CN113252800B - 一种hplc检测法匹拉韦及其有关物质的方法和其应用 - Google Patents

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Abstract

一种高效液相色谱法检测法匹拉韦有关物质的方法，所述方法使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为25‑35℃，检测波长为220nm‑250nm，流动相由A相和B相组成，流动相的流速为0.8‑1.2ml/min，其中，A相为pH为3.5‑6.0的水溶液，B相为有机溶剂。该分析方法中不同物质的分离度好，能够提高原料和制剂的安全性、有效性和质量可控性。

Description

一种HPLC检测法匹拉韦及其有关物质的方法和其应用
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测法匹拉韦及其有关物质的方法和其应用。
背景技术
法匹拉韦(favipiravir，结构如式Ⅰ所示)为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂类广谱抗病毒药物，该药物对人类应对可能出现的烈性病毒性传染病和可能的生物恐怖袭击具有重要的现实意义。
法匹拉韦在氧化、强酸、强碱条件下不稳定，易发生降解而产生降解物质，且其制备中引入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物等，均成为影响药品质量的有关物质，故需对其加以控制，以保障药品质量和用药安全性，实现药品质量可控。
CN104914185A公开了一种用高效液相色谱法检测法匹拉韦及其有关物质的方法。该方法采用二极管阵列检测器，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-磷酸盐溶液(优选pH7.0)为流动相进行梯度洗脱。该方法存在下述缺陷：一是未具体给出法匹拉韦的任何有关物质信息，故无法得知其能够检测的有关物质；二是未明确检测波长，进而无法明确其能检测何种有关物质，三是仅检测了法匹拉韦制剂中的一个有关物质，难以有效分离并检测法匹拉韦及其制剂中存在的多种有关物质。
因此，如何高效地分离并检测法匹拉韦及其制剂中存在的多种结构相近的有关物质，以保障药品质量并实现药品质量可控成为本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法分离检测法匹拉韦和/或其衍生物及其制剂中有关物质的方法，所述方法使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为25-35℃，检测波长为220nm-250nm，流动相由A相和B相组成，流动相的流速为0.8-1.2ml/min，其中，A相为pH为3.5-6.0的水溶液，B相为有机溶剂。
本发明的优选技术方案中，所述流动相中含有离子对试剂，优选所述离子对试剂选自四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵(10％水溶液)、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述离子对试剂浓度为15nM-25nM，优选为18nM-22nM，更优选为20nM。
本发明的优选技术方案中，组成B相的有机溶剂选自乙腈、甲醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，柱温选自25℃、30℃、35℃的任一种。
本发明的优选技术方案中，流动相的流速选自0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的任一种。
本发明的优选技术方案中，检测波长为220nm-240nm，优选检测波长选自220nm、230nm、240nm的任一种。
本发明的优选技术方案中，A相的pH为4.5-5.5，优选为A相的pH4.7-5.3，更优选A相选自pH4.7、pH4.8、pH5.0、pH5.2、pH5.3的任一种。
本发明的优选技术方案中，0-10min时，流动相中A相:B相的体积比为85:15-95:5；优选为0-10min时，流动相中A相:B相的体积比为87:13-93:7；更优选0-5min时，A相:B相的体积比为87:13-93:7。
本发明的优选技术方案中，35-40min时，流动相中A相:B相的体积比为65:35-55:45，维持洗脱5-20min。
本发明的优选技术方案中，35-40min时，流动相中A相:B相的体积比为68:32-52:47，维持洗脱5-20min；更优选35min时，流动相中A相:B相的体积比为68:32-52:47，维持洗脱5-20min，优选维持洗脱10-20min。
本发明的优选技术方案中，组成A相的水溶液为磷酸盐水溶液，优选所述的磷酸盐选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、磷酸铵盐的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，组成A相的磷酸盐水溶液的浓度为0.01％-0.35％，优选为0.05％-0.25％，更优选为0.15％。
本发明的优选技术方案中，组成A相的磷酸盐水溶液为磷酸二氢铵溶液，优选浓度为0.15％的磷酸二氢铵水溶液。
本发明的优选技术方案中，进样量为5-20μl，优选进样量选自5μl、10μl、15μl、20μl的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的待测物质、供试品、对照品溶液、供试品溶液的任一种用溶解溶剂溶解或稀释，优选所述的溶解溶剂选自甲醇-水溶液、磷酸盐水溶液的任一种。
本发明的优选技术方案中,用作溶解溶剂的甲醇-水溶液的体积比为1:0.5-1:1.5，优选为1:0.8-1:1。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、磷酸铵盐的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐水溶液的浓度为0.01％-0.35％，优选为0.05％-0.25％，更优选为0.15％。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐为磷酸二氢铵。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐水溶液为0.15％磷酸二氢铵溶液。
本发明的优选技术方案中，所述磷酸二氢铵溶液的pH值为5.0-9.0，优选pH6.0-8.0，更优选pH7.0-7.5。
