CN109142677B - 一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法 - Google Patents

一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，该方法包括以下步骤：Step1、确定研究内容，研究内容包括：1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容；2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容；3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容；Step2、确定研究方案，研究方案包括：(1)PAHs的选取；2)土壤样本的采集；(3)DOM的制备；(4)DOM元素组成分析；5)菌种选取；6)PDA液体培养基制备；7)磨口玻璃柱装置制作；8)静止培养；Step3、方案的实施；Step4、数据采集及数据分析；Step5、得出结论。该研究方法更加详实、具体，使土壤有机物污染分解实验更加规范，同时为土壤污染有机物分解产品的推出提供研究基础。

Description

一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法
技术领域
本发明涉及土壤有机物污染降解领域，具体涉及一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法。
背景技术
生物修复是土壤多环芳烃(PAHs)污染修复的有效手段。多环芳烃(PAHs)是含有两个或以上的闭合苯环的碳氢化合物，具有半挥发性、疏水性、生物积累性等特点，不易被降解，PAHs通过分配作用吸附在土壤有机质中，再加上土壤微小孔隙的截留，容易被土壤绑定、老化而长期停留在土壤中，使得PAHs在土壤中的生物有效性和生物可及性大大降低，造成土壤PAHs污染修复困难。由于微生物体对PAHS的吸附由分配作用主导，且吸附-解吸过程是可逆的，吸附在菌体上的PAHs可以解吸出来而发生降解，也可在菌体上直接发生降解作用,因此，增大生物吸附，促进生物降解，成为生物修复土壤PAHs污染的有效手段。水溶性有机物(Dissolved Organic Matter,DOM)是指土壤和水体中由一系列大小、结构不同的分子组成的，能通过0.45μm滤膜的、能溶于水的有机物的总称，仅占土壤有机质的很小部分，能显著影响土壤PAHs的浓度，制约其在土壤中的迁移、转化、降解等化学和生物学过程，该作用对微生物降解PAHs的影响很大。
DOM的主要成分是碳水化合物，在碳源的利用方面白腐菌将优先利用低分子量的DOM为碳源繁殖，同时由于高分子量的DOM的增溶，可溶性PAHs增多，且污染土壤含PAHs的环境对白腐菌的生长和适应起了潜在的驯化和诱导作用，当白腐菌利用完DOM的可利用碳源和土壤的其它营养后，菌丝生物量会迅速增加，吸附PAHs的量也会增大。此时土壤的碳、氮出现限氮条件，刺激白腐菌启动木素降解酶系的表达，降解吸附态和水溶态的PAHs。其过氧化物酶系的产生与途径和DOM的组成、土壤环境条件密切相关，特别是DOM的分子量、土壤营养条件碳、氮浓度与过氧化物降解酶系的产生机制及其相关性，是本发明要解决的关键问题之一。土壤pH值不仅影响白腐菌菌丝的生长，还影响DOM在土壤固/液两相的平衡分配过程；温度则主要影响白腐菌对PAHs的代谢及其菌群结构和PAHs的膜毒性。因此，复杂的土壤环境下DOM对白腐菌降解土壤PAHs的影响很大，值得深入探讨。
发明内容
本发明为了解决上述问题，公开了一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，该研究方法为土壤有机物污染降解提供了一条切实可行的思路，并为解决土壤污染问题打下坚实的理论基础。
该发明的实现主要包括以下技术内容：
一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，包括以下步骤：
Step1、确定研究内容，研究内容包括以下几个方面：
(1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容：对模型DOM进行分子量分级，极性、非极性和组分的分离，定量分析土壤在不同条件下、不同培养方式对PAHs的吸附作用，深入研究大分子量的DOM增溶PAHs对土壤吸附的影响过程，探明不同极性、不同分子量、不同组分的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容：定量研究灭活菌丝和生长菌丝PAHs的吸附-解吸的动态变化，分析小分子量的DOM作为碳源促进菌丝生长的过程对PAHs的影响作用，以可溶性PAHs为监测指标，进一步研究大分子量的DOM对PAHs的结合增溶过程，通过对过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、漆酶(Laccase)的定量监测，深入研究代谢降解酶与PAHs之间的动态关系，重点分析降解酶系产生的途径与机理，并监测PAHs降解的中间产物，从而探明DOM促进白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响作用；
