CN113234438B - 一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点、其制备方法及应用，包括该基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点的原材料由柠檬酸和苯甲酰脲组成，柠檬酸和苯甲酰脲的质量比为0.5‑3:1‑6。本发明通过N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，氟化铵为氟源添加剂，在增强RCBCPDs碳核结晶状态的同时，丰富了表面聚合物状态，引入氟后促使RCBCPDs拥有更大的多光子吸收截面，从而在体外和体内显示出更强的荧光成像效果。本发明基于柠檬酸和苯甲酰脲碳点制备体系，开发出具有红光的碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法简单，荧光性质出色，具有广阔的应用前景。将本发明所得RCBCPDs进行细胞成像和体内成像的应用，在细胞和小鼠体内均表现出抗干扰、具有选择性强、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料的制备，具体为一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点、其制备方法及应用，属于红光碳化聚合物点应用技术领域。
背景技术
在碳点十余年的发展过程中，由于其出色的发光性能和优越的生物相容性而受到了众多学者的关注。无论是“自上而下”还是“自下而上”方法合成出来的碳点通常都可近似看作“核-壳”结构，石墨烯量子点和碳量子点往往具有明确且清晰的碳核结构，其“壳”是由许多表面官能团(例如-COOH、-SH、O＝C-NH和C＝O等)组成，而碳化聚合物点的碳核部分结晶状态远不如前两者，但“壳”的结构却高度复杂，由聚合物、小分子和官能团所组成，这些独特的结构赋予了碳化聚合物点优异的性能，例如高水溶性、可调节的荧光发射、良好的生物相容性、低毒性和优异的光稳定性等，因此激发了在生物成像、生物传感、药物输送、癌症诊断和治疗等领域的应用。
但在前期的研究中，绝大部分碳点的荧光发射均小于600nm，这会导致强烈的组织吸收，自发荧光的高度干扰以及对组织的严重光损伤等问题，严重限制了碳点在生物体内的进一步应用。因此，制备长波长发射甚至是近红外发射的碳点具有重要意义。近年来，虽然碳点的荧光机制尚不清楚，但通过选择合适的前驱体，改变反应条件还是可以得到具有长波长发射的碳点。此外，对长波长发射起源的理解也是学者们关注的重点，这可完善碳点的荧光机理，从而指导具有特殊需求碳点的设计和制备。无论是实验还是理论研究都证实，长波长荧光发射可以通过以下几个途径，针对石墨烯量子点和碳量子点增大共轭尺寸、增加掺杂原子数目、对碳核表面状态的修饰等途径可以实现荧光红移；而针对碳化聚合物点，前驱体的选择、制备环境的调控以及表面交联状态的复杂化等途径能够导致荧光红移。另外，为了更好地将碳点应用于生物成像领域，促进成像效果的修饰手段很有必要。有文献报道，通过在制备中引入氟化铵可以使碳点内部或表面引入氟元素，促使碳点拥有更大的多光子吸收截面，从而在体外和体内显示出更强的荧光成像效果。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决现有技术中的长波长发射碳点少、细胞和体内成像干扰较大的问题，而提出一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点、其制备方法及应用，本发明的目的在于提供一种具有红色荧光的碳化聚合物点(RCBCPDs)，其制备及后处理方法简单，并可实现高效且具有选择性的细胞和体内成像。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点(RCBCPDs)，该基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点的原材料由柠檬酸和苯甲酰脲组成，柠檬酸和苯甲酰脲的质量比为0.5-3:1-6。
该基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将柠檬酸和苯甲酰脲混合，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，氟化铵为氟源添加剂进行溶剂热制备，得到反应物；
步骤(2)：将步骤(1)所得反应物依次进行冷却、过滤、离心和洗涤处理，得到固体产物；
步骤(3)：向步骤(2)所得固体进行透析处理，冷冻干燥后即得所述基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点。
本发明的进一步技术改进在于：步骤(1)中所述N,N-二甲基甲酰胺的加入量为1-10mL。
本发明的进一步技术改进在于：所述步骤(1)中氟化铵的加入量为0.01g-2g。
本发明的进一步技术改进在于：步骤(1)中所述溶剂热制备的温度为120-280℃，制备时间为0.5-24h。
本发明的进一步技术改进在于：步骤(2)中将步骤(1)得到的反应物冷却至室温后，再过滤、离心和洗涤，得到碳化聚合物点沉淀。步骤(3)中所述透析处理的透析截留分子量为100-14000，透析时间为24-120h。
基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点作为细胞成像和小鼠体内成像探针的应用。
将所述红光碳化聚合物加入到含有细胞的培养液中，共培养后，将细胞清洗，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞内部呈现红色荧光。
将所述红光碳化聚合物配置成一定浓度的溶液，以尾部静脉注射的方式注入小鼠体内，在荧光共聚焦显微镜下观察小鼠体内呈现红色荧光。