本发明的优选技术方案中，所述待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述待测物质选自3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠和溶解溶剂的组合、法匹拉韦或其衍生物和6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的组合、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺和6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸的组合、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸和6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的组合、3,6-二氟-2-氰基吡嗪和3,6-二氯-2-氰基吡嗪中的任一种。
本发明的优选技术方案中，当所述有关物质包含3,6-二氟-2-氰基吡嗪时，增加检测波长为280nm-300nm的检测，优选增加检测波长为290nm的检测。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中溶剂峰与待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，优选所述的待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，优选所述的待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中法匹拉韦或其衍生物与待测杂质的任一种之间的分离度不低于2.0，优选法匹拉韦或其衍生物与待测杂质的任一种之间的分离度不低于2.5，其中，所述的待测杂质或有关物质选自6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱为商购获得，优选为Agilent、Agela、Techmate、Kromasil公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱，更优选为ZORBAX SB-C18、Poroshell 120 EC-C18、ZORBAX 300SB-C18、XDB-C18、Eclipse Plus C18、TC-C18、Extend-C18、Bonshell C18、Venusil C18 Plus、Bonshell ASB C18、Venusil HLPC18、Venusil MP C18、Innoval Neo XD C18、Venusil XBP C18(A)、Venusil XBP C18(B)、Techmate C18-ST、Techmate C18-STⅡ、Techmate CI8 UG、Kromasil Eternity-5-C18、Kromasil EternityXT-10-C18、Kromasil 100-10-C18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil300-5-C18的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为4.6mm×250mm，填料粒径优选5μm。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦的衍生物选自法匹拉韦的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂化物中的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦的制剂选自本领域常规方法制得的制剂，优选选自片剂、分散片、肠溶片、含片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片、缓释片、控释片、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂、冻干粉针剂、喷雾剂、丸剂、微丸剂、糖浆剂、混悬剂、泡腾剂、注射液、冻干粉针剂的任一种。本发明的另一目的在于提供高效液相色谱法用于分离检测法匹拉韦或其衍生物含量方法中的应用，所述方法使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为25-35℃，检测波长为220nm-250nm，流动相由A相和B相组成，流动相的流速为0.8-1.2ml/min，其中，A相为pH为3.5-6.0的水溶液，B相为有机溶剂。
本发明的优选技术方案中，所述流动相中含有离子对试剂，优选所述离子对试剂选自四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵(10％水溶液)、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述离子对试剂浓度为15nm-25nm，优选为18nm-22nm，更优选为20nm。
本发明的优选技术方案中，组成B相的有机溶剂选自乙腈、甲醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，柱温选自25℃、30℃、35℃的任一种。
本发明的优选技术方案中，流动相的流速选自0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的任一种。
本发明的优选技术方案中，检测波长为220nm-240nm，优选检测波长选自220nm、230nm、240nm的任一种。
本发明的优选技术方案中，A相的pH为4.5-5.5，优选为A相的pH4.7-5.3，更优选A相选自pH4.7、pH4.8、pH5.0、pH5.2、pH5.3的任一种。
本发明的优选技术方案中，0-10min时，流动相中A相:B相的体积比为85:15-95:5；优选为0-10min时，流动相中A相:B相的体积比为87:13-93:7；更优选0-5min时，A相:B相的体积比为87:13-93:7。
本发明的优选技术方案中，35-40min时，流动相中A相:B相的体积比为65:35-55:45，维持洗脱5-20min。
本发明的优选技术方案中，35-40min时，流动相中A相:B相的体积比为68:32-52:47，维持洗脱5-20min，优选维持洗脱10-20min；更优选35min时，流动相中A相:B相的体积比为68:32-52:47，维持洗脱5-20min，优选维持洗脱10-20min。
