CN113226472A - 双免疫细胞衔接物 - Google Patents

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Abstract

双免疫细胞衔接物(TWICE)是包含第一组分和第二组分的用于治疗癌症的试剂盒或组合物。每个组分包含结合由所述癌症表达的肿瘤抗原或由肿瘤微环境中的非癌细胞表达的抗原的靶向部分。在一些实施方案中，所述第一组分和第二组分各自包含当结合在另一组分中的免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的免疫细胞结合结构域，以及当结合在另一组分中的补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的补充性结合结构域。在一些实施方案中，所述第一组分和/或第二组分包含当被靶向至癌细胞或它的微环境时具有活性的补充性功能性结构域。本发明的TWICE复合物提供了将多种功能组合至在肿瘤微环境中变得活化的两组分复合物中的独特能力。因此，本发明的复合物在具有单一方法施用定位至肿瘤微环境，并且能够实现两种不同信号以使患者受益的两组分复合物方面提供了有意义的优势。这个独特构建体提供了不存在于先前技术构建体中的益处。

Description

双免疫细胞衔接物
说明书
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月17日提交的美国临时申请第62/780,770号的优先权权益，所述美国临时申请出于任何目的通过引用以它的整体并入本文。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2019年12月12日创建，题为“2019-12-12_01131-0023-00PCT_ST25.txt”的文件提供，所述文件的大小是212,992字节。电子格式的序列表中的信息通过引用以它的整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于治疗特征在于存在癌细胞的疾患的经改善靶向免疫细胞衔接抗体复合物。具体地说，它涉及可用于治疗特征在于存在癌细胞的疾患的剂。
背景技术
癌症造成重大生命损失、苦难和经济影响。用于靶向癌症的免疫治疗策略已成为转化临床研究的活跃领域。
已开发各种免疫肿瘤学方法来应对癌症和由存在非所要细胞引起的其他疾病。在一个情形下，靶向T细胞衔接抗体复合物已显示有前景的数据。参见US 10,035,856。这些经掩蔽组合物包含第一组分和第二组分，两者均结合非所要细胞，并且在肿瘤微环境中在惰性结合配偶体从每个组分释放之后，各自变得可用于结合另一者。在第一组分和第二组分彼此结合之后，它们形成活性T细胞结合结构域。
其他开发已显示其他免疫干预(除使T细胞活化之外)已使患有癌症和其他疾病的患者受益。举例来说，PD-L1路径抑制可阻断免疫逃避，并且逆转一些肿瘤的T细胞耗竭(参见Chen DS等人Clin Cancer Res.18:6580-6587(2012))。同时活化T细胞和结合肿瘤相关抗原诸如检查点分子已作为一种用以活化针对癌细胞的T细胞的更加稳健和具有选择性的方法加以提出(参见Harris等人Cancer Biol Med 13(2):171-193(2016)以及Kobold等人Front Oncol 8:285(2018))。然而，没有单一治疗方法已以各种功能仅在所需治疗部位处变得具有活性的方式包括所有这些特征。
因此，视疾病和患者而定，进一步免疫肿瘤学或其他生物学干预也可使患者受益。一些先前构建体能够在肿瘤微环境中活化T细胞，但不具有任何其他属性。具体来说，将活性限制于所需治疗部位的先前构建体没有任何方式来并入额外功能性结构域。因此，需要在这个重定向免疫治疗领域中的额外开发。
发明内容
本发明的TWICE复合物提供了将多种功能组合至在肿瘤微环境中变得活化的两组分复合物中的独特能力。因此，本发明的复合物在具有单一方法施用定位至肿瘤微环境，并且能够实现两种不同信号以使患者受益的两组分复合物方面提供了有意义的优势。这个独特构建体提供了不存在于先前技术构建体中的益处。
根据说明书，本申请描述了一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；和当结合第二补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第一补充性结合结构域，其中所述第二补充性结合结构域不是所述第一组分的一部分，当所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第一补充性结合结构域是VL结构域，当所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第一补充性结合结构域是VH结构域，并且其中所述第一补充性结合结构域是所述第一免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第一免疫细胞结合结构域不结合于所述第一补充性结构域，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域；以及第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含第二靶向部分；当结合第一免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VH，并且其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VL；和当结合所述第一补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第二补充性结合结构域，其中当所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第二补充性结合结构域是VL结构域，当所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第二补充性结合结构域是VH结构域，并且其中所述第二补充性结合结构域是所述第二免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第二免疫细胞结合结构域不结合于所述第二补充性结构域，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合所述第一免疫细胞结合结构域。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于第一补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第一免疫细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第一补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。在一些实施方案中，第一接头和第二接头是可裂解接头。
在一些实施方案中，第二T细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于第二补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第二T细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第二补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
在一些实施方案中，第一接头和第二接头是可裂解接头。在一些实施方案中，第一接头和第二接头是相同的。在一些实施方案中，第一接头和第二接头是不同的。在一些实施方案中，第一接头和第二接头在长度方面是5至30个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头和第二接头在长度方面是8至16个氨基酸。在一些实施方案中，第一可裂解接头和/或第二可裂解接头的蛋白酶裂解位点由癌症或肿瘤微环境细胞表达的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，第一可裂解接头和/或第二可裂解接头的蛋白酶裂解位点由通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至癌症的蛋白酶裂解，所述靶向部分结合由癌症表达的肿瘤抗原，并且与第一组分或第二组分中的至少一者中的靶向部分相同或不同。
在一些实施方案中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域均是亮氨酸拉链；免疫球蛋白结构域；或T细胞受体(TCR)结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域包含CH1/CL、CH2、CH3或CH4。在一些实施方案中，TCR结构域包含TCR恒定结构域。在一些实施方案中，第一组分中的二聚化结构域与第二组分中的二聚化结构域相同。在一些实施方案中，第一组分中的二聚化结构域不同于第二组分中的二聚化结构域。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合癌症。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合免疫检查点分子、RANK或RANKL或细胞死亡诱导抗原。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合PD-L1。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)或阿维利尤单抗(avelumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合RANK。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合RANKL。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含地舒单抗(denosumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合细胞死亡诱导抗原。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合Fas/CD95/Apo1、TNFR1/p55/CD120a、DR3/Apo3/WSL-1/TRAMP/LARD、TRAIL-R1/DR4、DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER、DR6或CAR1。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合TRAIL-R1/DR4。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含马帕木单抗(mapatumumab)的VH和/或VL的全部或一部分。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含可那木单抗(conatumumab，AMG655)、来沙木单抗(lexatumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab，CS1008)或卓齐妥单抗(drozitumab，PRO95780)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合与细胞外基质相关的分子。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、糖皮质素诱导的TNF受体(GITR或TNFRSF18)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD3。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含莫罗莫那(muromonab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、福拉利尤单抗(foralumab)、SP34或博纳吐单抗(blinatumomab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合PD-1。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武利尤单抗(nivolumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CTLA-4。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伊匹木单抗(ipilimumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合TIM-3。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含TSR-022或Sym023的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合LAG-3。在一些实施方案中，其中第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含BMS-986016的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合KIR。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含利瑞利尤单抗(lirilumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD28。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含西拉利珠单抗(theralizumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD137。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含乌托米利尤单抗(utomilumab)或乌瑞利尤单抗(urelumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合OX40。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含PF-04518600或BMS 986178的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD27。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伐立利尤单抗(varlilumab)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合GITR(TNFRSF18)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含GWN323或BMS-986156的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合TIGIT。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含OMP-313M32、MTIG7192A、BMS-986207或MK-7684的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合ICOS。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含JTX-2011的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合巨噬细胞。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CSF1R。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含埃马妥珠单抗(emactuzumab)或IMC-CS4的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD40。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含NTM-1633或AFM13的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同抗原。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同细胞上的不同抗原。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合不同细胞。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在不结合于第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域时能够形成Fv。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在不结合于第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域时能够形成Fv。
本申请还描述了一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；所述第一免疫细胞结合结构域的第一惰性结合配偶体，其中所述第一惰性结合配偶体结合所述第一免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；分隔所述第一免疫细胞结合结构域和所述第一惰性结合配偶体的蛋白酶裂解位点，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶由所述癌症或肿瘤微环境细胞表达；或通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症，所述靶向部分结合(a)由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的所述第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原；和能够进行免疫细胞结合的第一补充性功能性结构域，以及第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含第二靶向部分；第二免疫细胞结合结构域；和任选的能够进行免疫细胞结合的第二补充性功能性结构域。
在一些实施方案中，第二组分包含补充性功能性结构域。在一些实施方案中，第一组分和/或第二组分的补充性功能性结构域包含受体的配体。在一些实施方案中，补充性功能性结构域是TGF-β家族的成员的潜活形式。在一些实施方案中，第一组分和/或第二组分的补充性功能性结构域包含细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员。
在一些实施方案中，第一组分和/或第二组分的补充性功能性结构域包含减弱化细胞因子。在一些实施方案中，减弱化细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员的变体。
在一些实施方案中，第二组分还包含第二免疫细胞结合结构域的第二惰性结合配偶体，其中所述第二惰性结合配偶体结合所述第二免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合第一免疫细胞结合结构域，其中如果所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；并且此外，其中蛋白酶裂解位点分隔所述第二免疫细胞结合结构域和所述第二惰性结合配偶体，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶由癌症表达；或通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至癌症，所述靶向部分结合(a)由癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原。
在一些实施方案中，第一组分不共价结合于第二组分。在一些实施方案中，第一组分共价结合于第二组分。在一些实施方案中，第一组分通过可裂解接头共价结合于第二组分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、T细胞受体、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含莫罗莫那、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、福拉利尤单抗、SP34或博纳吐单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞受体。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合PD-1。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含帕博利珠单抗或纳武利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CTLA-4。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含伊匹木单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合TIM-3。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含TSR-022或Sym023的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合LAG-3。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含BMS-986016的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合KIR。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含利瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD28。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含西拉利珠单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD137。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含乌托米利尤单抗或乌瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合OX40。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含PF-04518600或BMS 986178的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD27。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含伐立利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合GITR(TNFRSF18)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含GWN323或BMS-986156的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合TIGIT。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含OMP-313M32、MTIG7192A、BMS-986207或MK-7684的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合ICOS。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含JTX-2011的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合巨噬细胞。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CSF1R。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含埃马妥珠单抗或IMC-CS4的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD40。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含NTM-1633或AFM13的VH和/或VL的全部或一部分。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分是不同的。
在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分是相同的。
在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含DNA适体、RNA适体、白蛋白、载脂蛋白、纤连蛋白、锚蛋白、fynomer、Obody、DARPin、knotin、亲合多聚体(avimer)、atrimer、anti-callin、affilin、亲和体(affibody)、双环肽、cys结、FN3(adnectin、centryrin、pronectin或TN3)、或库尼茨(Kunitz)结构域。
在一些实施方案中，第二靶向部分结合由癌症表达的肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含结合以下的抗体或其抗原结合片段：α4-整合素(α4-integrin)；A33；ACVRL1/ALK1；ADAM17；ALK；APRIL；BCMA；C242；CA125；钙粘着蛋白-19(Cadherin-19)；CAIX；CanAg；碳酸酐酶IX；CCN1；CCR4；CD123；CD133；CD137(4-1BB)；CD138/粘结蛋白聚糖1(Syndecan1)；CD19；CD2；CD20；CD22；CD30；CD33；CD37；CD38；CD4；CD40；CD44；CD45；CD48；CD5；CD52；CD56；CD59；CD70；CD70b；CD71；CD74；CD79b；CD80；CD86；CD98；CEA；CEACAM；CEACAM1；CK8；c-Kit；密封蛋白-1(Claudin-1，CLDN1)；CLDN18(包括CLDN18.2)；CLDN6；c-met/HGFR；c-RET；Cripto；CTLA-4；CXCR4；DKK-1；DLL3；DLL4；TRAIL-R2/DR5；DRS；EGFL7；EGFR；EGFRvIII；内皮糖蛋白(endoglin)；ENPP3；EpCAM；EphA2；上皮唾蛋白(Episialin)；FAP；FGFR1；FGFR2；FGFR3；FGFR4；纤连蛋白额外结构域B；FLT-3；flt4；叶酸受体1；鸟苷酰基环化酶C(GCC)；GD2；GD3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖；GM3；GPNMB；GPR49；GRP78；Her2/Neu；HER3/ERBB3；HLA-DR；ICAM-1；IGF-1R；IGFR；IL-3Ra；整合素α5β1；整合素α6β4；整合素αV；整合素αVβ3；Lewis Y；Lewis y/b抗原；LFL2；LIV-1；Ly6E；MCP-1；间皮素(Mesothelin)；MMP-9；MUC1；MUC18；MUC5A；MUC5AC；肌抑素(Myostatin)；NaPi2b；神经纤毛蛋白1(Neuropilin 1)；NGcGM3；NRP1；P-钙粘着蛋白；PCLA；PD-1；PDGFRa；PD-L1；PD-L2；磷脂酰丝氨酸；PIVKA-II；PLVAP；PRLR；胃泌素原(Progastrin)；PSCA；PSMA；RANKL；RG1；Siglec-15；SLAMF6；SLAMF7；SLC44A4、STEAP-1；TACSTD-2；肌腱蛋白C(Tenascin C)；TPBG；TRAIL-R1/DR4；TROP-2；TWEAKR；TYRP1；VANGL2；VEGF；VEGF-C；VEGFR-2；或VEGF-R2。
在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含是抗α4-整合素抗体；抗CD137抗体；抗CCR4抗体；抗CD123抗体；抗CD133抗体；抗CD138抗体；抗CD19抗体；抗CD20抗体；抗CD22抗体；抗CD33抗体；抗CD38抗体；抗CD40抗体；抗CD49d抗体；抗CD52抗体；抗CD70抗体；抗CD74抗体；抗CD79b抗体；抗CD80抗体；抗CEA抗体；抗cMet抗体；抗Cripto抗体；抗CTLA-4抗体；抗DLL3抗体；抗TRAIL-2/DR5抗体；抗E-钙粘着蛋白抗体；抗内皮糖蛋白抗体；抗EpCAM抗体；抗表皮生长因子受体抗体；抗FGFR3抗体；抗纤连蛋白额外结构域B抗体；抗叶酸受体1抗体；抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体；抗gp95/97抗体；抗Her2抗体；抗IGF-1R抗体；抗IL-13R抗体；抗IL-4抗体；抗IL-6抗体；抗MMP-9抗体；抗MUC1抗体；抗粘蛋白核心蛋白抗体；抗NGcGM3抗体；抗P-钙粘着蛋白抗体；抗PD-L1抗体；抗p-糖蛋白抗体；抗PSCA抗体；抗PSMA抗体；抗SLAMF7抗体；抗TRAIL-R1/DR4抗体；抗转铁蛋白抗体；抗TROP-2抗体；或抗VEGF抗体的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、安德卡利昔单抗(Andecaliximab)、阿替利珠单抗、阿维利尤单抗、BCD-100、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、BGB-A317、博纳吐单抗、布妥昔单抗(Brentuximab)、BU59、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、卡罗妥昔单抗(Carotuximab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、达雷木单抗(Daratumumab)、德帕妥昔珠单抗(Depatuxizumab)、迪努妥昔单抗(Dinutuximab)、DS-8201、度伐利尤单抗、依决洛单抗(Edrecolomab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、G544、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、格巴妥木单抗(Glembatumumab)、GP1.4、hp67.6、IBI308、异贝莫单抗(Ibritumomab)、伊诺妥珠单抗(Inotuzumab)、伊匹木单抗、伊沙妥昔单抗(Isatuximab)、L19IL2、L19TNF、马格妥昔单抗(Margetuximab)、米维妥昔单抗(Mirvetuximab)、莫加木珠单抗(Mogamuizumab)、莫西妥莫单抗(Moxetumomab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈昔木单抗(Necitumumab)、纳武利尤单抗、奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉妥单抗(Olaratumab)、奥珠单抗(Oportuzumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、PDR001、帕博利珠单抗、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗伐匹妥珠单抗(Rovalpituzumab)、赛妥珠单抗(Sacituzumab)、SM3、TAK-164、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、乌妥昔单抗(Ublituximab)、乌瑞利尤单抗、乌托米利尤单抗、XMAB-5574或佐尔贝妥昔单抗(Zolbetuximab)。
在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的全长序列。在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的截短形式、类似物、变体或衍生物。
在一些实施方案中，第一靶向部分和/或第二靶向部分结合IL-2受体、IL-4、IL-6、黑素细胞刺激激素受体(MSH受体)、转铁蛋白受体(TR)、叶酸受体1(FOLR)、叶酸羟化酶(FOLH1)、EGF受体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR或CD40L。
在一些实施方案中，第二靶向部分结合由肿瘤微环境细胞表达的抗原。在一些实施方案中，肿瘤微环境细胞是成纤维细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，由成纤维细胞表达的抗原是成纤维细胞活化蛋白。在一些实施方案中，由巨噬细胞表达的抗原是MAC-1/CD11b或sideroflexin 3。
本申请还描述了一种治疗患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的癌症的方法，所述方法包括将组合物施用至所述患者。在一些实施方案中，在施用组合物之前评估癌症中浸润性免疫细胞的存在。在一些实施方案中，在施用组合物之前评估癌症中肿瘤抗原的存在。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分结合相同抗原。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分结合不同抗原。
在一些实施方案中，表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的癌症是以下中的任一者：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、淋巴组织增生性病症、骨髓发育不良病症、骨髓增生性疾病或恶变前疾病。
在一些实施方案中，使免疫细胞靶向至患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分两者的肿瘤抗原的癌症的方法包括将组合物施用至所述患者。在一些实施方案中，使免疫细胞靶向至患者中的表达两种肿瘤抗原的癌症的方法包括将组合物施用至所述患者，其中一种肿瘤抗原结合第一靶向部分，并且一种肿瘤抗原结合第二靶向部分。
在一些实施方案中，将细胞因子递送至患者的免疫细胞的方法包括将组合物施用至所述患者，其中组合物的第一补充性功能性结构域和/或第二补充性功能性结构域包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ或TNF超家族的成员。
额外目的和优势将部分地阐述于随后描述中，并且部分地将根据描述显而易见，或可通过实践来获悉。目的和优势将借助于在随附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和达到。
应了解上文一般性描述与下文详细描述两者均仅具有示例性和说明性，并且不限制权利要求。
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明一个(若干)实施方案，并且连同描述一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A至图1B显示双免疫细胞衔接物(“TWICE”)。图1A显示在施用至患者之前的两个构建体。图1B显示在TWICE的两个组分均靶向至癌细胞之后，TWICE结合和衔接一个效应(免疫)细胞上的两个信号传导分子。六角形和菱形代表癌细胞上由第一组分和第二组分的靶向部分(各自具有四个条纹化卵形的两个集合)结合的两个不同抗原。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色结构域)和补充性结合结构域(每个组分的白色结构域)。还显示了靶向部分与免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域之间的接头。当两个组分紧密邻近时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)以及两个补充性结合结构域(来自每个组分的一个补充性结合结构域)可彼此配对。三角形和圆形代表效应细胞上可由配对的免疫细胞结合结构域(结合由三角形代表的抗原)或配对的补充性结合结构域(结合由圆形代表的抗原)结合的不同抗原。在不存在结构域交换和配对下，两个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域不调节效应细胞。
图2显示在第一组分靶向至癌细胞，并且第二组分靶向至非癌细胞之后，衔接一个效应(免疫)细胞上的两个信号传导分子的TWICE。六角形代表癌细胞上由第一组分的靶向部分(四个条纹化卵形)结合的抗原。方块代表肿瘤微环境中的非癌细胞(诸如肿瘤相关巨噬细胞或成纤维细胞)上由第二组分的靶向部分(四个条纹化卵形)结合的抗原。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色结构域)和补充性结合结构域(每个组分的白色结构域)。当两个组分紧密邻近时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)以及两个补充性结合结构域(来自每个组分的一个补充性结合结构域)可彼此配对。三角形和圆形代表效应细胞上可由配对的免疫细胞结合结构域(抗原由三角形代表)和配对的补充性结合结构域(抗原由圆形代表)结合的不同抗原。在不存在结构域交换和配对下，两个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域不调节效应细胞。
图3显示在TWICE的两个组分均靶向至癌细胞之后，结合和衔接两个不同效应(免疫)细胞上的信号传导分子的TWICE。可采用各种靶向策略。如果TWICE具有结合癌细胞的两个组分，那么它可采用三种不同构型：(a)TWICE的两个组分可使用同一靶向部分的两个拷贝结合相同抗原(单一抗原靶向)；(b)TWICE可使用利用靶向相同抗原上的不同表位的不同靶向部分的单一抗原策略；或(c)当两个靶向部分均结合癌细胞时，TWICE的两个组分可结合两个不同抗原(双抗原靶向)。这个图代表使用靶向相同抗原上的不同表位的不同靶向部分的单一抗原靶向。回到这个图，菱形代表癌细胞上同一抗原的由第一组分和第二组分的靶向部分(两个具有四个条纹化卵形的集合)结合的两个分子。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色结构域)和补充性结合结构域(每个组分的白色结构域)。当两个组分紧密邻近时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)以及两个补充性结合结构域(来自每个组分的一个补充性结合结构域)可彼此配对。三角形和圆形代表两个不同效应细胞上可由配对的免疫细胞结合结构域(结合1号效应细胞上由三角形代表的抗原)或配对的补充性结合结构域(结合2号效应细胞上由圆形代表的抗原)结合的抗原。在不存在结构域交换和配对下，两个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域不调节效应细胞。
