KR20190055914A - 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 및 이의 구리 풀 이미징 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 및 이의 구리 풀(a copper pool) 이미징 용도에 대한 것으로, 살아있는 세포에서 구리 이온을 검출하기 위한 비율계량 형광 탐침으로, 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide)(화학식 1)을 개발하였다. 본 발명자들은 생리학적 조건하에서, 화합물 1 및 화합물 2가 Cu+ 및 Cu2+ 이온에 의해 화합물 3 및 화합물 4로 각각 가수분해된다는 것을 비율계량 형광 변화를 통해 확인하였고, 화합물 1이 생적합성이 있고(biocompatible), 살아있는 HeLa 세포 내 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에 주로 위치하였으며, 구리 이온(Cu+ 및 Cu2 +)에 의한 촉매 가수분해에 따라 비율계량 형광 변화를 쉽게 나타낸다는 것을 확인하였으므로, 본 발명은 화학, 생물학 및 환경공학 공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 및 이의 구리 풀 이미징 용도{Hydrazide-linked naphthalimide derivative and use for imaging a copper pool thereof}
본 발명은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 및 이의 구리 풀(a copper pool) 이미징 용도에 관한 것이다.
구리(copper)는 신경전달물질(neurotransmitter) 합성 및 대사 과정 뿐만 아니라, 호흡, 전자 및 산소 이동, 철 흡수, 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 감소와 같은 다양한 생물학적 과정에 있어 중요한 역할을 수행한다. 비정상적인 세포 내 구리 수준은 멘케스병(Menke’s diseases), 윌슨병(Wilson’s diseases), 알츠하이머병(Alzheimer’s diseases) 및 파킨슨병(Parkinson’s diseases)을 포함하는 여러 인간 질병과 관련되어 있다. 세포소기관 내 구리 분포에 대한 연구는 질병 진단 및 질병의 진행 경과를 관측하는데 매우 가치가 있다.
예를 들면, 윌슨병은 심각한 간-신경 장애인데, 구리 전달체(ATP7B) 내 돌연변이가 일어나고, 이후 세포 내 과도한 구리 축적으로 인해 발병한다. 간세포 내 구리 축적은 산화 스트레스 및 염증 반응을 유도하는데, 이는 결국 간 손상으로 이어진다. 흥미롭게도, ER 스트레스와 같은 ER 내 비정상적인 단백질 축적을 포함하는 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 기능 장애가 발병 과정과 관련되어 있지만, 구리 이온의 축적 부위는 비-ER 소기관이다. 사실, 손상된 조직 내 리소좀에서는 구리 이온이 풍부한 것으로 밝혀졌는데, 미토콘드리아 및 리소좀은 구리의 세포 항상성과 관련되어 있다. 한편, 상기 소기관 내 구리 이온이 ER 내 손상 과정에 관여하는지 아닌지는 불명확하다. 따라서, 구리-관련 질환을 이해하기 위해, 소기관 내 구리 수준을 이미징하기 위한 신뢰성 있는 기술이 상당히 필요하다.
살아있는 세포에서의 구리 이미징은 바이오센서 분야에서 흥미로운 주제인데, 구리 이온은 여러 대사체 및 단백질과 강하게 결합하여, 세포에서의 구리 자유 이온 농도는 매우 낮기 때문이다. 다양한 친화도를 가진 생분자와 복합체를 형성하는 구리 이온이 존재하는, 불안정한 구리 풀에서 구리 이온을 인식할 수 있는 센서는 보고된 적이 있다. 최근에, 살아있는 세포에서 구리 이온을 검출하기 위해, 많은 수의 형광 탐침이 개발되었다. 하지만, 몇몇 구리 탐침이 소기관-특이적 형광 이미지를 제공할 뿐이다. 또한, 대부분의 탐침이 형광 턴-오프(turn-off) 및 턴-온(turn-on) 전략을 적용하고 있는데, 이는 구리 이온이 존재하거나, 탐침이 존재하지 않을 경우 나타날 수 있는 비-형광 부위에서 종종 애매한 데이터 분석 결과를 나타낸다. 그러므로, 구리-관련 인간 질환을 연구하기 위해서는, 소기관 선택적 비율계량(ratiometric) 형광 구리 탐침이 필요하지만, 거의 개발되지 않고 있다.
