CN104630108A - 一株伯克霍尔德氏菌及其应用方法 - Google Patents

一株伯克霍尔德氏菌及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株伯克霍尔德氏菌及其应用方法。菌株Burkholderia sp.Z-90，保藏号为CGMCC No.9970。该菌株在代谢过程中能产生大量糖脂类生物表面活性剂，这些表面活性剂能络合解吸污染土壤中的重金属。将该菌株用于处理受重金属污染的土壤，土壤中重金属Zn,Pb,Mn,Cd,Cu和As的含量由原来Zn22374.1mg/kg,Pb2472.4mg/kg,Mn1837.2mg/kg，Cd447.0mg/kg,Cu709.5mg/kg和As562.2mg/kg降低至Zn12525.4mg/kg,Pb1670.0mg/kg,Mn878.1mg/kg，Cd278.3mg/kg,Cu538.6mg/kg和As384.3mg/kg，去除率分别为44.0％,32.5％,52.2％,37.7％,24.1％和31.6％。

Description

一株伯克霍尔德氏菌及其应用方法
技术领域
本发明涉及微生物菌株及其应用技术领域，具体涉及一株伯克霍尔德氏菌及其应用方法。
背景技术
随着工业的发展，大量重金属元素进入土壤中，严重危害动植物的生长，并通过生物富集、食物链放大等过程，进一步影响陆地物种和人类，给国家的安全造成了重大影响。近年来，重金属污染土壤修复方法得到广泛研究。常采用的重金属污染土壤修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复方法。物理修复工程量大，耗材耗力，而且很难将土壤重金属污染处理到要求值；化学修复会造成二次污染，因此不是理想的重金属修复方法。生物修复重金属污染土壤的方法由于其成本低、无二次污染和操作简单等优点而日益引起广大环保工作者极大的兴趣。分离驯化获得高修复效率的功能菌一直是研究者们致力开展的一项工作。国内外在这方面的报道较多，已分离能用于生物修复的菌株有多种，主要有氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、氧化硫硫杆菌(sulfur-oxidizing bacteria)、黑曲霉(Aspergillus niger)和简青霉(Penicillium simplicissimum)。但是，迄今为止，Burkholderia sp.淋滤重金属污染土壤的报道还鲜有报道。因此，本发明为重金属污染土壤生物修复提供了新的微生物资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株伯克霍尔德氏菌菌株和应用方法，该菌株代谢过程中能产生大量糖脂类生物表面活性剂。将该菌株产生的生物表面活性剂用于重金属污染土壤的治理，成本低，操作简单，无二次污染。
一株伯克霍尔德氏菌，所述菌株为Burkholderia Z-90，保藏号为CGMCC No.9970。
所述的菌株的应用方法，培养所述的伯克霍尔德氏菌菌株产生生物表面活性剂。培养时采用改良LB液体培养基，该培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，植物油4ml，加水至1L。所述的植物油包括菜籽油。
所述的菌株产生生物表面活性剂的温度范围25℃-40℃。
所述的菌株产生生物表面活性剂的种类为糖脂类生物表面活性剂。
所述的菌株的应用方法，所述的菌株用于去除污染土壤中重金属。
所述的菌株用于淋滤去除污染土壤中重金属。
可取247.5mL液体培养基装入500mL锥形瓶中灭菌，接种OD620值为3.6的接种液2.5mL，置于恒温震荡培养箱中，35℃，180r/min振荡培养两天后加入12.5g灭菌土壤，处理至少5天。
所述的液体培养基为改良LB液体培养基，组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，植物油4ml，加水至1L。所述的植物油包括菜籽油。
本发明采集中国湖南某高校餐饮中心下水道油泥样品，经过筛选、分离和纯化，得到一株产生生物表面活性剂的菌株，经鉴定，该菌株的16S rDNA基因序列与Burkhoideria sp.IHBB 2259、Burkhoideria sp.SBH-14的16S rDNA有100％的相似性，命名为伯克霍尔德氏菌Burkhoideria sp.Z-90。该菌株已于2014年11月14日向地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交专利生物保藏，保藏号为CGMCC No.9970。该菌株可用于重金属污染土壤修复。
本发明菌株接种于改良LB液体培养基中，改良LB液体培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，菜籽油4ml，加水至1L。从培养的第一天开始用自动界面张力仪(JYW-200A)测量培养基表面张力值，发现培养基表面张力值不断往下降，发酵培养(180rpm35℃)两天，能将培养液初始表面张力67.2mN/m降到32.6mN/m左右，发酵培养五天，能将培养液表面张力降至27.85mN/m左右，此时培养液的表面张力达到最低，表面活性剂的产量最高，为0.9216g/L。