本发明的优选技术方案中，组成A相的水溶液为磷酸盐水溶液，优选所述的磷酸盐选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、磷酸铵盐的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，组成A相的磷酸盐水溶液的浓度为0.01％-0.35％，优选为0.05％-0.25％，更优选为0.15％。
本发明的优选技术方案中，组成A相的磷酸盐水溶液为磷酸二氢铵溶液，优选浓度为0.15％的磷酸二氢铵水溶液。
本发明的优选技术方案中，进样量为5-20μl，优选进样量选自5μl、10μl、15μl、20μl的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的待测物质、供试品、对照品溶液、供试品溶液的任一种用溶解溶剂溶解或稀释，优选所述的溶解溶剂选自甲醇-水溶液、磷酸盐水溶液的任一种。
本发明的优选技术方案中,用作溶解溶剂的甲醇-水溶液的体积比为1:0.5-1:1.5，优选为1:0.8-1:1。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、磷酸铵盐的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐水溶液的浓度为0.01％-0.35％，优选为0.05％-0.25％，更优选为0.15％。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐为磷酸二氢铵。
本发明的优选技术方案中，用作溶解溶剂的磷酸盐水溶液为0.15％磷酸二氢铵溶液。
本发明的优选技术方案中，所述磷酸二氢铵溶液的pH值为5.0-9.0，优选pH6.0-8.0，更优选pH7.0-7.5。
本发明的优选技术方案中，所述待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述待测物质选自3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠和溶解溶剂的组合、法匹拉韦或其衍生物和6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的组合、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺和6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸的组合、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸和6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的组合、3,6-二氟-2-氰基吡嗪和3,6-二氯-2-氰基吡嗪中的任一种。
本发明的优选技术方案中，当所述有关物质包含3,6-二氟-2-氰基吡嗪时，增加检测波长为280nm-300nm的检测，优选增加检测波长为290nm的检测。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中溶剂峰与待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，优选所述的待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，优选所述的待测物质选自法匹拉韦或其衍生物、6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述检测方法中法匹拉韦或其衍生物与待测杂质的任一种之间的分离度不低于2.0，优选法匹拉韦或其衍生物与待测杂质的任一种之间的分离度不低于2.5，其中，所述的待测杂质或有关物质选自6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱为商购获得，优选为Agilent、Agela、Techmate、Kromasil公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱，更优选为ZORBAX SB-C18、Poroshell 120 EC-C18、ZORBAX 300SB-C18、XDB-C18、Eclipse Plus C18、TC-C18、Extend-C18、Bonshell C18、Venusil C18 Plus、Bonshell ASB C18、Venusil HLPC18、Venusil MP C18、Innoval Neo XD C18、Venusil XBP C18(A)、Venusil XBP C18(B)、Techmate C18-ST、Techmate C18-STⅡ、Techmate CI8 UG、Kromasil Eternity-5-C18、Kromasil EternityXT-10-C18、Kromasil 100-10-C18、Kromasil 100-5-C18、Kromasil300-5-C18的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为4.6mm×250mm，填料粒径优选5μm。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦的衍生物选自法匹拉韦的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂化物中的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦的制剂选自本领域常规方法制得的制剂，优选选自片剂、分散片、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂、冻干粉针剂、喷雾剂、丸剂、微丸剂(胜燕、美霞可以继续补充完善)的任一种。
本发明的另一目的在于提供本发明分离纯化制得的高纯度法匹拉韦或其衍生物或其有关物质的任一种用作标准品或对照品中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦的衍生物选自法匹拉韦的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂化物中的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述法匹拉韦或其衍生物的有关物质选自6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠、6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸、6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪、3,6-二氟-2-氰基吡嗪、3,6-二氯-2-氰基吡嗪的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种化合物E，