중국공개특허 CN103664971A (2014.03.26 공개)
본 발명의 목적은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 조성물, 구리 검출용 형광 화학 센서 및 구리 검출용 키트를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 구리를 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool)을 이미징하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
에서 선택됨.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 조성물, 구리 검출용 형광 화학 센서 및 구리 검출용 키트를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00005
또는
Figure pat00006
에서 선택됨.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00007
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00008
또는
Figure pat00009
에서 선택됨.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리가 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징 방법을 제공한다.
본 발명은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 및 이의 구리 풀(a copper pool) 이미징 용도에 대한 것으로, 살아있는 세포에서 구리 이온을 검출하기 위한 비율계량 형광 탐침으로, 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide)(화학식 1)을 개발하였다. 본 발명자들은 생리학적 조건하에서, 화합물 1 및 화합물 2가 Cu+ 및 Cu2 + 이온에 의해 화합물 3 및 화합물 4로 각각 가수분해된다는 것을 비율계량 형광 변화를 통해 확인하였고, 화합물 1이 생적합성이 있고(biocompatible), 살아있는 HeLa 세포 내 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에 주로 위치하였으며, 구리 이온(Cu+ 및 Cu2 +)에 의한 촉매 가수분해에 따라 비율계량 형광 변화를 쉽게 나타낸다는 것을 확인하였으므로, 본 발명은 화학, 생물학 및 환경공학 공정에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 상온에서 1% DMSO가 함유된 HEPES 완충액(20 mM, pH = 7.4)에 Na+, K+, Cu+, Cu2 +, Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Zn2 +, Fe2 + 및 Fe3 + (각 20 equiv.)를 첨가하고, 1시간 동안 반응시킨 후, 화합물 1(5.0 μM)의 UV/Vis 흡광도(a) 및 형광 스펙트럼을 나타낸다. 여기(Excitation)는 410 nm에서 일어났다. 삽입 그림은 가시적 색깔 변화 및 형광 색깔 변화 사진을 나타낸다.
도 2(a)는 다양한 농도의 Cu2 + 이온(0-400 μM) 첨가에 따른 화합물 1(5.0 μM)의 형광 변화를 나타낸다. 도 2(b)는 F545/F480 versus [Cu2 +]의 플롯을 나타낸다. 모든 스펙트럼은 1% DMSO가 포함된 HEPES 완충액(20 mM, pH = 7.4)으로 상온에서 1시간 반응시켜 얻어냈다. 여기(Excitation)는 410 nm에서 일어났다.
도 3은 545 nm에서의 형광 세기(fluorescence intensity; FI) 변화를 나타낸다. 검정 막대(bar)는 금속 이온(Na+, K+, Ca2 +, Mg2 +, Zn2 +, Co2 +, Fe2 +, Fe3 +; 각각 100 μM) 및 GSH(100 μM) 존재 또는 미존재시, 화합물 1 용액(5.0 μM)의 형광 세기를 나타낸다. 빨강 막대는 Cu2 + 이온(100 μM)을 용액에 첨가한 후의 형광 세기를 각각 나타낸다. 모든 데이터는 1% DMSO가 포함된 HEPES 완충액(20 mM, pH = 7.4)에서 2시간 동안 반응시킨 후 얻었다. 여기(Excitation)는 410 nm에서 일어났다.
도 4는 HeLa 세포에서 ER-, Lyso- 및 Mito-Red를 포함하는 소기관 추적자와 탐침 1을 동시 염색한 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. 탐침 1 및 소기관 추적자에 대한 여기 파장 및 필터 세트는 각각 475-525 nm band path를 가진 458 nm와(녹색 이미지), > 650 nm long path를 가진 543 nm(빨강색 이미지)였다. 병합된 이미지에서의 R 수치는 Pearson’s correlation coefficients를 나타낸다.
도 5는 HeLa 세포에서 화합물 1의 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. NaVO3 (100 μM)를 첨가하지 않거나, NaVO3 (100 μM)를 37℃에서 24시간 동안 전처리하는 조건으로, CuCl2 (200 μM)를 2시간 동안 처리하여 구리-오버로드된(overloaded) 세포를 준비하였다. 구리-오버로드된(overloaded) 세포는 Cu-킬레이터 (3,6-dithia-1,8-octanediol, 1 mM)로 37℃에서 30분 동안 각각 처리하였다. 세포들은 37℃에서 20분 동안 5 μM의 화합물 1로 무혈청 고농도 글루코스 DMEM 배지에서 반응시켰다. 그 후, 475-525 nm band path(BP)를 가진 458 nm와, 585-615 nm band path(BP)를 가진 543 nm의 여기 파장 및 필터 세트를 사용하여, 화합물 1의 형광 공초점 이미지를 수집하였다. 병합된 이미지에서의 R 수치는 Pearson’s correlation coefficients를 나타낸다.