取247.5mL改良LB液体培养基装入500mL锥形瓶中灭菌，接种OD620值为3.6的接种液2.5mL，置于恒温震荡培养箱中(35℃，180r/min)振荡培养两天后加入12.5g灭菌土壤。实验分成两组，第一组即先将接种后的培养基振荡培养两天，再加灭菌土壤，第二组为对照，将不接种的培养基振荡培养两天，再加入灭菌土壤。每组实验三个重复。五天后取出过滤，过滤后土壤风干研磨，微波消解，消解液的重金属浓度采用ICP-OES测量，经检测，土壤中重金属Zn,Pb,Mn,Cd,Cu和As的含量由原来Zn22374.1mg/kg,Pb2472.4mg/kg,Mn1837.2mg/kg，Cd447.0mg/kg,Cu709.5mg/kg和As562.2mg/kg降低至Zn12525.4mg/kg,Pb1670.0mg/kg,Mn878.1mg/kg，Cd278.3mg/kg,Cu538.6mg/kg和As384.3mg/kg，去除率分别为44.0％,32.5％,52.2％,37.7％,24.1％和31.6％。对照组中重金属Zn,Pb,Mn,Cd,Cu和As的去除率分别为1.9％，7.1％，14.3％，4.5％，8.4％，3.0％(图1)。
附图说明
图1：本发明菌株处理重金属污染土壤效果图；
图2：本发明菌株的扫描电镜图；
图3：本发明菌株的系统发育分析树；
图4：本发明菌株产生的生物表面活性剂的薄层色谱图；
图5：本发明菌株产生的生物表面活性剂的红外光谱图。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：菌株生物学鉴定
挑取单菌落接种于改良LB液体培养基中，置于35℃恒温震荡培养箱中培养过夜，离心收集菌体，按TIANGEN公司细菌DNA提取试剂盒操作进行菌体DNA提取，并进行PCR扩增。PCR扩增产物经测序公司测序，16S rDNA和Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，与Burkhoideria sp.IHB B 2259、Burkhoideria sp.SBH-14的16s rDNA有100％的相似性，将该菌株命名为Burkhoideria sp.Z-90，该菌株的扫描电镜图和系统发育分析树见图2，图3。
实施例2：Burkhoideria sp.Z-90产生物表面活性剂种类的测定
采用薄层层析法和红外光谱法测定Burkhoideria sp.Z-90产生物表面活性剂的种类。具体实验条件如下：将培养五天之后的发酵液于0.22微米滤孔膜上进行过滤，滤液以8000r/min的转速离心20min，将上清液再次过滤，用6mol/L的HCl溶液调节滤液的pH值至2，向滤液中加入等体积的乙酸乙酯溶液后放到磁力搅拌器上搅拌以使滤液与萃取剂充分混合，重复两次，合并有机相，于45℃下减压蒸溜，至圆底烧瓶内溶液为黄褐色粘稠状液体倒出，放于35℃真空干燥箱中干燥，待有机相完全挥发后，所得即为表面活性剂产品。将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，然后在95℃烘箱中加热10min显色呈棕红色斑点(图4)，初步说明此生物表面活性剂为糖脂类生物表面活性剂。试验中所用的展开剂为：氯仿-甲醇-水(v:v:v＝65:25:4)，由于展开剂不能互溶，应放置1小时后使用；显色剂为：3g苯酚，5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中。将提取的生物表面活性剂纯品在30℃下真空干燥24小时，采用KBr压片法进行FT-IR分析，分析结果如图5所示，3312.66cm-1处强的吸收带表明分子中含有大量的-OH。在3100-2900和1400-1200cm-1波段有糖类的特征吸收峰。酯类主要的特征吸收峰是酯基中C＝O和C-O-C的伸缩振动吸收，酯中羰基的伸缩振动为1750-1710cm-1及1300-1000cm-1。由此可知，1721.03cm-1、1241.47cm-1为生物表面活性剂中羰基的吸收峰。C-O-C有两个伸缩振动吸收为反对称伸缩振动1300-1150cm-1和对称伸缩振动1140-1030cm-1，因此1241.47cm-1和1104.35cm-1为生物表面活性剂中C-O-C的吸收带，1456.38cm-1则为C-H的弯曲振动。因此，进一步验证此生物表面活性剂为糖脂类生物表面活性剂。
实施例3：湖南衡阳某冶炼厂厂区污染土壤修复
将采集到的湖南衡阳某冶炼厂厂区污染土壤，风干，磨碎，过4.75mm孔径筛，取12.5g置于150℃灭菌锅中灭菌30min。取247.5mL已配好的改良LB液体培养基，装入500mL锥形瓶中，置于121℃灭菌锅中灭菌30min。灭菌完毕冷却后，接种2.5mL OD620值约为3.6的接种液于灭菌改良LB液体培养基中，置于35℃恒温振荡培养箱中培养两天，得到菌液。将12.5g灭菌土壤加入菌液中，放回恒温振荡培养箱中，五天后取出过滤，过滤后土壤风干研磨，微波消解，消解液的重金属浓度采用ICP-OES测量，经检测，土壤中重金属Zn,Pb,Mn,Cd,Cu和As的含量由原来Zn22374.1mg/kg,Pb2472.4mg/kg,Mn1837.2mg/kg，Cd447.0mg/kg,Cu709.5mg/kg和As562.2mg/kg降低至Zn12525.4mg/kg,Pb1670.0mg/kg,Mn878.1mg/kg，Cd278.3mg/kg,Cu538.6mg/kg和As384.3mg/kg，去除率分别为44.0％,32.5％,52.2％,37.7％,24.1％和31.6％。

