CN113288893B - 倍半萜内酯类化合物在制备治疗肾性贫血药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种倍半萜内酯类化合物天名精内酯酮新的生物活性——抑制脯氨酸羟化酶2并提升细胞中促红细胞生成素表达水平。脯氨酸羟化酶2抑制剂筛选实验结果显示，天名精内酯酮具有抑制脯氨酸羟化酶2的活性。生物活性实验显示，天名精内酯酮能显著提升HK‑2与Hep3B细胞中促红细胞生成素的表达水平，可作为主要活性成分用于制备治疗肾性贫血的药物。天名精内酯酮的结构如下：

Description

倍半萜内酯类化合物在制备治疗肾性贫血药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种倍半萜内酯类化合物天名精内酯酮的新的生物活性及应用——抑制脯氨酸羟化酶2活性，并提升细胞中促红细胞生成素表达水平，因此可作为活性物质用于制备治疗肾性贫血药物中，属于生物医药用途领域。

背景技术

贫血作为慢性肾病的常见并发症，主要发病机制是肾脏中内源性促红细胞生成素合成不足，其发病率随患者肾功能下降逐渐升高。在慢性肾病的发展过程中，肾脏中生成促红细胞生成素的肾小管成纤维细胞被转化为肌成纤维细胞，此过程将导致合成促红细胞生成素的能力下降，进而加速肾性贫血的发展。慢性肾病患者在出现贫血症状后若不及时干预，会严重影响生活质量并提高冠心病、心肌梗死等心血管疾病的发病率。目前，肾性贫血的较为成熟的治疗方法为补铁治疗、红系造血刺激剂（ESA）治疗和输血治疗，但这三种方法在改善患者贫血症状的同时也表现出严重的不良反应，补铁治疗中铁补充量通常超过人体负荷，长期以往会扩大体内氧化损伤、增加感染风险，并且患者长期摄入补铁剂常引发严重的胃肠道反应；ESA治疗会使体内产生超人体负荷的半合成促红细胞生成素，此作用将明显增加卒中、心肌梗死、高血压、癫痫等严重不良反应的发病风险；输血治疗常伴有溶血反应、发烧等副作用。

目前，通过稳定低氧诱导因子促进促红细胞生成素表达的方法以其安全性和有效性成为治疗肾性贫血的新选择。低氧诱导因子是调控促红细胞生成素表达的关键因子，脯氨酸羟化酶是调控低氧诱导因子的主要限速酶，其中脯氨酸羟化酶2存在于多个组织中，且对低氧诱导因子不同亚型均具有调控作用，被认为是脯氨酸羟化酶中最重要的亚型。脯氨酸羟化酶2抑制剂可以稳定低氧诱导因子进而促进促红细胞生成素表达，促使体内红细胞生成量上升以治疗肾性贫血。因此，寻找高效、安全的脯氨酸羟化酶2抑制剂对开发治疗肾性贫血的新药具有重要意义。

倍半萜类化合物是分子骨架由3个异戊二烯基单元构成的，含15个碳原子的萜类化合物，其多以含氧衍生物，如醇、酮、内酯等形式存在于挥发油中，多有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。已有研究表明，倍半萜类化合物多存在于菊科植物中，目前全球共发现菊科植物约1000个属，其中我国有233个属的分布，丰富的自然条件为我国深入研究倍半萜的新结构、新骨架，开发新用途提供了得天独厚的物质基础。目前分离得到的多个倍半萜类化合物已证实具有显著的抗肿瘤、抗炎、神经保护、抗真菌等活性，此类化合物的进一步研究对药物先导化合物的发现和活性化合物来源植物的深入开发具有重要意义。

本专利通过建立脯氨酸羟化酶2酶促反应体系，利用高效毛细管电泳筛选得到对脯氨酸羟化酶2具有抑制活性的倍半萜类化合物，并在细胞实验中发现该倍半萜内酯类化合物可显著提升HK-2与Hep3B细胞中促红细胞生成素的表达水平，可作为活性成分用于制备治疗肾性贫血的药物。

发明内容

本发明的目的是通过对该倍半萜内酯类化合物抑制脯氨酸羟化酶2并提升细胞中促红细胞生成素表达的活性进行研究，以期用于制备治疗肾性贫血的药物。

下面通过脯氨酸羟化酶2抑制剂筛选试验、调控HK-2、Hep3B中促红细胞生成素表达试验对倍半萜内酯类化合物抑制脯氨酸羟化酶2并激活细胞中促红细胞生成素的活性进行说明。上述倍半萜内酯类化合物为天名精内酯酮，结构式如下：