본 발명자들은 살아있는 세포에서 구리 이온을 검출하기 위한 비율계량 형광 탐침으로, 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide)(화학식 1)을 개발하였다. 이는 구리 이온이 하이드라지드와 쉽게 결합하여, 수용액에서 가수분해(hydrolysis)가 더 잘 일어난다는 장점이 있다(반응식 2). 분자 내 전자 전이(internal charge transfer; ICT) 특성을 갖는 나프탈이미드 염료는 세포 내 바이오-활성인자(bio-active species)의 비율계량 이미징에 빈번하게 적용되고 있다. 본 발명자들은 생리학적 조건하에서, 화합물 1 및 화합물 2가 Cu+ 및 Cu2 + 이온에 의해 화합물 3 및 화합물 4로 각각 가수분해된다는 것을 비율계량 형광 변화를 통해 확인하였다(반응식 2b). 본 발명자들은 화합물 1이 생적합성이 있고(biocompatible), 살아있는 HeLa 세포 내 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에 주로 위치하였으며, 구리 이온(Cu+ 및 Cu2 +)에 의한 촉매 가수분해에 따라 비율계량 형광 변화를 쉽게 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00010
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00011
또는
Figure pat00012
에서 선택됨.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2 + 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00013
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
에서 선택됨.
상세하게는, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 형광 화학 센서를 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2 + 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00016
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00017
또는
Figure pat00018
에서 선택됨.
상세하게는, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2+ 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00019
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00020
또는
Figure pat00021
에서 선택됨.
상세하게는, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 내 소기관은 소포체(endoplasmic reticulum; ER)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00022
상기 화학식 1에서, R은
Figure pat00023
또는
Figure pat00024
에서 선택됨.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리가 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리 검출방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2+ 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 지표는 UV-Vis(Ultraviolet-visible) 분광 광도계, 형광 광도계, 전자분무 이온화 질량 분광법 또는 공초점 현미경을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 시료는 구리 검출이 요구되는 시료이면 어떠한 것이든 가능하다. 보다 바람직하게는, 토양 및 수질로부터 얻어진 환경 시료 또는 생체로부터 분리된 생체 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 내 소기관은 소포체(endoplasmic reticulum; ER)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체를 유기 및 무기산을 이용해 형성할 수 있으며, 예컨대 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 소재 및 기기
모든 형광 및 UV/Vis 흡광도 스펙트럼은 RF-6000 및 UV-2600 분광광도계로 각각 기록하였다. NMR 스펙트럼은 Varian (400 MHz) 기기로 기록하였다. [Cu(MeCN)4][PF6] 및 Na+, K+, Cu2 +, Co2 +, Ca2 +, Mg2 +, Zn2 +, Fe2 + 및 Fe3 +의 염화물과 같은 모든 시약 및 양이온 화합물은 Aldrich로부터 구입하였고, 받은 즉시 사용하였다.
2. UV/ Vis 흡광도 및 형광 분광 분석 방법
금속 염화물의 스톡(stock) 용액은 탈이온화된 물에서 제조하였다. Cu2 +는 아세토니트릴 스톡 용액으로부터 [Cu(MeCN)4][PF6]의 형태로 전달되었다. 합성 탐침의 스톡 용액은 DMSO에서 제조하였다. 화합물 1-4의 형광양자효율(fluorescence quantum yields; Φ f)은 대조 물질과 비교하여 측정되었다. 화합물 1 및 2에 대한 대조물질은 4-아미노 N-부틸 1,8-나프탈이미드(4-amino N-butyl 1,8-naphthalimide; Φ f = 0.64 in ethanol)이고, 화합물 3 및 4에 대한 대조물질은 퀴닌(quinine; Φ f = 0.54 in 0.5 M H2SO4)이다. 모든 스펙트럼 데이터는 1% DMSO가 포함된 HEPES 완충액 (20 mM, pH 7.4)에서 기록되었다. 여기(excitation)는 모든 여기 슬릿(slit) 폭 5 nm로, 410 nm에서 수행하였다.