(3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容：深入分析土壤吸附、菌丝的吸附-解吸过程、小分子量的DOM促进菌丝生长、大分子量的DOM的结合增溶、酶代谢降解和PAHs的浓度变化之间的相互关系，深入研究复杂土壤条件下DOM增溶PAHs和促进菌丝生长对土壤降解PAHs的影响作用，重点监测白腐菌降解酶系产生的途径及机理的动力学关系与体系碳、氮源利用规律的关联性，探明降解酶的产生与高产和体系碳、氮的耦合关系，并监测PAHs降解的中间产物，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；Step2、确定研究方案，研究方案包括以下方面：
(1)、PAHs的选取：选取土壤污染的高环PAHs菲或芘为模型研究物；
(2)、土壤样本的采集：采集典型PAHs污染区土壤，测定PAHs的含量；在实验室冷冻干燥，用研钵捣碎研细，过2mm筛备用，此为原土；原土测定颗粒组成、有机质、氮、pH值指标；称取风干并过2mm筛的原土置于三角瓶中，加入100mL去离子水，200r/min下恒温振荡4h，静止后弃去上清液，重新加入去离子水，重复该过程4次，然后将土样自然风干，磨碎，过2mm筛，作为去除内源DOM的土样；自制室内PAHs污染土壤：将PAHs的乙醇溶液，加入含灭菌土壤的锥形瓶中，放置至乙醇全部挥发完为止；
(3)、DOM的制备：采用水浸提法，选用新鲜奶牛粪，作水分校正后与超纯水1：2混合，连续振5h，然后4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，滤液中的有机物即为DOM，其浓度采用TOC仪测定，滤液经电渗析去离子后，40℃旋转蒸发浓缩冻干，磨碎备用；
(4)、DOM元素组成分析：用Foss Heraeus CHN-O-Rapid型元素分析仪进行元素分析；在750℃温度下灰化4h，称重确定灰分含量；O的含量由总重量减去灰分、碳、氢、氮的重量计算；以除去灰分的纯有机质为基数计算各元素的相对百分含量；用KBr压片法在Nexus870型红外光谱仪上测定红外光谱；在Bruker DRX500仪器上进行核磁共振测定，1H的共振频率为79.452MHz，DMSO-d6为溶剂；
(5)、菌种选取：白腐菌从云南省微生物研究所购买的Phanero chaetechrysosporium BKM-F-1767(GIM3.383)；在PDA液体培养基里摇床培养4-5天后作为一级种子，新鲜活菌丝或高温灭活菌丝两种处理；
(6)、PDA液体培养基制备:200g/L土豆，煮沸10min后的提取物，20g/L葡萄糖，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 3.0g/L；
(7)、磨口玻璃柱装置制作：定制长约80cm、内径8cm的玻璃圆筒，两头分别配置密封的磨口玻璃密封盖，管内填满混匀的PAHs污染土壤；
(8)、静止培养：将污染土壤放入磨口玻璃柱装置，DOM+白腐菌孢子待加溶液缓慢从上面入口加入玻璃柱中，不同温度气候箱静止培养，隔一段时间倒置一次，利用端口盖子的开启或密闭来控制氧气量，定期取样监测相关指标；
Step3、方案的实施，方案的实施包括以下方面：
(1)DOM对土壤吸附PAHs的影响作用：
A、DOM的分离、分级：
分子量分级(透析法)：将8000Da透析膜(Spectra/Por7，Spect rum Industries，California)剪成所需大小，扎紧一端，系成袋状，置于0.01mol/L CH3 COOH中煮沸30min，然后用超纯水洗涤数次；在透析袋中加入10mL DOM溶液，上端扎紧悬挂于铁丝上，置于0.005m ol/L K2SO4溶液中透8h(搅动数次)，然后置于超纯水中继续透析32h，间隔搅动，并换3次水，实验在4℃下进行，用差减法确定不同分子量级DOM的含量；
极性与非极性DOM的分离：活化树脂：将XAD-7树脂在0.1mol/L NaOH中浸泡24h后，用超纯水洗涤干净，将XAD-7装填到玻璃柱(内径2cm，长25cm)中，装填高度为20cm，用30mL0.1mol/L HCl洗柱，再用超纯水洗至无DOC；
组分分离：将10mL调整到pH 2的DOM加入柱中，先用40mL 0.01mol/L HCl洗脱，然后用超纯水洗至无DOC，洗脱液流速为1mL/m in，收集洗脱液并测定其中DOC含量，这部分DOM代表亲水性DOM组分，吸附在树脂上的疏水性DOM组分则用差减法求出；
B、土壤吸附：