Claims (10)

1.一株伯克霍尔德氏菌，其特征在于，所述菌株为Burkholderia Z-90，保藏号为CGMCCNo.9970。
2.权利要求1所述的菌株的应用方法，其特征在于，培养所述的伯克霍尔德氏菌菌株产生生物表面活性剂。.
3.根据权利要求2所述的菌株的应用方法，其特征在于，培养时采用改良LB液体培养基，该培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，植物油4ml，加水至1L。
4.根据权利要求3所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的植物油包括菜籽油。
5.根据权利要求2或3或4所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的菌株产生生物表面活性剂的温度范围25℃-40℃。
6.根据权利要求2所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的菌株产生生物表面活性剂的种类为糖脂类生物表面活性剂。
7.权利要求1所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的菌株用于去除污染土壤中重金属。
8.根据权利要求7所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的菌株用于淋滤去除污染土壤中重金属。
9.根据权利要求7所述的菌株的应用方法，其特征在于，取247.5mL液体培养基装入500mL锥形瓶中灭菌，接种OD620值为3.6的接种液2.5mL，置于恒温震荡培养箱中，35℃，180r/min振荡培养两天后加入12.5g灭菌土壤，处理至少5天。
10.根据权利要求9所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的液体培养基为改良LB液体培养基，组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，植物油4ml，加水至1L。
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