3. 검출 한계 측정
검출 한계는 다음 식에 따라 계산하였다.
검출 한계(Detection limit) = 3σ/k
σ는 공시료(blank) 측정의 표준편차, k는 분석물 농도에 대한 형광 세기 비율 사이의 기울기이다. 검출 한계는 형광 적정에 기초하여 계산되었다. 탐침의 형광 방출 스펙트럼은 5번 측정되었고, 공시료 측정의 표준편차를 계산하였다. 기울기를 계산하기 위해, 분석물의 농도에 대한 형광 세기의 비율을 플롯하였다.
4. 탐침 1에 대한 구리 이온 -매개 가수분해의 동역학 분석
탐침 1은 pH 7.4에서 HEPES 완충액 (20 mM)에 녹였다. 구리 스톡 용액 (5 mM) 적당량을 화합물 1 용액에 첨가한 후, 545 nm에서의 형광 세기를 410 nm 여기(excitation)에 따라 형광광도계 (Hitachi, Japan)를 사용하여 기록하였다. 600초 동안의 형광 세기 변화를 분석하였고, 동역학 분석에 사용하였다. 측정된 초기 속도의 동역학 분석은 다음 식을 기초로 하였다.
Figure pat00025
초기 속도 = Vmax [Cu 이온]/([Cu 이온] + Km)이고, Vmax 수치는 [Cu 이온]이 무한대일 경우, 추정되는 최대 속도이고, Km 수치는 Cu 이온 및 탐침 1 간 복합체에 대한 해리 상수이다.
5. 세포 배양 및 공초점 현미경 분석
인간 자궁경부암 세포주(HeLa)를 10% FBS(Gipco), 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에서 배양하였다. 이미징 하루 전, 세포들을 공초점 접시에 놓았고, 5% (v/v) CO2가 포함된 습윤 대기 조건으로, 37℃에서 배양하였다. 세포 이미지들은 공초점 현미경(Zeiss model LSM 510)을 사용하여 얻었다. 탐침의 형광 이미지들은 458 nm 및 543 nm의 여기 파장과, band path 475-525 nm 및 band path 585-615 nm 방출 필터를 사용하여 얻었다.
6. 탐침 및 소기관 추적자(tracker)의 동시 염색 및 공초점 현미경 분석
동시-위치화(co-localization) 실험을 위한 소기관 추적 염료는 Invitrogen으로부터 구입하였다. 살아있는 HeLa 세포는 무혈청 고농도 글루코스 DMEM 배지에서, ER-Red(0.5 μM), Lyso-Red(0.05 μM) 또는 Mito-Red(0.1 μM)로 각각 37℃에서 15분 동안 전처리하였다. 그 후, 상기 세포들은 무혈청 고농도 글루코스 DMEM 배지에서, 탐침(5 μM)으로 37℃에서 20분 동안 반응시켰고, PBS로 씻어냈다. 탐침 및 소기관 추적자에 대한 여기 파장 및 필터 세트는 각각 475-525 nm band path(BP)를 가진 458 nm와, > 650 nm long path(LP)를 가진 543 nm 였다.
7. MTT 분석
세포 생존능은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통해 측정하였다. 2×105/mL 세포를 96-웰 플레이트에서 다양한 농도의 탐침 1 또는 2로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 무혈청 배지에 녹인 MTT 용액(5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하였고, 세포들은 1시간 동안 배양하였다. 배양 과정에서 불수용성 포르마잔(formazan)이 형성되었고, DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 멀티-웰 플레이트 리더를 사용하여, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 포르마잔의 양을 확인하였다(n = 4).
< 실시예 1> 탐침 1 및 2의 합성 및 특성 분석
탐침 1 및 탐침 2는 원-팟의 합성 과정을 통해 새롭게 합성되었다(반응식 1). 화합물 1 및 화합물 2의 화학 구조는 FAB 및 ESI mass spectrometry 뿐만 아니라, 1H 및 13C NMR spectroscopy로 확인하였다.
[반응식 1]
Figure pat00026
(1) 화합물 1의 합성
화합물 3 및 화합물 4는 기존의 보고에 따라 제조하였다(J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 17314-17319, Chem. Commun., 2013, 49, 1862-1864, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 4596-4597).