不同粒级结构的灭菌污染土壤的不同PAHs浓度，去除内源DOM和未去除内源DOM，9种不同pH值(4.0-8.0)、6种不同温度(25-40℃)，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM的不同的量(5-50mL)，5种不同水土比，分析DOM对土壤在0-36h的吸附行为的影响，以未添加DOM作对比，分别设定灭菌土壤、不加土壤和不添加D OM空白，分摇床和静止培养，每隔3h取样，以土壤微生物生物量、水溶液中PAHs浓度、土壤中PAHs的浓度为监测指标，定量研究大分子量的DOM的结合增溶对土壤吸附行为的影响过程，探明不同组分、不同极性、不同分子量的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响：
A、菌丝的吸附：
一定量的灭活菌丝和活菌丝，不同接种量接入不同PAHs浓度的液体培养液中，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM，设定不加DOM、只加PAHs溶液的液体培养基空白，摇床和静止培养，观察菌丝形态的变化，以水溶液中PAHs的浓度为监测指标，定量研究0-30dDOM对菌丝吸附-解吸PAHs的作用过程的影响，探明DOM的增溶对菌丝吸附-解吸的影响作用。
B、促进菌丝生长：
将在液体培养基里培养5-6天生长良好的一级种子，按不同接种量接入含PAHs不同浓度培养基中，不同分子量、不同极性、不同组分的DOM按照一定的浓度梯度添加，以未添加DOM为对照，9种不同pH、6种不同温度，外源N选择脲、酒石酸铵，外源C选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系7种不同的C/N，分摇床振荡培养和静置培养，每隔24h取样一次，以生物量、PAHs浓度、Lip、Mnp和Laccase活性为监测指标，深入研究从接种到检出降解酶活性阶段DOM促进白腐菌生长的作用机制；
C、酶代谢降解：
一级种子按不同的接种量接入含不同PAHs浓度的液体培养基中，不同极性、不同接种量、不同分子量的DOM，以未添加DOM的含PAHs培养基接种相同量的一级种子为样品空白，选择相同的氮和碳，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，最适pH、最适温度，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，定量监测生物量、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Laccase酶活性，研究不同碳氮比和白腐菌的酶代谢降解途径的作用关系，监测Lip、Mnp和Laccase的产生机制和PAHs浓度变化的动态关系，进一步分析PAHs的中间代谢产物，研究PAHs的降解途径，从而探明白腐菌自产酶开始DOM对关键酶分泌过程的影响作用；
(3)DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制：
基于以上研究结果，深入分析土壤吸附、小分子量DOM促进菌丝生长、大分子量DOM对PAHs的结合增溶、白腐菌菌丝吸附/解吸以及酶代谢降解之间的相互关系，不同分子量、不同极性、不同组分、不同体积的DOM和不同接种量的白腐菌菌丝、不同土壤条件(pH、温度、碳、氮、氧气、灭菌和未灭菌)，不同PAHs浓度，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系不同7种不同C/N，5种不同水土比，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，检测生物量、氮、碳、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Lacca se酶活性指标，分析PAHs的中间代谢产物，研究复杂条件下不同C/N和关键酶产生的途径与机理的耦合关系，探明复杂条件下降解酶高产、稳产的关键因素，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；
(4)测试方法：
木质素过氧化物酶(Lip)采用藜芦醇-分光光度法，锰过氧化物酶(Mnp)采用愈创木酚-分光光度法，漆酶(Laccase)用ABTS-分光光度法；颗粒组成采用吸管法；土壤总有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；总氮采用开氏定氮法测定；pH用玻璃电极测定(水土比为1:5，仪器型号：上海雷磁ZD-2，自动电位滴定仪)；菌丝干重用恒重重量法，生物量用平板计数法；
