CN103740593A

CN103740593A - 一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻及其应用

Info

Publication number: CN103740593A
Application number: CN201310747194.7A
Authority: CN
Inventors: 张杭君; 蒋晓军; 刘嘉裕; 肖文丰; 鲁莉萍
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2013-12-28
Filing date: 2013-12-28
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-12-28
Also published as: CN103740593B

Abstract

本发明提供了一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻属（Anabaena sp.）PD-3，及其在微生物降解多氯联苯中的应用。所述鱼腥藻属（Anabaena sp.）PD-3保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2013年9月8日，保藏编号：CCTCC No：M2013398。本发明提供了一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻PD-3，该藻种能够有效降解PCB28、29、30、31,暴露一周时间该鱼腥藻对PCB28的降解效率超过60%，对PCB44和PCB61的脱氯百分比分别为63.6%和57.3%，优于鱼腥藻PD-1（保藏编号：CCTCC No：M2011446）对PCB44和PCB61的脱氯百分比（49.3%和48.3%）。因此，该鱼腥藻PD-3可广泛应用于环境中多氯联苯的降解，具有重要应用前景。

Description

一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻属（Anabaena sp.）PD-3，及其在微生物降解多氯联苯中的应用。

（二）背景技术

多氯联苯（PCBs）作为一种具有良好化学稳定性及热稳定性的有机材料，一直以来都被广泛应用于工业生产领域。PCBs具有明显的“三致”效应和较强的脂溶性，能够沿着食物链在生物体中富集积累，对生物体构成危害。虽然其生产和使用已于1979年被禁止，但是由于其半衰期在40年左右，具有显著环境持久性，并且PCBs的半挥发性也使其随大气干湿沉降在世界范围内迁移并最终沉积到地表。因此，在全球污染性和非污染性土壤中普遍检出PCBs的存在。环境中残留的PCBs对自然生态和生物体存在严重的潜在风险。因此，PCB污染环境的修复问题已经成为国内外研究的热点之一。

多氯联苯被列为《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中12种特别有害的持久性有机污染物之一，是一种具有危害作用的内分泌干扰物，生物的生殖系统、免疫系统和神经系统都会严重受到其影响。PCBs不但可降低人的生育能力，引起人类精子数量减少、致畸，同时能抑制脑细胞合成、造成脑损伤。多氯联苯会诱导肝脏、生殖系统及免疫系统病变甚至癌变，1968年，日本的“米糠油”事件而导致1300名中毒者出现肝功能紊乱，急性肝坏死、肝昏迷。由于PCBs可通过食物链在生物体内的富集，它对人类身体健康的威胁已经日趋严重，东部沿海地区及东北重工业区作为我国PCBs污染的高危区，这些地区PCBs污染状况和人群健康状况之间的关系值得高度重视。

物理方法、化学方法和微生物方法是目前广泛应用于去除PCBs的传统方法。常规的物理和化学如高温热分解方法（在1000～1400℃下燃烧多氯联苯分解为二氧化碳、水、无机盐和灰渣）、“脱氯分解”法（利用多氯联苯在某些碱性试剂（钾、钠、钙、镁及其氢氧化物）和催化剂作用下，由氢原子置换多氯联苯的氯原子）一般只能用于点源污染的治理，且成本过于高昂并易于造成二次污染。近年来，采用具有降解功能的先锋物种对PCBs污染土壤进行生物修复已经成为一门新兴技术，它具有成本低、无二次污染及处理效果好等优点，备受人们关注。已证实可以用于降解PCBs的先锋物种包括：细菌、真菌和放线菌等微生物种。细菌如分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、产乙烯脱卤拟球菌（Dehalococcoides ethenogenesstrain195）等；真菌如曲霉属（Aspergillus fumigatus）、卷霉属（Circinellamuscae）等；放线菌如戈登式菌属（Gordonia sp JAAS1）、诺卡氏菌属（Starcartesian bacteria）等对PCBs均具有降解能力。但尽管国内外学者在微生物降解多氯联苯方面进行了研究，利用脱氯功能藻种降解多氯联苯的领域在我国还处于真空状态，未见有相关文献及实验进行报道。因此，筛选出具有我国自主知识产权，可高效降解多氯联苯的藻种，无论在基础研究还是应用开发方面都具有非常重要的意义。

