再加入200μL Triton-100，在加热条件下溶解，调pH到6.0-7.0，冷却后加入10μL 1mol/L二硫苏糖醇，再用容量瓶定容至10mL，得到裂解液。
(3)第一洗涤液的配制：称取盐酸胍于烧杯中用无菌水溶解，再用容量瓶定容让盐酸胍终浓度为4mol/L；将4mol/L的盐酸胍与无水乙醇1:1混合，第一洗涤液。
(4)第二洗涤液的配制：对无水乙醇进行稀释，让乙醇的含量为80％。
(5)洗脱液的配制：①配制1mol/L Tris-HCl溶液：称取Tris-HCl用水溶解，再用容量瓶定容，调pH为7.0-8.0，让终浓度为1mol/L；②配制0.5mol/L的EDTA·2Na：称取EDTA·2Na，用水溶解，再用容量瓶定容，调pH为7.0-8.0，让终浓度为0.5mol/L；③取1ml Tris-HCl溶液和EDTA·2Na溶液于容量瓶中，用水定容到100mL，得到1xTE洗脱液。
实施例2
使用实施例1中的试剂盒进行手工提取细菌基因组DNA的方法，具体步骤如下：
S1、配制LB液体培养基，接种活化菌种，在37℃条件下200r/min培养12-14h；
S2、取混合菌液1ml，在10000r/min速度下离心60s；
S3、加入350μL裂解液和20μL蛋白酶K孵育20分钟；
S3、加入350μL结合液和15μL磁珠悬浮液，充分混匀，静置10min，用磁力架吸附磁珠，去除清液；
S4、加入700μL第一洗涤液，充分振荡混匀，1min后用磁力架吸附磁珠，去除清液；再加入第二洗涤液80％乙醇，充分混匀，1min后磁力架吸附磁珠，去除清液，该步骤重复一次；
S5、最后加入80μL洗脱液，55℃洗脱5min，用磁力架将磁珠吸附到管壁，转移洗脱液，得到含核酸的洗脱液，即为核酸溶液。经检测，核酸溶液核酸浓度为203.7ng/mL。将得到的核酸溶液进行定量PCR，检验提取的效果，检验结果如图4和图5所示。图4为蜡样芽孢杆菌16S基因扩增曲线图；图5为蜡样芽孢杆菌16S基因扩增溶解曲线图。
实施例3
使用实施例1中的试剂盒进行自动化提取细菌基因组DNA的方法，具体步骤如下：
S1、取混合lml加入至EP管中，10000r/min速度离心60s，弃去上清液；
S2、加入350μL裂解液和20μL蛋白酶K混匀进行裂解和酶解；
S3、将混合液体加入96板的1列7列，并加入350μL结合液(即异丙醇，加入后，异丙醇浓度为38％)；
S4、把15μL磁珠悬浮液和400μL去离子水加入至96板的2列8列；将600μL第一洗涤液加入到96板的3列和9列，第二洗涤液加入到4、5列和10、11列；将80μL洗脱液加入96板的6列和12列；
S5、把96板置于核酸提取仪中，设置裂解结合时间8分钟，第一次洗涤时间60s，第二次洗涤时间为60S，第三次洗涤时间为5min；洗脱时间4min，丢弃磁珠10s。程序设置好后运行核酸提取仪；提取结束后将6列和12列内的洗脱液转移到新的EP管中，得到含有核酸的洗脱液，即为核酸溶液。经检测，核酸溶液中核酸浓度为372.7ng/mL。将所得核酸溶液用于用荧光定量PCR，测定结果如图6和图7所示。图6为蜡样芽孢杆菌16S基因扩增曲线图；图7为蜡样芽孢杆菌16S基因扩增溶解曲线图。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，所述磁珠悬浮液中的磁珠为Fe3O4@UiO-66复合材料；所述洗脱液为TE缓冲液；所述Fe3O4@UiO-66复合材料采用热溶剂法制备，具体为：将四氧化三铁、四氯化锆和对苯二甲酸溶解在DMF中，再加入乙酸，混合均匀，然后在130~150℃下加热进行反应，反应完成后，冷却至室温，用水和乙醇交替清洗，干燥，即得Fe3O4@UiO-66复合材料。
2.根据权利要求1所述的基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液中磁珠浓度为80-150mg/mL，磁珠大小为110-120nm。
3.根据权利要求1-2任一项所述的基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括盐酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、二硫苏糖醇、Triton-100和柠檬酸，所述裂解液pH6-7，盐酸胍浓度为5-7.4mol/L。
4.根据权利要求1所述的基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述结合液包括异丙醇；所述洗涤液包括第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液包括盐酸胍和乙醇，所述第二洗涤液包括乙醇；所述洗脱液包括Tris-HCl和EDTA。
5.根据权利要求4所述的基于磁性材料提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液中盐酸胍浓度为3-5mol/L，乙醇和盐酸胍按体积比1:1添加；所述第二洗涤液中，乙醇为80%乙醇；所述洗脱液中，Tris-HCl浓度为5-10mol/L，EDTA浓度为1.5-3.0mmol/L。
6.一种提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行基因组DNA提取。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、将菌液进行离心分离，去除上层清液，留下菌体；
S2、在所述菌体中加入所述裂解液和蛋白酶K，进行裂解和酶解；
S3、接着加入所述磁珠悬浮液和结合液，振荡，去除裂解混合物；
S4、加入第一洗涤液或第二洗涤液，振荡，静置，去除上层清液；再加入第二洗涤液或第一洗涤液，振荡，静置，去除上清液；
S5、最后加入洗脱液，振荡，静置，转移洗脱液，得到含有核酸的洗脱液，即为核酸溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述裂解液、所述菌液和所述蛋白酶K的体积比为（30~35）：20:2；步骤S3中，所述磁珠悬浮液和所述结合液的体积比为（30~20）：1；步骤S4中，所述第一洗涤液和第二洗涤液与所述裂解液的体积比分别为（1~7）：（2~12）；步骤S5中，所述洗脱液与步骤S1的所述菌液的体积比为（1~4）：（2~5）。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将细菌和培养液混合，在1000r/min的速度下离心分离60s，去除上层细菌培养液，留下底部细菌菌体；
S2、向步骤S1所得菌体中加入裂解液和蛋白酶K，充分混匀，在56℃条件下孵育20-30min，得到菌液；
S3、将裂解后所得的菌液加入到96孔板的第1列和第7列中，第2列和第8列中加入磁珠悬浮液和无菌水或超纯水，在第3列和第9列加入第一洗涤液，第4列、第5列、第10列和第11列加入第二洗涤液，第6列和第12列加入洗脱液；
S4、将所述96孔板放入到核酸自动提取机中提取，等待程序运行结束后得到含有细菌核酸的洗脱液，即为核酸溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述磁珠悬浮液与超纯水或无菌水的体积比为10-20μL：400-500μL，所述第一洗涤液和第二洗涤液均为500-750μL，所述洗脱液为80-100μL。
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