土壤相中PAHs和中间产物的抽提测定：将土壤用二氯甲烷超声萃取15min，反复萃取3次，将萃取有机相混合，过滤取澄清上清液旋转蒸发，N2吹定容为1mL，转换溶液为正己烷，过硅胶、氧化铝符合净化柱，依次用20mL正己烷洗去杂质，70mL二氯甲烷/正己烷(3/7，V/V)混合洗脱PAHs，洗脱液再旋转蒸发浓缩至1-2mL，N2吹浓缩至0.5mL GC-M测定；进样口温度为250℃，脉冲无分流方式进样，载气为高纯氦气，流量为l.0mL/min，恒流模式；色谱柱：HPS-Ms(30m×0.25mm，0.25μm；升温程序：初始柱温45℃保持3min，以10℃/min升温至130℃，保持3min，然后以8℃/min升温至300℃，保持5min而后升温至310℃，保持2min；SIM模式，四极杆温度150℃，离子源230℃，气相色谱质谱接口温度230℃，离子化方式EI(电子轰击离子化)，电子轰击能量70eV，电子倍增电压1.4KV，自动调谐，自曝全扫描(SCAN)，质量数扫描范围50～300mu；然后根据各化合物的保留时间与质谱图建立选择粒子检测(SIM)的时间范围与定性、定量离子；选择粒子扫描色谱图将依据以下条件定性：①保留时间范围±1s，信号应大于等于3倍噪声信号；②定性、定量离子峰检测强度的比值应不超过理论值的15％；
Step4、数据采集及数据分析；
Step5、得出结论。
本发明具有以下有益效果：1、建立了一整套完整的DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，该研究方法详细地公开了实施该方法所需的设备、材料以及操作流程，给土壤研究从业人员以深刻的启发并形成相应的研究标准，促进土壤有机物污染分解实验的规范化管理；
2、该方法可作为生产厂家研制土壤污染有机物分解产品的实验研究基础，从而创造更高的社会价值。
附图说明
图1是本发明的研究方法流程图；
图2为本发明的研究方法实施路线图。
具体实施方式
一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，包括以下实施步骤：
Step1、确定研究内容，研究内容包括以下几个方面：
(1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容：对模型DOM进行分子量分级，极性、非极性和组分的分离，定量分析土壤在不同条件下、不同培养方式对PAHs的吸附作用，深入研究大分子量的DOM增溶PAHs对土壤吸附的影响过程，探明不同极性、不同分子量、不同组分的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容：定量研究灭活菌丝和生长菌丝PAHs的吸附-解吸的动态变化，分析小分子量的DOM作为碳源促进菌丝生长的过程对PAHs的影响作用，以可溶性PAHs为监测指标，进一步研究大分子量的DOM对PAHs的结合增溶过程，通过对过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、漆酶(Laccase)的定量监测，深入研究代谢降解酶与PAHs之间的动态关系，重点分析降解酶系产生的途径与机理，并监测PAHs降解的中间产物，从而探明DOM促进白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响作用；
(3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容：深入分析土壤吸附、菌丝的吸附-解吸过程、小分子量的DOM促进菌丝生长、大分子量的DOM的结合增溶、酶代谢降解和PAHs的浓度变化之间的相互关系，深入研究复杂土壤条件下DOM增溶PAHs和促进菌丝生长对土壤降解PAHs的影响作用，重点监测白腐菌降解酶系产生的途径及机理的动力学关系与体系碳、氮源利用规律的关联性，探明降解酶的产生与高产和体系碳、氮的耦合关系，并监测PAHs降解的中间产物，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；Step2、确定研究方案，研究方案包括以下方面：
(1)、PAHs的选取：选取土壤污染的高环PAHs菲或芘为模型研究物；
(2)、土壤样本的采集：采集典型PAHs污染区土壤，测定PAHs的含量；在实验室冷冻干燥，用研钵捣碎研细，过2mm筛备用，此为原土；原土测定颗粒组成、有机质、氮、pH值指标；称取风干并过2mm筛的原土置于三角瓶中，加入100mL去离子水，200r/min下恒温振荡4h，静止后弃去上清液，重新加入去离子水，重复该过程4次，然后将土样自然风干，磨碎，过2mm筛，作为去除内源DOM的土样；自制室内PAHs污染土壤：将PAHs的乙醇溶液，加入含灭菌土壤的锥形瓶中，放置至乙醇全部挥发完为止；
(3)、DOM的制备：采用水浸提法，选用新鲜奶牛粪，作水分校正后与超纯水1：2混合，连续振5h，然后4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，滤液中的有机物即为DOM，其浓度采用TOC仪测定，滤液经电渗析去离子后，40℃旋转蒸发浓缩冻干，磨碎备用；
(4)、DOM元素组成分析：用Foss Heraeus CHN-O-Rapid型元素分析仪进行元素分析；在750℃温度下灰化4h，称重确定灰分含量；O的含量由总重量减去灰分、碳、氢、氮的重量计算；以除去灰分的纯有机质为基数计算各元素的相对百分含量；用KBr压片法在Nexus870型红外光谱仪上测定红外光谱；在Bruker DRX500仪器上进行核磁共振测定，1H的共振频率为79.452MHz，DMSO-d6为溶剂；