图4显示在TWICE的两个组分均靶向至癌细胞之后，结合和衔接效应(免疫)细胞上的信号传导分子，并且结合癌细胞上的信号传导分子的TWICE。菱形代表癌细胞上同一抗原的由第一组分和第二组分的靶向部分(两个具有四个条纹化卵形的集合)结合的两个分子。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色结构域)和补充性结合结构域(每个组分的白色结构域)。当两个组分紧密邻近时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)以及两个补充性结合结构域(来自每个组分的一个补充性结合结构域)可彼此配对。三角形代表效应细胞上可由配对的免疫细胞结合结构域结合的抗原。条纹化矩形代表癌细胞上可由配对的补充性结合结构域结合的抗原。在不存在结构域交换和配对下，免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域不调节效应细胞或癌细胞。
图5显示在施用至患者之前的包含功能性结构域的TWICE。显示了第一组分和第二组分的靶向部分(各自具有四个条纹化卵形的两个集合)。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色弯曲结构域)。每个组分还包含连接于免疫细胞结合结构域的惰性结合结构域(每个组分的白色弯曲结构域，也被称为惰性结合配偶体)。一个组分还包含补充性功能性结构域(黑色三角形)。还显示了靶向部分与免疫细胞结合结构域或补充性功能性结构域之间的接头。此外，显示了在每个组分的免疫细胞结合结构域与惰性结合配偶体之间的接头。连接惰性结合配偶体的接头可为在肿瘤微环境中被裂解的可裂解接头。这个裂解释放惰性结合配偶体。
当两个组分紧密邻近并且惰性结合配偶体已被释放时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)可彼此配对。此外，补充性功能性结构域可基于靶向部分使它定位至靶标细胞(诸如癌细胞或效应细胞)而结合和衔接靶标细胞。补充性功能性结构域的活性在不需要与另一结构域配对下发生，但在补充性功能性结构域通过靶向部分来定位至靶标细胞时得以增强。在不存在结构域交换和配对下，两个组分的免疫细胞结合结构域不调节靶标细胞。在一些实施方案中，两个组分均可包含补充性功能性结构域。在一些实施方案中，仅一个组分包含惰性结合配偶体。
图6显示在施用至患者之前的包含二聚化结构域的TWICE。显示了第一组分和第二组分的靶向部分(各自具有四个条纹化卵形的两个集合)。每个组分包含免疫细胞结合结构域(每个组分的黑色结构域)和补充性结合结构域(每个组分的白色结构域)。还显示了靶向部分与免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域之间的接头。二聚化结构域通过接头连接于每个组分的免疫细胞结合结构域以及补充性结合结构域(以致每个组分具有可缔合的二聚化结构域A和二聚化结构域B)。一对二聚化结构域的缔合(二聚化结构域A和二聚化结构域B的配对)增强每个组分的VH结构域和VL结构域的缔合。二聚化结构域接头可为可裂解的，以致在肿瘤微环境中的裂解之后，接头被裂解，并且二聚化结构域丧失。在移除二聚化结构域之后以及当两个组分紧密邻近时，可发生结构域交换，以致两个免疫细胞结合结构域(来自每个组分的一个免疫细胞结合结构域)以及两个补充性结合结构域(来自每个组分的一个补充性结合结构域)可彼此配对。在不存在结构域交换和配对下，两个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域不调节靶标细胞。在不存在二聚化结构域接头的裂解下，每个组分的VH结构域和VL结构域保持联合在一起而无结构域交换。在一些实施方案中，仅一个组分包含一对二聚化结构域，而另一组分不包含二聚化结构域。
图7A至图7C显示表12中所列的具有各种二聚化结构域接头和二聚化结构域的TWICE分子的表达和裂解。图7A显示具有各种二聚化结构域接头和二聚化结构域的TWICE。通过SDS-PAGE(图7B)分析TWICE，并且还分析了裂解产物(图7C)。
图8A至图8B显示由含有Fab或dsFv结合部分的TWICE历经一定浓度范围(图8A)或以EC50测量结果(图8B)达成的靶标结合。
图9A至图9C显示具有异Fc二聚化结构域的CD3/CTLA4TWICE的的桥接ELISA。图9A显示测定设计，而图9B显示以CD3桥接获得的结果，并且图9C显示以CTLA-4桥接获得的结果。
图10A至图10B显示具有卷曲螺旋二聚化结构域的CD3/CTLA4TWICE的以CD3桥接ELISA(图10A)或CTLA4桥接ELISA(图10B)获得的结果。
图11A至图11B显示CD28/CD3 TWICE在CD3桥接ELISA(图11A)或CD28桥接ELISA(图11B)中的结果。
图12A至图12B显示用西拉利珠单抗(抗CD28)和乌瑞利尤单抗(抗4-IBB)TWICE进行的桥接ELISA。具体来说，这显示CD28/4-1BB(CD137)TWICE在CD28桥接ELISA(图12A)或4-1BB桥接ELISA(图12B)中的结果。
图13显示阿替利珠单抗/伊匹木单抗TWICE的PD-L1结合。具体来说，这显示PD-L1/CTLA-4TWICE在PD-L1桥接ELISA中的结果。
图14A至图14B显示由CD3/CTLA4 TWICE在进行或不进行预裂解下达成的关于HCT-15细胞的T细胞重定向。图14A显示由预裂解达成的活化。图14B显示在进行以及不进行预裂解下获得的实验结果。
图15A至图15D显示由CD3/CTLA-4TWICE达成的T细胞重定向和HCT15细胞杀灭。图15A显示裂解分析的结果。图15B显示干扰素γ释放。图15C和图15D显示在不同条件下的度量HCT15细胞的特异性溶解的LDH释放的结果。
图16显示由CD3/CD28 TWICE达成的关于HCT-15的T细胞重定向。这个图显示以CD3/CD28 TWICE达成的如由LDH释放所度量的HCT-15细胞杀灭。
图17A至图17B显示预活化/耗竭外周血液单个核细胞(PMBC)针对HCT15细胞的重定向，如通过流式细胞计量术(图17A)所测量或由干扰素γ释放(图17B)所度量。
图18A至图18B显示NK细胞针对HCT15细胞的重定向，如通过CD16a桥接ELISA(图18A)所测量或由LDH释放(图18B)所度量。
序列描述
表1提供了本文引用的某些序列的清单。
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具体实施方式
I.双免疫细胞衔接物
双免疫细胞衔接物(“TWICE”)是指两组分复合物，其中两个组分的结构域可配对并且结合和衔接免疫细胞。因此，单一TWICE包含可存在于两个单独多肽中或单一多肽中的两个组分。因此，TWICE可为单一构建体，或它可为具有两个组分的试剂盒。除非另外明确讨论，否则在整个申请和权利要求中对术语TWICE的使用包括两种实施方案。本申请描述了一系列TWICE。TWICE可活化不同路径以介导多种抗癌作用。
如本申请将描述，TWICE可包含第一组分和第二组分，其各自包含靶向部分、免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域。第一组分和第二组分的靶向部分起使TWICE靶向至癌细胞或肿瘤微环境中的细胞的作用。当来自两个组分的免疫细胞结合结构域一起配对并且/或者来自两个组分的补充性结合结构域一起配对时，这些配对结构域可起调节免疫细胞活性的作用，或发挥其他(即补充性)功能。举例来说，配对的补充性结合结构域可阻断免疫检查点或诱导癌细胞的细胞死亡。
预期相较于不包含补充性结构域的复合物(即相较于仅结合免疫细胞上的单一抗原的复合物)，在TWICE中存在补充性结合结构域会改善它们在治疗癌症方面的功效。
如本申请还将描述的，第一组分，以及任选地，第二组分，可包含能够进行免疫细胞结合的补充性功能性结构域。在具有补充性功能性结构域的一些实施方案中，免疫细胞结合结构域是经掩蔽的。TWICE的补充性功能性结构域可在不需要与不同结构域配对的情况下调节免疫功能。
本文所述的本发明的TWICE复合物的主要优势是免疫细胞结合结构域，以及在一些实施方案中，补充性结合结构域，将仅在TWICE的第一组分与第二组分两者紧密邻近时配对(在此处是在处于肿瘤微环境中时，因为它们均被靶向至癌症)。在癌症部位处，TWICE的不同组分之间的结构域配对可改善特异性，并且降低脱靶效应，因为免疫细胞结合结构域，以及任选地，补充性结合结构域，仅在来自两个组分的结构域在癌细胞或它的微环境处配对之后起作用。
在描述TWICE的一些代表性类型之后，本申请将接着描述构成不同类型的TWICE的组分。TWICE不限于本文代表性描述，因为TWICE可调节与癌症存活和抗癌免疫应答相关的许多路径。
本发明的TWICE复合物提供了将多种功能组合至在肿瘤微环境中变得活化的两组分复合物中的独特能力。因此，本发明的复合物在具有单一方法施用定位至肿瘤微环境，并且能够实现两种不同信号以使患者受益的两组分复合物方面提供了有意义的优势。在一些实施方案中，那些信号中的一者(来自配对的免疫细胞结合结构域)仅在两组分复合物会合时被活化。在一些实施方案中，那些信号中的两者(来自配对的免疫细胞结合结构域以及来自配对的补充性结合结构域)均仅在两组分复合物会合时被活化。这个独特构建体提供了不存在于先前技术构建体中的许多益处。
1.活化一种类型的免疫细胞上的两个信号传导路径的TWICE
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，结合相同类型的免疫细胞。
如本文所用，免疫细胞也可被称为“效应细胞”。术语“效应细胞”意指介导针对癌症的活性的免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，结合T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，结合免疫细胞上的相同抗原。在这个实施方案中，两个信号传导路径是相同的，并且影响被扩大。在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，结合免疫细胞上的不同抗原。在这个实施方案中，两个信号传导路径是不同的，并且两种不同信号传输至免疫细胞。
一般来说，T细胞活化的过程涉及多种信号。初级信号来自T细胞受体(TCR)与由抗原递呈细胞(APC)递呈的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合。共刺激性信号可由若干不同T细胞和APC相互作用中的一者产生(参见Buchbinder EI,Desai A Am J ClinOncol.39(1):98-106(2016))。T细胞的活化由若干共刺激性受体增强，所述共刺激性受体诸如是CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)和ICOS。T细胞与APC或癌细胞之间的相互作用还可涉及降低T细胞活化的若干抑制性/检查点分子，诸如PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3和KIR(Torphy RJ等人Int J Mol Sci.18:2642(2017))。因此，将针对共刺激性或共抑制性受体的两种抗体的作用组合可增强抗肿瘤T细胞应答。
TWICE可包含(在配对之后)针对T细胞上的共刺激性或检查点分子的两种功能性抗体，从而导致稳健T细胞活化(图1B，显示两个组分的黑色免疫细胞结合结构域的配对以及两个组分的白色补充性结合结构域的配对)。当T细胞存在于肿瘤中，但由于来自癌细胞的免疫抑制性信号而是非活性的时，稳健T细胞活化可用于患者中(Wu AA等人OncoImmunology 4:7(2015))。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，可通过与T细胞的激动性或拮抗性结合来衔接免疫细胞。
就“激动性”来说，其意指配对的免疫细胞结合结构域或配对的补充性结合结构域与抗原的结合使信号传导路径活化。当与抗原的结合导致免疫细胞活化时，激动性结合可受到关注。
就“拮抗性”来说，其意指配对的免疫细胞结合结构域或配对的补充性结合结构域与抗原的结合阻断或抑制信号传导路径。当天然配体与抗原的结合通常导致免疫细胞去活化时，拮抗性结合可受到关注。以这个方式，本发明的TWICE的一组“拮抗性”配对结构域的结合可通过阻断或抑制通常介导免疫细胞无反应性或去活化的路径来活化免疫细胞。
已知对免疫细胞具有拮抗或激动作用的抗体可用于产生本发明的TWICE的配对结合结构域。如果信号传导路径促进T细胞活化，那么激动性方法将增加T细胞活化。如果信号传导路径抑制T细胞活化，那么拮抗性方法将增加T细胞活化。因此，许多不同类型的路径可用于这个方法中。
激动性抗体的一个实例是刺激TCR复合物的CD3ε抗体(例如SP34、OKT3)。在另一实例中，针对GITR的激动性抗体可活化CD8+T效应细胞，同时抑制调控性T细胞功能(参见Knee等人,European Journal of Cancer 67:1e10(2016))。导致刺激免疫细胞的拮抗性抗体的实例是PD-1抗体(例如帕博利珠单抗或纳武利尤单抗)。PD-1抑制免疫细胞，因此，这些抗体阻断PD-1与它的配体的相互作用，并且由此拮抗抑制性信号。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，可产生两种激动性抗体，并且对免疫系统提供两种正性刺激(例如抗CD3ε抗体以及抗CD137抗体)。CD3与CD137两者均促进T细胞活化。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，可产生一种激动抗体和一种拮抗抗体(例如抗CD3ε抗体和抗CTLA4抗体)。如上讨论的CD3刺激TCR复合物，而CTLA4提供抑制性信号。拮抗CTLA4的抑制性信号将促进T细胞活化。
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，可产生阻断两种抑制性信号的两种拮抗性抗体(例如抗CTLA4抗体和抗PD-1抗体)。如上所讨论，这些信号中的两者均抑制T细胞活化，并且拮抗它们将促进T细胞活化。
另一示例性TWICE将CD3ε(CD3e)抗体与促进T细胞活化的另一抗体组合。当前证据表明CD3双特异性抗体通过不同检查点分子进一步调控(参见Kobold S等人FrontOncol.8:285(2018))。此外，在一些患者或环境中，T细胞活化性双特异性抗体的治疗作用还受到经诱导T细胞无反应性(不存在对特定抗原的正常免疫应答)的限制。因此，将活化T细胞的抗CD3ε抗体与增强T细胞活化并且防止无反应性的抗体组合可产生增强的和/或更持久的抗肿瘤T细胞应答。
2.调节两种免疫细胞的TWICE
在一些实施方案中，免疫细胞结合结构域在一起配对时，以及补充性结合结构域在一起配对时，结合两种不同免疫细胞。以这个方式，TWICE可调节两种不同类型的免疫细胞。广泛范围的不同免疫细胞可由TWICE调节，包括以下代表性实例。图2显示通过TWICE使两种免疫细胞(1号效应细胞和2号效应细胞)活化的代表性模型。
a)刺激T细胞并且抑制肿瘤相关巨噬细胞的TWICE
两种不同免疫细胞的结合可用于其中T细胞从肿瘤排除，并且肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可存在的肿瘤微环境中。TAM代表一类替代性活化的巨噬细胞，其通过促进血管生成、免疫抑制和炎症来促进肿瘤生长(Poh和Ernst,Front Oncol.12(8):49(2018))。在一些实施方案中，当补充性结合结构域以及免疫细胞结合结构域配对时，TWICE通过阻断TAM活性以及活化T细胞来将活性组合。
在一些实施方案中，TWICE包含当一起配对时介导T细胞活化的免疫细胞结合结构域，以及在一起配对时抑制TAM的补充性结合结构域。
举例来说，用抗CSF1R阻断抗体靶向TAM使TAM浸润降低，并且促进CD8+T细胞扩增(Ries CH等人Cancer Cell.25(6):846-59(2014))。活化CD40路径也可干扰TAM的免疫抑制作用。CD40激动性抗体可导致经典活化的巨噬细胞的重新编程或募集，此可用于触发针对肿瘤的有效免疫应答。在免疫结合结构域以及补充性结合结构域的配对之后，将T细胞活化性抗体和CD40激动性抗体或抗CSF1R阻断抗体组合的代表性TWICE相较于单独使用这些抗体中的任一者可提供累加功效。
b)刺激T细胞和NK细胞的TWICE
TWICE可用于活化T细胞与NK细胞两者以杀灭癌细胞。相比于单独活化任一细胞，共活化T细胞和NK细胞可导致对癌症的更稳健免疫应答。
在一些实施方案中，TWICE包含当一起配对时介导T细胞活化的免疫细胞结合结构域，以及在一起配对时介导诸如用抗CD16A抗体达成的NK细胞活化的补充性结合结构域。举例来说，在包含TWICE440和TWICE441的TWICE中，抗CD16A抗体与抗CD3抗体OKT3组合(参见SEQ ID NO:212-215以及图18A至图18B)。
3.刺激免疫细胞并且介导对癌细胞的作用的TWICE
TWICE还可以配对的免疫细胞结合结构域结合免疫细胞，并且以配对的补充性结合结构域结合癌细胞。这个治疗策略可直接诱导对所靶向癌细胞的生物功能，以及介导抗癌免疫细胞活化。在癌细胞中诱导的生物功能可为例如通过死亡受体诱导细胞死亡，或抑制免疫抑制性信号。
已描述可活化免疫细胞的配对的免疫细胞结合结构域，并且TWICE组分还可包含结合癌症的补充性结合结构域。
a)刺激免疫细胞并且阻断由癌症达成的免疫细胞去活化的TWICE
本发明的TWICE可用于活化免疫细胞，并且阻断来自癌细胞的对免疫细胞的抑制性信号。在一些实施方案中，补充性结合结构域在一起配对时可阻断来自癌细胞的抑制免疫细胞活化的信号。
举例来说，一些癌症表达PD-L1，其可结合T细胞上的PD-1或B7.1，并且导致T细胞失活。在一些实施方案中，补充性结合结构域在一起配对时结合癌细胞上的PD-L1。在一些实施方案中，与PD-L1的结合阻断与T细胞上的PD-1的相互作用。已显示阻断PD-1和PD-L1的相互作用会改善抗肿瘤应答。PD-L1抗体(诸如阿替利珠单抗、度伐利尤单抗和阿维利尤单抗)被核准用以治疗若干恶性疾病，包括非小细胞肺癌和黑素瘤。
在另一实例中，一些癌症可表达肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，其下调抗肿瘤免疫应答。此种分子的一实例是核因子κ-B的受体活化因子(RANK)，其结合它的在调控性T细胞上的配体RANKL以产生免疫抑制性环境(参见Wu等人Oncoimmunology.4(7)(2015))。在一些实施方案中，补充性结合结构域在一起配对时结合癌细胞上的RANK。在一些实施方案中，与RANK的结合阻断与T细胞上的RANKL的相互作用。在癌症的临床前小鼠模型中，通过针对RANKL的拮抗性抗体阻断RANK信号传导使可活化T细胞的抗CTLA4抗体的抗肿瘤作用增强(Ahern等人Clin Cancer Res.23(19):5789-5801(2017))。
b)刺激免疫细胞并且触发癌细胞的细胞死亡的TWICE
本发明的TWICE还可用于活化免疫细胞，并且触发癌细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，补充性结合结构域在一起配对时可通过结合由癌细胞表达的受体来触发癌细胞的死亡。
可被刺激以触发细胞死亡的受体的实例包括TNFR家族的成员，诸如Fas/CD95/Apo1、TNFR1/p55/CD120a、DR3/Apo3/WSL-1/TRAMP/LARD、TRAIL-R1/DR4、DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER或CAR1。处于临床开发中的诱导癌细胞的细胞死亡的TNFR家族激动抗体是马帕木单抗(NCT01258608)。将直接杀灭癌细胞以及活化抗癌免疫应答的活性组合的TWICE可具有累加功效。
4.包含补充性功能性结构域的TWICE
TWICE的第一组分和/或第二组分还可包含补充性功能性结构域。如本文所用的“补充性功能性结构域”是指当被靶向至适当免疫细胞时调节免疫功能而不需要与另一结构域配对的分子。因此，TWICE可使补充性功能性结构域靶向至免疫细胞，并且促进在不进行靶向的情况下缺乏活性或毒性可太大以致不能全身性递送的补充性功能性结构域的活性。示例性补充性功能性结构域是必须被靶向至适当免疫细胞以具有活性的减弱化细胞因子。这个实施方案显示于图5中。减弱化细胞因子可优先活化靶标细胞，如由以作为一种CD-122优先IL-2路径激动剂的贝培阿地白介素(bempegaldesleukin，NKTR-214)获得的数据所示。
以这个方式，TWICE可介导由配对的免疫细胞结合结构域的活性以及来自补充性功能性结构域的活性达成的累加抗癌免疫应答—实际上为效应细胞递送仅在效应细胞/癌细胞衔接突触中活化的“关爱包裹”。
B.单一多肽链或两个组分
TWICE可包含单一多肽链或两个单独组分。
在一些实施方案中，第一组分不共价结合于第二组分。在一些实施方案中，第一组分共价结合于第二组分。
在一些实施方案中，TWICE包含两个单独组分。换句话说，TWICE可包含是单独多肽的第一组分和第二组分。
在一些组分中，TWICE包含单一多肽链。在一些实施方案中，第一组分和第二组分含于单一氨基酸序列内。
当TWICE包含单一多肽链时，第一组分和第二组分可由接头分隔。在一些实施方案中，这个接头共价结合第一组分和第二组分。在一些实施方案中，这个接头包含可裂解接头。在一些实施方案中，在第一组分与第二组分之间的可裂解接头包含蛋白酶裂解位点。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的裂解位点是蛋白酶裂解位点。SEQ ID NO:1-84列出了可使用的一些示例性蛋白酶裂解位点，但TWICE不限于这组蛋白酶裂解位点，并且可采用其他蛋白酶裂解位点。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的裂解位点是肿瘤相关蛋白酶裂解位点。肿瘤相关蛋白酶是与肿瘤相关的蛋白酶。在一些实施方案中，相对于身体的其他区域，肿瘤相关蛋白酶在肿瘤中具有更高表达。表2(显示于以下章节IV中)提供了肿瘤相关蛋白酶的实例，但在肿瘤中表达的任何蛋白酶都可用于选择用于TWICE的肿瘤相关蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，蛋白酶由肿瘤微环境中的非癌细胞诸如肿瘤相关巨噬细胞或成纤维细胞表达。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的裂解位点是见于血液中的蛋白酶的裂解位点。见于血液中的示例性蛋白酶包括凝血酶、嗜中性白细胞弹性蛋白酶和弗林蛋白酶(furin)。
C.靶向部分
第一组分的靶向部分通过将剂递送至癌细胞的局部环境，从而使得能够达成局部化治疗策略来起作用。在一些实施方案中，第一靶向部分通过特异性结合癌细胞来靶向癌细胞。
在一些实施方案中，第一靶向部分与第二靶向部分两者均结合由癌症表达的肿瘤抗原。
在一些实施方案中，第一靶向部分结合由癌症表达的肿瘤抗原，并且第二靶向部分结合由肿瘤微环境细胞表达的抗原。
在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。就抗原结合片段来说，我们意指保留它对靶标的结合活性的任何抗体片段，诸如scFv或其他功能性片段，包括缺乏轻链的免疫球蛋白、VHH、VNAR、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、抗体片段、微型双功能抗体、scAB、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、Fd、CDR区、或抗体的能够结合抗原或表位的任何部分或肽序列。VHH和VNAR是经典抗体的替代物，并且尽管它们在不同物种(分别是骆驼科动物和鲨鱼)中产生，但我们也将它们包括在抗体的抗原结合片段中。在一些实施方案中，Fv结构域是二硫键稳定化Fv(dsFv)。除非明确指示为“全长抗体”，否则当本申请提及抗体时，它固有地包括对其抗原结合片段的提及。
在一些实施方案中，靶向部分不是抗体，而是另一类型的靶向部分。广泛范围的能够靶向癌症的靶向部分是已知的，包括DNA适体、RNA适体、白蛋白、载脂蛋白、纤连蛋白、锚蛋白、fynomer、Obody、DARPin、knotin、亲合多聚体、atrimer、anticallin、affilin、亲和体(affibody)、双环肽、cys结、FN3(adnectin、centryrin、pronectin、TN3)和库尼茨结构域。这些和其他非抗体骨架结构可用于靶向至癌细胞。较小非抗体骨架快速地从血流移除，并且相比于单克隆抗体具有较短半衰期。由于穿过血管内皮和基底膜从毛细血管腔快速外渗，所以它们还显示较快组织穿透。参见Vazquez-Lombardi等人,Drug Discovery Today20(1):1271-1283(2015)。靶向癌症的许多非抗体骨架已处于临床开发中，还有其他候选物处于临床前阶段。参见Vazquez-Lombardi，表1。
1.能够靶向癌症的靶向部分
在一些实施方案中，仅第一靶向部分结合由癌症表达的抗原，而第二靶向部分不结合。在一些实施方案中，第一靶向部分与第二靶向部分两者均结合由癌症表达的抗原。
在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分是相同的，并且结合相同抗原。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分结合由癌症表达的相同抗原。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分结合由癌症表达的相同抗原上的不同表位。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分结合由癌症表达的不同抗原。
可用于靶向的某些肿瘤抗原(癌细胞类型的实例在括号中)包括：Her2/Neu(上皮恶性肿瘤)；CD22(B细胞恶性肿瘤)；EpCAM(CD326)(上皮恶性肿瘤)；EGFR(上皮恶性肿瘤)；PSMA(前列腺癌)；CD30(B细胞恶性肿瘤)；CD20(B细胞恶性肿瘤)；CD33(髓系恶性肿瘤)；CD80(B细胞恶性肿瘤)；CD86(B细胞恶性肿瘤)；CD2(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CA125(多种癌症，包括卵巢癌)；碳酸酐酶IX(多种癌症，包括肾细胞癌)；CD70(B细胞恶性肿瘤)；CD74(B细胞恶性肿瘤)；CD56(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CD40(B细胞恶性肿瘤)；CD19(B细胞恶性肿瘤)；c-met/HGFR(胃肠道和肝恶性肿瘤)；TRAIL-R1/DR4(多种恶性肿瘤，包括卵巢和结肠直肠癌)；DRS(多种恶性肿瘤，包括卵巢和结肠直肠癌)；PD-1(B细胞恶性肿瘤)；PD-L1(多种恶性肿瘤，包括上皮腺癌)；IGF-1R(大多数恶性肿瘤，包括上皮腺癌)；VEGF-R2(与包括上皮腺癌的大多数恶性肿瘤相关的血管结构)；前列腺干细胞抗原(PSCA)(前列腺腺癌)；MUC1(上皮恶性肿瘤)；CanAg(肿瘤，诸如结肠和胰腺癌)；间皮素(许多肿瘤，包括间皮瘤以及卵巢和胰腺腺癌)；P-钙粘着蛋白(上皮恶性肿瘤，包括乳腺腺癌)；肌抑素(GDF8)(许多肿瘤，包括肉瘤以及卵巢和胰腺腺癌)；Cripto(TDGF1)(上皮恶性肿瘤，包括结肠、乳腺、肺、卵巢和胰腺癌)；ACVRL 1/ALK1(多种恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤)；MUC5AC(上皮恶性肿瘤，包括乳腺腺癌)；CEACAM(上皮恶性肿瘤，包括乳腺腺癌)；CD137(B细胞或T细胞恶性肿瘤)；CXCR4(B细胞或T细胞恶性肿瘤)；神经纤毛蛋白1(上皮恶性肿瘤，包括肺癌)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖(多种癌症，包括肝、脑和乳腺癌)；HER3/ERBB3(上皮恶性肿瘤)；PDGFRa(上皮恶性肿瘤)；EphA2(多种癌症，包括神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌和小细胞肺癌)；CD38(骨髓瘤)；CD138(骨髓瘤)；α4-整合素(AML、骨髓瘤、CLL和大多数淋巴瘤)；CCR4抗体(淋巴瘤)；CD52(白血病)；CD79b(淋巴瘤)；CTLA-4(多种癌症，包括非小细胞肺癌、头颈部癌、尿道上皮癌和肝细胞癌)；DLL3(肺癌)；内皮糖蛋白(多种癌症，包括软组织肉瘤、血管肉瘤和肾细胞癌)；纤连蛋白额外结构域B(黑素瘤)；叶酸受体1(多种癌症，包括上皮卵巢癌、腹膜癌和输卵管癌)；MMP-9(胃癌或胃食管结合部腺癌)；NGcGM3(肺癌)；SLAMF7(多发性骨髓瘤)；TROP-2(乳腺癌)；或VEGF(结肠直肠癌)。
在一些实施方案中，靶向部分结合α4-整合素；A33；ACVRL1/ALK1；ADAM17；ALK；APRIL；BCMA；C242；CA125；钙粘着蛋白-19；CAIX；CanAg；碳酸酐酶IX；CCN1；CCR4；CD123；CD133；CD137(4-1BB)；CD138/粘结蛋白聚糖1；CD19；CD2；CD20；CD22；CD30；CD33；CD37；CD38；CD4；CD40；CD44；CD45；CD48；CD5；CD52；CD56；CD59；CD70；CD70b；CD71；CD74；CD79b；CD80；CD86；CD98；CEA；CEACAM；CEACAM1；CK8；c-Kit；CLDN1；CLDN18；CLDN18.2；CLDN6；c-met/HGFR；c-RET；Cripto；CTLA-4；CXCR4；DKK-1；DLL3；DLL4；TRAIL-R2/DR5；DRS；EGFL7；EGFR；EGFRvIII；内皮糖蛋白；ENPP3；EpCAM；EphA2；上皮唾蛋白；FAP；FGFR1；FGFR2；FGFR3；FGFR4；纤连蛋白额外结构域B；FLT-3；flt4；叶酸受体1；GCC；GD2；GD3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖；GM3；GPNMB；GPR49；GRP78；Her2/Neu；HER3/ERBB3；HLA-DR；ICAM-1；IGF-1R；IGFR；IL-3Ra；整合素α5β1；整合素α6β4；整合素αV；整合素αVβ3；Lewis Y；Lewis y/b抗原；LFL2；LIV-1；Ly6E；MCP-1；间皮素；MMP-9；MUC1；MUC18；MUC5A；MUC5AC；肌抑素；NaPi2b；神经纤毛蛋白1；NGcGM3；NRP1；P-钙粘着蛋白；PCLA；PD-1；PDGFRa；PD-L1；PD-L2；磷脂酰丝氨酸；PIVKA-II；PLVAP；PRLR；胃泌素原；PSCA；PSMA；RANKL；RG1；Siglec-15；SLAMF6；SLAMF7；SLC44A4、STEAP-1；TACSTD-2；肌腱蛋白C；TPBG；TRAIL-R1/DR4；TROP-2；TWEAKR；TYRP1；VANGL2；VEGF；VEGF-C；VEGFR-2；或VEGF-R2。
表2(显示于以下章节IV中)提供了癌症类型、靶向部分的可能靶标以及由那些癌症类型表达的蛋白酶的非限制性实例。与癌症相关的蛋白酶可被称为肿瘤相关蛋白酶。为制备需要在肿瘤部位处裂解的TWICE，可鉴定癌症，并且选择靶向部分的靶标(根据需要)，并且选择癌症类型或所需肿瘤微环境细胞(诸如TAM或TAF)的一种或两种蛋白酶。并非每种TWICE都需要蛋白酶裂解，但蛋白酶裂解可有益于以具有裂解位点的单一分子形式产生的TWICE或包含惰性结合配偶体的TWICE。
表3(显示于以下章节IV中)提供了关于可用不同靶向部分靶向的癌症的额外信息，包括一些靶向部分可能够靶向许多不同类型的癌症的事实。在TWICE中，第一组分与第二组分两者均可包含能够靶向癌症的靶向部分。第一组分和第二组分的靶向部分可结合相同抗原或不同抗原。
结合肿瘤抗原并且对肿瘤细胞具有特异性的抗体在本领域中是熟知的。
FDA维护用于治疗癌症的核准抗体药物的清单，所述药物中的许多结合癌症抗原，并且可在这个情形下采用。参见在FDA网站上的The Orange Book Online或Drugs@FDA。FDA还在clinicaltrials.gov数据库中维护处于进行中的临床试验的清单，其可通过疾病名称加以搜索。表4(显示于以下章节IV中)提供了对肿瘤细胞具有特异性的核准抗体的代表性清单。表5(显示于以下章节IV中)提供了对肿瘤细胞具有特异性的处于开发中的抗体的代表性清单。
表6(显示于以下章节IV中)概述了关于结合肿瘤抗原并且可用作TWICE中的靶向部分的示例性抗体的所选出版物。这些出版物显示能够结合肿瘤抗原的靶向部分在提交本申请时完全在本领域中的技能和发明人的掌握内。
本领域中熟知的其他抗体可作为靶向部分用于靶向至给定癌症。抗体和它们的相应抗原包括纳武利尤单抗(抗PD-1Ab)、TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125(仿制))、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿夫妥珠单抗(afutuzumab)(抗CD20)、培阿赛珠单抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)(抗CEA)、阿玛妥昔单抗(amatuximab)(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴维昔单抗(bavituximab)(抗磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(bectumomab)(抗CD22)、贝利木单抗(belimumab)(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA相关抗原)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、莫坦辛比伐单抗(bivatuzumab mertansine)(抗CD44 v6)、博纳吐单抗(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗CD30(TNFRSF8))、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)(抗粘蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(cantuzumab ravtansine)(抗MUC1)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)(抗前列腺癌细胞)、卡利尤单抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索单抗(抗EpCAM、CD3)、cBR96-多柔比星(doxorubicin)免疫缀合物(抗Lewis-Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、西利珠单抗(cedelizumab)(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA相关抗原)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗IGF-1受体)、替利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(抗MUC1)、可那木单抗(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、达西珠单抗(dacetuzumab)(抗CD40)、达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、达洛妥珠单抗(dalotuzumab)(抗胰岛素样生长因子I受体)、达雷木单抗(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、地美西珠单抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫单抗(detumomab)(抗B淋巴瘤细胞)、卓齐妥单抗(抗DR5)、度利戈妥单抗(duligotumab)(抗HER3)、杜斯吉妥单抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、伊美昔单抗(ecromeximab)(抗GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(抗EpCAM)、埃罗妥珠单抗(抗SLAMF7)、伊斯利莫单抗(elsilimomab)(抗IL-6)、恩凡妥珠单抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受体)、恩替库单抗(enoticumab)(抗DLL4)、恩司妥昔单抗(ensituximab)(抗5AC)、西伊匹莫单抗(epitumomab cituxetan)(抗上皮唾蛋白)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu、CD3)、埃达珠单抗(etaracizumab)(抗整合素αvβ3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、法妥珠单抗(farletuzumab)(抗叶酸受体1)、FBTA05(抗CD20)、芬克拉妥珠单抗(ficlatuzumab)(抗HGF)、芬妥木单抗(figitumumab)(抗IGF-1受体)、弗兰妥单抗(flanvotumab)(抗TYRP1(糖蛋白75))、夫苏木单抗(fresolimumab)(抗TGFβ)、弗妥昔单抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔单抗(galiximab)(抗CD80)、加尼妥单抗(ganitumab)(抗IGF-I)、奥佐米星吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33)、吉瑞昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、维多汀格巴妥木单抗(glembatumumab vedotin)(抗GPNMB)、古塞库单抗(guselkumab)(抗IL13)、伊巴珠单抗(ibalizumab)(抗CD4)、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)、伊克卢库单抗(icrucumab)(抗VEGFR-1)、伊戈伏单抗(igovomab)(抗CA-125)、佐尔贝妥昔单抗(IMAB362，抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSF1R)、IMC-TR1(TGFβRII)、英加妥珠单抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、英克勒库单抗(inclacumab)(抗选择素P)、雷英达妥昔单抗(indatuximab