本发明的另一目的在于提供化合物E的制备方法，包括以下步骤，将法匹拉韦或其药学上可接受的盐置于氧化剂和反应溶剂存在的反应体系中，在25℃-100℃发生氧化反应，分离、纯化反应产物，即得。
本发明的优选技术方案中，所述氧化剂选自双氧水、间氯过氧苯甲酸、叔丁基过氧化氢、三氧化硫吡啶盐(SO3·Py)、NaOCl/TEMPO(次氯酸钠/2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物)、高碘酸钠(NaIO4)、H2O2/NaOH、硝酸铈铵、四乙酸铅(LTA)、铬酸酐-酸酐(CrO3-Ac2O)、CrO2Cl2、CrO3(Py)2、SeO2、氯铬酸吡啶盐(PCC)、重铬酸吡啶盐(PDC)、重铬酸盐、MnO2、DMSO-DCC(二环己基碳二亚胺)、DMSO-Ac2O、DMSO-(COCl)2、DMS/NCS(N-氯代丁二酰亚胺)、(1,1,1-三乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述氧化剂的用量为法匹拉韦：氧化剂的摩尔比为1:0.8-1:2，优选为1:1-1:5。
本发明的优选技术方案中，所述反应溶剂选自极性质子溶剂、极性非质子溶剂的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述反应溶剂选自水、甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的氧化反应温度为50℃-90℃，优选为60-80℃。
本发明的另一目的在于提供化合物E用作法匹拉韦或其制剂的对照品或标准品中的应用。
本发明的另一目的在于提供化合物E用作法匹拉韦或其制剂质量控制中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
1.本发明通过科学筛选并优化高效液相色谱法的检测条件，包括优化色谱条件和梯度洗脱条件，实现了法匹拉韦或其衍生物及其制剂与其在制备、存储中产生的多种结构相近、难以分离的有关物质之间的有效分离与检测。本发明的高效液相色谱法中溶剂峰与待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，法匹拉韦与任一种待测杂质之间的分离度不低于2.0，可用于法匹拉韦或其衍生物及其制剂的分离、含量测定、制备纯化或其有关物质的监控。
2、本发明的高效液相色谱法具有专属性好、灵敏度高等优点，实现了3-氨基甲酰基吡嗪-2-羟基钠与溶剂峰之间、法匹拉韦与6-((3-氨基甲酰基-5-氟吡嗪-2-基)氧代)-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺之间，以及6-氯-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酸与6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺之间的有效分离，待测物质的检测限为0.15-0.61ng，定量限为0.31-1.22ng。该方法既利于法匹拉韦原料及制剂的质量控制，保障药品质量及其安全性，且缩短杂质出峰时间，利于缩短生产检测周期并降低生产成本，适用于工业化、规模化生产的相关要求。
3、本发明首次制备、分离并表征了法匹拉韦的氧化降解化合物E，并将其用作法匹拉韦或其制剂的对照品或标准品，用于控制法匹拉韦或其制剂的质量，保障药品质量及其安全性。
附图说明
图1对比例1待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图2对比例2待测杂质与主成分粗品混合样品HPLC图；
图3实施例1待测杂质质与主成分混合样品HPLC图；
图4实施例2待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图5实施例3待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图6实施例4待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图7实施例5待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图8实施例6待测杂质与主成分混合样品HPLC图；
图9实施例7待测杂质与主成分混合样品HPLC图。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
表1
HPLC设备：岛津LC-20A高效液相色谱仪，DAD检测器。
色谱柱1：Agela Venusil XBP C18(A)4.6×250mm，5μm
色谱柱2：TechMate C18-ST 4.6×250mm，5μm
色谱柱3：Kromasil 100-5C18 4.6×250mm，5μm
对比例1
1、色谱柱：Kromasil 100-5C18 4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH5.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：1.0ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
取法匹拉韦、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质F和杂质H适量，将浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，混匀，用磷酸调pH值至7.0)作为溶解溶剂，将其溶解并制成含法匹拉韦2.0mg/ml，上述杂质分别为1.0μg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，用前述溶解溶剂(即pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液)，将稀释成2.0μg/ml的溶液作为对照溶液。精密称取杂质G适量，用前述溶解溶剂(即pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液)溶解，将其制成浓度为1.0μg/ml的溶液，作为对照品溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液、对照溶液、对照品溶液各10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图1。供试品的实验数据见表2。