（三）发明内容

本发明的目的在于针对当前环境特别是土壤中残留的多氯联苯污染物，提供一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻属（Anabaena sp.）PD-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2013年9月8日，保藏编号：CCTCC No：M2013398。

该藻种分离自浙江省台州市某多氯联苯污染的水稻田。鱼腥藻暴露在2mg/L的PCB28、29、30、31中7天，可使PCBs残留量降为初始含量的38%、55%、63%、36%，对多氯联苯具有较强的降解能力。

该藻种的藻体藻丝直走或弯曲，藻丝外面有透明、无色的水样胶鞘，细胞一般为球形或腰鼓形，少数为圆柱形。鱼腥藻PD-3藻种在1000lux光照强度下，20～30℃温度下，pH7.0～9.0范围内均可在生长，最适生长pH为7.0，最适生长温度为25℃。

所述鱼腥藻属PD-3的16SrDNA序列如下：

GATCTACGCTGGCGGTATGCTTTTCACATGCAAGTCGAACGGTCTCT

TCCCAGATAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCCTGAGAATCTAGCTT

CAGGTCGGGCACTTCCACTGGAAACGGTGGCTAATACCCCATGTGC

CGAAAGGTGAAAGATTTATTGCCTGAAGATGAGCTCCCGTCTGATTA

GCTAGTTGGTGTCCTAAGAGCGCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTG

GTCTGAGACCATGATCAGCCACACTGGTACTGAGACACGGCCCTGA

CTCGTACGGGAGGCAGCAGTGCCGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAG

CCTGACCCAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTCCGTTGTA

AACCTCAAATCTCAGGGAATAAAAAAATGAAGGTACCTGAGGAATA

AGCATCGGCTAACTGGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATG

CAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTTTTGCGTCCGCAGGTGGCA

CTGTAAGTCTGCTGTTAAAGAGCAAGGCTCAACCTTGTTTTGGCAG

TGGAAACTACAGAGCTACAGTACGTTCGGCCCAGAGGGAATTCGTG

GTGTAGCCCTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCCCTGGCGA

AAGGGCTCTGCTACCGGGTTTCTGACACTGAGGGACGAAAGCTAG

GGGAGCGAATGGGAAATGTAACGCCAGTTGTCCTAGCCGTAAACGA

TGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCCCAGCCA

ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAAC

TCACAGGAATT。经16SrDNA序列分析，该藻种鉴定为：鱼腥藻属中的一株藻。

本发明还涉及所述的鱼腥藻属PD-3在微生物降解多氯联苯中的应用。

具体的，所述微生物降解在pH7.0～7.1、25℃，于光照1000lux～2000lux条件下进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻PD-3，该藻种能够有效降解PCB28、29、30、31,暴露一周时间该鱼腥藻对PCB28的降解效率超过60%。因此，该鱼腥藻PD-3可广泛应用于环境中多氯联苯的降解,具有重要应用前景。

（四）附图说明

图1为鱼腥藻种降解PCB28暴露7天后降解效率的实验结果；

图2为鱼腥藻种降解PCB29暴露7天后降解效率的实验结果；

图3为鱼腥藻种降解PCB30暴露7天后降解效率的实验结果；

图4为鱼腥藻种降解PCB31暴露7天后降解效率的实验结果；

图5为鱼腥藻种降解PCBs动力学实验结果；

图6为鱼腥藻Anabaena PD-3与鱼腥藻Anabaena PD-1（保藏编号：CCTCCNo：M2011446）对PCB44的脱氯降解效果比较；

图7为鱼腥藻PD-3与鱼腥藻PD-1（保藏编号：CCTCC No：M2011446）对PCB61的脱氯降解效果比较。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）藻种分离与筛选

土样：采自浙江省台州市某多氯联苯污染的水稻田；

藻种的富集与分离:采用含10ppm PCBs的液体培养基筛选；

本发明所述培养基为：BG11无机盐无氯液体培养基（1000mL），组成见表2；

BG11无机盐培养基组成见表1（溶剂为水）：

表1

A₅溶液组成见表2（溶剂为水）：

表2

BG11无机盐无氯培养基组成见表3（溶剂为水）：

表3

藻种的分子鉴定：

藻种的16SrDNA序列经测序，得到如SEQ ID NO.1所示的序列，通过在Genebank上对该藻种的16S rDNA的BLAST进行比较分析（结果见表4）。BLAST比较分析结果表明：该藻种的16S rDNA序列与鱼腥藻属的同源性极高（99%），因此该功能藻种在分子分类上鉴定为鱼腥藻属（Anabaena）。