ravtansine)(抗SDC1)、奥佐米星伊诺妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、英特妥木单抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹木单抗(抗CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、(抗CEA)、兰博利珠单抗(lambrolizumab)(抗PDCD1)、来沙木单抗(抗TRAIL-R2)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗CD33)、利瑞利尤单抗(抗KIR2D)、莫坦辛洛妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)(抗CD56)、鲁卡妥木单抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁昔单抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受体))、马帕木单抗(抗TRAIL-R1)、马格妥昔单抗(抗ch4D5)、马妥珠单抗(matuzumab)(抗EGFR)、马利木单抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受体a-链)、米拉珠单抗(milatuzumab)(抗CD74)、明瑞莫单抗(minretumomab)(抗TAG-72)、米妥莫单抗(mitumomab)(抗GD3神经节苷脂)、莫木利珠单抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、帕莫西妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)(抗CD22)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)(抗C242抗原)、埃托那莫单抗(naptumomab estafenatox)(抗5T4)、纳那妥单抗(narnatumab)(抗RON)、奈昔木单抗(抗EGFR)、奈弗库单抗(nesvacumab)(抗促血管生成素2(angiopoietin 2))、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(抗EGFR)、纳武利尤单抗(抗IgG4)、巯诺莫单抗(nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(抗CD20)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奥拉妥单抗(抗PDGF-Rα)、奥纳珠单抗(onartuzumab)(抗c-MET)、奥妥昔珠单抗(ontuxizumab)(抗TEM1)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)(抗EpCAM)、奥戈伏单抗(oregovomab)(抗CA-125)、奥特妥珠单抗(otlertuzumab)(抗CD37)、潘考单抗(pankomab)(抗MUC1的肿瘤特异性糖基化)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)、帕考珠单抗(pascolizumab)(抗IL-4)、帕曲妥单抗(patritumab)(抗HER3)、佩姆莫单抗(pemtumomab)(抗MUC1)、帕妥珠单抗(抗HER2/neu)、匹迪珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1)、维多汀皮那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22)、平妥莫单抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、维多汀泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普立木单抗(pritumumab)(抗波形蛋白(vimentin))、PRO131921(抗CD20)、奎利珠单抗(quilizumab)、(抗IGHE)、雷妥莫单抗(抗N-羟乙酰基神经氨酸)、雷得妥单抗(radretumab)(抗纤连蛋白额外结构域-B)、雷莫芦单抗(抗VEGFR2)、利妥木单抗(rilotumumab)(抗HGF)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗IGF-1受体)、罗度单抗(roledumab)(抗RHD)、罗维利珠单抗(rovelizumab)(抗CD11和CD18)、沙马利珠单抗(samalizumab)(抗CD200)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)(抗TAG-72)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、SGN-CD33A(抗CD33)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗FAP)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗IL-6)、索利托单抗(solitomab)(抗EpCAM)、松妥珠单抗(sontuzumab)(抗上皮唾蛋白)、他巴利尤单抗(tabalumab)(抗BAFF)、替他卡珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)(抗α-胎蛋白(alpha-fetoprotein))、帕他莫单抗(taplitumomab paptox)(抗CD19)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)(抗肌腱蛋白C)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗CD40)、替妥木单抗(teprotumumab)(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、替西木单抗(ticilimumab)(抗CTLA-4)、替加珠单抗(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、托西莫单抗(抗CS20)、托维妥单抗(tovetumab)(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、曲加珠单抗(tregalizumab)(抗CD4)、曲美木单抗(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(抗EpCAM)、乌妥昔单抗(抗CD20)、乌瑞利尤单抗(抗4-1BB)、凡替妥单抗(vantictumab)(抗卷曲受体(Frizzled receptor))、伐利昔单抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐特珠单抗(vatelizumab)(抗ITGA2)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)、维森库单抗(vesencumab)(抗NRP1)、维西珠单抗(抗CD3)、伏洛昔单抗(volociximab)(抗整合素α5β1)、玛伏多汀伏司妥珠单抗(vorsetuzumab mafodotin)(抗CD70)、伏妥莫单抗(votumumab)(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、扎鲁木单抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎木单抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎妥昔单抗(zatuximab)(抗HER1)、齐拉木单抗(ziralimumab)(抗CD147(生碱蛋白(basigin)))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAP1)、TAK-164(抗GCC)和GDC-0199(抗Bcl-2)。
结合这些抗原的抗体也可用于TWICE中，尤其针对指示的癌症类型：氨基肽酶N(CD13)、膜联蛋白A1(annexin A1)、B7-H3(CD276，各种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌瘤)、CA19-9(癌瘤)、L6(癌瘤)、Lewis Y(癌瘤)、Lewis X(癌瘤)、α胎蛋白(癌瘤)、CA242(结肠直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌瘤)、前列腺特异性抗原(前列腺)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺)、表皮生长因子(癌瘤)、CD2(霍奇金氏病、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自体免疫疾病、恶性腹水)、CD19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞赘瘤、自体免疫疾病)、CD21(B细胞淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金氏淋巴瘤)、CD33(白血病、自体免疫疾病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、梅克尔(Merkel)细胞癌以及液体肿瘤、多发性骨髓瘤)、CD66e(癌瘤)、CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌瘤)、CD123(白血病)、粘蛋白(癌瘤)、CD221(实体肿瘤)、CD22(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC和其他癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体肿瘤)、CEACAM3(结肠直肠癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌)、DLL4(A样-4)、EGFR(各种癌症)、CTLA4(黑素瘤)、CXCR4(CD 184，血液肿瘤、实体肿瘤)、内皮糖蛋白(CD 105，实体肿瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子，膀胱癌、头部癌、颈部癌、结肠癌、NHL、前列腺癌和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGR1(自体免疫疾病)、FOLR(叶酸受体，卵巢癌)、FGFR(癌瘤)、GD2神经节苷脂(癌瘤)、G-28(细胞表面抗原糖脂，黑素瘤)、GD3独特型(癌瘤)、热激蛋白(癌瘤)、HER1(肺癌、胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人绒毛膜促性腺激素(癌瘤)、IGF1R(实体肿瘤、血液癌症)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多发性骨髓瘤、RA、卡斯尔曼氏病(Castleman's disease)、IL6依赖性肿瘤)、整合素(αvβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、αvβ5，关于各种癌症)、MAGE-1(癌瘤)、MAGE-2(癌瘤)、MAGE-3(癌瘤)、MAGE 4(癌瘤)、抗转铁蛋白受体(癌瘤)、p97(黑素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1，非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、支气管癌和胃肠癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结肠直肠癌)、gp100(黑素瘤)、MARTI(黑素瘤)、MPG(黑素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A，小细胞肺癌、NHL)、核仁素(nucleolin)、Neu致癌基因产物(癌瘤)、P21(癌瘤)、连接素-4(nectin-4)(癌瘤)、抗N-羟乙酰基神经氨酸抗体的互补位(乳腺癌、黑素瘤癌)、PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)、PSMA(前列腺肿瘤)、PSA(前列腺)、ROB04、TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72，AML、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(癌症)、Tie(CD202b)、组织因子、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌瘤)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤、NHL、其他癌症、RA和SLE)、TPBG(滋养层糖蛋白，肾细胞癌)、TRAIL-R1(肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1，淋巴瘤、NHL、结肠直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD106，黑素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2(CD309)(各种癌症)。已综述一些其他肿瘤相关抗原靶标(Gerber等人,mAbs 20091:247-253；Novellino等人,Cancer Immunol Immunother.200554:187-207，Franke等人,Cancer Biother Radiopharm.2000,15:459-76，Guo等人,Adv Cancer Res.2013；119:421-475，Parmiani等人J Immunol.2007 178:1975-9)。这些抗原的实例包括分化簇(CD4、CDS5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD166、.CD168、CD184、CDw186、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白A1、核仁素、内皮糖蛋白(CD105)、ROB04、氨基肽酶N、-样-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、hTERT、肉瘤易位断裂点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、周期素B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、海藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYPIB I、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAXS、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2和Fos相关抗原1。
在一些实施方案中，能够靶向癌症的靶向部分不是抗体，而是另一类型的靶向部分。表7(显示于以下章节IV中)呈现一些代表性非抗体靶向部分和它们的相应靶标。
在另一实施方案中，靶向部分可为已知在癌细胞上表达的蛋白质的结合配偶体。此类表达水平可包括过度表达。举例来说，表8(显示于以下章节IV中)中所述的结合配偶体可结合癌细胞上的以下靶标。
结合配偶体无需包含表8中所列的结合配偶体的全长或野生型序列。所需要的全部是结合配偶体结合癌细胞上的靶标，并且因此可包括本领域中熟知的截短形式、类似物、变体和衍生物。
另外，在一些实施方案中，结合配偶体可为能够结合已知在癌细胞上表达的蛋白质的适体。结合癌细胞的适体是熟知的，并且用于设计它们的方法是已知的。
基于细胞的SELEX系统可用于从随机候选文库选择一组靶标细胞特异性适体。可将ssDNA或ssRNA汇合物溶解于结合缓冲液中，并且使其变性，接着与靶标细胞一起孵育。在洗涤之后，可通过加热来洗脱结合的DNA或RNA，接着与阴性细胞一起孵育(如果需要)，离心，并且移除上清液。可通过用经生物素标记的引物进行PCR来扩增上清液。可使用经链霉亲和素包被的珠粒来使所选有义ssDNA或ssRNA与反义生物素化链分离。为增加亲和力，可通过增加洗涤时间、缓冲液体积和洗涤次数来增加洗涤强度。在所需轮数的选择之后，可对所选ssDNA或ssRNA汇合物进行PCR扩增，并且将其克隆至大肠杆菌(E.coli)中并测序。参见Shangguan等人,Aptamers evolved from live cells as effective molecular probesfor cancer study,PNAS 103(32:11838-11843(2006)；Lyu等人,Generating CellTargeting Aptamers for Nanotherapeutics Using Cell-SELEX,Theranostics6(9):1440-1452(2016)；也参见Li等人,Inhibition of Cell Proliferation by an Anti-EGFRAptamer,PLoS One 6(6):e20229(2011)。这些参考文献中的用于设计适体的特定方法和结合癌细胞的特定适体据此通过引用并入本文。
举例来说，适体可包含SEQ ID NO:94至164。在一些实施方案中，适体可包含SEQID NO:95。这些适体针对EGFR，并且仅作为可结合癌细胞上呈现的靶标的适体的代表加以提供。针对癌细胞上的其他靶标的其他适体同样是本文描述的一部分，并且通过引用并入本文，如Zhu等人,Theranostics 4(9):931-944(2014)中所述。
在一些实施方案中，供在本文中使用的适体以在纳体积摩尔浓度至皮体积摩尔浓度的范围内(诸如1皮体积摩尔浓度至500纳体积摩尔浓度或1皮体积摩尔浓度至100纳体积摩尔浓度)的Kd结合癌细胞上的靶标。
2.能够靶向肿瘤微环境细胞的靶向部分
当前癌症免疫治疗抗体需要效应细胞存在于肿瘤内。然而，肿瘤可产生排除效应细胞的免疫抑制性环境，从而致使免疫疗法具有较小有效性(参见Herbst等人Nature.515(7528):563-7(2014))。缺乏效应细胞的肿瘤可被称为“冷肿瘤”(参见Whiteside TL等人Clin Cancer Res.22(8):1845-55(2016))。
效应细胞可通过肿瘤基质，特别是通过肿瘤微环境中的非癌细胞，诸如肿瘤相关成纤维细胞(TAF)从肿瘤排除(参见Ziani等人,Front Immunol.9:414(2018))。肿瘤微环境中的非癌细胞可被称为“肿瘤微环境细胞”。因为冷肿瘤中的T细胞可被限制于基质，所以被靶向至恶性细胞和基质的界面的免疫治疗剂可潜在克服免疫排除。因此，用第二靶向部分靶向肿瘤微环境细胞可提供本发明的试剂盒或组合物的额外特异性。
在一些实施方案中，第一靶向部分结合由癌症表达的抗原抗原，并且第二靶向部分结合由肿瘤微环境细胞表达的抗原。在一些实施方案中，肿瘤微环境细胞是成纤维细胞或巨噬细胞。这些细胞可被称为肿瘤相关成纤维细胞或癌症相关成纤维细胞(TAF或CAF)或肿瘤相关巨噬细胞或癌症相关巨噬细胞(TAM或CAM)。如本文所用，“肿瘤相关成纤维细胞”是指紧密邻近于肿瘤团块或在肿瘤团块内所见的成纤维细胞。如本文所用，“肿瘤相关巨噬细胞”是指紧密邻近于肿瘤团块或与肿瘤团块一起所见的巨噬细胞。
图2显示TWICE的一个组分靶向至癌细胞，并且另一组分靶向至肿瘤微环境中的非癌细胞。在这个类型的TWICE的情况下，两个组分的免疫结合结构域和/或两个组分的补充性结合结构域将仅在癌细胞和非癌肿瘤微环境细胞紧密邻近时配对。
TAF的特征在于表达活化标志物诸如成纤维细胞活化蛋白α(FAP)和α-平滑肌肌动蛋白(参见Barnett和Vilar,J Natl Cancer Inst110(1):11-13(2018))，并且可通过直接或间接机制创建免疫抑制性环境。直接免疫抑制作用可由生长因子诸如TGF-β或细胞因子诸如CXCL12介导，并且间接免疫抑制作用可通过肿瘤微环境中细胞外基质重塑来介导(参见Ziani等人,2018)。
在一些实施方案中，第二组分的靶向部分结合由TAF表达的抗原。在一些实施方案中，靶向至TAF的靶向部分包含结合FAP的抗体诸如西罗珠单抗(参见US20120258119A1)。FAP主要在肿瘤基质上而非在正常成纤维细胞上表达(Brennen等人Mol Cancer Ther.11(2):257–266(2012))。
在一些实施方案中，第二组分的靶向部分结合由TAM表达的抗原。在一些实施方案中，靶向至TAM的靶向部分包含结合MAC-1/CD11b(参见EP0488061A2)或sideroflexin 3(参见WO2018020000)的抗体。
D.免疫细胞结合结构域
第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合免疫细胞上的抗原。如本文所用，“免疫细胞”可为包含在免疫系统中的任何细胞。免疫细胞可为涉及于先天性或适应性免疫应答中的细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是天然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞或T细胞。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞或天然杀伤T细胞(NKT细胞)。
1.T细胞结合结构域
在一些实施方案中，第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞。在一些实施方案中，第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3或T细胞受体(TCR)。
CD3存在于所有T细胞上，并且由指定为γ、δ、ε、ζ和η的亚单位组成。TCR是存在于T细胞上的由指定为α、β、γ和δ的不同亚单位组成的另一分子。CD3的细胞质尾部足以在不存在TCR受体复合物的其他组分下转导为T细胞活化所必需的信号。通常，T细胞细胞毒性的活化首先取决于TCR与位于单独细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白质的结合，所述蛋白质自身结合于外来抗原。在无外部干预的情况下，仅当这个初始TCR-MHC结合已发生时才可达成CD3依赖性信号级联，此导致T细胞克隆扩增，并且最终，接着产生T细胞细胞毒性。然而，在一些本发明实施方案中，当第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域结合CD3和/或TCR时，在不存在独立TCR-MHC下的细胞毒性T细胞活化可借助于CD3和/或TCR分子的交联，从而模拟免疫突触形成而发生。这意指T细胞可以克隆非依赖性方式，即以不依赖于由T细胞携带的特定TCR克隆的方式，在细胞毒性方面被活化。这允许活化整个T细胞区室，而非仅仅具有某一克隆身份的特定T细胞。
在一些实施方案中，第一T细胞结合结构域是VH结构域，并且第二T细胞结合结构域是VL结构域。在一些实施方案中，第一T细胞结合结构域是VL结构域，并且第二T细胞结合结构域是VH结构域。在一些实施方案中，第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域在一起配对时可构成Fv。如本文所用，“Fv”是指联合在一起的VH和VL。换句话说，当一起配对时，第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域可构成“scFv”，例外之处是VH和VL不呈在VH与VL之间具有接头的单链构型的事实。
如果第一T细胞结合结构域和第二T细胞结合结构域是一对VH结构域和VL结构域，那么VH结构域和VL结构域可对在T细胞的表面上表达的抗原诸如CD3或TCR具有特异性。在一些实施方案中，抗CD3或抗TCR抗体结合CD3或TCR的亚单位。如果抗原是CD3，那么一种潜在T细胞结合结构域可源于莫罗莫那(莫罗莫那-CD3或OKT3)、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、福拉利尤单抗、SP34或博纳吐单抗。本领域技术人员将了解广泛范围的抗CD3抗体，其中一些是核准疗法或已在人患者中加以临床测试(参见Kuhn和WeinerImmunotherapy 8(8):889-906(2016))。表9(显示于以下章节IV中)呈现关于示例性抗CD3抗体的所选出版物。对包括αβ和γδTCR的TCR具有特异性的抗体也是熟知的。表10(显示于以下章节IV中)呈现关于示例性抗TCR抗体的所选出版物。
T细胞结合结构域还可包括作为潜在补充性结合结构域列出的任何抗体，诸如程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT、或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
2.天然杀伤细胞结合结构域
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在一起配对时能够活化天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在一起配对时能够结合CD16A。在一些实施方案中，配对的免疫细胞结合结构域与NK细胞上的CD16A的结合使针对CD33阳性白血病细胞的NK细胞活化。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含NTM-1633(参见NCT03603665)或AFM13(参见NCT01221571)的VH和/或VL的全部或一部分。
3.巨噬细胞结合结构域
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在一起配对时能够结合巨噬细胞。在一些实施方案中，巨噬细胞是活化的巨噬细胞。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在一起配对时能够结合CSF1R。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含埃马妥珠单抗/RG7155(NCT01494688)或IMC-CS4(NCT01346358)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在一起配对时能够结合CD40。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
E.补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一组分和第二组分包含补充性结合结构域。当两个组分的补充性结合结构域配对时，这导致额外功能。这个额外功能可为例如诱导癌细胞的死亡或增加抗肿瘤免疫应答。额外功能还可用于使得肿瘤微环境更适宜于免疫细胞。
因为TWICE的两个组分被靶向至癌症或肿瘤微环境，所以通过补充性结合结构域的配对介导的额外功能将发生在肿瘤或它的微环境中。在一些实施方案中，由配对的补充性结合结构域介导的额外功能限于肿瘤和它的微环境，由此降低脱靶效应。举例来说，将活性限于肿瘤和它的微环境的这个能力可有利于活化或抑制具有广布表达和/或一定范围的生理功能的靶标分子，诸如TGF-β。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同抗原。举例来说，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，可结合T细胞上的CD3。配对的补充性结合结构域与配对的免疫细胞结合结构域两者与CD3的结合可导致更稳健活化抗癌免疫应答。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同细胞上的不同抗原。举例来说，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，可结合T细胞上的不同抗原。配对的补充性结合结构域与配对的免疫细胞结合结构域两者与T细胞上的两种不同抗原的结合可导致稳健活化抗癌免疫应答。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合不同细胞。举例来说，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时可结合癌细胞以导致细胞死亡，并且第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时可结合T细胞以介导抗癌免疫应答。肿瘤细胞中细胞死亡路径的活化以及抗癌免疫应答的活化可增加肿瘤消退。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够调节T细胞、巨噬细胞或NK细胞活性。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞上的共刺激性抗原或共抑制性抗原。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够具有针对癌症的细胞死亡诱导活性。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合细胞死亡诱导抗原。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域是VH结构域，并且第二补充性结合结构域是VL结构域。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域是VL结构域，并且第二补充性结合结构域是VH结构域。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时可构成Fv。换句话说，当一起配对时，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域可构成“scFv”，例外之处是VH和VL不呈单链构型的事实。
在一些实施方案中，已知抗体的VH结构域可用作第一补充性结合结构域，而VL结构域可用作第二补充性结合结构域。
在一些实施方案中，已知抗体的VL结构域可用作第一补充性结合结构域，而VH结构域可用作第二补充性结合结构域。
1.调节T细胞活性的补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够调节TCR活性。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞共信号传导分子。T细胞共信号传导分子已在文献中充分表征(参见Chen L和Flies DB Nat Rev Immunol 13(4):227–242(2013))，并且包括共刺激性和共抑制性抗原。在一些实施方案中，共信号传导分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)或肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员。共抑制性抗原也可被称为免疫检查点分子。
表11(显示于以下章节IV中)提供了可通过调节T细胞功能来诱导抗肿瘤应答的临床研究抗体的实例。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD3e。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含莫罗莫那、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、福拉利尤单抗、SP34或博纳吐单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含帕博利珠单抗或纳武利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伊匹木单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含TSR-022或Sym023的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含BMS-986016的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含利瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD28。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含西拉利珠单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD137。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含乌托米利尤单抗或乌瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合OX40。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含PF-04518600或BMS986178的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD27。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伐立利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合GITR。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含GWN323或BMS-986156的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含OMP-313M32、MTIG7192A、BMS-986207或MK-7684的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含JTX-2011(处于临床开发中的抗ICOS抗体)的VH和/或VL的全部或一部分。
2.靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域与TAM上的抗原的结合介导增加的对肿瘤的免疫应答。举例来说，抗CSF1R阻断抗体使TAM浸润降低，并且促进CD8+T细胞扩增(Ries CH等人Cancer Cell.25(6):846-59(2014))。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够抑制TAM。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够重新编程或募集活性巨噬细胞。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CSF1R。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含埃马妥珠单抗/RG7155(NCT01494688)或IMC-CS4(NCT01346358)的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD40。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
3.刺激NK细胞的补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够活化NK细胞。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD16A。在一些实施方案中，配对的补充性结合结构域与NK细胞上的CD16A的结合使针对CD33阳性白血病细胞的NK细胞活化。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含NTM-1633(参见NCT03603665)或AFM13(参见NCT01221571)的VH和/或VL的全部或一部分。
4.抑制由癌细胞表达的检查点分子的补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够抑制由癌细胞表达的检查点分子。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够阻断来自癌细胞的抑制免疫细胞活化的信号。许多不同免疫检查点分子已在文献中描述(参见Park等人,Experimental&Molecular Medicine50:109(2018)，所述文献通过引用以它的整体并入本文以公开不同免疫检查点分子)。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合PD-L1。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含阿替利珠单抗、度伐利尤单抗或阿维利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合CD73。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含CPI-006或MEDI9447的VH和/或VL的全部或一部分。
5.结合RANK的补充性结合结构域
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够抑制调控性T细胞的活化。
在一些实施方案中，补充性结合结构域在一起配对时结合RANK或RANKL。RANK在癌细胞上表达，并且可结合调控性T细胞上的RANKL以产生免疫抑制性环境(参见de Groot等人,Cancer Treatment Reviews 62:18-28(2018))。在一些实施方案中，与癌细胞上的RANK或RANKL的结合阻断调控性T细胞活化，并且刺激免疫应答。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合RANK。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合RANKL。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含地舒单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
6.结合细胞死亡诱导抗原的补充性结合结构域
如本文所用，“细胞死亡诱导”抗原是在由配体结合之后刺激细胞死亡的抗原。包括所有类型的细胞死亡。细胞死亡可为程序化的(例如凋亡)或非程序化的(例如坏死)。在一些实施方案中，细胞死亡是坏死、凋亡或程序化坏死。