화합물 3 (0.1 g, 0.29 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate, 0.1 g, 0.49 mmol)를 CH3CN (30 mL)에 질소 가스로 0℃에서 용해시켰다. 상온에서 밤새도록 혼합한 후, CH3CN에 용해시킨 하이드라진 모노하이드레이트(hydrazine monohydrate; 0.028 mL, 0.58 mmol) 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 2시간 혼합한 후, 반응 혼합물에서 노란색 고체가 형성되었다. 유기용매를 증발시켰고, 잔여물을 MeOH (2 mL)에 녹였다. 여분의 디에틸 에테르(diethyl ether)를 사용하여, 노란색 고체의 화합물 1(0.06 g, 53%)을 얻어냈다. FAB-MS m/z [M+H]+ calc. 399, obs. 399. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)δ 1.32 (s, 9H); 2.57 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 4.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H); 7.87 (t, J = 6.6 Hz, 1H); 8.42 (d, J = 8.2 Hz, 1H); 8.49~8.52 (m, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6)δ 27.9, 33.8, 35.9, 80.4, 125.2, 131.1, 132.8, 163.1, 163.7, 170.5.
(2) 화합물 2의 합성
화합물 1을 합성하기 위해 사용된 과정을 변형하여, 화합물 2를 합성하였다. 화합물 4 (0.1 g, 0.29 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate, 0.09 g, 0.49 mmol)을 사용하여, 노란색 고체 형태의 화합물 2를 61% 수율로 얻어냈다. ESI-MS m/z [M-H+Na]+ calc. 422.120, obs. 422.950. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6/CDCl3) δ 1.95 (s, 3H); 3.72 (t, J = 4.7Hz, 2H); 3.79 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 4.14 (t, J = 4.7 Hz, 2H); 4.36 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 1H); 7.85 (s, 1H); 8.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H); 8.55 ~8.59 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 /CDCl3) δ 20.4, 38.3, 63.0, 67.2, 67.9, 114.2, 122.0, 128.6, 130.5, 132.4, 163.1, 163.7, 170.1.
< 실시예 2> 화합물 1 및 화합물 2의 센싱 능력 분석
하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide)(화합물 1 및 화합물 2)의 구리 이온 검출 기작은 반응식 2에 나타냈다.
생리학적 조건하에서, Na+, K+, Cu+, Cu2 +, Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Zn2 +, Fe2 + 및 Fe3 +와 같이 생물학적으로 관련된 금속 이온들의 첨가에 따른 UV/Vis 흡광도 및 형광 스펙트럼 변화를 관측하여, 화합물 1 및 화합물 2의 센싱 능력을 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 넓은 흡광도를 나타냈으며, 380 및 480 nm 에서 각각 최대 방출 밴드를 나타냈다. Cu2 + 또는 Cu+ 이온의 첨가에 따라, 화합물 1의 흡광도는 380 에서 440 nm로 변화하였는데, 이는 무색에서 노란색으로 가시적인 색깔 변화를 나타냈다(도 1a). 증가된 형광 세기에 따라, 화합물 1의 방출도 480 (Φf = 0.014)에서 545 (Φf = 0.018) nm로 변화하였고, 파란색에서 노란색을 띈 녹색으로 형광 색깔의 변화도 나타났다(도 1b). 하지만, Na+, K+, Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Zn2 +, Fe2+ 및 Fe3 +와 같은 다른 금속 이온을 첨가한 경우에는 이러한 변화를 관측할 수 없었다. 화합물 2에 대해서도 유사한 흡광도 및 형광 변화가 관측되었다(탐침 단독, λem = 480 nm, Φf = 0.012; 구리 이온이 첨가된 화합물 2, λem = 550 nm, Φf = 0.020). 상기 결과는 화합물 1 및 화합물 2가 다른 생물학적으로 관련된 금속 이온에 비해 구리 이온에서 높은 선택성을 가진 비율계량 형광 변화를 제공한다는 것을 나타낸다.