本发明通过N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，氟化铵为氟源添加剂，在增强RCBCPDs碳核结晶状态的同时，丰富了表面聚合物状态，引入氟后促使RCBCPDs拥有更大的多光子吸收截面，从而在体外和体内显示出更强的荧光成像效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明基于柠檬酸和苯甲酰脲碳点制备体系，开发出具有红光的碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法简单，荧光性质出色，具有广阔的应用前景。
(2)将本发明所得RCBCPDs进行细胞成像和体内成像的应用，在细胞和小鼠体内均表现出抗干扰、具有选择性强、灵敏度高等优点。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的透射电镜图
图2为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的高分辨透射电镜图。
图3为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的傅立叶变换红外光谱图。
图4为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的X射线能谱图。
图5为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的稳态吸收和荧光图。
图6为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的细胞毒性验证图。
图7为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的HepG2细胞成像图。
图8为本发明制备的红光碳化聚合物点RCBCPDs的小鼠体内成像图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种红光碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法包括如下步骤：
1)将0.5g柠檬酸和4g苯甲酰脲混匀加入聚苯酚罐中，再加入5mL N,N-二甲基甲酰胺和0.05g氟化铵后，将聚苯酚管转入不锈钢外套中，在160℃下反应24h；
2)将步骤1)所得反应物冷却至室温后，对其进行过滤、离心和洗涤操作，收集沉淀物备用；
3)将步骤2)所得沉淀物溶解于适量高纯水中，并将其转移至截留分子量为8000的已活化透析袋中，于常温下透析96h；之后，将RCBCPDs的水溶液转移至小烧杯中，冷冻干燥48h，即得所述RCBCPDs(墨蓝色粉末)。
图1为本实施例所得RCBCPDs的透射电镜/高分辨透射电镜图，结果表明所得RCBCPDs呈纳米球状或椭球状，其平均粒径为1.5nm，在水溶液中单分散，没有明显的聚集。
图2为本实施例所得RCBCPDs的傅里叶变换红外光谱图，结果表明所得RCBCPDs在740cm-1、1482cm-1和3200cm-1左右的峰对应N-H的振动，位于1198cm-1和1350cm-1的特征峰是由C-O键和C-N键的伸缩振动引起的，位于1250cm-1和1390cm-1的小且尖锐的峰对应C-F键，1580cm-1的特征峰归属于C＝C键的伸缩振动，1720cm-1和3400cm-1的特征峰均属于羧基，分别由C＝O键和O-H键振动引起，3300cm-1左右的特征峰来源于N-H键的伸缩振动。
图3为本实施例所得RCBCPDs的X射线能谱图，XPS的总谱显示RCBCPDs由4种元素组成，分别是碳(286.21eV)、氮(399.03eV)、氧(530.84eV)和氟(688.68eV)，元素分析的结果显示，4种元素的原子比分别是C(68.65％)、N(19.55％)、O(11.21％)和F(0.6％)。
实施例二
一种红光碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法包括如下步骤：
1)将2g柠檬酸和1g苯甲酰脲混匀加入聚苯酚罐中，再加入8mL N,N-二甲基甲酰胺和1g氟化铵后，将聚苯酚管转入不锈钢外套中，在220℃下反应10h；
2)将步骤1)所得反应物冷却至室温后，对其进行过滤、离心和洗涤操作，收集沉淀物备用；
3)将步骤2)所得沉淀物溶解于适量高纯水中，并将其转移至截留分子量为3500的已活化透析袋中，于常温下透析24h；之后，将RCBCPDs的水溶液转移至小烧杯中，冷冻干燥48h，即得所述RCBCPDs(褐色粉末)。
图4为本实施例所得RCBCPDs的稳态吸收和荧光图，结果表明RCBCPDs具有540nm的特征吸收波长以及620nm的发射波长。
应用例一
将本发明实施例2所得RCBCPDs应用于人肝癌细胞(HepG2)细胞成像，具体步骤包括如下：
1)将人肝癌细胞(HepG2)接种于孔板中，再放入37℃、5％CO2培养箱中孵育30min；
2)取出孔板，先用0.01mol·L-1的PBS缓冲液洗涤细胞数次，将实施例2中的RCBCPDs(10μg·mL-1)加入孔板，在37℃、5％CO2培养箱中共孵育6h；
3)用0.01mol·L-1的PBS缓冲液洗涤细胞数次后，置于共聚焦荧光显微镜下观察RCBCPDs进入细胞的情况。
由图6可以看出，RCBCPDs进入了人肝癌细胞(HepG2)并成功实验荧光成像。从左到右分别是细胞明场照片，RCBCPDs进入细胞后的荧光成像图片(激发波长为635nm)，明场和荧光成像叠加照片。更重要的，RCBCPDs具有选择性富集在某些细胞器的潜力。说明本发明制备的RCBCPDs在细胞成像方面具有良好的应用。
实施例三
一种红光碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法包括如下步骤：
1)将1g柠檬酸和6g苯甲酰脲混匀加入聚苯酚罐中，再加入10mL N,N-二甲基甲酰胺和0.8g氟化铵后，将聚苯酚管转入不锈钢外套中，在240℃下反应24h；