表4：鱼腥藻种16SrDNA基因序列的BLAST比较

藻种的生物降解作用：

该鱼腥藻的用途是降解PCB28、29、30、31，暴露时间为7天时，鱼腥藻PD-3对PCB28、29、30、31的降解效率分别到达约62%、45%、37%、54%。

实施例2：鱼腥藻种Anabaena PD-3生物降解2mg/L的PCB287天的暴露实验

首先将脱氯功能藻种PD-3（即CCTCC No：M2013398）在波长680nm的测定藻液（培养基为BG11无机盐无氯液体培养基，下同）的OD值，将OD值调整到0.38，使藻种处于对数生长期。随后于洁净的50mL锥形瓶中加入20mL藻液，并添加PCB28（浓度为100mg/L）400μL，调整PCB28的终浓度为2mg/L。使用无菌滤膜将锥形瓶密封。最后将人工气候培养箱的光照强度分别调整至1003lux，培养条件为25℃，光暗比为12：12h（即光照12h、黑暗12h交替），暴露培养7天后采用硫氰酸汞高铁光度法测定氯离子浓度，研究其降解效应，降解效率达65%，降解结果见图1。

实施例3：鱼腥藻种Anabaena PD-3生物降解2mg/L的PCB297天的暴露实验

首先将脱氯功能藻种PD-3在波长680nm的测定藻液的OD值，将OD值调整到0.38，使藻种处于对数生长期。随后于洁净的50mL锥形瓶中加入20mL藻液，并添加PCB29（浓度为100mg/L）400μL，调整PCB29的终浓度为2mg/L。使用无菌滤膜将锥形瓶密封。最后将人工气候培养箱的光照强度分别调整至1003lux，培养条件为25℃，光暗比为12：12h，暴露培养7天后采用硫氰酸汞高铁光度法测定氯离子浓度，研究其降解效应，降解效率达54%，降解结果见图2。

实施例4：鱼腥藻种Anabaena PD-3生物降解2mg/L的PCB307天的暴露实验

首先将脱氯功能藻种PD-3在波长680nm的测定藻液的OD值，将OD值调整到0.38，使藻种处于对数生长期。随后于洁净的50mL锥形瓶中加入20mL藻液，并添加PCB30（浓度为100mg/L）400μL，调整PCB30的终浓度为2mg/L。使用无菌滤膜将锥形瓶密封。最后将人工气候培养箱的光照强度分别调整至1003lux，培养条件为25℃，光暗比为12：12h，暴露培养7天后采用硫氰酸汞高铁光度法测定氯离子浓度，研究其降解效应，降解效率达37%，降解结果见图3。

实施例5：鱼腥藻种Anabaena PD-3生物降解2mg/L的PCB317天的暴露实验

首先将脱氯功能藻种PD-3在波长680nm的测定藻液的OD值，将OD值调整到0.38，使藻种处于对数生长期。随后于洁净的50mL锥形瓶中加入20mL藻液，并添加PCB31（浓度为100mg/L）400μL，调整PCB31的终浓度为2mg/L。使用无菌滤膜将锥形瓶密封。最后将人工气候培养箱的光照强度分别调整至1003lux，培养条件为25℃，光暗比为12：12h，暴露培养7天后采用硫氰酸汞高铁光度法测定氯离子浓度，研究其降解效应，降解效率达62%，降解结果见图4。

实施例6：鱼腥藻种Anabaena PD-3生物降解2mg/L的PCB28、29、30、31动力学实验

首先将脱氯功能藻种PD-3在波长680nm的测定藻液的OD值，将OD值调整到0.38，使藻种处于对数生长期。随后于洁净的50mL锥形瓶中加入20mL藻液，并分别添加PCB28、29、30、31（浓度为100mg/L）400μL，调整PCBs的终浓度为2mg/L。使用无菌滤膜将锥形瓶密封。最后将人工气候培养箱的光照强度分别调整至1000lux，培养条件为25℃，光暗比为12：12h，分别按培养时间1天、3天、5天、7天取样，采用硫氰酸汞高铁光度法测定氯离子浓度，研究其降解动力学过程，7d后对PCB28、29、30、31降解效率达62%、43%、30%、55%。降解结果见图5。