[반응식 2]
Figure pat00027
< 실시예 3> 구리 이온에 대한 화합물 1의 가수분해 기작 분석
구리 이온에 대한 화합물 1의 가수분해 기작을 확인하기 위해서, 구리 이온 및 탐침의 농도에 따른 동역학 분석을 수행하였다. 초기 속도는 탐침의 농도에 따라 선형으로 증가하였다. 1 : 1 복합체 형성 후 일어나는 느린 가수분해에 대한 동역학 식에 기초하여, Cu+ 및 Cu2 + 촉매 반응에 대해, 해리 상수(dissociation constant; Km)는 각각 28.2 ± 5.7 및 14.9 ± 1.5 μM로 측정되었고, 최대 속도(maximum rate; Vmax)는 각각 5.64 ± 0.57 및 4.51 ± 0.14 △F545 min-로 측정되었다. 구리 이온 농도가 Km 수치보다 더 낮을 경우, 구리 촉매 형광 발생 반응이 구리 이온의 농도에 비례한다는 것을 나타냈다. 이는 구리 이온의 수를 상대적으로 측정하는데 있어 확실히 유리한 점이라고 할 수 있다.
반응식 2b에서 나타낸 바와 같이, 탐침 1이 구리-촉진된 가수분해를 통하여 아미노나프탈이미드 화합물 3으로 전환되는지 확인하기 위해서, 반응 혼합물을 ESI-MS 및 1H NMR spectroscopy로 분석하였다. 구리 이온이 존재하는 경우에는, 화합물 1과 관련된 질량 피크가 사라졌고, 화합물 3과 관련된 새로운 질량 피크가 관측되었다. 화합물 3의 형태는 1H NMR spectroscopy에 의해 좀 더 확인되었다. 화합물 2도 유사하게, 구리-촉진된 가수분해를 통하여 화합물 4로 전환되었다. 결과적으로, 화합물 1 및 화합물 2는 구리 이온, 즉 Cu+ 및 Cu2 +의 노출에 따라, 구리-촉진된 가수분해를 통하여 비율계량 형광 변화를 나타낼 수 있었다.
상기 Cu+ 및 Cu2 + 이온에 대한 화합물 1 및 화합물 2의 가수분해 반응이 세포 내에서 검출된 구리 이온의 확인에 있어 불명확성을 야기할 수 있다는 의문을 가질 수 있으나, Cu+에서 Cu2 + 이온으로의 낮은 환원 전위와, ER과 같은 몇몇 소기관에서의 상대적으로 평등한 레독스 환경으로 인해, 세포 내 구리 이온들의 산화 상태는 쉽게 서로 상호전환될 수 있다. 또한, 상기 이온들은 대부분 생분자들과 불안정한 구리 복합체로 존재하는 것으로 예측된다. 따라서, 화합물 1 및 화합물 2는 불안정한 풀(pool)을 포함하는 세포 내 전체 구리 이온 풀을 검출할 수 있다고 판단된다.
< 실시예 4> 화합물 1의 비율계량 형광 변화의 정량 분석
다양한 농도의 Cu2 + 이온에 대한, 화합물 1의 비율계량 형광 변화를 정량적으로 분석하였다(도 2). [Cu2 +]가 증가할수록, 545 nm에서의 형광 세기는 증가하였고, 480 nm에서의 세기는 감소하였다(도 2a). 또한, 100 μM Cu2 + 이온 첨가시, 형광 세기 비율(F545/F480)은 포화되는 것으로 확인되었다(도 2b). F545/F480 비율 및 0-25 μM 범위 내 [Cu2 +] 사이에서 선형 상관관계(R2 = 0.99)가 확인되었다. 화합물 1의 검출 한계는 Cu2 + 및 Cu+ 이온 각각에 대해 1.1 μM 및 0.7 μM인 것으로 확인되었다. 다양한 농도의 Cu2 + 이온에 대한 화합물 1의 흡광도 스펙트럼은 380 내지 440 nm에서 점진적인 변화가 확인되었다. 즉, 상기 결과는 생리학적 조건하에서 구리 이온를 정성 및 정량 분석하는데, 화합물 1이 비율계량 형광 탐침으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
< 실시예 5> 경쟁 금속 이온 존재시 , 구리 이온에 대한 화합물 1의 형광 반응 분석