在一些实施方案中，细胞死亡诱导抗原包含死亡受体。死亡受体是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，特征在于存在细胞内“死亡结构域”。在一些实施方案中，死亡受体是Fas/CD95/Apo1、TNFR1/p55/CD120a、DR3/Apo3/WSL-1/TRAMP/LARD、TRAIL-R1/DR4、DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER、DR6或CAR1。
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合TRAIL-R1/DR4。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含马帕木单抗(抗TRAIL-R1/DR4死亡受体抗体)的VH和/或VL的全部或一部分。在一个实施方案中，抗DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER抗体包含可那木单抗(AMG655)、来沙木单抗、替加珠单抗(CS1008)或卓齐妥单抗(PRO95780)。
F.二聚化结构域
在一些实施方案中，第一组分和第二组分还包含二聚化结构域，如图6中所示。如本文所用，“二聚化结构域”是指允许两个蛋白质单体(即单一蛋白质)结合在一起的氨基酸序列。因此，二聚化结构域可包含导致两个蛋白质单体形成二聚体的任何序列。在一些实施方案中，结合是共价的。在一些实施方案中，结合是非共价的。
二聚化结构域可连接于补充性结合结构域或免疫细胞结合结构域。
在一些实施方案中，二聚化结构域促进第一补充性结合结构域与第一免疫细胞结合结构域的缔合和/或第二补充性结合结构域与第二免疫细胞结合结构域的缔合。以这个方式，二聚化可降低补充性结合结构域从免疫细胞结合结构域解离出肿瘤部位的潜力。
在一些实施方案中，可裂解接头(即包含裂解位点的接头)介导第一免疫细胞结合结构域从第一组分的第一补充性结合结构域解离，以及/或者第二免疫细胞结合结构域从第二补充性结合结构域的解离。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域结合第一补充性结合结构域，直至至少一个可裂解接头被裂解，以致第一免疫细胞结合结构域和第一补充性结合结构域中的任一者(或两者)从它的相应二聚化结构域释放。在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域结合第二补充性结合结构域，直至至少一个可裂解接头被裂解，以致第二免疫细胞结合结构域和第二补充性结合结构域中的任一者(或两者)从它的相应二聚化结构域释放。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于第一补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第一免疫细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第一补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于第二补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第二免疫细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第二补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
二聚化结构域可包含已知二聚化结构域氨基酸序列的全部或一部分。二聚化结构域可包含与已知二聚化氨基酸序列具有同源性，但不匹配已知序列的序列。在一些实施方案中，二聚化结构域可包含被优化以改善结合的氨基酸。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含来自转录因子或受体/配体对的氨基酸序列。二聚化结构域的非限制性实例包括来自受体酪氨酸激酶、转录因子、14-3-3蛋白和G蛋白偶联受体的序列。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链(也被称为卷曲螺旋)。如本文所用，“亮氨酸拉链”是指包含亮氨酸残基的周期性重复的任何氨基酸序列。已描述用于二聚化的广泛多种亮氨酸拉链，诸如专利US 9,994,646。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白结构域。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白可变结构域是VH或VL结构域。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域是Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域是CH1/CL、CH2、CH3或CH4。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含IgE CH2结构域。
在一些实施方案中，二聚化结构域包含TCR恒定结构域。TCR恒定结构域可来自任何链(例如α、β、γ或δ)。
在一些实施方案中，第一组分中的二聚化结构域与第二组分中的二聚化结构域相同。举例来说，第一组分和第二组分中的二聚化结构域可为亮氨酸拉链。当第一组分和第二组分中的二聚化结构域是相同的时，这可被称为“同二聚化”。
在一些实施方案中，第一组分中的二聚化结构域不同于第二组分中的二聚化结构域。举例来说，第一组分和第二组分中的二聚化结构域可包含受体/配体对。当第一组分和第二组分中的二聚化结构域是不同的时，这可被称为“异二聚化”。
二聚化结构域还可被工程改造来创建“钮”或“孔”以使两个蛋白质二聚化。此类钮入孔二聚化序列可包括钮入孔Fc或钮入孔CH3结构域。已描述用于产生双特异性抗体的广泛范围的钮入孔实例(参见Xu等人,mAbs 7(1):231-242(2015))。
在一些实施方案中，二聚化结构域是经工程改造的。就“经工程改造”来说，其意指对氨基酸序列进行突变以改变蛋白质的一种或多种性质。在一些实施方案中，当两个蛋白质结构域在不存在工程改造下通常不缔合时，工程改造使得这两个结构域的缔合在静电方面是有利的。在一些实施方案中，两个免疫球蛋白恒定结构域是经工程改造的，并且可被称为“经工程改造免疫球蛋白恒定结构域”。在一些实施方案中，Fc区的工程改造导致Fc区诸如CH结构域的异二聚化。
在一些实施方案中，两个Fc区被工程改造来包含相反电荷，并且缔合在一起(参见WO2009089004)。在一些实施方案中，两个Fc区被工程改造来包含两个亮氨酸拉链，并且缔合在一起(参见US9,994,646)。在一些实施方案中，两个Fc区通过赖氨酸重定位(参见WO2017106462)来工程改造。
结构域可被工程改造，以致TWICE的每个组分在制造、运输和施用期间是充分稳定的，但当TWICE的两个组分紧密邻近时，结合动力学将仍然有利于免疫结合结构域彼此配对，以及当适用时，有利于补充性功能性结构域彼此配对。
产生异二聚Fc的若干方式可用于制备本文所述的构建体。为试图以不对称IgG即通过两个不同配对重链形成为异二聚体的IgG的形式产生双特异性抗体，Ridgway等人已通过突变来工程改造IgG1的CH3结构域，以致一个链含有“钮”，并且另一链含有相应“孔”(J.B.Ridgway等人Protein Eng.9:617–621(1196))。由于同二聚体中的空间位阻，当从同一细胞共表达时，这个“钮入孔”方法的两个经工程改造重链将优先形成异二聚体。此后已公开若干其他突变，在经工程改造Fc结构域中使用类似的空间位阻或排斥电荷策略以促进在两个不同链之间形成异二聚体(Atwell等人Journal of Molecular Biology270:26-35(1997)；Gunasekaran等人,Journal of Biological Chemistry285:19637-46(2010)；Moore等人mAbs 3,546–557(2011)；Strop P等人J.Mol.Biol.420,204–219(2012)，VonKreudenstein等人2013,mAbs；5:646-54(2013))。空间位阻和排斥电荷的组合也已用于对IgG重链进行工程改造以高效形成异二聚体(WO2017106462A1)。使用不同方法，Davis等人(Davis等人,Protein Engineering,Design&Selection 23(4):195–202(2010))已使用IgG和IgA序列对使得能够达成Fc异二聚化的不对称CH3结构域进行工程改造而开发了链交换工程改造结构域(SEED)。
G.补充性功能性结构域
在一些实施方案中，第一组分或第二组分包含补充性功能性结构域。如本文所用，“补充性功能性结构域”是指当结合特定细胞类型时具有功能的结构域。补充性功能性结构域不同于补充性结合结构域，因为补充性功能性结构域不需要与另一结构域配对来具有功能。
在一些实施方案中，第一组分与第二组分两者均包含补充性功能性结构域。在一些实施方案中，仅第一组分包含补充性功能性结构域。
一般来说，充当受体的配体的细胞表面蛋白的细胞外结构域可用作补充性功能性结构域。在一些实施方案中，补充性功能性结构域是用于T细胞活化的共刺激性分子。在一些实施方案中，补充性功能性结构域是用于结合整合素的配体。
在一些实施方案中，补充性功能性结构域是TGF-β家族的成员的潜活形式。在一些实施方案中，潜活形式在肿瘤微环境中被活化以在肿瘤细胞处局部地起作用。
在一些实施方案中，补充性功能性结构域是细胞因子。广泛范围的细胞因子已在癌症的情况下加以临床测试(参见Vazquez-Lombardi等人,Antibodies 2:426-451(2013))。此外，并入细胞因子作为TWICE的补充性功能性结构域允许局部递送细胞因子，因此，可对细胞因子的全身性施用加以改进。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员。
在一些实施方案中，补充性功能性结构域是减弱化细胞因子。
如本文所用，“减弱化细胞因子”是相较于野生型细胞因子具有降低它的活性的突变的细胞因子，或用通过可在肿瘤或肿瘤基质微环境中裂解的接头连接于细胞因子的掩蔽物加以“掩蔽”的细胞因子。因此，减弱化细胞因子可为天然存在的细胞因子的变异形式。在一些实施方案中，除非减弱化细胞因子被靶向至靶标细胞，否则它缺乏活性。被靶向至肿瘤的减弱化细胞因子可具有稳健抗肿瘤作用，伴有有限的全身性毒性(参见Pogue等人,PLoSONE 11(9):e0162472(2016)以及Pogue等人,Cytokine 1:66(2015))。
也已提出减弱化细胞因子使免疫系统活化，并且诱导效应T细胞的增殖，而未进行减弱的相同细胞因子可导致免疫系统的阻抑和调控性T细胞的增殖。
在一些实施方案中，减弱化细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员的变异形式。在一些实施方案中，减弱化细胞因子必须被靶向至癌症或它的微环境以具有功能。
H.接头
就接头来说，我们包括使TWICE的部分连接在一起的任何化学部分。
在一些实施方案中，用于TWICE中的接头可为柔性接头。接头包括肽、聚合物、核苷酸、核酸、多糖和脂质有机物质(诸如聚乙二醇)。在一些实施方案中，接头是肽接头。肽接头的长度可为约2-100、10-50、或15-30个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度可为至少10、至少15、或至少20个氨基酸，并且至多80、至多90、或至多100个氨基酸。在一些实施方案中，接头是具有单一或重复GGGGS(SEQ ID NO:85)、GGGS(SEQ ID NO:86)、GS(SEQ ID NO:87)、GSGGS(SEQ ID NO:88)、GGSG(SEQ ID NO:89)、GGSGG(SEQ ID NO:90)、GSGSG(SEQ IDNO:91)、GSGGG(SEQ ID NO:92)、GGGSG(SEQ ID NO:93)和/或GSSSG(SEQ ID NO:94)序列的肽接头。
在一些实施方案中，接头不包含裂解位点(即非可裂解接头)。不包含裂解位点的示例性接头包括顺丁烯二酰亚胺(MPA)或SMCC接头。
在一些实施方案中，接头包含裂解位点(即可裂解接头)。
在一些实施方案中，接头使靶向部分连接于免疫细胞结合结构域、补充性结合结构域或补充性功能性结构域。在一些实施方案中，接头使二聚化结构域连接于免疫细胞结合结构域或补充性结合结构域。
1.用以连接靶向部分的接头
在一些实施方案中，接头使靶向部分连接于免疫细胞结合结构域。在一些实施方案中，接头使靶向部分连接于补充性结合结构域或补充性功能性结构域。在一些实施方案中，使靶向部分连接于补充性结合结构域或补充性功能性结构域的接头是非可裂解接头。在一些实施方案中，使靶向部分连接于补充性结合结构域或补充性功能性结构域的接头是柔性接头。
2.用以连接二聚化结构域的接头
在一些实施方案中，接头使二聚化结构域连接于免疫细胞结合结构域。在一些实施方案中，接头使二聚化结构域连接于补充性结合结构域。
用于使二聚化结构域连接于免疫细胞结合结构域或补充性结合结构域的接头可被称为“二聚化结构域接头”。在一些实施方案中，二聚化结构域接头是可裂解接头。
在一些实施方案中，二聚化结构域接头可包含裂解位点。在一些实施方案中，二聚化结构域接头包含蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，二聚化结构域接头包含可在肿瘤微环境中裂解的蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，二聚化结构域接头包含一种或多种基质金属蛋白酶的裂解位点。
视采用的二聚化结构域而定，一定范围的二聚化结构域接头长度可用于TWICE中。二聚化结构域接头的长度可需要是足够长的，以允许达成蛋白酶裂解的灵活性。然而，太长的二聚化结构域接头可使两个二聚化结构域在空间上相隔太远以致不能确保二聚化。
在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头具有相同或类似长度。在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头具有不同长度。
在一些实施方案中，二聚化结构域接头长度有助于促进两个二聚化结构域的缔合。
在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头在长度方面是5-30个氨基酸。在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头在长度方面是8-16个氨基酸。
在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头在长度方面是5-15个氨基酸。举例来说，当二聚化结构域是CH1/CL时，这个长度的接头可为适当的。
在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头在长度方面是12-30个氨基酸。举例来说，当二聚化结构域是亮氨酸拉链(卷曲螺旋)时，这个长度的接头可为适当的。在一些实施方案中，第一二聚化结构域接头和第二二聚化结构域接头在长度方面是15-20个氨基酸。举例来说，这个长度的接头可适合于某些亮氨酸拉链二聚化结构域。
代表性二聚化结构域接头的实例包括SEQ ID NO:203-211。
I.裂解位点和可裂解接头
在一些实施方案中，裂解位点允许在某些位置处对构建体的特异性裂解。包含裂解位点的接头可被称为可裂解接头。
举例来说，是单一多肽构建体的TWICE可在第一组分与第二组分之间包含可裂解接头。这个TWICE的其他实施方案还可采用可裂解接头，诸如二聚化结构域接头。
在一些实施方案中，裂解可发生在非所要细胞的外部，而不首先内化至细胞中以及参与经典抗原加工路径。
在某些实施方案中，至少一个裂解位点可由癌细胞表达的酶裂解。举例来说，已知的是癌细胞会表达某些酶，诸如蛋白酶。非限制性地举例来说，组织蛋白酶B裂解FR、FK、VA和VR以及其他序列；组织蛋白酶D裂解PRSFFRLGK(SEQ ID NO:45)，ADAM28裂解KPAKFFRL(SEQ ID NO:1)、DPAKFFRL(SEQ ID NO:2)、KPMKFFRL(SEQ ID NO:3)和LPAKFFRL(SEQ IDNO:4)；并且MMP2裂解例如AIPVSLR(SEQ ID NO:46)、SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO:47)、HPVGLLAR(SEQ ID NO:48)、GPLGVRGK(SEQ ID NO:49)和GPLGLWAQ(SEQ ID NO:50)。还可采用表1或表2中所列的其他裂解位点。蛋白酶裂解位点和与癌症相关的蛋白酶在本领域中是熟知的。Oncomine(www.oncomine.org)是一个在线癌症基因表达数据库，因此当TWICE的剂用于治疗癌症时，熟练人士可搜索Oncomine数据库以鉴定将适于治疗给定癌症类型的特定蛋白酶裂解位点(或两个蛋白酶裂解位点)。替代性数据库包括欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatic Institute)(www.ebi.ac.uk)，特别是(www.ebi.ac.uk/gxa)。蛋白酶数据库包括ExPASy Peptide Cutter(www.ca.expasy.org/tools/peptidecutter)。
在一些实施方案中，蛋白酶由肿瘤微环境中的非癌细胞诸如肿瘤相关巨噬细胞或成纤维细胞表达。
在一些实施方案中，一个或多个可裂解接头的蛋白酶裂解位点由共定位的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，蛋白酶通过靶向部分来共定位至癌症，所述靶向部分结合由癌症表达的肿瘤抗原，并且与第一组分或第二组分中的靶向部分相同或不同。在一些实施方案中，蛋白酶通过靶向部分来共定位至癌症，所述靶向部分结合由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原。
可裂解接头中的裂解位点可起从补充性结合结构域和/或免疫细胞结合结构域释放二聚化结构域的作用。裂解位点可起在非所要细胞的微环境中从第一和/或免疫细胞衔接结构域释放补充性结合结构域和/或免疫细胞结合结构域的作用。
在一些实施方案中，使二聚化结构域连接于免疫细胞结合结构域或补充性结合结构域的第一可裂解接头和/或第二可裂解接头中的蛋白酶裂解位点由蛋白酶裂解，所述蛋白酶由癌症表达，或通过结合由癌症表达的肿瘤抗原的靶向部分来共定位至癌症。
J.补充性结合结构域与免疫细胞结合结构域的结合
在一些实施方案中，第一补充性结合结构域是第一免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第一免疫细胞结合结构域不结合于所述第一补充性结构域，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合第二免疫细胞结合结构域。
在一些实施方案中，第二补充性结合结构域是第二免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第二免疫细胞结合结构域不结合于所述第二补充性结构域，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合于第一免疫细胞结合结构域。
当补充性结合结构域从免疫细胞结合结构域解离并且与配对的补充性结构域缔合时，或当免疫细胞结合结构域从补充性结合结构域解离并且与配对的免疫细胞结合结构域缔合时，这可被称为结构域交换。在这个结构域交换事件中，结构域从不匹配构型变动成活性和配对构型。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在不结合于第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域时能够形成Fv。在一些实施方案中，第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在不结合于第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域时能够形成Fv。
在一些实施方案中，第一组分和第二组分包含二聚化结构域以促进单一组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域的缔合。在一些实施方案中，二聚化结构域接头中可裂解接头的裂解允许在癌细胞或它的微环境处达成单一组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域的解离。在一些实施方案中，第一组分和第二组分不包含二聚化结构域。
K.通过惰性结合配偶体进行的掩蔽
在一些实施方案中，TWICE包含惰性结合配偶体以掩蔽第一免疫细胞结合结构域和/或第二免疫细胞结合结构域。在一些实施方案中，仅第一免疫细胞结合结构域是经掩蔽的。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域与第二免疫细胞结合结构域两者均是经掩蔽的。
举例来说，在一些实施方案中，惰性结合配偶体是包含补充性功能性结构域的那些TWICE的组分，所述补充性功能性结构域诸如图5和章节G中所述的那些。
在一些实施方案中，包含补充性功能性结构域的第一组分和/或第二组分包含惰性结合配偶体。
在一些实施方案中，第一惰性结合配偶体结合第一免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合第二免疫细胞结合结构域。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域是VH结构域，并且惰性结合配偶体是VL结构域。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域是VL结构域，并且惰性结合配偶体是VH结构域。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点分隔第一免疫细胞结合结构域和第一惰性结合配偶体。在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从免疫细胞结合结构域释放惰性结合配偶体。
在一些实施方案中，第二惰性结合配偶体结合第二免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合第一免疫细胞结合结构域。
在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域是VH结构域，并且惰性结合配偶体是VL结构域。在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域是VL结构域，并且惰性结合配偶体是VH结构域。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点分隔第二免疫细胞结合结构域和第二惰性结合配偶体。在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从免疫细胞结合结构域释放惰性结合配偶体。
在一些实施方案中，蛋白酶由癌症表达。在一些实施方案中，蛋白酶由肿瘤微环境中的细胞诸如TAF或TAM表达。
在一些实施方案中，蛋白酶通过是抗体或抗原结合片段的靶向部分来共定位至癌症，所述靶向部分结合(a)由癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或(b)结合由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原。
L.制备方法
如本文所述的不同TWICE可使用遗传工程改造技术制备。具体来说，可在适合宿主中表达一种或两种核酸以产生TWICE或它的组分。举例来说，可制备包含编码TWICE的核酸序列的载体，所述TWICE包括它的所有组成部分和接头，并且那个载体可用于转化适当宿主细胞(或单个载体可用于单独表达每个组分)。
视宿主的性质和将核酸引入至宿主中的方式，以及需要的是游离型维持还是整合而定，还可在载体中使用各种调控元件。
还可采用化学连接技术，诸如使用顺丁烯二酰亚胺或SMCC接头。
在其中靶向部分是适体的情况下，本领域普通技术人员将了解如何使适体缀合于蛋白质，即免疫细胞结合结构域或补充性结合结构域。适体可使用硫醇连接或其他标准缀合化学加以缀合。可使顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺或SH基团附加于适体以使它连接于免疫细胞结合结构域或补充性结合结构域。
II.药物组合物
TWICE可用作药物组合物。因此，它们可连同药学上可接受的载体一起制备。如果需要胃肠外施用，那么举例来说，TWICE可提供在无菌无热原注射用水或无菌无热原盐水或可为胃肠外施用所接受的其他形式中。或者，TWICE可以冻干形式提供以在添加无菌液体载体下再混悬。如果呈单独形式，那么TWICE可以单一药物组合物形式或以两种药物组合物形式提供。
III.使用TWICE的方法
本文所述的TWICE可用于治疗癌症的方法中，所述方法包括将包含至少第一组分和第二组分的TWICE施用至患者，如所述组分中的每一者已在以上各种实施方案中详细描述。
另外，本文所述的剂还可用于靶向患者对癌细胞的自身免疫应答的方法中，所述方法包括将TWICE施用至患者。
在一些实施方案中，本文所述的TWICE可用于使免疫细胞靶向至表达结合第一靶向部分与第二靶向部分两者的肿瘤抗原的癌症的方法中。在一些实施方案中，免疫细胞是表达CD3或TCR的T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的TWICE可用于使免疫细胞靶向至表达两种肿瘤抗原的癌症的方法中，其中一种肿瘤抗原结合第一靶向部分，并且一种肿瘤抗原结合第二靶向部分。在一些实施方案中，免疫细胞是表达CD3或TCR的T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的TWICE可用于将细胞因子递送至患者的免疫细胞的方法中。在一些实施方案中，TWICE的第一补充性功能性结构域和/或第二补充性功能性结构域包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员。
在一些实施方案中，患者患有癌症或具有认定的恶化前状态。在一些实施方案中，患者患有不可检测的癌症，但处于显现癌症的高风险下，包括具有与增加的癌症风险相关的突变。在一些实施方案中，处于显现癌症的高风险下的患者患有具有高转化风险的恶变前肿瘤。在一些实施方案中，处于显现癌症的高风险下的患者具有与高风险相关的遗传概况。在一些实施方案中，基于循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞的存在来确定患者中癌症或恶化前状态的存在。在一些实施方案中，治疗是抢先性的或防治性的。在一些实施方案中，治疗减缓或阻止癌症的发生或复发。
施用至患者的剂的量可由患者的医师选择以便提供有效治疗所论述的疾患的量。TWICE的第一组分和第二组分可于同一制剂中施用，或于两种不同制剂中在充分接近以在患者中具有活性的时期内施用。
接受治疗的患者可为人。患者可为灵长类动物或任何哺乳动物。或者，患者可为动物，诸如驯化动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如实验室啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或兔)、或在农业中重要的动物(诸如马、牛、绵羊或山羊)。
癌症可为实体或非实体恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症可为实体肿瘤，其中所述实体肿瘤不是淋巴瘤。癌症可为任何癌症，诸如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、淋巴组织增生性病症、骨髓发育不良病症、骨髓增生性疾病以及恶变前疾病或适于治疗的任何其他癌症。
在一些实施方案中，本领域技术人员可在启动治疗之前评估肿瘤。
举例来说，本领域技术人员可评估肿瘤中浸润性T细胞的存在。在一些实施方案中，治疗方法包括在启动治疗之前确认肿瘤中T细胞的存在。在一些实施方案中，患者将患有伴有T细胞浸润的实体肿瘤。肿瘤样品可关于T细胞标志物加以染色，并且使用成像技术显示肿瘤中T细胞浸润的存在，并且任选地显示浓度。
在一些实施方案中，治疗方法包括在启动治疗之前确认肿瘤抗原的存在。在一些实施方案中，治疗方法包括在启动治疗之前评估肿瘤抗原的浓度。举例来说，本领域技术人员可基于由肿瘤过度表达的抗原的概况来选择肿瘤抗原或选择患者以进行治疗。本领域技术人员还可通过选择过度表达特定抗原的患者，基于他们的抗原表达概况来选择患者以用TWICE治疗。在一些实施方案中，这些肿瘤抗原是细胞表面肿瘤抗原。肿瘤样品可关于目标抗原加以染色以显示肿瘤抗原的存在，并且任选地显示浓度。表达下限也可使用用特定TWICE进行的体外T细胞活化测定来确定。这些方法允许研究者确认患者的肿瘤具有适于TWICE靶向至肿瘤微环境的抗原。
在一些实施方案中，治疗方法包括(i)确认肿瘤中T细胞的存在；(ii)确认一种或多种肿瘤抗原的存在，以及/或者(iii)评估肿瘤抗原的浓度。在一些实施方案中，一种或多种结合第一靶向部分和第二靶向部分的肿瘤抗原的表达在足够高的水平下表达以致使TWICE的两个组分紧密邻近。
在一些实施方案中，生物标志的存在用于选择患者以接受TWICE。广泛多种肿瘤标志在本领域中是已知的，诸如在www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-marker s-fact-sheet处所述的那些。在一些实施方案中，肿瘤标志是ALK基因重排或过度表达；α-胎蛋白；β-2-微球蛋白；β-人绒毛膜促性腺激素；BRCA1或BRCA2基因突变；BCR-ABL融合基因(费城染色体(Philadelphia chromosome))；BRAF V600突变；C-kit/CD117；CA15-3/CA27.29；CA19-9；CA-125；降血钙素(calcitonin)；癌胚抗原(CEA)；CD20；嗜铬粒蛋白A(chromogranin A，CgA)；染色体3、7、17或9p21；上皮来源的循环肿瘤细胞
Figure BDA0003114676680001021
细胞角蛋白(cytokeratin)片段21-1；EGFR基因突变分析；雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)；纤维蛋白/纤维蛋白原(fibrin/fibrinogen)；HE4；HER2/neu基因扩增或蛋白质过度表达；免疫球蛋白；KRAS基因突变分析；乳酸脱氢酶；神经元特异性烯醇化酶(NSE)；核基质蛋白22；程序化死亡配体1(PD-L1)；前列腺特异性抗原(PSA)；甲状腺球蛋白；尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)；纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)；5蛋白质特征
Figure BDA0003114676680001022
21基因特征(Oncotype
Figure BDA0003114676680001024
)；或70基因特征
Figure BDA0003114676680001023
TWICE可单独或与其他形式的疗法联合施用，所述其他形式的疗法包括手术、放射、传统化学疗法、或其他免疫疗法。
在一些实施方案中，其他免疫疗法可包括用免疫细胞因子或细胞因子融合物进行的单独治疗。细胞因子是指由身体天然产生以活化和调控免疫系统的细胞信号传导蛋白。细胞因子融合物是指包含细胞因子的全部或一部分的经工程改造分子。举例来说，细胞因子融合物可包含细胞因子的连接于允许靶向至肿瘤的抗体的全部或一部分，诸如达尔白介素(Darleukin)(参见Zegers等人(2015)Clin.Cancer Res.,21,1151-60)、替白介素(Teleukin)(参见WO2018087172)。
在一些实施方案中，其他免疫疗法是癌症治疗疫苗接种。在一些实施方案中，癌症治疗疫苗接种加强身体的天然防御以对抗癌症。这些可针对共有的肿瘤抗原(诸如E6、E7、NY-ESO、MUC1或HER2)或针对个性化突变新抗原。
IV.实施方案
以下编号条目提供了如本文所述的实施方案，但此处叙述的实施方案不具有限制性。
条目1.一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；和当结合第二补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第一补充性结合结构域，其中所述第二补充性结合结构域不是所述第一组分的一部分，当所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第一补充性结合结构域是VL结构域，当所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第一补充性结合结构域是VH结构域，并且其中所述第一补充性结合结构域是所述第一免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第一免疫细胞结合结构域不结合于所述第一补充性结构域，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域；以及第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含第二靶向部分；当结合第一免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VH，并且其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VL；和当结合所述第一补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第二补充性结合结构域，其中当所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第二补充性结合结构域是VL结构域，当所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第二补充性结合结构域是VH结构域，并且其中所述第二补充性结合结构域是所述第二免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第二免疫细胞结合结构域不结合于所述第二补充性结构域，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合所述第一免疫细胞结合结构域。
条目2.如条目1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于所述第一补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第一免疫细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第一补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
条目3.如条目1-2中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中第二T细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于所述第二补充性结合结构域，其中所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第二T细胞结合结构域；所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第二补充性结合结构域；并且所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
条目4.如条目2-3中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头是可裂解接头。
条目5.如条目2-4中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头是相同的。
条目6.如条目2-4中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头是不同的。
条目7.如条目2-6中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头在长度方面是5至30个氨基酸。
条目8.如条目2-6中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头在长度方面是8至16个氨基酸。
条目9.如条目2-8中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一可裂解接头和/或第二可裂解接头的蛋白酶裂解位点由所述癌症或肿瘤微环境细胞表达的蛋白酶裂解。
条目10.如条目2-9中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一可裂解接头和/或第二可裂解接头的蛋白酶裂解位点由通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症的蛋白酶裂解，所述靶向部分结合由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与所述第一组分或所述第二组分中的至少一者中的靶向部分相同或不同。
条目11.如条目1-10中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一二聚化结构域和第二二聚化结构域均是亮氨酸拉链；免疫球蛋白结构域；或T细胞受体(TCR)结构域。
条目12.如条目11所述的试剂盒或组合物，其中所述免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白恒定结构域。
条目13.如条目12所述的试剂盒或组合物，其中所述免疫球蛋白恒定结构域包含CH1/CL、CH2、CH3或CH4。
条目14.如条目11所述的试剂盒或组合物，其中所述TCR结构域包含TCR恒定结构域。
条目15.如条目1-14中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分中的所述二聚化结构域与所述第二组分中的所述二聚化结构域相同。
条目16.如条目1-14中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分中的所述二聚化结构域不同于所述第二组分中的所述二聚化结构域。
条目17.如条目1-16中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合所述癌症。
条目18.如条目17所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合免疫检查点分子、RANK或RANKL或细胞死亡诱导抗原。
条目19.如条目18所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合免疫检查点分子。
条目20.如条目19所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合PD-L1。
条目21.如条目20所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含阿替利珠单抗、度伐利尤单抗或阿维利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目22.如条目19所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD73。
