CN113277623B - 丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用。本发明是本发明发明人发现了丝状固氮蓝藻能有效降低水体得克隆浓度得到的发明创造。本发明不仅提供了一种得克隆的生物处理方法，而且由于丝状固氮蓝藻易于收集，容易从水体中分离，从而水体后续处理简单。

Description

丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用
技术领域
本发明属于污染物的生物处理领域，特别涉及丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用。
背景技术
得克隆(Dechlorane Plus，简称DP，CAS号：13560-89-9)，或称Dechlorane605，是一种添加型多氯代阻燃剂。得克隆主要应用于电线、电缆、尼龙、电子元件、电视以及计算机外壳等高分子材料。作为添加型阻燃剂，得克隆自身与聚合物之间无化学键连接，在其相关产品的生产使用和回收过程中极易释放到环境中，由此产生的污染近年才引起人们的关注。目前，已在世界许多地区的大气、水体、土壤、沉积物等介质和生物中被检测到。得克隆具有持久性、长距离迁移性、生物积累性以及潜在毒性等特性。研究表明长期皮肤接触和吸入高浓度得克隆会造成肺部、肝脏和生殖系统组织病变等。此外，得克隆还具有雌激素效应(刘志远等，2014)。中国作为阻燃剂使用的得克隆的生产始于2004年江苏安邦电化有限公司，年产量约300～1000t。得克隆已在国内很多区域的土壤、水体、底泥，甚至鱼类等生物中检测到，其生态环境风险值得关注。
对于持久性污染物处理最有效也最常用的方法是化学法，但存在二次污染风险，且处理费用较高。而环境友好价格低廉的生物处理法具有更大的应用潜力。研究表明很多微生物具有富集去除或降解难以降解的有机污染物的能力，是最重要的生物处理方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，是基于本发明发明人发现丝状固氮蓝藻能有效去除水体中的得克隆，且丝状固氮蓝藻的生长未受到得克隆的影响，丝状形态完整可以直接用纱布过滤。
所述的丝状固氮蓝藻优选为沼泽念珠藻(Nostoc paludosum)FACHB 89、固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)FACHB 119、念珠藻属(Nostoc sp.)FACHB-131和鱼腥藻属(Anabaena sp.)UTEX 2576S中的至少一株；更优选为固氮鱼腥藻(Anabaena azoticaFACHB 119)。
所述的得克隆优选为顺式得克隆和反式得克隆中一种或两种。
上述丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，优选包括如下步骤：
(1)将丝状固氮蓝藻培养至对数生长期；
(2)将对数生长期的丝状固氮蓝藻接种到含得克隆的培养液中，得到处理后的水体。
上述丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，还包括如下步骤：
(3)将步骤(2)得到的处理后的水体过滤，得到去除得克隆和丝状固氮蓝藻的水体。
步骤(1)中所述的培养的培养基为BG110液体培养基。
所述的BG110液体培养基的组成如下：K2HPO4·3H2O 0.04g/L、MgSO4·7H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001 g/L、Na2CO30.02g/L、微量元素A5 1mL，余量为水；
微量元素A5的组成如下：H3BO3 2.860g/L、NaMoO4·2H2O 0.021g/L、ZnSO4·7H2O0.222g/L、CuSO4·5H2O 0.079g/L、MnCl2·4H2O 1.810g/L、NiSO4·6H2O 0.479g/L，余量为水。
步骤(1)中所述的培养的条件优选为于25～30℃、光照2500～4000lx、光暗时间为14～18h：6～10h进行培养；更优选为于28℃、光照、光暗时间为16h:8h进行培养。
步骤(1)中所述的对数生长期优选为OD680为0.8～1.2；更优选为1。
所述的接种量优选为接种得到的水体OD680为0.08～0.1。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明发明人发现了丝状固氮蓝藻能有效降低水体得克隆浓度，从而提供了丝状固氮蓝藻的新用途。丝状固氮蓝藻用于去除水体得克隆，不仅提供了一种得克隆生物处理方法，而且丝状固氮蓝藻易于收集，容易从水体中分离，后续处理简单。
附图说明
图1是不同固氮蓝藻藻株对反式得克隆去除能力实验图。
图2是A.azotica FACHB-119在含得克隆的培养液中的生长曲线图(左)和实验照片图(右)。
图3是A.azotica FACHB-119对顺式得克隆的去除效果图。
图4是A.azotica FACHB-119对反式得克隆的去除效果图。
图5是纱布过滤法收集藻细胞实验图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：固氮蓝藻藻株的筛选
(1)藻种活化
藻种的活化：从中国科学院淡水藻种库获得的3株丝状固氮蓝藻(Nostocpaludosum FACHB 89、Anabaena azotica FACHB 119、Nostoc sp.FACHB-131)及从美国德州UTEX藻种库获得的1株丝状固氮蓝藻(Anabaena sp.UTEX2576S)。从平板上取少量加入含20mL无菌BG110液体培养基的50mL玻璃三角瓶中，在光照培养箱中温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h预培养7天。然后再将预培养藻进行转接2次。