(5)、菌种选取：白腐菌从云南省微生物研究所购买的Phanero chaetechrysosporium BKM-F-1767(GIM3.383)；在PDA液体培养基里摇床培养4-5天后作为一级种子，新鲜活菌丝或高温灭活菌丝两种处理；
(6)、PDA液体培养基:200g/L土豆，煮沸10min后的提取物，20g/L葡萄糖，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 3.0g/L；
(7)、磨口玻璃柱装置：定制长约80cm、内径8cm的玻璃圆筒，两头分别配置密封的磨口玻璃密封盖，管内填满混匀的PAHs污染土壤；
(8)、静止培养：将污染土壤放入磨口玻璃柱装置，DOM+白腐菌孢子待加溶液缓慢从上面入口加入玻璃柱中，不同温度气候箱静止培养，隔一段时间倒置一次，利用端口盖子的开启或密闭来控制氧气量，定期取样监测相关指标；
Step3、方案的实施，方案的实施包括以下方面：
(1)DOM对土壤吸附PAHs的影响作用：
A、DOM的分离、分级：
分子量分级(透析法)：将8000Da透析膜(Spectra/Por7，Spect rum Industries，California)剪成所需大小，扎紧一端，系成袋状，置于0.01mol/L CH3 COOH中煮沸30min，然后用超纯水洗涤数次；在透析袋中加入10mL DOM溶液，上端扎紧悬挂于铁丝上，置于0.005m ol/L K2SO4溶液中透8h(搅动数次)，然后置于超纯水中继续透析32h，间隔搅动，并换3次水，实验在4℃下进行，用差减法确定不同分子量级DOM的含量；
极性与非极性DOM的分离：活化树脂：将XAD-7树脂在0.1mol/L NaOH中浸泡24h后，用超纯水洗涤干净，将XAD-7装填到玻璃柱(内径2cm，长25cm)中，装填高度为20cm，用30mL0.1mol/L HCl洗柱，再用超纯水洗至无DOC；
组分分离：将10mL调整到pH 2的DOM加入柱中，先用40mL 0.01mol/L HCl洗脱，然后用超纯水洗至无DOC，洗脱液流速为1mL/m in，收集洗脱液并测定其中DOC含量，这部分DOM代表亲水性DOM组分，吸附在树脂上的疏水性DOM组分则用差减法求出；
B、土壤吸附：
不同粒级结构的灭菌污染土壤的不同PAHs浓度，去除内源DOM和未去除内源DOM，9种不同pH值(4.0-8.0)、6种不同温度(25-40℃)，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM的不同的量(5-50mL)，5种不同水土比，分析DOM对土壤在0-36h的吸附行为的影响，以未添加DOM作对比，分别设定灭菌土壤、不加土壤和不添加D OM空白，分摇床和静止培养，每隔3h取样，以土壤微生物生物量、水溶液中PAHs浓度、土壤中PAHs的浓度为监测指标，定量研究大分子量的DOM的结合增溶对土壤吸附行为的影响过程，探明不同组分、不同极性、不同分子量的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响：
A、菌丝的吸附：
一定量的灭活菌丝和活菌丝，不同接种量接入不同PAHs浓度的液体培养液中，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM，设定不加DOM、只加PAHs溶液的液体培养基空白，摇床和静止培养，观察菌丝形态的变化，以水溶液中PAHs的浓度为监测指标，定量研究0-30dDOM对菌丝吸附-解吸PAHs的作用过程的影响，探明DOM的增溶对菌丝吸附-解吸的影响作用。
B、促进菌丝生长：
将在液体培养基里培养5-6天生长良好的一级种子，按不同接种量接入含PAHs不同浓度培养基中，不同分子量、不同极性、不同组分的DOM按照一定的浓度梯度添加，以未添加DOM为对照，9种不同pH、6种不同温度，外源N选择脲、酒石酸铵，外源C选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系7种不同的C/N，分摇床振荡培养和静置培养，每隔24h取样一次，以生物量、PAHs浓度、Lip、Mnp和Laccase活性为监测指标，深入研究从接种到检出降解酶活性阶段DOM促进白腐菌生长的作用机制；
C、酶代谢降解：
一级种子按不同的接种量接入含不同PAHs浓度的液体培养基中，不同极性、不同接种量、不同分子量的DOM，以未添加DOM的含PAHs培养基接种相同量的一级种子为样品空白，选择相同的氮和碳，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，最适pH、最适温度，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，定量监测生物量、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Laccase酶活性，研究不同碳氮比和白腐菌的酶代谢降解途径的作用关系，监测Lip、Mnp和Laccase的产生机制和PAHs浓度变化的动态关系，进一步分析PAHs的中间代谢产物，研究PAHs的降解途径，从而探明白腐菌自产酶开始DOM对关键酶分泌过程的影响作用；