实施例7：鱼腥藻Anabaena PD-3与鱼腥藻Anabaena PD-1对PCB44的脱氯降解效果比较

取无氯培养条件下对数生长期的鱼腥藻PD-3和PD-1（保藏编号：CCTCC No：M2011446）各20mL，向两种蓝藻培养体系中加入PCB44，调整PCB44在培养体系中的终浓度均为2mg/L。将上述蓝藻降解体系置于2000lux，25℃，光暗比12：12h的人工气候箱中培养7天取样。采用硫氰酸汞高铁光度法测定体系中的氯离子含量。结果表明，Anabaena PD-3对PCB44的7天脱氯百分比为63.6%，Anabaena PD-1对PCB44的7天脱氯百分比为49.3%。藻种PD-3对PCB44的脱氯效果好于藻种PD-1的脱氯效果。脱氯降解结果见图6。

实施例8：鱼腥藻PD-3与鱼腥藻PD-1对PCB61的脱氯降解效果比较

取无氯培养条件下对数生长期的鱼腥藻PD-3和PD-1（即在先申请CN102550425A中的CCTCC No.M2011446，现重命名为Anabaena PD-1）培养物各20mL，向两种蓝藻培养体系中加入PCB61，调整PCB61在培养体系中的终浓度为2mg/L。将上述蓝藻降解体系置于1000lux，25℃，光暗比12：12h的人工气候箱中培养7天后取样。采用硫氰酸汞高铁光度法测定体系中的氯离子含量。结果表明，Anabaena PD-3对PCB44的7天脱氯百分比为57.3%，Anabaena PD-1对PCB44的7天脱氯百分比为48.3%。本发明藻种PD-3对PCB61的脱氯效果好于藻种PD-1的脱氯效果，脱氯降解结果见图7。

Claims

1.一种能高效降解多氯联苯的鱼腥藻属（Anabaena sp.）PD-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2013年9月8日，保藏编号：CCTCC No：M2013398。

2.如权利要求1所述的鱼腥藻属PD-3，其特征在于所述鱼腥藻属PD-3的16SrDNA序列如下：

GATCTACGCTGGCGGTATGCTTTTCACATGCAAGTCGAACGGTCT

CTTCCCAGATAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCCTGAGAATCTAG

CTTCAGGTCGGGCACTTCCACTGGAAACGGTGGCTAATACCCCAT

GTGCCGAAAGGTGAAAGATTTATTGCCTGAAGATGAGCTCCCGTC

TGATTAGCTAGTTGGTGTCCTAAGAGCGCACCAAGGCGACGATCA

GTAGCTGGTCTGAGACCATGATCAGCCACACTGGTACTGAGACAC

GGCCCTGACTCGTACGGGAGGCAGCAGTGCCGAATTTTCCGCAAT

GGGCGAAAGCCTGACCCAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGC

TCTTCCGTTGTAAACCTCAAATCTCAGGGAATAAAAAAATGAAGG

TACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTGGGTGCCAGCAGCCGCG

GTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTTTT

GCGTCCGCAGGTGGCACTGTAAGTCTGCTGTTAAAGAGCAAGGC

TCAACCTTGTTTTGGCAGTGGAAACTACAGAGCTACAGTACGTTC

GGCCCAGAGGGAATTCGTGGTGTAGCCCTGAAATGCGTAGAGAT

CAGGAAGAACACCCCTGGCGAAAGGGCTCTGCTACCGGGTTTCT

GACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGAAATGTAA

CGCCAGTTGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTG

TATCGACCCGAGCCGTGCCCCAGCCAACGCGTTAAGTATCCCGCC

TGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCACAGGAATT。

3.如权利要求1所述的鱼腥藻属PD-3在微生物降解多氯联苯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述微生物降解在pH7.0～7.1、25℃，于光照1000lux～2000lux条件下进行。