条目23.如条目22所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含CPI-006或MEDI9447的VH和/或VL的全部或一部分。
条目24.如条目18所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合RANK。
条目25.如条目18所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合RANKL。
条目26.如条目25所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含地舒单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目27.如条目18所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合细胞死亡诱导抗原。
条目28.如条目27所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合Fas/CD95/Apo1、TNFR1/p55/CD120a、DR3/Apo3/WSL-1/TRAMP/LARD、TRAIL-R1/DR4、DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER、DR6或CAR1。
条目29.如条目28所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合TRAIL-R1/DR4。
条目30.如条目29所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含马帕木单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目31.如条目28所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合DR5/Apo2/TRAIL-R2/TRICK2/KILLER。
条目32.如条目31所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含可那木单抗(AMG655)、来沙木单抗、替加珠单抗(CS1008)或卓齐妥单抗(PRO95780)的VH和/或VL的全部或一部分。
条目33.如条目1-16中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合与细胞外基质相关的分子。
条目34.如条目1-16中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
条目35.如条目34所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞。
条目36.如条目35所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
条目37.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD3。
条目38.如条目37所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含莫罗莫那、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、福拉利尤单抗、SP34或博纳吐单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目39.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合PD-1。
条目40.如条目39所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含帕博利珠单抗或纳武利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目41.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CTLA-4。
条目42.如条目41所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伊匹木单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目43.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合TIM-3。
条目44.如条目43所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含TSR-022或Sym023的VH和/或VL的全部或一部分。
条目45.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合LAG-3。
条目46.如条目45所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含BMS-986016的VH和/或VL的全部或一部分。
条目47.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合KIR。
条目48.如条目47所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含利瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目49.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD28。
条目50.如条目49所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含西拉利珠单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目51.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD137。
条目52.如条目51所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含乌托米利尤单抗或乌瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目53.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合OX40。
条目54.如条目53所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含PF-04518600或BMS986178的VH和/或VL的全部或一部分。
条目55.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合CD27。
条目56.如条目55所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含伐立利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目57.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合GITR(TNFRSF18)。
条目58.如条目57所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含GWN323或BMS-986156的VH和/或VL的全部或一部分。
条目59.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在一起配对时能够结合TIGIT。
条目60.如条目59所述的试剂盒或组合物，其中第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含OMP-313M32、MTIG7192A、BMS-986207或MK-7684的VH和/或VL的全部或一部分。
条目61.如条目36所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在结合在一起时能够结合ICOS。
条目62.如条目61所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含JTX-2011的VH和/或VL的全部或一部分。
条目63.如条目34所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合巨噬细胞。
条目64.如条目63所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CSF1R。
条目65.如条目65所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含埃马妥珠单抗或IMC-CS4的VH和/或VL的全部或一部分。
条目66.如条目63所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD40。
条目67.如条目66所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
条目68.如条目34所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞。
条目69.如条目68所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。
条目70.如条目69所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域包含NTM-1633或AFM13的VH和/或VL的全部或一部分。
条目71.如条目1-70中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同抗原。
条目72.如条目1-70中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合相同细胞上的不同抗原。
条目73.如条目1-70中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时，以及所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时，能够结合不同细胞。
条目74.如条目1-73中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在不结合于所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域时能够形成Fv。
条目75.如条目1-74中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和第二补充性结合结构域在不结合于所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域时能够形成Fv。
条目76.一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；所述第一免疫细胞结合结构域的第一惰性结合配偶体，其中所述第一惰性结合配偶体结合所述第一免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；分隔所述第一免疫细胞结合结构域和所述第一惰性结合配偶体的蛋白酶裂解位点，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶由所述癌症或肿瘤微环境细胞表达；或通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症，所述靶向部分结合(a)由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的所述第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原；和能够进行免疫细胞结合的第一补充性功能性结构域，以及第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含第二靶向部分；第二免疫细胞结合结构域；和任选的能够进行免疫细胞结合的第二补充性功能性结构域。
条目77.如条目76所述的试剂盒或组合物，其中所述第二组分包含补充性功能性结构域。
条目78.如条目76-77中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分和/或第二组分的所述补充性功能性结构域包含受体的配体。
条目79.如条目78所述的试剂盒或组合物，其中所述补充性功能性结构域是TGF-β家族的成员的潜活形式。
条目80.如条目78所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分和/或第二组分的所述补充性功能性结构域包含细胞因子。
条目81.如条目78所述的试剂盒或组合物，其中所述细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员。
条目82.如条目80所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分和/或第二组分的所述补充性功能性结构域包含减弱化细胞因子。
条目83.如条目82所述的试剂盒或组合物，其中所述减弱化细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员的变体。
条目84.如条目76-83中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第二组分还包含所述第二免疫细胞结合结构域的第二惰性结合配偶体，其中所述第二惰性结合配偶体结合所述第二免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合所述第一免疫细胞结合结构域，其中如果所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；并且此外，其中蛋白酶裂解位点分隔所述第二免疫细胞结合结构域和所述第二惰性结合配偶体，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶由所述癌症表达；或通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症，所述靶向部分结合(a)由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的所述第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原。
条目85.如条目1-84中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一组分不共价结合于所述第二组分。
条目86.一种构成条目1-85中的任一者所述的试剂盒或组合物的分子，其中所述第一组分共价结合于所述第二组分。
条目87.如条目86所述的单一分子，其中所述第一组分通过可裂解接头共价结合于所述第二组分。
条目88.如条目1-87中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
条目89.如条目88所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞。
条目90.如条目89所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、T细胞受体、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT、或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
条目91.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3。
条目92.如条目91所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含莫罗莫那、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、福拉利尤单抗、SP34或博纳吐单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目93.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合所述T细胞受体。
条目94.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合PD-1。
条目95.如条目94所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含帕博利珠单抗或纳武利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目96.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CTLA-4。
条目97.如条目96所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含伊匹木单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目98.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合TIM-3。
条目99.如条目98所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含TSR-022或Sym023的VH和/或VL的全部或一部分。
条目100.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合LAG-3。
条目101.如条目100所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含BMS-986016的VH和/或VL的全部或一部分。
条目102.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合KIR。
条目103.如条目102所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含利瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目104.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD28。
条目105.如条目104所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含西拉利珠单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目106.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD137。
条目107.如条目106所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含乌托米利尤单抗或乌瑞利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目108.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合OX40。
条目109.如条目108所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含PF-04518600或BMS 986178的VH和/或VL的全部或一部分。
条目110.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合CD27。
条目111.如条目110所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含伐立利尤单抗的VH和/或VL的全部或一部分。
条目112.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合GITR(TNFRSF18)。
条目113.如条目112所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含GWN323或BMS-986156的VH和/或VL的全部或一部分。
条目114.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合TIGIT。
条目115.如条目114所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含OMP-313M32、MTIG7192A、BMS-986207或MK-7684的VH和/或VL的全部或一部分。
条目116.如条目90所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域在结合在一起时能够结合ICOS。
条目117.如条目116所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含JTX-2011的VH和/或VL的全部或一部分。
条目118.如条目88所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合巨噬细胞。
条目119.如条目118所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CSF1R。
条目120.如条目119所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含埃马妥珠单抗或IMC-CS4的VH和/或VL的全部或一部分。
条目121.如条目120所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD40。
条目122.如条目121所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含CP-870,893的VH和/或VL的全部或一部分。
条目123.如条目88所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞。
条目124.如条目123所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。
条目125.如条目124所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和第二免疫细胞结合结构域包含NTM-1633或AFM13的VH和/或VL的全部或一部分。
条目126.如条目1-125中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和第二靶向部分是不同的。
条目127.如条目1-125中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和第二靶向部分是相同的。
条目128.如条目1-127中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。
条目129.如条目1-128中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含DNA适体、RNA适体、白蛋白、载脂蛋白、纤连蛋白、锚蛋白、fynomer、Obody、DARPin、knotin、亲合多聚体、atrimer、anti-callin、affilin、亲和体、双环肽、cys结、FN3(adnectin、centryrin、pronectin或TN3)或库尼茨结构域。
条目130.如条目1-129中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第二靶向部分结合由所述癌症表达的肿瘤抗原。
条目131.如条目128所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含结合以下的抗体或其抗原结合片段：α4-整合素；A33；ACVRL 1/ALK1；ADAM17；ALK；APRIL；BCMA；C242；CA125；钙粘着蛋白-19；CAIX；CanAg；碳酸酐酶IX；CCN1；CCR4；CD123；CD133；CD137(4-1BB)；CD138/粘结蛋白聚糖1；CD19；CD2；CD20；CD22；CD30；CD33；CD37；CD38；CD4；CD40；CD44；CD45；CD48；CD5；CD52；CD56；CD59；CD70；CD70b；CD71；CD74；CD79b；CD80；CD86；CD98；CEA；CEACAM；CEACAM1；CK8；c-Kit；CLDN1；CLDN18；CLDN18.2；CLDN6；c-met/HGFR；c-RET；Cripto；CTLA-4；CXCR4；DKK-1；DLL3；DLL4；TRAIL-R2/DR5；DRS；EGFL7；EGFR；EGFRvIII；内皮糖蛋白；ENPP3；EpCAM；EphA2；上皮唾蛋白；FAP；FGFR1；FGFR2；FGFR3；FGFR4；纤连蛋白额外结构域B；FLT-3；flt4；叶酸受体1；GCC；GD2；GD3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖；GM3；GPNMB；GPR49；GRP78；Her2/Neu；HER3/ERBB3；HLA-DR；ICAM-1；IGF-1R；IGFR；IL-3Ra；整合素α5β1；整合素α6β4；整合素αV；整合素αVβ3；Lewis Y；Lewis y/b抗原；LFL2；LIV-1；Ly6E；MCP-1；间皮素；MMP-9；MUC1；MUC18；MUC5A；MUC5AC；肌抑素；NaPi2b；神经纤毛蛋白1；NGcGM3；NRP1；P-钙粘着蛋白；PCLA；PD-1；PDGFRa；PD-L1；PD-L2；磷脂酰丝氨酸；PIVKA-II；PLVAP；PRLR；胃泌素原；PSCA；PSMA；RANKL；RG1；Siglec-15；SLAMF6；SLAMF7；SLC44A4、STEAP-1；TACSTD-2；肌腱蛋白C；TPBG；TRAIL-R1/DR4；TROP-2；TWEAKR；TYRP1；VANGL2；VEGF；VEGF-C；VEGFR-2；或VEGF-R2。
条目132.如条目128所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含是抗α4-整合素抗体；抗CD137抗体；抗CCR4抗体；抗CD123抗体；抗CD133抗体；抗CD138抗体；抗CD19抗体；抗CD20抗体；抗CD22抗体；抗CD33抗体；抗CD38抗体；抗CD40抗体；抗CD49d抗体；抗CD52抗体；抗CD70抗体；抗CD74抗体；抗CD79b抗体；抗CD80抗体；抗CEA抗体；抗cMet抗体；抗Cripto抗体；抗CTLA-4抗体；抗DLL3抗体；抗TRAIL-2/DR5抗体；抗E-钙粘着蛋白抗体；抗内皮糖蛋白抗体；抗EpCAM抗体；抗表皮生长因子受体抗体；抗FGFR3抗体；抗纤连蛋白额外结构域B抗体；抗叶酸受体1抗体；抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体；抗gp95/97抗体；抗Her2抗体；抗IGF-1R抗体；抗IL-13R抗体；抗IL-4抗体；抗IL-6抗体；抗MMP-9抗体；抗MUC1抗体；抗粘蛋白核心蛋白抗体；抗NGcGM3抗体；抗P-钙粘着蛋白抗体；抗PD-L1抗体；抗p-糖蛋白抗体；抗PSCA抗体；抗PSMA抗体；抗SLAMF7抗体；抗TRAIL-R1/DR4抗体；抗转铁蛋白抗体；抗TROP-2抗体；或抗VEGF抗体的抗体或其抗原结合片段。
条目133.如条目128所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含阿仑珠单抗、安德卡利昔单抗、阿替利珠单抗、阿维利尤单抗、BCD-100、贝伐珠单抗、BGB-A317、博纳吐单抗、布妥昔单抗、BU59、卡瑞利珠单抗、卡罗妥昔单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、德帕妥昔珠单抗、迪努妥昔单抗、DS-8201、度伐利尤单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、G544、吉妥珠单抗、格巴妥木单抗、GP1.4、hp67.6、IBI308、异贝莫单抗、伊诺妥珠单抗、伊匹木单抗、伊沙妥昔单抗、L19IL2、L19TNF、马格妥昔单抗、米维妥昔单抗、莫加木珠单抗、莫西妥莫单抗、那他珠单抗、奈昔木单抗、纳武利尤单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉妥单抗、奥珠单抗、帕尼单抗、PDR001、帕博利珠单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、罗伐匹妥珠单抗、赛妥珠单抗、SM3、TAK-164、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗、乌妥昔单抗、乌瑞利尤单抗、乌托米利尤单抗、XMAB-5574或佐尔贝妥昔单抗。
条目134.如条目1-127中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。
条目135.如条目134所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的全长序列。
条目136.如条目134所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD-1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的截短形式、类似物、变体或衍生物。
条目137.如条目1-134中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分结合IL-2受体、IL-4、IL-6、黑素细胞刺激激素受体(MSH受体)、转铁蛋白受体(TR)、叶酸受体1(FOLR)、叶酸羟化酶(FOLH1)、EGF受体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR或CD40L。
条目138.如条目1-129中的任一者所述的试剂盒或组合物，其中所述第二靶向部分结合由肿瘤微环境细胞表达的抗原。
条目139.如条目138所述的试剂盒或组合物，其中所述肿瘤微环境细胞是成纤维细胞或巨噬细胞。
条目140.如条目139所述的试剂盒或组合物，其中由成纤维细胞表达的所述抗原是成纤维细胞活化蛋白。
条目141.如条目139所述的试剂盒或组合物，其中由巨噬细胞表达的所述抗原是MAC-1/CD11b或sideroflexin 3。
条目142.一种治疗患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的癌症的方法，所述方法包括将条目1-141中的任一者所述的组合物施用至所述患者。
条目143.如条目142所述的方法，其中在施用所述组合物之前评估所述癌症中浸润性免疫细胞的存在。
条目144.如条目142-143中的任一者所述的方法，在施用所述组合物之前评估所述癌症中肿瘤抗原的存在。
条目145.如条目142-144中的任一者所述的方法，其中所述第一靶向部分和第二靶向部分结合相同抗原。
条目146.如条目142-144中的任一者所述的方法，其中所述第一靶向部分和第二靶向部分结合不同抗原。
条目147.如条目142-146中的任一者所述的方法，其中表达结合所述第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的所述癌症是以下中的任一者：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、淋巴组织增生性病症、骨髓发育不良病症、骨髓增生性疾病或恶变前疾病。
条目148.一种使免疫细胞靶向至患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分两者的肿瘤抗原的癌症的方法，所述方法包括将条目1-141中的任一者所述的组合物施用至所述患者。
条目149.一种使免疫细胞靶向至患者中的表达两种肿瘤抗原的癌症的方法，其中一种肿瘤抗原结合第一靶向部分，并且一种肿瘤抗原结合第二靶向部分，所述方法包括将条目1-141中的任一者所述的组合物施用至所述患者。
条目150.一种将细胞因子递送至患者的免疫细胞的方法，所述方法包括将条目76-147中的任一者所述的组合物施用至所述患者，其中TWICE的所述第一补充性功能性结构域和/或第二补充性功能性结构域包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、或TNF超家族的成员。
V.支持表格
以下支持表格已在以上申请中提及。
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实施例
实施例1.阻断免疫细胞中两个抑制性路径的TWICE
TWICE可被开发来作用于一定范围的癌症和免疫细胞。这些实例用于显示本领域技术人员可如何产生具有特定功能的TWICE。
举例来说，可产生具有两种检查点抑制性抗体的协同组合的TWICE。
作为第一步骤，本领域技术人员将首先选择适合于给定癌症的靶向部分。靶向部分可基于关于给定类型的癌症的文献以及某些抗原的普遍性来选择。或者，可评估由特定患者中的癌症表达的抗原。举例来说，利妥昔单抗(抗CD20抗体)可用于靶向CD20阳性淋巴瘤，并且西妥昔单抗(抗EGFR抗体)可用于靶向某些实体肿瘤。
TWICE可允许使用两个靶向部分。本领域技术人员可选择两个靶向部分以使第一组分与第二组分两者均靶向至给定癌症。使用用于靶向一个组分的CA125以及使用用以靶向另一组分的EpCAM，可靶向卵巢癌。
在选择适当靶向部分之后，本领域技术人员可确定什么类型的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域在配对时可能具有最大治疗功效。
图1显示TWICE可如何采用两个针对癌细胞的靶向结构域以允许通过免疫细胞上的两个信号传导路径来达成活化。
为增强抗肿瘤免疫应答，可需要产生抑制两种检查点分子，因此相较于单独抑制任一检查点分子，使抗癌免疫应答加强的TWICE。
举例来说，可产生TWICE，其中第一组分包含伊匹木单抗(抗CTLA4抗体)的VH作为免疫细胞结合结构域，以及纳武利尤单抗(抗PD-1抗体)的VL作为补充性结合结构域。于是，这个TWICE的第二组分可包含伊匹木单抗(抗CTLA4抗体)的VL作为免疫细胞结合结构域，以及纳武利尤单抗(抗PD-1抗体)的VH作为补充性结合结构域。TWICE的功能不受哪个组分具有给定抗体的VH或VL影响，只要一个组分具有VH，并且另一组分具有VL即可。
通过以这个方式产生TWICE，TWICE的第一组分与第二组分两者均可被靶向至癌症。在癌症部位处，伊匹木单抗的VH和VL以及纳武利尤单抗的VH和VL可基于第一组分和第二组分的紧密邻近而配对。这将允许TWICE在结构域配对之后阻断两种免疫检查点，并且导致稳健免疫细胞活化。
实施例2.刺激免疫细胞中的两个路径的TWICE
可开发(当免疫细胞结合结构域以及补充性结合结构域配对时)刺激免疫细胞中的两个路径以介导稳健抗癌作用的TWICE。举例来说，癌症可为表达EGFR的乳腺癌。
对于这些实施例中的任一者，第二靶向部分都可被选择来靶向至肿瘤微环境细胞。在这个实施例中，第二靶向部分可被选择来靶向至肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。因此，尽管第一靶向部分(在第一组分中)可结合由肿瘤表达的抗原，但第二靶向部分(在第二组分中)可结合由TAM表达的抗原。对于靶向表达EGFR的乳腺癌，第一靶向部分可为西妥昔单抗，并且第二靶向部分可为MAC-1/CD11b。
图2概述其中第一组分被靶向至癌细胞，并且第二组分被靶向至非癌细胞(在这个实施例中是TAM)的TWICE。这个类型的TWICE也将仅在癌细胞紧密邻近于TAM时发生结构域配对。免疫细胞结合结构域的配对以及补充性结合结构域的配对可刺激免疫效应细胞上的2个路径。
举例来说，本领域技术人员可选择活化CD3e路径与CD137路径两者。为此，他/她可产生TWICE，其中第一组分包含SP34(抗CD3抗体)的VH和乌托米利尤单抗(抗CD137抗体)的VL，并且第二组分包含SP34(抗CD3抗体)的VL和乌托米利尤单抗(抗CD137抗体)的VH。
通过以这个方式产生TWICE，TWICE的第一组分与第二组分两者均可被靶向至紧密邻近于例如在肿瘤基质处的TAM的癌细胞。SP34的VH和VL以及乌托米利尤单抗的VH和VL可接着基于第一组分和第二组分的紧密邻近而配对。这将允许TWICE在结构域配对之后对T细胞提供两种正性刺激。
以与这个实施例或实施例1中所述的方式类似的方式，可产生TWICE以阻断抑制性检查点分子(例如通过配对的免疫细胞结合结构域)，并且对免疫系统提供正性刺激(例如通过配对的补充性结合结构域)。这些类型的构建体还可稳健活化抗癌免疫应答。
实施例3.在癌症部位处活化两种不同免疫细胞的TWICE
TWICE可组合对两种不同免疫效应细胞的活性。举例来说，TWICE可被产生来介导T细胞活化和巨噬细胞活化。
针对由癌细胞表达的抗原的靶向部分可如实施例1中所概述加以选择。在这个特定实例中，两个靶向部分均可结合在乳腺癌细胞上的HER2。两个靶向部分可为相同的，或结合HER2上的不同表位。于是，如图3中所示，TWICE的配对的免疫细胞结合结构域可结合第一效应细胞(在这个情况下是T细胞)，并且配对的补充性结合结构域可结合第二效应细胞(在这个情况下是巨噬细胞)。
本领域技术人员可选择活化T细胞中的CD3与巨噬细胞中的CD40路径两者。为此，他/她可产生TWICE，其中第一组分包含SP34(抗CD3抗体)的VH和CP-870,893(抗CD40抗体)的VL，并且第二组分包含SP34(抗CD3抗体)的VL和CP-870,893(抗CD40抗体)的VH。
通过以这个方式产生TWICE，第一组分和第二组分将被靶向至癌细胞。在癌细胞处，SP34的VH和VL以及CP-870,893的VH和VL可基于第一组分和第二组分的紧密邻近而配对。这将允许TWICE在结构域配对之后在癌症部位处刺激T细胞与巨噬细胞两者。
以类似方式，TWICE可被设计来在癌症部位处活化T细胞和NK细胞的组合。
实施例4.调节免疫细胞和癌细胞的TWICE
TWICE还可组合对免疫细胞以及直接对癌细胞的活性。举例来说，TWICE可被产生来介导T细胞活化，并且阻断由癌细胞表达的免疫检查点分子。
两个针对由癌细胞表达的单一抗原的靶向部分可如实施例3中所概述加以选择，所述单一抗原诸如是乳腺癌细胞上的HER2。于是，如图4中所示，TWICE的配对的免疫细胞结合结构域可结合效应细胞(在这个情况下是T细胞)，并且配对的补充性结合结构域可结合癌症。
本领域技术人员可选择活化T细胞中的CD3，并且阻断癌细胞中的PD-L1。为此，他/她可产生TWICE，其中第一组分包含SP34(抗CD3抗体)的VH和阿维利尤单抗(抗PD-L1抗体)的VL，并且第二组分包含SP34(抗CD3抗体)的VL和阿维利尤单抗(抗PD-L1抗体)的VH。