(3)DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制：
基于以上研究结果，深入分析土壤吸附、小分子量DOM促进菌丝生长、大分子量DOM对PAHs的结合增溶、白腐菌菌丝吸附/解吸以及酶代谢降解之间的相互关系，不同分子量、不同极性、不同组分、不同体积的DOM和不同接种量的白腐菌菌丝、不同土壤条件(pH、温度、碳、氮、氧气、灭菌和未灭菌)，不同PAHs浓度，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系不同7种不同C/N，5种不同水土比，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，检测生物量、氮、碳、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Lacca se酶活性指标，分析PAHs的中间代谢产物，研究复杂条件下不同C/N和关键酶产生的途径与机理的耦合关系，探明复杂条件下降解酶高产、稳产的关键因素，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；
(4)测试方法：
木质素过氧化物酶(Lip)采用藜芦醇-分光光度法，锰过氧化物酶(Mnp)采用愈创木酚-分光光度法，漆酶(Laccase)用ABTS-分光光度法；颗粒组成采用吸管法；土壤总有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；总氮采用开氏定氮法测定；pH用玻璃电极测定(水土比为1:5，仪器型号：上海雷磁ZD-2，自动电位滴定仪)；菌丝干重用恒重重量法，生物量用平板计数法；
土壤相中PAHs和中间产物的抽提测定：将土壤用二氯甲烷超声萃取15min，反复萃取3次，将萃取有机相混合，过滤取澄清上清液旋转蒸发，N2吹定容为1mL，转换溶液为正己烷，过硅胶、氧化铝符合净化柱，依次用20mL正己烷洗去杂质，70mL二氯甲烷/正己烷(3/7，V/V)混合洗脱PAHs，洗脱液再旋转蒸发浓缩至1-2mL，N2吹浓缩至0.5mL GC-M测定；进样口温度为250℃，脉冲无分流方式进样，载气为高纯氦气，流量为l.0mL/min，恒流模式；色谱柱：HPS-Ms(30m×0.25mm，0.25μm；升温程序：初始柱温45℃保持3min，以10℃/min升温至130℃，保持3min，然后以8℃/min升温至300℃，保持5min而后升温至310℃，保持2min；SIM模式，四极杆温度150℃，离子源230℃，气相色谱质谱接口温度230℃，离子化方式EI(电子轰击离子化)，电子轰击能量70eV，电子倍增电压1.4KV，自动调谐，自曝全扫描(SCAN)，质量数扫描范围50～300mu；然后根据各化合物的保留时间与质谱图建立选择粒子检测(SIM)的时间范围与定性、定量离子；选择粒子扫描色谱图将依据以下条件定性：①保留时间范围±1s，信号应大于等于3倍噪声信号；②定性、定量离子峰检测强度的比值应不超过理论值的15％；
Step4、数据采集及数据分析；
Step5、得出结论。

Claims (1)

1.一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，包括以下步骤：
Step1、确定研究内容，研究内容包括以下方面：
(1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容：对模型DOM进行分子量分级，极性、非极性和组分的分离，定量分析土壤在不同条件下、不同培养方式对PAHs的吸附作用，深入研究大分子量的DOM增溶PAHs对土壤吸附的影响过程，探明不同极性、不同分子量、不同组分的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容：定量研究灭活菌丝和生长菌丝PAHs的吸附-解吸的动态变化，分析小分子量的DOM作为碳源促进菌丝生长的过程对PAHs的影响作用，以可溶性PAHs为监测指标，研究大分子量的DOM对PAHs的结合增溶过程，通过对过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、漆酶(Laccase)的定量监测，深入研究代谢降解酶与PAHs之间的动态关系，重点分析降解酶系产生的途径与机理，并监测PAHs降解的中间产物，从而探明DOM促进白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响作用；