表2
峰号 保留时间 面积 分离度(USP) 理论塔板数(USP)
杂质B 3.372 49496 -- 5379
法匹拉韦 16.005 58963512 31.317 10563
杂质E 17.380 19427 2.250 13443
杂质A 28.788 50638 18.438 32598
杂质D 32.090 13439 5.227 42076
杂质C 33.261 25040 1.808 38484
杂质F 41.514 27345 14.527 126634
杂质H 42.129 21632 1.004 49385
由图1和表2可见，在该色谱条件下，杂质F和杂质H的分离度仅为1.004，不符合分离度大于1.5的要求，且未检测出杂质G。
对比例2
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH4.5、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、混匀，用磷酸调pH值至4.5)
B相：甲醇
3、流速：1.0ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
取法匹拉韦、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质F和杂质H适量，将浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，混匀，用磷酸调pH值至7.0)作为溶解溶剂，将其溶解并制成含法匹拉韦1.5mg/ml，上述杂质分别为2.0μg/ml的溶液，作为供试品溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图2。供试品的实验数据见表3。
表3
峰号 保留时间 面积 分离度(USP) 理论塔板数(USP)
杂质B 3.753 31035 -- 8788
杂质E 5.636 24540 9.722 9849
未知杂质1 5.954 5765 0.869 2239
未知杂质2 6.765 6602 2.044 8707
杂质A 7.945 124369 4.118 12595
杂质D 8.995 64452 3.575 13984
法匹拉韦 9.641 23622526 1.853 9631
未知杂质3 11.309 7790 3.956 10086
未知杂质4 13.125 14762 4.288 17520
杂质C 15.271 74628 5.842 32694
杂质F 16.227 79191 2.716 31402
未知杂质5 17.234 5609 2.498 24530
由图2和表3可见，杂质D和法匹拉韦不能有效分离，难以有效检测法匹拉韦和杂质D的含量；未检出杂质G；杂质H出峰时间在有机相浓度下降时。为此，需要优化色谱条件，实现药品的质量可控。
实施例1
1、色谱柱：TechMate C18-ST，250×4.6mm，5μm
2、流动相：
A相：pH5.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：1ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
取法匹拉韦、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质F和杂质H适量，将浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，混匀，用磷酸调pH值至7.0)作为溶解溶剂，将其溶解并制成含法匹拉韦2.0mg/ml，上述杂质分别为1.0μg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，用pH7.0、0.15％的磷酸二氢铵溶液稀释，将其制备成2.0μg/ml的溶液作为对照溶液。精密称取杂质G适量，加pH7.0、0.15％的磷酸二氢铵溶液溶解并制成1.0μg/ml的溶液，作为对照品溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图3。供试品的实验数据见表4。
表4
由图3和表4可见，杂质F与杂质H之间的分离度为2.281，且其他物质之间的分离效果良好。
实施例2
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相
A相：pH5.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：1.0ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：28℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图4，供试品的实验数据见表5。
表5
实施例3
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH5.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：0.8ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图5，供试品的实验数据见表6。
表6
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实施例4
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH4.8、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH4.8)
B相：甲醇
3、流速：1ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图6，供试品的实验数据见表7。
表7
实施例5
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH5.2、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.2)
B相：甲醇
3、流速：0.8ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图7，供试品的实验数据见表8。