2)将步骤1)所得反应物冷却至室温后，对其进行过滤、离心和洗涤操作，收集沉淀物备用；
3)将步骤2)所得沉淀物溶解于适量高纯水中，并将其转移至截留分子量为500的已活化透析袋中，于常温下透析120h；之后，将RCBCPDs的水溶液转移至小烧杯中，冷冻干燥48h，即得所述RCBCPDs(黑色粉末)。
本发明还公开了将其可以用于人肺癌细胞(A549)细胞成像，具体步骤包括：
1)将人肺癌细胞(A549)接种于孔板中，再放入37℃、5％CO2培养箱中孵育30min；
2)取出孔板，先用0.01mol·L-1的PBS缓冲液洗涤细胞数次，将实施例2中的RCBCPDs(20μg·mL-1)加入孔板，在37℃、5％CO2培养箱中共孵育1h；
3)用0.01mol·L-1的PBS缓冲液洗涤细胞数次后，置于共聚焦荧光显微镜下观察RCBCPDs进入细胞的情况。
需要说明的是，其表征在实施例1、2中已经列举了具体数据，实施例3中原料成分、制备条件参数与实施例1、2略有不同，但是并不影响对细胞成像的能力，故为了节约篇幅，不再重复列举具体的试验数据。
实施例四
一种红光碳化聚合物点RCBCPDs，其制备方法包括如下步骤：
1)将0.5g柠檬酸和2g苯甲酰脲混匀加入聚苯酚罐中，再加入10mL N,N-二甲基甲酰胺和0.1g氟化铵后，将聚苯酚管转入不锈钢外套中，在180℃下反应4h；
2)将步骤1)所得反应物冷却至室温后，对其进行过滤、离心和洗涤操作，收集沉淀物备用；
3)将步骤2)所得沉淀物溶解于适量高纯水中，并将其转移至截留分子量为1000的已活化透析袋中，于常温下透析48h；之后，将RCBCPDs的水溶液转移至小烧杯中，冷冻干燥48h，即得所述RCBCPDs(墨绿色粉末)。
应用例二
将本发明实施例4所得RCBCPDs应用于小鼠体内成像，具体步骤包括如下：
1)通过尾静脉注射300μL(3mg·mL-1)的RCBCPDs进入小鼠体内，再将小鼠用异氟烷麻醉置于动物盘中；
2)用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)拍摄RCBCPDs在小鼠体内随时间成像的情况；
3)将小鼠解剖，取出器官，同样在激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)下进行成像。
由图8左图可以看出，RCBCPDs能成功实现小鼠体内成像，更重要的，RCBCPDs主要集中在淋巴处，具有淋巴选择性成像的应用能力；另外，如图8右图所示，RCBCPDs在部分脏器(肺、肝、肾、肠)有富集，具有内脏成像的应用能力。
需要说明的是，对最终得到的RCBCPDs的材料学表征数据已在实施例一中具体列举出来了，其作用在实施例1、2中已经列举了具体数据，实施例4中原料成分、制备条件参数与实施例1、2略有不同，但是并不影响RCBCPDs本身物质的特性、以及在细胞和小鼠体内成像的能力，故为了节约篇幅，不再重复列举具体的试验数据。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (8)
1.一种基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点用于制备细胞成像和小鼠体内淋巴选择性成像探针的应用，其特征在于，
所述细胞为人肺癌细胞A549；
所述基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点的原材料由柠檬酸和苯甲酰脲组成，柠檬酸和苯甲酰脲的质量比为0.5-3:1-6；
所述基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点的制备方法包括如下步骤：
步骤（1）：将柠檬酸和苯甲酰脲混合，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，氟化铵为氟源添加剂进行溶剂热制备，得到反应物；
步骤（2）：将步骤(1)所得反应物依次进行冷却、过滤、离心和洗涤处理，得到固体产物；
步骤（3）：向步骤(2)所得固体进行透析处理，冷冻干燥后即得所述基于柠檬酸和苯甲酰脲的红光碳化聚合物点。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述N,N-二甲基甲酰胺的加入量为1-10mL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中氟化铵的加入量为0.01g-2g。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述溶剂热制备的温度为120-280℃，制备时间为0.5-24h。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中将步骤（1）得到的反应物冷却至室温后，再过滤、离心和洗涤，得到碳化聚合物点沉淀。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中所述透析处理的透析截留分子量为100-14000，透析时间为24-120h。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述红光碳化聚合物点加入到含有细胞的培养液中，共培养后，将细胞清洗，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞内部呈现红色荧光。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：将所述红光碳化聚合物点配置成一定浓度的溶液，以尾部静脉注射的方式注入小鼠体内，在荧光共聚焦显微镜下观察小鼠体内呈现红色荧光。
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