通过以这个方式产生TWICE，两个组分均将被靶向至癌细胞。在癌细胞处，SP34的VH和VL以及阿维利尤单抗的VH和VL可基于第一组分和第二组分的紧密邻近而配对。这将允许TWICE在结构域配对之后刺激肿瘤微环境中的T细胞，并且阻断由癌细胞表达的PD-L1介导的免疫抑制。
以类似方式，可设计结合癌细胞上的RANK或细胞死亡诱导抗原的TWICE。
举例来说，本领域技术人员可选择活化T细胞上的CD3，并且直接诱导癌细胞死亡。为此，他/她可产生TWICE，其中第一组分包含SP34(抗CD3抗体)的VH和马帕木单抗(抗TRAIL-R1/DR4死亡受体抗体)的VL，并且第二组分包含SP34(抗CD3抗体)的VL和马帕木单抗(抗TRAIL-R1/DR4抗体)的VH。这将允许TWICE在于癌细胞处进行结构域配对之后刺激T细胞，并且直接触发癌细胞死亡。
因此，TWICE可介导直接抗癌作用，并且刺激抗癌免疫应答。
实施例5.包含二聚化结构域的TWICE
在实施例1-4中所述的任何构建体中，TWICE还可包含二聚化结构域，如图6中所示。一对的一个二聚化结构域可连接于免疫细胞结合结构域，而这对的另一二聚化结构域可连接于补充性结合结构域。举例来说，每个组分可包含一对钮入孔二聚化序列。二聚化结构域中的一者或两者可通过可裂解接头(被称为二聚化结构域接头)诸如包含ADAM28裂解位点(SEQ ID NO:1)的接头加以连接。
以这个方式，每个组分的钮入孔二聚化结构域迫使单个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域的配对。在通过靶向部分来靶向至肿瘤微环境之后，连接一个或两个二聚化结构域的可裂解接头可被裂解，并且释放二聚化结构域。以这个方式，免疫细胞结合结构域和/或补充性结合结构域将仅在肿瘤微环境中变得可用于与它们的在另一组分中的相应结构域配对。
因此，二聚化结构域可用于迫使每个组分的免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域在处于肿瘤微环境处的所需作用部位的外部结合，并且阻断在肿瘤微环境的外部在组分之间的结构域配对。相反，在肿瘤微环境中，由蛋白酶对二聚化结构域接头的裂解可允许仅在肿瘤处产生结构域交换和活性。
可设计TWICE，其中两个组分均包含二聚化结构域，或其中仅一个组分包含二聚化结构域。
实施例6.包含补充性功能性结构域的TWICE
其他TWICE可包含当被靶向至癌细胞时具有活性的补充性功能性结构域，如图5中所示。在这个实施例中，第一组分包含减弱化IFN-α细胞因子(参见Pogue等人,PLoS ONE 11(9):e0162472(2016))。
第一组分与第二组分两者均可包含抗EPCAM scFv。第一组分可包含抗CD3E VH结构域，诸如SP34的VH结构域(即免疫细胞结合结构域)，所述抗CD3E VH结构域通过具有MMP2裂解位点(AIPVSLR；SEQ ID NO:46)的25聚体接头连接于来自甘特如单抗(gantenerumab)的惰性结合配偶体VL结构域。第二组分可包含抗CD3E VL结构域，诸如SP34的VL结构域(即免疫细胞结合结构域)，所述抗CD3E VL结构域通过具有MMP2裂解位点(AIPVSLR；SEQ IDNO:46)的25聚体接头连接于来自克隆α-MUC1-1抗体的惰性结合配偶体VH结构域。
以这个方式，除非由肿瘤相关蛋白酶MMP2裂解，否则第一组分和第二组分的免疫细胞结合结构域是经掩蔽的。当第一组分和第二组分被靶向至EPCAM阳性肿瘤时，由MMP2达成的裂解可介导惰性结合结构域(即惰性结合配偶体)的释放。以这个方式，SP34的VH和VL可在癌症部位处结合和活化T细胞。此外，通过EPCAM抗体使减弱化IFN-α靶向至癌细胞可导致直接抗癌作用。这个类型的TWICE可通过减弱化细胞因子介导抗癌作用，并且刺激抗癌免疫应答。
类似地，TWICE可采用IL-15或减弱化IL-2调节T细胞活化。
以类似方式，可设计在第一组分中包含其他减弱化细胞因子作为补充性功能性结构域的TWICE。还可设计在第一组分与第二组分两者中均包含补充性功能性结构域以达成累加作用的TWICE。
实施例7.包含各种二聚化结构域接头和各种二聚化结构域的TWICE
为构建TWICE分子的实例，使用明确确定的靶向癌细胞的抗EpCAM抗体。选择EpCAM抗体索利托单抗(Brischwein K等人Mol Immunol.43(8):1129-43(2006))，并且以包含两个链的抗原结合片段(Fab)的形式使用这个抗体，重链由重链可变结构域加上CH1结构域组成，并且轻链由轻链可变结构域和κ恒定结构域组成。
对于这些TWICE分子的初始测试，使用在长度方面是15个氨基酸的柔性接头，使抗CD3ε抗体SP34的VH融合于索利托单抗Fab的C末端，并且使抗PDL1抗体阿替利珠单抗的VL融合于索利托单抗Fab的轻链的C末端。
如图6中所示，TWICE分子可含有连接错误配对的可变结构域，并且除非TWICE在肿瘤微环境中以蛋白水解方式活化，否则阻止结构域交换的二聚化结构域。这个二聚化结构域可以异二聚化形式构建以增强在VH结构域与VL结构域之间高效形成异二聚体，并且避免形成同二聚体。若干异二聚化结构域已在文献中描述。为测试哪些异二聚化结构域适于工程改造TWICE，使用各种异二聚化结构域构建和表达了若干TWICE。
首先，使用如图7A中所示的卷曲螺旋异二聚化结构域构建了TWICE。卷曲螺旋也已被称为亮氨酸拉链。已被工程改造为酸性和碱性卷曲以形成异二聚体的卷曲螺旋结构域的序列列于US 20160002356A1中以及US 8877893 B2中。在本实例中，使TWICE分子的重链融合于碱性卷曲(SEQ ID NO:201)，并且使轻链融合于酸性卷曲(SEQ ID NO:202)。本领域普通技术人员将了解重链也可融合于酸性卷曲，并且轻链融合于碱性卷曲。
表12列出了包括在卷曲螺旋TWICE构建体中的二聚化结构域接头。这些二聚化结构域接头可含有可由蛋白酶裂解的序列。蛋白酶裂解将导致二聚化结构域与TWICE分子的其余部分的分离，此允许通过结构域交换达成在两个TWICE之间免疫细胞结合VH或VL结构域的互补。在表12中所列的实例中，列出了二聚化结构域接头的若干实例。在一些实例中，接头含有可在肿瘤微环境中由基质金属蛋白酶裂解的序列。在其他实例中，二聚化结构域接头含有可由因子Xa(FXa)裂解的蛋白酶位点，此可用于在体外人工活化TWICE分子。换句话说，因子Xa裂解位点在实例中用作蛋白酶裂解位点的代替物，因为因子Xa便于在实验室环境中使用。在表12中所列的一些实例中，一个TWICE分子的重链和轻链在它们的二聚化结构域接头中包含相同蛋白酶裂解序列，并且在其他实例中，一个TWICE分子的重链和轻链在它们的二聚化结构域接头中包含不同蛋白酶裂解序列。
在表12中所列的一些实例中，TWICE含有异二聚Fc作为二聚化结构域。在此处，WO2017106462A1中公开的赖氨酸重定位策略用于构建具有异Fc二聚化结构域的TWICE。表12显示用于TWICE分子TWICE191和TWICE192中的二聚化结构域接头。TWICE191包含SEQ IDNO:171的重链和SEQ ID NO:172的轻链，并且TWICE192包含SEQ ID NO:173的重链和SEQ IDNO:174的轻链。这些TWICE含有在重链的Fc中的突变S364K/K409L和在轻链的Fc中的K370S/F405K以促进在重链与轻链之间形成异Fc。用异Fc二聚化结构域工程改造TWICE使得能够结合新生儿Fc受体FcRn，此介导分子的再循环，并且延长它们的血清半衰期。这些TWICE实例还在Fc中含有N297Q突变，此产生效应子功能受损的无糖基化分子。
在另一实例中，Fab恒定结构域(CH1和CL)作为二聚化结构域用于构建TWICE分子。为允许还含有Fab作为癌症靶向部分的TWICE分子的重链和轻链的高效组装，将二聚化结构域CH1和CL构建成交换Fab(图7A)。交换Fab是一种通过交换Fab中的一者中的恒定结构域以致VH连接于CL，并且VL连接于CH1来使得双特异性抗体构建体的两个轻链能够高效组装的策略(Schaefer W等人,Proc Natl Acad Sci U S A.108(27):11187-92(2011))。在含有交换Fab二聚化结构域的TWICE构建体(TWICE200和TWICE204，参见表13)中，免疫细胞衔接物的VH以二聚化结构域接头序列连接于CL结构域，并且补充性衔接物的VL以二聚化结构域接头序列连接于CH1结构域。因子Xa蛋白酶裂解序列(Ile-Glu-Gly-Arg)包括在所有二聚化结构域接头中。TWICE200的完全序列包含SEQ ID NO:177的重链和SEQ ID NO:178的轻链，并且构建体TWICE204包含SEQ ID NO:179的重链和SEQ ID NO:180的轻链。
在另一实例中，使用IgE CH2结构域作为二聚化结构域构建了TWICE。IgE CH2通常充当IgE中的铰链结构域，但这个结构域已用于通过结构域取代来构建具有类似结合性质的Fab样分子(Cooke等人,mAbs.10(8):1248-1259(2018))。在TWICE189和TWICE190中，使用表12中给出的二聚化结构域接头序列使IgE CH2结构域融合于免疫细胞衔接物VH结构域和VL结构域。二聚化结构域接头含有因子Xa裂解序列(Ile-Glu-Gly-Arg)。
Figure BDA0003114676680001621
Figure BDA0003114676680001631
Figure BDA0003114676680001632
Figure BDA0003114676680001641
通过共转染相应重链和轻链，在摇瓶中在短暂HEK293培养物(30-50ml)中表达表13中所列的TWICE蛋白。使用IMAC柱(Histrap Excel,GE)，或在含有Fc的TWICE蛋白的情况下，利用蛋白A管柱(MabSelect PrismA,GE)，通过FPLC从上清液纯化表达的蛋白质。通过SDS-PAGE分析经纯化蛋白质，并且在测试的所有接头和二聚化结构域的情况下都显示了在预期分子量下的条带(图7B)。具有卷曲螺旋或异Fc二聚化结构域的TWICE的表达水平是最高的。
通过用重组FXa蛋白酶裂解，进一步测试了TWICE。在15μl的反应中，在环境温度下，将约1μg的纯化TWICE和0.1μg FXa(New England Biolabs#_P8010)在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)以及100mM NaCl和2mM CaCl2的缓冲液中孵育1小时。通过添加5μl 4X LDS样品缓冲液(Thermo Fisher NP0007)，以及加热至95℃持续2分钟来终止反应。接着通过SDSPAGE分离样品以分析裂解产物(图7C)。
在两个二聚化结构域接头中，即在重链中以及在轻链中含有FXa裂解序列的样品TWICE193、TWICE191和TWICE192(表13)由FXa完全裂解(图7C)。具有在重链二聚化结构域接头中的FXa裂解位点和在轻链二聚化结构域接头中的MMP2裂解位点的TWICE117仅被部分裂解(图7B)。具有包括在两个二聚化结构域接头中的FXa裂解位点的构建体TWICE200、TWICE204、TWICE189和TWICE190在这些条件下未由FXa蛋白酶裂解。这个结果表明构建体TWICE200、TWICE204、TWICE189和TWICE190中二聚化结构域的构型(CH1/CL或IgE CH2)或在长度方面是5至8个残基的接头长度(表12)不有利于这些特定构建体中的蛋白酶裂解。然而，是包括在设计TWICE117、TWICE193、TWICE192和TWICE193中的二聚化结构域的卷曲螺旋和异Fc适于构建TWICE。含有这些二聚化结构域的TWICE分子良好表达，并且可通过用重组蛋白酶进行的裂解活化。
实施例8.具有各种结合部分的TWICE：Fv相对于Fab
以CD3抗体SP34和CTLA4抗体伊匹木单抗以及含有异Fc二聚化结构域来工程改造TWICE分子。在一些实例中，抗EpCAM抗体索利托单抗以Fab形式使用(TWICE277和TWICE278)，在其他实例中，通过在VH的残基44与VL的残基100(涉及Kabat编号)之间工程改造二硫键，这个抗体以二硫键稳定化Fv(dsFv，TWICE332和TWICE335)形式使用。表达TWICE分子，并且通过如上所述的蛋白A亲和色谱法纯化，并且在ELISA结合测定中测试它们结合EpCAM的能力。将在5μg/ml下的重组可溶性EpCAM-His6蛋白(内部产生)在4℃下在ELISA板上包被过夜，并且用含1％BSA的PBS对板进行封闭。使TWICE的连续稀释液结合EpCAM，并且用小鼠抗人Fc二级抗体(JDC-10Abcam，ab99759)检测结合的TWICE。结果(图8A至图8B)显示具有Fab或dsFv靶向部分的TWICE分子以类似结合亲和力结合于抗原，其中dsFv TWICE的KD在1.04nM至1.65nM的范围内，并且Fab TWICE的KD在1.21nM至1.22nM的范围内。因此，TWICE分子可以不同靶向部分例如Fab或dsFv构建以靶向肿瘤微环境中的细胞。
实施例9.在桥接ELISA中测试CD3/CTLA-4TWICE
为测试由TWICE对达成的结构域交换和功能性互补位(即配对的VH/VL结构域)产生，开发了测量TWICE对同时结合靶标抗原和免疫细胞衔接分子的能力的桥接ELISA测定。图9A中的示意图说明这个桥接ELISA的原理。简要来说，将ELISA板用在5μg/ml的浓度下的靶标抗原(重组可溶性EpCAM，黑色六角形)包被过夜。可如上所述通过用FXa裂解来活化TWICE分子，接着在连续稀释度下添加至板中。TWICE可以它们的靶标结合部分结合靶标抗原，所述靶标结合部分在图9A中绘制为Fab(4个灰色卵形)。与板上的靶标抗原(EpCAM)的结合致使TWICE紧密邻近，此允许免疫细胞结合结构域和补充性结合结构域经受结构域交换，并且形成完整免疫细胞结合互补位(图9A中的黑色和白色卵形)。通过与由免疫细胞结合结构域结合的抗原诸如CD3(图9A中的条纹化三角形)一起孵育来测量功能性互补。抗原以Fc融合蛋白(鼠IgG2a Fc)形式提供，并且因此可用抗小鼠Fc二级抗体检测。为明晰起见，在图9A中的示意图中省略了通过二级抗体进行的这个检测步骤。
图9B和图9C显示测量TWICE对的通过结构域交换达成的功能性互补的桥接ELISA的实例。在这些实例中，使用TWICE277和278(如表13中所述)，其含有结合CD3ε的免疫细胞结合抗体SP34和结合CTLA-4的补充性抗体伊匹木单抗。CD3抗体的VH和CTLA-4抗体的VL包含在TWICE277中，并且抗CD3抗体的VL和抗CTLA-4抗体的VH包含在TWICE278中。TWICE分子的这些实例还含有异Fc二聚化结构域和在两个二聚化结构域接头中的FXa裂解位点。图9B显示来自测量TWICE结合CD3的能力的CD3桥接ELISA的结果，并且图9C显示测量TWICE结合CTLA-4的能力的CTLA-4桥接ELISA的结果。在这个实验中，即使当通过用FXa裂解来活化时，单个TWICE(单独277或278)也不显示与CD3或与CTLA-4的结合。此外，当TWICE 277和278组合但不通过用FXa裂解来活化时，TWICE不显示与CD3或CTLA-4的结合。仅当TWICE277和278组合并由FXa裂解以移除二聚化结构域时，它们才显示以剂量依赖性响应与CD3或CTLA-4的结合(图9B和图9C中的菱形符号)。这些结果证明当两个TWICE均结合于靶标抗原时，TWICE分子可经受结构域交换，并且产生功能性免疫细胞结合结构域。此外，这些TWICE的二聚化结构域如所意图来充当阻止TWICE的结构域交换的锁定机构，除非二聚化结构域通过蛋白酶裂解而移除。
图10A至图10B显示在桥接ELISA实验中测试的CD3/CTLA-4TWICE分子的另一实例。这个实验中使用的TWICE281和282包含与上述TWICE277和TWICE278相同的EpCAM靶向抗体以及CD3和CTLA-4抗体，但因为它们含有卷曲螺旋二聚化结构域而不同。此外，TWICE281和282含有在重链中的FXa裂解位点和在轻链中的MMP2裂解序列，并且分子因此可通过由FXa或MMP2裂解来活化。类似于先前实验，TWICE277和278仅在通过用FXa裂解来活化时显示剂量-响应结合曲线(图10A和图10B)。在不由FXa活化下，TWICE不结合CD3或CTLA-4。因此，异Fc和卷曲螺旋二聚化结构域均适于工程改造TWICE。当需要TWICE的延长血清半衰期时，异Fc可为优选的。
实施例10.CD3/CD28 TWICE
图11A至图11B显示在桥接ELISA实验中测试的由CD3抗体SP34和共刺激性抗CD28抗体西拉利珠单抗构建的TWICE的一实例(来自表13的TWICE 394和395)。再次使用异Fc二聚化结构域和在重链接头与轻链接头两者中的FXa裂解位点工程改造TWICE的这些实例。类似于先前实例，TWICE394和TWICE395仅在它们组合并通过裂解来活化时显示与免疫细胞抗原CD3和CD28的结合(图11A和图11B)。单个TWICE不显示与任一免疫细胞抗原的结合。裂解再次为结构域交换和结合所必需，如由未裂解TWICE不显示任何桥接活性的事实所证实(图11A和图11B中的灰色方块)。
实施例11.CD28/4-1BB TWICE
图12A至图12B显示用结合共刺激性分子CD28和CD137(4-1BB)的抗体西拉利珠单抗和乌瑞利尤单抗构建的TWICE的一实例。使用西拉利珠单抗和乌瑞利尤单抗的可变结构域以及含有异Fc二聚化结构域和在两个接头中的FXa裂解位点，构建了TWICE400和401(如表13中所示)。当在桥接ELISA形式中测试这些分子时，当用FXa预裂解构建体，并且两种TWICE均存在时，TWICE显示与CD28(图12A)和4-1BB(图12B)的结合。两种TWICE在单独的情况下均不结合于CD28或4-1BB。
实施例12.CTLA-4/PD-L1 TWICE
图13显示用分别结合检查点分子CTLA-4和PD-L1的抗体伊匹木单抗和阿替利珠单抗构建的TWICE的一实例。TWICE283含有伊匹木单抗的VH和阿替利珠单抗的VL，并且互补性TWICE284含有阿替利珠单抗的VH和伊匹木单抗的VL，如表13中所示。以卷曲螺旋二聚化结构域和重链中的FXa裂解位点设计了这些TWICE。当在EpCAM/PD-L1桥接ELISA中测试这些TWICE时，TWICE 284展现与PD-L1的显著结合(图13)，尽管这个TWICE仅含有阿替利珠单抗的VH，但缺乏同源阿替利珠单抗VL。这个结果表明阿替利珠单抗的VH足以介导抗原结合。
这个见解与以下事实一致：与PD-L1复合的阿替利珠单抗的晶体结构(Lee HT等人Sci Rep 7:5532-5532(2017))揭示抗体的VL不与抗原显著接触，因此对于抗原结合来说可为非必需的或可替换的。因此，归因于当互补位(即VH/VL对)在TWICE中拆分时阿替利珠单抗保留它在VH结构域中的结合性质的事实，阿替利珠单抗是不适于构建TWICE，至少不适于与伊匹木单抗联合的抗体的一实例。
然而，如图9A至图12B中所示，伊匹木单抗、SP34、西拉利珠单抗和乌瑞利尤单抗是当互补位拆分时不展现结合的示例性抗体，并且此类抗体因此适于构建TWICE。
实施例13.由TWICE达成的免疫细胞活化
在体外T细胞活化测定中测试由TWICE构建体达成的T细胞重定向。简要来说，将结肠直肠癌细胞(HCT-15)在5,000个细胞/孔的密度下接种在96孔板中，并且使其贴壁过夜。在10:1的效靶比下添加外周血液单个核细胞(PBMC)，并且用TWICE分子的连续稀释液处理细胞。在一些实验中，在添加至细胞之前，通过用FXa蛋白酶(NEB#P8010L)裂解来预活化TWICE分子。
为定量T细胞活化，使用IFNγELISA试剂盒(Invitrogen88-7316-88)，在添加TWICE之后24小时检测培养基中的分泌干扰素γ。使用定量测量来自经溶解癌细胞的乳酸脱氢酶(LDH)的细胞毒性测定(CytoTox96，Promega)，在开始处理之后48小时测定靶标细胞杀灭。靶标细胞杀灭表示为图14A至图16中所示的剂量-响应曲线中的特异性溶解(％)，此对应于相较于用溶解缓冲液溶解的细胞，并且减除来自未处理细胞的背景LDH释放的LDH释放分数。
图14A至图14B显示用之前已在桥接ELISA中测试的TWICE277和278以及TWICE281和282进行的细胞杀灭测定的结果。如上所述，这些TWICE含有抗CD3ε衔接抗体SP34和CTLA-4抗体伊匹木单抗。TWICE277和278用通过接头GGGIEGRGGG(SEQ ID NO:206)连接于VH或VL的异Fc二聚化结构域构建，所述接头含有FXa裂解序列Ile-Glu-Gly-Arg。相比之下，TWICE281和282在重链和轻链中含有具有非相同接头的卷曲螺旋二聚化结构域(图14A)。这些TWICE用在重链接头GGGGSIEGRGGGGS(SEQ ID NO:203)中的FXa裂解位点和在轻链接头GGPLGVRGKGGGS(SEQ ID NO:204)中的MMP2裂解位点构建。来自这个实验的LDH释放数据(图14B)证明当在添加至细胞之前通过FXa预活化TWICE时，两个TWICE对均诱导由PBMC对癌细胞的强力杀灭。TWICE277和278在不进行预裂解下不诱导这个杀灭应答，此确认裂解为TWICE活化和结构域交换所必需，并且与在用这些分子进行的桥接ELISA实验中获得的数据(图9B至图9C)一致。然而，在桥接ELISA中也需要由FXa活化(图10A至图10B)的TWICE281和282即使当不使TWICE预活化时也易于以剂量依赖性方式诱导由PBMC对HCT15的杀灭。
这些结果显示TWICE分子可由可裂解轻链接头中的MMP2位点的癌细胞活化。总之，这个实验确认：(1)TWICE可高效衔接免疫细胞以杀灭癌细胞；(2)蛋白水解裂解为TWICE活化所必需，并且(3)由癌细胞产生的蛋白酶可活化TWICE分子。
图15A至图15D显示用也含有抗CD3ε衔接抗体SP34和CTLA-4抗体伊匹木单抗的TWICE 285和TWICE286进行的裂解测定(图15A)、T细胞活化测定(图15B)和杀灭测定(图15C至图15D)的结果。以在重链与轻链两者中的二聚化结构域接头GGGGSIEGRGGSGGGS(SEQ IDNO:205)中的FXa裂解位点设计了TWICE的这些实例，所述二聚化结构域接头长于以上在图14A至图14B中所示的实例的接头。TWICE的这些实例也含有卷曲螺旋二聚化结构域。
当用FXa裂解TWICE285时，分子产生了在SDS-PAGE上的预期片段(图15A)，从而显示TWICE可用FXa预活化。图15B和图15C中所示的细胞因子释放和杀灭数据确认当TWICE通过用FXa蛋白酶裂解来活化时，TWICE分子TWICE285加上TWICE286能够衔接并且针对HCT-15细胞重定向PBMC。单独TWICE285和TWICE286均不诱导由T细胞达成的干扰素γ释放或对癌细胞的杀灭。
然而，当在LDH释放实验中在不进行预裂解下一起测试这些TWICE时，分子诱导了癌细胞溶解，而与由FXa预活化无关(图15D)。这个结果不同于在桥接ELISA和T细胞活化测定中需要裂解以达成活化的上述TWICE实例。因此，数据确定二聚化结构域和接头长度的设计与TWICE活化相关。TWICE285和TWICE286的特定较长接头GGGGSIEGRGGSGGGS(SEQ ID NO:205)与存在于这些构建体中的卷曲螺旋二聚化结构域联合在不存在裂解下可不阻止结构域交换。
实施例14.共刺激性TWICE
接着，在T细胞重定向测定中测试如表13中所示的衔接CD3和CD28的TWICE394和TWICE395(图16)。如上所述，这些TWICE由抗CD28抗体西拉利珠单抗和抗CD3ε抗体SP34构建。因此，如图11A至图11B中所示，这些分子可结合CD3和CD28，此提供共刺激性信号以触发T细胞活化。当在T细胞杀灭测定中测试这些TWICE时，在用FXa预活化之后，TWICE394和395诱导对HCT-15癌细胞的稳健杀灭，但在不进行先前裂解下不显示活性。
为测试由TWICE衔接CD28和CD3获得的刺激性信号，开发了用以在测试TWICE活性之前使T细胞耗竭的方案。对于T细胞活化和耗竭，将前列腺癌细胞(PC-3)在150,000个细胞/孔的密度下接种在6孔板中，并且使其贴壁过夜。在10:1的效靶比下添加外周血液单个核细胞(PBMC)，并且用基于US10035856B2的SEQ ID NO:168和169的两组分T细胞衔接物在100nM的浓度下处理细胞。这个两组分系统类似于CD3双特异性抗体起作用，因为T细胞被衔接以杀灭癌细胞。然而，就预活化来说，它优于常规双特异性抗体，因为分子不能结合溶液中的CD3，并且因此可易于通过洗涤PBMC来移除。通过流式细胞计量术在预活化之后48小时分析PBMC，从而揭示处理诱导CD3+细胞上活化和耗竭标志物的稳健上调(图17A)，从而证明预活化和耗竭。相比于未刺激PBMC，此类预活化免疫细胞可更加反映肿瘤微环境中的免疫细胞，因为已知的是肿瘤浸润性淋巴细胞被耗竭，并且显示耗竭标志物的表达增加(Baitsch L等人Trends Immunol.33(7):364-72(2012))。
预活化PBMC随后用于如上所述的针对结肠直肠癌细胞(HCT-15)的重定向测定中以测试TWICE分子触发T细胞活化的效能，例外之处是在这个测定中将效靶比修改成1:4。图17B显示这个T细胞活化测定的结果。结合CD3和CD28的TWICE394和TWICE395诱导耗竭T细胞的稳健活化，如由IFNγ分泌所度量。结合CD3和CTLA-4的TWICE277和TWICE278也诱导IFNγ分泌，虽然水平低于TWICE394和TWICE395。在这个测定中还包括含有与非功能性VH结构域和VL结构域(SEQ ID NO:199和200)配对的CD3抗体VH结构域和VL结构域的一对对照TWICE。在用耗竭T细胞进行的这个重定向实验中，对照TWICE431加上TWICE432产生了低水平的干扰素γ。总之，这些结果与显示由三特异性抗体达成的对CD28以及CD3的共刺激性活化产生优于任一单独刺激的T细胞活化，并且可达成更强烈抗肿瘤免疫应答的新近出版物(Wu,L.,Seung,E.,Xu,L.等人Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy oftumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation.Nat Cancer(2019年11月18日在线出版)doi:10.1038/s43018-019-0004-z)一致。与这个观察结果一致，本发明的数据表明TWICE可强力刺激耗竭T细胞，并且相比于单独CD3衔接，共刺激或检查点阻断的累加作用可诱导更强烈应答。然而，与公开的三特异性抗体相反，TWICE可以可活化方式递送这些共刺激性信号。
实施例15.通过CD16A来衔接NK细胞的TWICE
在另一实例中，TWICE被工程改造来使用针对CD16A的抗体衔接天然杀伤(NK)细胞。用于构建这些TWICE分子的抗CD16A抗体已在临床试验(NCT01221571)中在作为靶向CD30和CD16A的双特异性抗体的分子AFM13中评估。对于在TWICE对中评估这个抗体，使抗CD16A抗体与抗CD3抗体OKT3组合以产生包含异Fc二聚化结构域和在二聚化结构域接头中的FXa裂解位点的TWICE分子TWICE440和TWICE441。
首先在与上述桥接ELISA实验类似的CD16A桥接ELISA中测试TWICE分子。TWICE440和441仅在两种TWICE均存在，并且用FXa蛋白酶预活化时显示与CD16A的预期结合(图18A)。如以其他TWICE分子所见，TWICE的预裂解是必要的，并且未裂解TWICE在这个桥接ELISA测定中不展现与CD16A的结合。此外，单个TWICE分子即使在它们由FXa预裂解时也不显示与CD16A的结合。因此，源于AFM13的抗CD16A抗体适用于TWICE中，因为拆分互补位的半部(即VH和VL)在它们在TWICE中分开时不结合抗原。
随后使用HCT15结肠癌细胞和NK细胞，在重定向测定中测试TWICE440和441。如上对于上述用PBMC进行的重定向测定所述，将癌细胞在5000个细胞/孔下接种在96孔板中，并且使其贴壁过夜。接着，在20:1的效靶比下，将纯化NK细胞(Stem Cell Technologies，目录号70036)添加至癌细胞，并且在各种浓度下将预活化TWICE添加至孔中。使用定量测量来自经溶解癌细胞的LDH的细胞毒性测定(CytoTox96，Promega)，在添加TWICE之后24小时，通过测量LDH释放来测定靶标细胞杀灭。这个NK细胞重定向测定的结果显示于图18B中。在这个实验中，靶向EpCAM和CD16a的对照双特异性抗体(CTRL406)诱导了从癌细胞的LDH释放，从而证明由NK细胞达成的杀灭。
靶向EpCAM和CD3的对照双特异性抗体也诱导了LDH释放，但程度小于CD16a/EpCAM双特异性抗体，可能是由于存在一些NKT细胞。TWICE440和441诱导了稳健NK重定向和癌细胞杀灭，此类似于以CD16a/EpCAM双特异性抗体观察到的杀灭量，从而证明TWICE分子可被工程改造来通过CD16a抗体衔接NK细胞。通过抗CD16抗体来衔接NK细胞可诱导癌细胞杀灭。
等同物
前述书面说明书被视为足以使得本领域技术人员能够实施实施方案。先前描述和实施例详述某些实施方案，并且描述由本发明者预期的最佳模式。然而，应了解无论前述事项可如何详细出现在正文中，实施方案都可以许多方式实施，并且应根据随附权利要求及其任何等同物加以解释。
如本文所用，术语约是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指示。术语约通常是指本领域普通技术人员将视为等同于所叙述值(例如具有相同功能或结果)的一定范围的数值(例如所叙述范围的+/-5-10％)。当诸如至少和约的术语位于数值或范围的清单之前时，所述术语修饰所述清单中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可包括向最接近的有效数字进行舍入的数值。
序列表
<110> 雷维托普有限公司(REVITOPE LIMITED)
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 7
Tyr Pro Ala Lys Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 8
Lys Trp Ala Lys Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 9
Asp Pro Met Lys Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 10
Asp Pro Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 11
Asp Pro Met Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 12
Lys Met Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 13
Lys Met Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 14
Lys Pro Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 15
Leu Pro Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 16
Leu Pro Met Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 17
Leu Met Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 18
Leu Met Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 19
Leu Pro Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 20
Leu Pro Ala Met Phe Phe Tyr Met
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 21
Lys Pro Met Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 22
Lys Pro Ala Lys Phe Phe Tyr Met
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 23
Lys Pro Ala Lys Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 24
Ile Pro Met Lys Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 25
Ile Pro Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 26
Ile Pro Met Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 27
Ile Met Ala Met Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 28
Ile Met Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 29
Ile Pro Ala Met Phe Phe Ile Met
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM28裂解位点
<400> 30
Ile Pro Ala Met Phe Phe Tyr Met
1 5
<210> 31
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 31
Phe Arg
1
<210> 32
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 32
Phe Lys
1
<210> 33
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 33
Val Ala
1
<210> 34
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 34
Val Arg
1
<210> 35
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是瓜氨酸
<400> 35
Val Xaa
1
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 36
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu
1 5
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 37
Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 38
Ser Leu Leu Ile Ala Arg Arg Met Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 39
Lys Lys Phe Ala
1
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 40
Ala Phe Lys Lys
1
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶B裂解位点
<400> 41
Gln Gln Gln
1
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶D裂解位点
<400> 42
Pro Arg Ser Phe Phe Arg Leu Gly Lys
1 5
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶D裂解位点
<400> 43
Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织蛋白酶K裂解位点
<400> 44
Gly Gly Pro
1
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP1裂解位点
<400> 45
Ser Leu Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Phe Asn
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2裂解位点
<400> 46
Ala Ile Pro Val Ser Leu Arg
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2裂解位点
<400> 47
Ser Leu Pro Leu Gly Leu Trp Ala Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2裂解位点
<400> 48
His Pro Val Gly Leu Leu Ala Arg
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2裂解位点
<400> 49
Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Lys
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2裂解位点
<400> 50
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP3裂解位点
<400> 51
Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP7裂解位点
<400> 52
Gly Pro Leu Gly Leu Ala Arg Lys
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP7裂解位点
<400> 53
Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser
1 5
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP7裂解位点
<400> 54
Ser Leu Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser Phe Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2/9裂解位点
<400> 55
Gly Ile Leu Gly Val Pro
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP2/9裂解位点
<400> 56
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9裂解位点
<400> 57
Ala Val Arg Trp Leu Leu Thr Ala
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9裂解位点
<400> 58
Pro Leu Gly Leu Tyr Ala Leu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9裂解位点
<400> 59
Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9裂解位点
<400> 60