表8
实施例6
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵18mM，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：0.8ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图8，供试品的实验数据见表9。
表9
由图4-图8、表5-表9可见，本发明通过优化高效液相检测法的色谱条件和梯度洗脱条件，能够有效改善各待测物质之间的分离度，实现各待测物质的有效分离与检测，进而实现药品质量可控。
实施例7
1、色谱柱：Agela Venusil XBP C18(A)柱，4.6×250mm，5μm
2、流动相：
A相：pH5.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.5g，用水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml、四丁基硫酸氢铵6.8g，混匀，用磷酸调pH值至5.0)
B相：甲醇
3、流速：1.0ml/min，进样量：10μl
4、检测器：DAD检测器，检测波长：230nm和290nm，柱温：30℃
5、溶解溶剂：pH7.0、浓度为0.15％的磷酸二氢铵溶液
梯度洗脱条件：
溶液配制方法及浓度同实施例1，供试品色谱图见图9，供试品的实验数据见表10。
表10
专属性
在该有关物质检测色谱条件下，空白溶剂对主峰及杂质的检测无干扰；本品在酸、碱、高温、光照、氧化等破坏的条件下产生的杂质与主成分间、各杂质之间均能够有效分离；各降解条件下，物料基本守恒。
定量限与检测限
八个有关物质的检测限为0.15-0.61ng，灵敏度在0.002-0.006％之间；定量限为0.31-1.22ng，灵敏度在0.001-0.003％之间。实验结果显示，本品有关物质检查方法灵敏度高。
精密度
法匹拉韦及各有关物质的进样精密度良好，RSD在1％以内。
重复性
同一批次样品，重复测定6次，6次测得的结果无明显差异，表明本法重复性良好。
线性与范围
八个有关物质在0.1μg/ml～2μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
回收率
本方法测得本品中各杂质的高中低3个浓度(限度浓度的80％、100％、120％的溶液)9份样品回收率结果均在90％～110％范围内，且9份样品回收率结果的RSD均小于3.0％，结果符合验证要求，本方法的准确度良好。
溶液稳定性
有关物质供试品溶液在室温放置48小时，分别于配制后0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h进样分析，各考察时间点测得的法匹拉韦及各杂质峰面积均无明显变化，且没有新杂质产生。供试品溶液在室温下放置48h，溶液稳定性良好。
耐用性
本品经改变柱温、流速、缓冲盐pH、离子对加入情况、改变不同厂家色谱柱后对有关物质的测定结果均无明显影响；系统适用性溶液中杂质与杂质、杂质与主成分之间的分离良好。由此可知，条件微调不会影响有关物质的测定，本方法耐用性良好。
实施例8化合物E的制备
将浓度为30％的过氧化氢水溶液7ml和纯化水63ml加入反应容器中，搅拌条件下，加入法匹拉韦10.00g。升温至70-80℃，搅拌，至反应完全。用二氯甲烷萃取(50mlx2)，合并有机相，加入30％硫代硫酸钠溶液50ml搅拌1h。将有机相分出后，减压浓缩，制得淡黄色油状物8.32g。经硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂(正己烷/乙酸乙酯＝3:1，v/v)。合并洗脱液，减压蒸干，制得白色固体1.28g，即得。
MS(ESI)m/z(M+H)+:295.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.32(brs,1H),8.50(d,J＝5.6Hz,1H),8.44(brs,2H),8.36(brs,1H),8.10(brs,1H),7.86(brs,1H).
1H NMR(400MHz,DMSO-d6+D2O)δ8.43(d,J＝8.4Hz,1H),8.39(brs,1H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.5,163.7,159.7,156.6,154.9,153.5,153.4,134.4,134.4,133.0,132.8,123.5。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种化合物E，
2.化合物E的制备方法，包括以下步骤，
将法匹拉韦或其药学上可接受的盐置于氧化剂和反应溶剂存在的反应体系中，在25℃-100℃发生氧化反应，分离、纯化反应产物，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述氧化剂选自双氧水、间氯过氧苯甲酸、叔丁基过氧化氢、三氧化硫吡啶盐、次氯酸钠/2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物、高碘酸钠、H2O2/NaOH、硝酸铈铵、四乙酸铅、铬酸酐-酸酐、CrO2Cl2、CrO3(Py)2、SeO2、氯铬酸吡啶盐、重铬酸吡啶盐、重铬酸盐、MnO2、DMSO-DCC、DMSO-Ac2O、DMSO-(COCl)2、DMS/NCS、(1,1,1-三乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮的任一种或其组合。
4.根据权利要求2或3任一项所述的制备方法，其中，所述氧化剂的用量为法匹拉韦：氧化剂的摩尔比为1:0.8-1:2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述反应溶剂选自极性质子溶剂、极性非质子溶剂的任一种或其组合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述反应溶剂选自水、甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿的任一种或其组合。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述氧化反应的温度为50℃-90℃。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述氧化反应的温度为60℃-80℃。
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