(3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容：深入分析土壤吸附、菌丝的吸附-解吸过程、小分子量的DOM促进菌丝生长、大分子量的DOM的结合增溶、酶代谢降解和PAHs的浓度变化之间的相互关系，深入研究复杂土壤条件下DOM增溶PAHs和促进菌丝生长对土壤降解PAHs的影响作用，重点监测白腐菌降解酶系产生的途径及机理的动力学关系与体系碳、氮源利用规律的关联性，探明降解酶的产生与高产和体系碳、氮的耦合关系，并监测PAHs降解的中间产物，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；
Step2、确定研究方案，研究方案包括以下方面：
(1)、PAHs的选取：选取土壤污染的高环PAHs菲或芘为模型研究物；
(2)、土壤样本的采集：采集典型PAHs污染区土壤，测定PAHs的含量；在实验室冷冻干燥，用研钵捣碎研细，过2mm筛备用，此为原土；原土测定颗粒组成、有机质、氮、pH值指标；称取风干并过2mm筛的原土置于三角瓶中，加入100mL去离子水，200r/min下恒温振荡4h，静止后弃去上清液，重新加入去离子水，重复该过程4次，然后将土样自然风干，磨碎，过2mm筛，作为去除内源DOM的土样；自制室内PAHs污染土壤：将PAHs的乙醇溶液，加入含灭菌土壤的锥形瓶中，放置至乙醇全部挥发完为止；
(3)、DOM的制备：采用水浸提法，选用新鲜奶牛粪，作水分校正后与超纯水1：2混合，连续振5h，然后4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，滤液中的有机物即为DOM，其浓度采用TOC仪测定，滤液经电渗析去离子后，40℃旋转蒸发浓缩冻干，磨碎备用；
(4)、DOM元素组成分析：用Foss Heraeus CHN-O-Rapid型元素分析仪进行元素分析；在750℃温度下灰化4h，称重确定灰分含量；O的含量由总重量减去灰分、碳、氢、氮的重量计算；以除去灰分的纯有机质为基数计算各元素的相对百分含量；用KBr压片法在Nexus 870型红外光谱仪上测定红外光谱；在Bruker DRX500仪器上进行核磁共振测定，1H的共振频率为79.452MHz，DMSO-d6为溶剂；
(5)、菌种选取：白腐菌从云南省微生物研究所购买的Phanero chaete chrysosporiumGIM3.383；在PDA液体培养基里摇床培养4-5天后作为一级种子，新鲜活菌丝或高温灭活菌丝两种处理；
(6)、PDA液体培养基制备:200g/L土豆，煮沸10min后的提取物，20g/L葡萄糖，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 3.0g/L；
(7)、磨口玻璃柱装置制作：定制长80cm、内径8cm的玻璃圆筒，两头分别配置密封的磨口玻璃密封盖，管内填满混匀的PAHs污染土壤；
(8)、静止培养：将污染土壤放入磨口玻璃柱装置，DOM+白腐菌孢子待加溶液缓慢从上面入口加入玻璃柱中，不同温度气候箱静止培养，隔一段时间倒置一次，利用端口盖子的开启或密闭来控制氧气量，定期取样监测相关指标；
Step3、方案的实施，方案的实施包括以下方面：
(1)DOM对土壤吸附PAHs的影响作用：
A、DOM的分离、分级：
分子量分级：将8000Da透析膜剪成所需大小，扎紧一端，系成袋状，置于0.01mol/L CH3COOH中煮沸30min，然后用超纯水洗涤数次；在透析袋中加入10mL DOM溶液，上端扎紧悬挂于铁丝上，置于0.005mol/L K2SO4溶液中透8h，然后置于超纯水中继续透析32h，间隔搅动，并换3次水，实验在4℃下进行，用差减法确定不同分子量级DOM的含量；
极性与非极性DOM的分离：活化树脂：将XAD-7树脂在0.1mol/L NaOH中浸泡24h后，用超纯水洗涤干净，将XAD-7装填到玻璃柱中，装填高度为20cm，用30mL 0.1mol/L HCl洗柱，再用超纯水洗至无DOC；
组分分离：将10mL调整到pH 2的DOM加入柱中，先用40mL 0.01mol/L HCl洗脱，然后用超纯水洗至无DOC，洗脱液流速为1mL/min，收集洗脱液并测定其中DOC含量，这部分DOM代表亲水性DOM组分，吸附在树脂上的疏水性DOM组分则用差减法求出；
B、土壤吸附：
不同粒级结构的灭菌污染土壤的不同PAHs浓度，去除内源DOM和未去除内源DOM，9种不同pH值、6种不同温度，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM的不同的量，5种不同水土比，分析DOM对土壤在0-36h的吸附行为的影响，以未添加DOM作对比，分别设定灭菌土壤、不加土壤和不添加DOM空白，分摇床和静止培养，每隔3h取样，以土壤微生物生物量、水溶液中PAHs浓度、土壤中PAHs的浓度为监测指标，定量研究大分子量的DOM的结合增溶对土壤吸附行为的影响过程，探明不同组分、不同极性、不同分子量的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；