具体方法为：将预培养得到的固氮蓝藻藻液转接到20mL BG110液体培养基中，使得其OD680约等于0.1。在含有20mL的无菌BG110液体培养基的50mL玻璃三角瓶中培养至对数生长期(OD680约为1)，取对数生长期藻液再按上述步骤进行转接一次，按照预培养的条件进行培养至对数生长期。培养条件均为：温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h。
(2)固氮蓝藻的筛选
将活化后的固氮蓝藻扩大培养至对数生长期后，测量OD680值，转移部分固氮蓝藻至装有200mL含反式得克隆(反式得克隆的浓度为1000ng/L)的BG110的500mL玻璃三角瓶中，使培养液初始OD680值为0.1，在温度28℃、光照3000lx、光暗时长为16h:8h光照培养箱中培养6天，测量其OD680值和水体中反式得克隆含量。具体方法：
①得克隆母液配制：配制0.5mg/L的得克隆母液，具体是用甲苯将5mg/L的标准使用液稀释10倍，用微孔滤膜过滤除菌。
②含得克隆的BG110溶液的配制：在BG110培养基中反式得克隆母液，使得反式得克隆的最终浓度为1000ng/L。
③接种：将对数生长期的固氮蓝藻在无菌条件下3000rpm离心5min，混合均匀后，加入步骤2)配制的BG110培养液中。
④取样：在温度28℃、光照3000lx、光暗时长为16h:8h光照培养箱中培养6d后，摇匀，取少量的藻液测定其OD680，将藻液6000rpm离心5min，使用0.45μm微孔滤膜抽滤分离培养液和藻细胞。
⑤萃取：将步骤4)处理所得的滤液转移到250mL分液漏斗中，使用10mL二氯甲烷清洗抽滤瓶3次，合并到分液漏斗中。在分液漏斗加入50mL二氯甲烷，盖上玻璃塞在，通风橱中快速振荡2min，松开玻璃塞，静置15min，用圆底烧瓶收集下层有机相。重复萃取2次，合并二氯甲烷提取液，在旋转蒸发仪上45℃水浴减压旋蒸至近干。少量多次加入正己烷润洗圆底烧瓶，定容到1.0mL，使用封口膜密封瓶盖，保存在-80℃冰箱，待测。
⑥测定：采用气相色谱-质谱法进行得克隆的测定。
测定结果如如图1所示。从图1可知，不同藻株对反式得克隆浓度为1000ng/L的去除效果存在差异，藻株Anabaena azotica FACHB-119的去除率最高，达到80.5±3.5％，显著高于另外三株藻。后续以该藻株进行顺式和反式得克隆去除实验。
实施例2：固氮蓝藻A.azotica FACHB-119对顺式和反式得克隆的去除评估
取对数生长期藻液，置于含200mL BG110液体培养基的500mL玻璃三角瓶中，得到的最终培养液的初始OD680值为0.1；接着加入浓度为0.5mg/L的混合得克隆(顺式得克隆和反式得克隆按质量比1:1混合得到)母液400μL，使培养液最终得克隆含量为1000ng/L，封口后放置在温度28℃、光照3000lx、光暗时长为16h:8h的光照培养箱中培养。以不加固氮蓝藻为对照，处理和对照各三个重复，具体步骤参照上述筛选的方法。
在不同的培养时间取样，测定在含得克隆的BG110液体培养基中丝状固氮蓝藻的生长曲线，结果如图2所示。从图2可知，藻株A.azotica FACHB-119在含得克隆培养液中生长状况良好。到第4d开始进入快速生长期。
按实施例1的方法检测培养液中得克隆中的含量。从图3和图4的结果可以看出，固氮蓝藻能显著降低培养液中的得克隆含量。在第2d对两种得克隆的去除率相对较低，仅约为10％～12％，应该与藻尚处于停滞期有关。而进入快速生长期后，在4d～10d对顺式得克隆的去除率介于55.5％～68.9％之间，对反式得克隆则在58.5％～70.3％之间。
实施例3：固氮蓝藻A.azotica FACHB-119处理反式得克隆后的收集
藻细胞收集实验方法同实施例2，区别是以反式得克隆母液替代混合得克隆母液。处理6d后，取藻液测定OD680值，然后将藻液用4层医用纱布进行过滤，测定滤液OD680值。以OD680代表藻生物量，以过滤前后OD680差值占未过滤藻液OD680值的百分比为纱布过滤法的藻收率。
纱布过滤法收集藻细胞实验如图5所示，细胞收率见表1，结果表明其收率达到93.7±3.3％，说明绝大多数藻细胞均可经过简单的纱布过滤法收集。
表1纱布过滤法收集培养到第6d藻细胞结果
Figure BDA0003086262370000051
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）将丝状固氮蓝藻培养至对数生长期；
（2）将对数生长期的丝状固氮蓝藻接种到得克隆污染的水体中培养，得到处理后的水体；
步骤（1）中所述的培养的培养基为BG11液体培养基或BG110液体培养基；
步骤（1）中所述的培养的条件为于25～30℃、光照2500～4000lx以及光暗时间为14～18h：6～10h进行培养；
步骤（1）中所述的对数生长期为OD680为0.8～1.2；
步骤（2）中所述的接种的接种量为接种得到的水体OD680为0.08～0.1；
所述的丝状固氮蓝藻为固氮鱼腥藻（Anabaena azotica）FACHB 119。
2.根据权利要求1所述的丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，其特征在于：所述的得克隆为顺式得克隆和反式得克隆中一种或两种。
3.根据权利要求1所述的丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，其特征在于还包括如下步骤：
（3）将步骤（2）得到的处理后的水体过滤，得到去除得克隆和丝状固氮蓝藻的水体。
4.根据权利要求1所述的丝状固氮蓝藻在去除水体得克隆中的应用，其特征在于：
步骤（1）中所述的培养的条件为于28℃、光照3000lx以及光暗时间为16h:8h进行培养；
步骤（1）中所述的对数生长期为OD680为1。
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