구리 이온에 대한 탐침 1의 형광 향상에 있어, 다른 생물학적으로 존재할 수 있는 금속 이온들의 간섭 가능성을 확인하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, Na+, K+, Ca2 +,Mg2 +,Zn2 +,Co2 +,Fe2 + 또는 Fe3 +와 같은 다른 금속 이온이 존재하는 경우, 탐침 1은 아무런 형광 변화를 나타내지 않았으나, 용액에 Cu2 + 이온을 첨가한 후에는 545 nm에서 형광 증가가 나타났다. 또한, 세포 내 가장 풍부한 티올(thiol)로서, 구리 이온과 복합체를 형성할 수 있는 글루타치온(glutathione; GSH)이 존재하는 경우에도, Cu2 +에 대한 화합물 1의 형광 발생 반응은 일어났다. GSH 존재시, 형광 발생 반응률은 느리게 감소하였는데, 이는 GSH에 대한 경쟁적인 구리 결합 친화도로 인한 것으로 예상된다. 즉, 다른 경쟁적인 금속 이온 및 GSH가 존재하는 경우에도, 탐침 1은 구리 이온을 검출할 수 있다는 것을 명확하게 밝혀냈다. 상기 결과는 화합물 1이 세포 내 불안정한 구리 풀을 이미징하는데 사용될 수 있다는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 6> 화합물 1의 구리 유도 가수분해에 있어 pH의 영향 분석
또한, 화합물 1의 구리-유도 가수분해에 있어 pH의 영향을 확인하였다. 구리 이온의 미존재시, pH 4.5-7.5 범위에서 화합물 1은 545 nm에서 아무런 형광 증가를 나타내지 않았다. 하지만, 구리 이온 존재시, pH 5.0-7.5 범위에서 탐침 1은 545 nm에서 주목할 만한 형광 증가를 나타냈다. 상기 결과는 탐침 1이 생물학적으로 관련된 pH 범위에서 구리 이온을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
< 실시예 7> 살아있는 세포 내에서 화합물 1의 형광 이미지 분석
살아있는 세포 내에서 화합물 1을 적용하기 위해, 형광 공초점 현미경을 사용하여, HeLa 세포에서 화합물 1의 형광 이미지를 관측하였다. HeLa 세포는 다양한 농도의 화합물 1로 처리되었다(각각 2, 5 및 10 μM). 탐침 1은 살아있는 세포 내로 침투하는 것으로 나타났고, 공초점 현미경을 통해 녹색 형광 신호를 관측할 수 있었다. 이에 비해, 화합물 1의 소수성 터트-부틸 부분 대신에 친수성 아세틸화된 에틸렌 글리콜을 가지고 있는 화합물 2의 경우에는 세포 내 형광 이미지를 거의 확인하기 어려웠는데, 이는 세포 침투성이 낮기 때문인 것으로 추정된다. 화합물 1의 경우에는 세포 침투성이 있어, 세포 내 구리 이온을 검출하는데 사용될 수 있다.
다음으로, 본 발명자들은 ER-Red, Lyso-Red 및 Mito-Red와 같은 형광 소기관 추적자(tracker)를 사용하여 HeLa 세포 내에서 화합물 1의 세포 내 위치를 확인하였다. HeLa 세포 내에서, 각각의 소기관 추적자에 대해 화합물 1의 동시 염색을 통한 공초점 현미경 이미지를 도 4에 나타냈다. 화합물 1의 형광 신호는 다른 소기관 추적자에 비해 주로 ER-Red와 동시에 위치하는 것으로 나타났는데, 이는 Pearson’s correlation coefficients (R) 분석을 통해 좀 더 확인하였다. ER, 리소좀 및 미토콘드리아 추적자에 대한 화합물 1의 R 수치는 각각 0.8930, 0.5720 및 0.5013인 것으로 나타났다. 상기 결과는 탐침 1이 세포 내 ER에 주로 위치하고 있다는 것을 뒷받침하고, 이는 살아있는 세포에서 ER의 불안정한 구리 풀을 이미징하는데 탐침 1이 활용될 수 있다는 것을 나타낸다.