(2)DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响：
A、菌丝的吸附：
一定量的灭活菌丝和活菌丝，不同接种量接入不同PAHs浓度的液体培养液中，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM，设定不加DOM、只加PAHs溶液的液体培养基空白，摇床和静止培养，观察菌丝形态的变化，以水溶液中PAHs的浓度为监测指标，定量研究0-30dDOM对菌丝吸附-解吸PAHs的作用过程的影响，探明DOM的增溶对菌丝吸附-解吸的影响作用；
B、促进菌丝生长：
将在液体培养基里培养5-6天生长良好的一级种子，按不同接种量接入含PAHs不同浓度培养基中，不同分子量、不同极性、不同组分的DOM按照一定的浓度梯度添加，以未添加DOM为对照，9种不同pH、6种不同温度，外源N选择脲、酒石酸铵，外源C选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系7种不同的C/N，分摇床振荡培养和静置培养，每隔24h取样一次，以生物量、PAHs浓度、Lip、Mnp和Laccase活性为监测指标，深入研究从接种到检出降解酶活性阶段DOM促进白腐菌生长的作用机制；
C、酶代谢降解：
一级种子按不同的接种量接入含不同PAHs浓度的液体培养基中，不同极性、不同接种量、不同分子量的DOM，以未添加DOM的含PAHs培养基接种相同量的一级种子为样品空白，选择相同的氮和碳，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，最适pH、最适温度，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，定量监测生物量、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Laccase酶活性，研究不同碳氮比和白腐菌的酶代谢降解途径的作用关系，监测Lip、Mnp和Laccase的产生机制和PAHs浓度变化的动态关系，分析PAHs的中间代谢产物，研究PAHs的降解途径，从而探明白腐菌自产酶开始DOM对关键酶分泌过程的影响作用；
(3)DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制：
基于以上研究结果，深入分析土壤吸附、小分子量DOM促进菌丝生长、大分子量DOM对PAHs的结合增溶、白腐菌菌丝吸附/解吸以及酶代谢降解之间的相互关系，不同分子量、不同极性、不同组分、不同体积的DOM和不同接种量的白腐菌菌丝、不同土壤条件，不同PAH s浓度，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系不同7种不同C/N，5种不同水土比，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，检测生物量、氮、碳、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Laccase酶活性指标，分析PAHs的中间代谢产物，研究复杂条件下不同C/N和关键酶产生的途径与机理的耦合关系，探明复杂条件下降解酶高产、稳产的关键因素，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；
(4)测试方法：
木质素过氧化物酶采用藜芦醇-分光光度法，锰过氧化物酶采用愈创木酚-分光光度法，漆酶用ABTS-分光光度法；颗粒组成采用吸管法；土壤总有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；总氮采用开氏定氮法测定；pH用玻璃电极测定；菌丝干重用恒重重量法，生物量用平板计数法；
土壤相中PAHs和中间产物的抽提测定：将土壤用二氯甲烷超声萃取15min，反复萃取3次，将萃取有机相混合，过滤取澄清上清液旋转蒸发，N2吹定容为1mL，转换溶液为正己烷，过硅胶、氧化铝符合净化柱，依次用20mL正己烷洗去杂质，70mL二氯甲烷/正己烷混合洗脱PAHs，洗脱液再旋转蒸发浓缩至1-2mL，N2吹浓缩至0.5mL GC-M测定；进样口温度为250℃，脉冲无分流方式进样，载气为高纯氦气，流量为l.0mL/min，恒流模式；色谱柱：HPS-Ms，电子轰击能量70eV，电子倍增电压1.4KV，自动调谐，自曝全扫描，质量数扫描范围50～300mu；然后根据各化合物的保留时间与质谱图建立选择粒子检测的时间范围与定性、定量离子；选择粒子扫描色谱图将依据以下条件定性：①保留时间范围±1s，信号应大于等于3倍噪声信号；②定性、定量离子峰检测强度的比值应不超过理论值的15％；
Step4、数据采集及数据分析；
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