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP11裂解位点
<400> 61
Ala Ala Ala Thr Ser Ile Ala Met
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP11裂解位点
<400> 62
Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu
1 5
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP13裂解位点
<400> 63
Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val
1 5 10
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP14裂解位点
<400> 64
Pro Arg His Leu Arg
1 5
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP14裂解位点
<400> 65
Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP14裂解位点
<400> 66
Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSA/KLK3
<400> 67
His Ser Ser Lys Leu Gln
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSA/KLK3
<400> 68
Ser Ser Lys Leu Gln
1 5
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KLK4
<400> 69
Arg Gln Gln Arg
1
<210> 70
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TMPRSS2
<400> 70
Gly Gly Arg
1
<210> 71
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 豆荚蛋白
<400> 71
Ala Ala Asn
1
<210> 72
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ST14 (基质蛋白酶)
<400> 72
Gln Ala Arg
1
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C1s裂解位点
<400> 73
Tyr Leu Gly Arg Ser Tyr Lys Val
1 5
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C1s裂解位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 74
Met Gln Leu Gly Arg Xaa
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MASP2裂解位点
<400> 75
Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C2a和Bb裂解位点
<400> 76
Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp Glu
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> uPa裂解位点
<400> 77
Thr Tyr Ser Arg Ser Arg Tyr Leu
1 5
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> uPa裂解位点
<400> 78
Lys Lys Ser Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Val
1 5 10
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> uPa裂解位点
<400> 79
Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr
1 5
<210> 80
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> uPa裂解位点
<400> 80
Ala Phe Lys
1
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组织型纤溶酶原激活物(tPA)
<400> 81
Gly Gly Ser Gly Gln Arg Gly Arg Lys Ala Leu Glu
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM10
<400> 82
Pro Arg Tyr Glu Ala Tyr Lys Met Gly Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM12
<400> 83
Leu Ala Gln Ala Phe
1 5
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADAM17
<400> 84
Glu His Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Lys
1 5 10
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 86
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 87
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 87
Gly Ser
1
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 88
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 89
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 90
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 91
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 92
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 93
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性氨基酸接头(可以重复方式呈现)
<400> 94
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 95
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体(紧密结合剂，具有Kd=2.4 nM)
<400> 95
ugccgcuaua augcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 96
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 96
uggcgcuaaa uagcacggaa auaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 97
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 97
ugcuaguaua ucgcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 98
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 98
ugccgccaua ucacacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 99
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 99
uuccgcugua uaacacggac uuaaucgccg uaguaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 100
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 100
ugucgcucua uugcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 101
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 101
ugcugcuuua ucccacauau uuuuuccccu cauaacaaua uuucuccccc c 51
<210> 102
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> n是a、c、g或u
<400> 102
ugcngcuaua ucgcncguau uuaaucgccg uagaaaagca ugucnangcc g 51
<210> 103
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 103
ugcaaagaaa acgcacguau uuaaucgccg uaguaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 104
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 104
ugcaucacua ucgaaccuau uuaauccacc aaaauaauug caaguccaua cuc 53
<210> 105
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n是a、c、g或u
<400> 105
ugccnnaaua acacacnuau auaaucgccg uacaaaauca ugucaaancc g 51
<210> 106
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 106
ugcagcugua uugcacguau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 107
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 107
uuccgauaau cccgcguacu aaaucaccau agucaacaau uuccaaccuc 50
<210> 108
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 108
uccacuauau cacacguauu uaaucgccgu agaaaagcau gucaaagccg 50
<210> 109
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 109
ucccucaacc ucgcuacuau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc u 51
<210> 110
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 110
ugccgcuaua ucacacgaau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 111
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 111
agccccuaga acacacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 112
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 112
ugccaauaua uaacacggaa uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 113
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 113
ugccgcuaua gcgcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 114
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 114
ugcagauaua ugucacucau uaauccccgu auaaaaacau aacuaagcuc 50
<210> 115
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 115
uguagcugua uugcacacau uaaaucgccg uaguaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 116
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 116
uaccaauaua ucgccacaca uaaucgccgu agaaaagcau gucaaagccg 50
<210> 117
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 117
ugccgcuaug cccacggaau uuaaucgccg uagaaaaaca ugucaaaguc g 51
<210> 118
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 118
ugccgcuauu uagcacggau uaaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 119
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a、c、g或u
<400> 119
ugccgcuauu uagcacggau uaaaucgccg uagaaaagca ugucnaagcc g 51
<210> 120
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n是a、c、g或u
<400> 120
uguaguaaua ugacacggau uuaaucgccg uagaaaagca ngucaaagcc u 51
<210> 121
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 121
ugucgccauu acgcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 122
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 122
ugcccccaaa cuacacaaau uuaaucgccg uauaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 123
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 123
ugcacuaucu cacacguacu aaucgccgua uaaaagcaug ucaaagccg 49
<210> 124
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 124
ugucgcaaua auacacuaau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 125
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 125
ugcaacaaua uagcacguau uuaaucgccg uaguaaagca ugucaaagg 49
<210> 126
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 126
cuaccacaaa ucccacauau uuaaucuccc aaucaaaucu uguccauucc c 51
<210> 127
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 127
ugcccuaaac ucacacggau auaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 128
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 128
uugucguaug ucacacguau uaaaucgccg uauaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 129
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 129
uuccgcuaua acacacggag aaaaucgccg uaguaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 130
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 130
ugccgauaua acgcacggau auaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 131
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 131
ugccauuaua cagcacggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 132
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 132
uccagaaaua ugcacacauu uaaucgccgu agaaaagcau gucaaagccg 50
<210> 133
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 133
uccgcuaaac aacacggaua caaucgccgu agaaaagcau guccaagccg 50
<210> 134
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(48)
<223> n是a、c、g或u
<400> 134
ugcacuaucu cacacguacu aaucgccgua uaaaagcaug ucaaannng 49
<210> 135
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a、c、g或u
<400> 135
aungcnannn uacacguauu naaucgccgu agaaaagcau gucanagccg 50
<210> 136
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 136
ugcugcuaua uugcaauuuu uuaaacuaag uagaaaacca uguacaaguc g 51
<210> 137
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 137
ugucgccaua uugcacggau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 138
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 138
ugccguuaua acccacggaa uuuaaccucc guagaaaagc augucaaagc cg 52
<210> 139
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n是a、c、g或u
<400> 139
ugugaauaua uaucacggau uuaaucgccg uauaaaagcn augucaaagc cg 52
<210> 140
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n是a、c、g或u
<400> 140
ugccgauaun nancacggau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 141
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 141
ugucacuaaa uugcacguau auaaucgccg uaguaagcau gucaaagccg 50
<210> 142
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 142
ugcaaccaua aagcacguaa uaaaucgccg uauauaagca ugucaaagcc g 51
<210> 143
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 143
ugccgcuaua uagcacguau uaaucgccgu aguaaagcau gucaaagccg 50
<210> 144
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 144
ugccgcuaua gcacacggaa uuuaaucgcc guaguaaagc augucaaagc cg 52
<210> 145
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a、c、g或u
<400> 145
ugcagguaua uaacncggau uuaaucgccg uagaaaagca ugucnaagcc g 51
<210> 146
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 146
ugcuccuaua acacacggau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 147
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 147
ugcccguaau ugcacggauu uaaucgccgu agaaaagcau guccaagccg g 51
<210> 148
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n是a、c、g或u
<400> 148
acucccuaua ungcaacuac auaaucgccg uaaauaagca uguncaagcc g 51
<210> 149
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 149
ugaagcuaga ucacacuaaa uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaaaaa gccg 54
<210> 150
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 150
ugacucuuua ucccccguac auuauucacc gaaccaaagc auuaccaucc cc 52
<210> 151
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 151
ugacgcccua acacacguau auaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 152
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 152
ugucgcaaaa uagcacguau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 153
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 153
ugaguguaua auucacguau uuaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 154
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 154
ugcuacuaua ucguagguaa cuaaucgccc uacaaacuca cucuaaaacc g 51
<210> 155
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 155
uuacgcuaua ucacacggaa uuuuaaucgc cguagaaaag cauguccaag ccg 53
<210> 156
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 156
cccaucugua cuacaggaau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 157
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 157
ugcccauaaa uagcacggau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 158
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 158
ugccgcaaua acauacacau auaaucgccg uagaaaagca ugucaaagcc g 51
<210> 159
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 159
ugcaacuaua ucgcacguau guaaucgccg uagaaaaagc augucaaagc c 51
<210> 160
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 160
uuccgcuaua uagcacggaa uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 161
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 161
uuccgcuaag ucacacgaaa uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 162
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 162
uguagcaaua ucacacguaa uuaaucgccg uauauaagca ugucaaagcc g 51
<210> 163
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 163
ugccguuaua uaucacggau uuaaucgccg uagaaaagca uguccaagcc g 51
<210> 164
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EGFR适体
<400> 164
uaacacauau aucaaguaac uuaucuccuu aguaaccauc uccaagccg 49
<210> 165
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VH-CH1，SP34 VH，FXa，碱性卷曲
<400> 165
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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<220>
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420 425 430
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu
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<400> 175
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245 250 255
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115 120 125
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165 170 175
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Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
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325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Gly Arg Gly Pro Ser Val
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<220>
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
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Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
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Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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<212> PRT
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<220>
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<400> 179
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165 170 175
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val
260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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405 410 415
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
420 425 430
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435 440 445
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
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100 105 110
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
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Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe
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<220>
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100 105 110
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115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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225 230 235 240
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
245 250 255
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
260 265 270
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
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420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Leu Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
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435 440 445
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Leu Ser Pro Gly
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<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VH-CH1，西拉利珠单抗VH，FXa，Fc
<400> 195
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370 375 380
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405 410
<210> 196
<211> 578
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<220>
<223> 抗EpCAM VL-CL，西拉利珠单抗VL，FXa，Fc
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1 5 10 15
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35 40 45
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130 135 140
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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
225 230 235 240
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Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn
275 280 285
Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
290 295 300
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly
340 345 350
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
355 360 365
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
370 375 380
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
385 390 395 400
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
405 410 415
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
420 425 430
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
435 440 445
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
450 455 460
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
465 470 475 480
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
485 490 495
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
500 505 510
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515 520 525
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
530 535 540
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
545 550 555 560
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
565 570 575
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 197
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1 5 10 15