R₁=CH₂、R₂=H、R₃=H、R₄=O、R₅=CH₃、R₆=H。

1、脯氨酸羟化酶2抑制剂筛选试验

1.1 脯氨酸羟化酶2酶促反应条件

使用大肠杆菌表达的脯氨酸羟化酶2（EC:1.14.11.29）的部分序列（177-426）用于抑制活性化合物的筛选。酶促反应液包括：二硫苏糖醇 500 μM，抗坏血酸 500 μM，α-酮戊二酸 150 μM，氯化亚铁 200 μM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.0）50 mM，低氧诱导因子 60 μM，脯氨酸羟化酶2 3 μM。将配制完成的酶促反应样品于28℃孵育4 h，之后加入等体积邻苯二胺（OPD）10 mM，于110℃加热20 min实现α-酮戊二酸与OPD的衍生化，随后使用毛细管电泳仪分离并积分α-酮戊二酸与OPD的衍生化后的峰。

1.2 毛细管电泳检测方法的建立

使用高效毛细管电泳建立检测方法，经条件优化，选取长度为90 cm，内径为50 μM的石英毛细管，背景缓冲液为20 mM 四硼酸钠（pH=9.0），运行电压+25 kV，卡盒温度为25℃，待测样品用50 mbar进样10 s，检测波长为210 nm。

每次进样前毛细管需依次用1 M HCl冲洗120 s，H₂O冲洗50 s，1 M NaOH冲洗120s，H₂O冲洗50 s，背景缓冲液冲洗150 s。

1.3 计算活性化合物IC₅₀

通过检测并积分酶促反应后含化合物的样品（Sample）与不含化合物的对照样品（PHD2）的α-酮戊二酸衍生物的峰面积差量除以无脯氨酸羟化酶2的样品（Control）与不含化合物的对照样品（PHD2）的α-酮戊二酸衍生物的峰面积差量，得到活性化合物的抑制率，计算公式为：

实验结果：通过建立脯氨酸羟化酶2酶促反应体系，利用高效毛细管电泳分离检测并积分样品中α-酮戊二酸衍生物的峰面积以计算该倍半萜内酯化合物的IC₅₀值。图1为天名精内酯酮抑制PHD2的IC₅₀曲线。由IC₅₀曲线可得天名精内酯酮的IC₅₀值为80.16 μM，说明天名精内酯酮对PHD2具有较强的抑制能力，可作为活性成分进一步研究其抑制PHD2激活低氧诱导因子并提高下游靶基因的表达水平对相关疾病产生的治疗作用。

2、调控HK-2、Hep3B细胞因子试验

实验方法：取处于对数期生长细胞，接种于6孔板（1×10⁶/孔），加样品处理后，使用胰酶消化收集细胞，转移至EP管中，加入1 mL Trizol裂解细胞，收集RNA液体层，向其中加入异丙醇沉淀核酸，75%乙醇处理后12000 rpm离心5 min，吸除残液后加入DEPC水，并进行RNA定量。加入总RNA、DEPC水和Mix试剂配制反转录体系，得到cDNA产物。再在此基础上加入上下游引物及Mix试剂配制PCR体系，上机后95℃预变性2 min，在循环反应中，95℃保持5s，60℃保持30 s，进行40个循环，反应结束后，根据扩增曲线和融解曲线，测定hEPO mRNA相对含量。其中引物序列如下：

h-EPO-F: GCTGCATGTGGATAAAGCCG

h-EPO-R: AGACTCGGAAGAGTTTGCGG

实验结果：在HK-2细胞中（见图2），经2.5 μM和5.0 μM样品处理组，hEPO mRNA的表达量与对照组相比有显著差异（ p<0.05）。在Hep3B细胞中（见图3），经10 μM样品处理组，hEPO mRNA的表达量与对照组相比有显著差异（ p<0.05），20 μM处理表现出极显著差异（ p<0.01）。这些结果表明，天名精内酯酮显著增强了hEPO mRNA的表达量。

综上所述，天名精内酯酮对脯氨酸羟化酶2具有抑制作用，并通过抑制脯氨酸羟化酶2稳定低氧诱导因子，提升了细胞中促红细胞生成素的表达水平，因而可作为活性成分用于治疗肾性贫血。

附图说明

图1为天名精内酯酮抑制PHD2的IC₅₀曲线。

图2为天名精内酯酮调控HK-2细胞中hEPO mRNA的表达水平。

图3为天名精内酯酮调控Hep3B细胞中hEPO mRNA的表达水平。

具体实施方式

以天名精内酯酮为主要药物活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂，包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液或注射剂。

Claims (4)

1.天名精内酯酮或其药用盐在制备治疗肾性贫血药物中的应用。

2.如权利要求1所述天名精内酯酮或其药用盐在制备治疗肾性贫血药物中的应用，其特征在于：天名精内酯酮或其药用盐抑制脯氨酸羟化酶2的活性，提升HK-2与Hep3B细胞中促红细胞生成素的表达水平。

3.如权利要求1所述天名精内酯酮或其药用盐在制备治疗肾性贫血药物中的应用，其特征在于：以天名精内酯酮或其药用盐为活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂或注射剂。

4.如权利要求3所述天名精内酯酮或其药用盐在制备治疗肾性贫血药物中的应用，其特征在于：内服制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、片剂或口服液。

Images