살아있는 세포에서의 구리 이온 검출에 대한 화합물 1의 능력을 확인하기 위해서, CuCl2 (200 μM)로 2시간 동안 전처리한 구리-오버로드된(overloaded) HeLa 세포 상에서 공초점 현미경 분석을 수행하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 구리-오버로드된(overloaded) 세포를 화합물 1로 20분 동안 처리하면, 585-615 nm band path (BP) 필터를 사용하여 수집한 빨간색 형광 신호가 증가하였다. 또한, 빨간색 형광 신호는 구리 이온 방출 억제제인 NaVO3 존재하는 경우에 더 증가하였는데, 이는 구리가 축적되어 있다는 것을 의미한다. 반면, 구리-오버로드된(overloaded) 세포에 Cu-킬레이터(chelator) (3,6-dithia-1,8-octanediol)를 처리하면, 빨간색 형광 신호는 상당히 감소되었다. 구리-로딩하지 않은 세포들은 BP 585-615 nm에서 최소한의 형광 세기를 나타냈다(도 5의 대조군). 또한, 화합물 1의 구리-촉진된 가수분해 산물인, 화합물 3의 세포 형광 세기는 CuCl2, NaVO3 및 Cu-킬레이터에 대해 아무런 영향을 받지 않았다. 상기 결과는 도 5에 나타낸 살아있는 세포의 구리-오버로드된(overloaded) 상태 관련 비율계량 형광 변화가 세포 내 구리 이온에 의한 화합물 1의 형광 발생 가수분해 때문이라는 것을 나타낸다. 또한, BP 475-525 nm 및 BP 585-615 nm의 형광 이미지는 각각 화합물 1 및 화합물 3으로부터 방출되어 겹쳐진 것을 확인하였다(도 5). 종합하면, 화합물 1은 주로 세포 내 ER에 위치한다는 사실을 통해, 화합물 1의 구리-촉매 형광 발생 가수분해가 ER에서 일어난다는 것을 밝혀냈다. 화합물 1에 대한 세포 생존능은 MTT 분석을 통해 측정하였는데, 본 발명에 사용된 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다.
결론적으로, 본 발명자들은 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 화합물 1 및 2는 하이드라지드 부분의 구리-촉매 가수분해에 의해 형광을 방출한다는 것을 확인하였는데, 이는 480 및 545 nm에서의 형광 방출 간 비율계량 변화를 나타냈다. 화합물 1의 가수분해 반응은 구리 이온에 대해 선택적이었고, 생물학적으로 풍부한 다른 금속 이온 및 GSH의 존재 하에서도 쉽게 반응이 있어났다. 또한, pH 5.0 - 7.5의 범위에서 구리 이온은 탐침 1을 가수분해하여 형광 변화를 유도하였다. 살아있는 HeLa 세포에서, 탐침 1은 생적합성이 있고, 주로 ER에 위치하였으며, 오버로드된(overloaded) 구리 이온에 의해 비율계량 형광 변화를 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 살아있는 세포의 ER에서, 화합물 1이 불안정한 풀(pool) 및 이의 유사체를 포함하는 가능한 전체 구리 풀을 검출할 수 있다는 것을 확신하였고, 세포 내 ER에서 비율계량 형광 이미지를 관측함으로써 구리 풀과 관련된 질병의 진단 및 경과 관측에 활용될 수 있다고 판단하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드(hydrazide-linked naphthalimide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 1]
    Figure pat00028

    상기 화학식 1에서, R은
    Figure pat00029
    또는
    Figure pat00030
    에서 선택됨.
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00031

    상기 화학식 1에서, R은
    Figure pat00032
    또는
    Figure pat00033
    에서 선택됨.
  3. 제2항에 있어서, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출하는 것을 특징으로 하는 구리 검출용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2 + 이온인 것을 특징으로 하는 구리 검출용 조성물.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리 검출용 형광 화학 센서.
    [화학식 1]
    Figure pat00034

    상기 화학식 1에서, R은
    Figure pat00035
    또는
    Figure pat00036
    에서 선택됨.
  6. 제5항에 있어서, 상기 구리 검출은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하여 검출하는 것을 특징으로 하는 구리 검출용 형광 화학 센서.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2 + 이온인 것을 특징으로 하는 구리 검출용 형광 화학 센서.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00037

    상기 화학식 1에서, R은
    Figure pat00038
    또는
    Figure pat00039
    에서 선택됨.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 내 소기관은 소포체(endoplasmic reticulum; ER)인 것을 특징으로 하는 구리 풀(a copper pool) 이미징용 조성물.
  10. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리가 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리 검출방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 지표 측정은 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 480 nm 및 545 nm에서 형광 세기 비율(F545 nm/F480 nm)을 측정하는 것을 특징으로 하는 구리 검출방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 구리는 Cu+ 또는 Cu2 + 이온인 것을 특징으로 하는 구리 검출방법.
  13. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포 내 소기관은 소포체(endoplasmic reticulum; ER)인 것을 특징으로 하는 세포 내 소기관의 구리 풀(a copper pool) 이미징 방법.
KR1020170152753A 2017-11-16 2017-11-16 하이드라지드 결합된 나프탈이미드 유도체 및 이의 구리 풀 이미징 용도 KR102078439B1 (ko)

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