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Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
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100 105 110
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
225 230 235 240
Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu
245 250 255
Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp
260 265 270
Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
275 280 285
Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser Arg
290 295 300
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
305 310 315 320
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
325 330 335
Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly
355 360 365
Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
370 375 380
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
385 390 395 400
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
405 410 415
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
420 425 430
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr
435 440 445
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
450 455 460
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
465 470 475 480
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
485 490 495
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500 505 510
Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
515 520 525
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
530 535 540
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Leu Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly
595
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VL-CL，乌瑞利尤单抗VL，FXa，Fc
<400> 198
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195 200 205
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
325 330 335
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340 345 350
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420 425 430
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435 440 445
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485 490 495
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
500 505 510
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
515 520 525
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VL-CL，虚拟VL，FXa，Fc
<400> 199
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225 230 235 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
245 250 255
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
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Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
275 280 285
Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Ala Val Phe Gly
325 330 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
340 345 350
Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
355 360 365
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
370 375 380
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
385 390 395 400
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
405 410 415
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
420 425 430
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435 440 445
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500 505 510
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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580
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VH-CH1，虚拟VH，FXa，Fc
<400> 200
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
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Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
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Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
225 230 235 240
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
245 250 255
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260 265 270
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg
275 280 285
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
290 295 300
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
305 310 315 320
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
325 330 335
Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp
340 345 350
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ile
355 360 365
Glu Gly Arg Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
370 375 380
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
385 390 395 400
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
405 410 415
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
420 425 430
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
435 440 445
Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
450 455 460
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
465 470 475 480
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
485 490 495
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
500 505 510
Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
515 520 525
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
545 550 555 560
Tyr Ser Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
565 570 575
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
580 585 590
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
595 600
<210> 201
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 碱性卷曲
<400> 201
Lys Asn Ala Gln Cys Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn
1 5 10 15
Ala Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 202
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 酸性卷曲
<400> 202
Glu Asn Ala Gln Cys Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn
1 5 10 15
Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 203
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 亮氨酸拉链序列
<400> 203
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 204
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 亮氨酸拉链序列
<400> 204
Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Lys Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 205
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 亮氨酸拉链序列
<400> 205
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 异Fc序列
<400> 206
Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 异Fc序列
<400> 207
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH1序列
<400> 208
Ile Glu Gly Arg Gly
1 5
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CL序列
<400> 209
Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
1 5
<210> 210
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgE CH2序列
<400> 210
Gly Ile Glu Gly Arg Gly
1 5
<210> 211
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgE CH2序列
<400> 211
Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
1 5
<210> 212
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VH-CH1，OKT3 VH，FXa，Fc
<400> 212
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val
225 230 235 240
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
245 250 255
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met
260 265 270
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
275 280 285
Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
290 295 300
Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
305 310 315 320
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
325 330 335
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly Asp
355 360 365
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
370 375 380
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
385 390 395 400
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
405 410 415
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
420 425 430
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
435 440 445
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
450 455 460
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
465 470 475 480
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
485 490 495
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
500 505 510
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
515 520 525
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
530 535 540
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Leu Leu Thr Val Asp
545 550 555 560
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
565 570 575
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
580 585 590
Gly
<210> 213
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VL-CL，OKT3 VL，FXa，Fc
<400> 213
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
245 250 255
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val
275 280 285
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly Asp
340 345 350
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
355 360 365
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
370 375 380
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
385 390 395 400
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
405 410 415
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
420 425 430
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
435 440 445
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
450 455 460
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
465 470 475 480
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
485 490 495
Thr Cys Leu Val Ser Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
500 505 510
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
515 520 525
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
530 535 540
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
545 550 555 560
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
565 570 575
Gly
<210> 214
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VH-CH1，抗CD16A VH，FXa，Fc
<400> 214
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
225 230 235 240
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu
245 250 255
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met
260 265 270
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile
275 280 285
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290 295 300
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
305 310 315 320
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
325 330 335
Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly
355 360 365
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370 375 380
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
385 390 395 400
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
405 410 415
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
420 425 430
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435 440 445
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
450 455 460
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
465 470 475 480
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
485 490 495
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Lys
500 505 510
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Pro Gly
<210> 215
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗EpCAM VL-CL，抗CD16A VL，FXa，Fc
<400> 215
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr
225 230 235 240
Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser
245 250 255
Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
405 410 415
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
420 425 430
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
545 550 555 560
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
565 570 575
Gly

Claims (25)

1.一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含：
a.第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含：
i.结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；
ii.当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；和
iii.当结合第二补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第一补充性结合结构域，其中
(1)所述第二补充性结合结构域不是所述第一组分的一部分，
(2)当所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第一补充性结合结构域是VL结构域，
(3)当所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第一补充性结合结构域是VH结构域，并且
(4)其中所述第一补充性结合结构域是所述第一免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第一免疫细胞结合结构域不结合于所述第一补充性结构域，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域；以及：
b.第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含：
i.第二靶向部分；
ii.当结合第一免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VH，并且其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH，那么所述第二免疫细胞结合结构域是VL；和
iii.当结合所述第一补充性结合结构域时能够结合补充性抗原的第二补充性结合结构域，其中
(1)当所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域时，所述第二补充性结合结构域是VL结构域，
(2)当所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域时，所述第二补充性结合结构域是VH结构域，并且
(3)其中所述第二补充性结合结构域是所述第二免疫细胞结合结构域的结合配偶体，以致除非所述第二免疫细胞结合结构域不结合于所述第二补充性结构域，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合所述第一免疫细胞结合结构域。
2.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域来结合于所述第一补充性结合结构域，其中：
a.所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第一免疫细胞结合结构域；
b.所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第一补充性结合结构域；并且
c.所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
3.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中第二T细胞结合结构域通过第一二聚化结构域和第二二聚化结构域结合于所述第二补充性结合结构域，其中：
a.所述第一二聚化结构域通过第一接头连接于所述第二T细胞结合结构域；
b.所述第二二聚化结构域通过第二接头连接于所述第二补充性结合结构域；并且
c.所述第一接头和/或第二接头是可裂解接头。
4.如权利要求2所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头是可裂解接头；任选地，其中所述第一可裂解接头和/或第二可裂解接头的蛋白酶裂解位点由所述癌症或肿瘤微环境细胞表达的蛋白酶裂解。
5.如权利要求2所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头在长度方面是5至30个氨基酸。
6.如权利要求5所述的试剂盒或组合物，其中所述第一接头和第二接头在长度方面是8至16个氨基酸。
7.如权利要求2所述的试剂盒或组合物，其中所述第一二聚化结构域和第二二聚化结构域均是：
a.亮氨酸拉链；
b.免疫球蛋白结构域；或
c.T细胞受体(TCR)结构域。
8.如权利要求7所述的试剂盒或组合物，其中所述第一二聚化结构域和第二二聚化结构域均是免疫球蛋白结构域。
9.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合所述癌症；任选地，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合免疫检查点分子、RANK或RANKL、或细胞死亡诱导抗原。
10.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
11.如权利要求10所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞；任选地，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
12.如权利要求10所述的试剂盒或组合物，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞；任选地，其中所述第一补充性结合结构域和所述第二补充性结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。
13.一种用于治疗患者中的癌症的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含：
a.第一组分，所述第一组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含：
i.结合由所述癌症表达的肿瘤抗原的第一靶向部分；
ii.当结合第二免疫细胞结合结构域时能够具有免疫细胞结合活性的第一免疫细胞结合结构域，其中所述第二免疫细胞结合结构域不是所述第一组分的一部分，并且其中所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域或VL结构域；
iii.所述第一免疫细胞结合结构域的第一惰性结合配偶体，其中所述第一惰性结合配偶体结合所述第一免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第一免疫细胞结合结构域不结合所述第二免疫细胞结合结构域，其中如果所述第一免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第一免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；
iv.分隔所述第一免疫细胞结合结构域和所述第一惰性结合配偶体的蛋白酶裂解位点，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶：
(1)由所述癌症或肿瘤微环境细胞表达；或
(2)通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症，所述靶向部分结合(a)由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的所述第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原；和
v.能够进行免疫细胞结合的第一补充性功能性结构域，以及：
b.第二组分，所述第二组分包含靶向免疫细胞结合剂，所述靶向免疫细胞结合剂包含：
i.第二靶向部分；
ii.第二免疫细胞结合结构域；和
iii.任选的能够进行免疫细胞结合的第二补充性功能性结构域。
14.如权利要求13所述的试剂盒或组合物，其中所述第二组分包含补充性功能性结构域；任选地，其中所述第一组分和/或第二组分的所述补充性功能性结构域包含受体的配体；进一步任选地，其中所述补充性功能性结构域包含TGF-β家族的成员的潜活形式或细胞因子。
15.如权利要求13所述的试剂盒或组合物，其中所述第二组分还包含所述第二免疫细胞结合结构域的第二惰性结合配偶体，其中所述第二惰性结合配偶体结合所述第二免疫细胞结合结构域，以致除非所述惰性结合配偶体被移除，否则所述第二免疫细胞结合结构域不结合所述第一免疫细胞结合结构域，其中如果所述第二免疫细胞结合结构域是VH结构域，那么所述惰性结合配偶体是VL结构域，并且如果所述第二免疫细胞结合结构域是VL结构域，那么所述惰性结合配偶体是VH结构域；并且此外，其中
蛋白酶裂解位点分隔所述第二免疫细胞结合结构域和所述第二惰性结合配偶体，其中所述蛋白酶裂解位点能够在蛋白酶存在下从所述免疫细胞结合结构域释放所述惰性结合配偶体，所述蛋白酶：
a.由所述癌症表达；或
b.通过是抗体或其抗原结合片段的靶向部分来共定位至所述癌症，所述靶向部分结合(a)由所述癌症表达的肿瘤抗原，并且与剂中的所述第一靶向部分和/或第二靶向部分相同或不同，或结合(b)由肿瘤微环境中的细胞表达的抗原。
16.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞。
17.如权利要求16所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合T细胞；任选地，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合CD3、T细胞受体、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD28、CD137、OX40、CD27、GITR(TNFRSF18)、TIGIT或诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。
18.如权利要求16所述的试剂盒或组合物，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫细胞结合结构域在彼此结合时能够结合天然杀伤细胞；任选地，其中所述第一免疫细胞结合结构域和所述第二免疫结合结构域在彼此结合时能够结合CD16A。
19.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含抗体或其抗原结合片段；任选地，其中所述第一靶向部分和/或第二靶向部分包含结合以下的抗体或其抗原结合片段：α4-整合素；A33；ACVRL 1/ALK1；ADAM17；ALK；APRIL；BCMA；C242；CA125；钙粘着蛋白-19；CAIX；CanAg；碳酸酐酶IX；CCN1；CCR4；CD123；CD133；CD137(4-1BB)；CD138/粘结蛋白聚糖1；CD19；CD2；CD20；CD22；CD30；CD33；CD37；CD38；CD4；CD40；CD44；CD45；CD48；CD5；CD52；CD56；CD59；CD70；CD70b；CD71；CD74；CD79b；CD80；CD86；CD98；CEA；CEACAM；CEACAM1；CK8；c-Kit；CLDN1；CLDN18；CLDN18.2；CLDN6；c-met/HGFR；c-RET；Cripto；CTLA-4；CXCR4；DKK-1；DLL3；DLL4；TRAIL-R2/DR5；DRS；EGFL7；EGFR；EGFRvIII；内皮糖蛋白；ENPP3；EpCAM；EphA2；上皮唾蛋白；FAP；FGFR1；FGFR2；FGFR3；FGFR4；纤连蛋白额外结构域B；FLT-3；flt4；叶酸受体1；GCC；GD2；GD3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；磷脂酰肌醇蛋白聚糖；GM3；GPNMB；GPR49；GRP78；Her2/Neu；HER3/ERBB3；HLA-DR；ICAM-1；IGF-1R；IGFR；IL-3Ra；整合素α5β1；整合素α6β4；整合素αV；整合素αVβ3；Lewis Y；Lewis y/b抗原；LFL2；LIV-1；Ly6E；MCP-1；间皮素；MMP-9；MUC1；MUC18；MUC5A；MUC5AC；肌抑素；NaPi2b；神经纤毛蛋白1；NGcGM3；NRP1；P-钙粘着蛋白；PCLA；PD-1；PDGFRa；PD-L1；PD-L2；磷脂酰丝氨酸；PIVKA-II；PLVAP；PRLR；胃泌素原；PSCA；PSMA；RANKL；RG1；Siglec-15；SLAMF6；SLAMF7；SLC44A4、STEAP-1；TACSTD-2；肌腱蛋白C；TPBG；TRAIL-R1/DR4；TROP-2；TWEAKR；TYRP1；VANGL2；VEGF；VEGF-C；VEGFR-2；或VEGF-R2。
20.如权利要求1所述的试剂盒或组合物，其中所述第二靶向部分结合由肿瘤微环境细胞表达的抗原；任选地，其中所述肿瘤微环境细胞是成纤维细胞或巨噬细胞。
21.如权利要求20所述的试剂盒或组合物，其中由成纤维细胞表达的所述抗原是成纤维细胞活化蛋白，或由巨噬细胞表达的所述抗原是MAC-1/CD11b或sideroflexin 3。
22.一种治疗患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的癌症的方法，所述方法包括将权利要求1所述的组合物施用至所述患者；任选地，其中表达结合所述第一靶向部分和/或第二靶向部分的肿瘤抗原的所述癌症是以下中的任一者：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、淋巴组织增生性病症、骨髓发育不良病症、骨髓增生性疾病或恶变前疾病。
23.一种使免疫细胞靶向至患者中的表达结合第一靶向部分和/或第二靶向部分两者的肿瘤抗原的癌症的方法，所述方法包括将权利要求1所述的组合物施用至所述患者。
24.一种使免疫细胞靶向至患者中的表达两种肿瘤抗原的癌症的方法，其中一种肿瘤抗原结合第一靶向部分，并且一种肿瘤抗原结合第二靶向部分，所述方法包括将权利要求1所述的组合物施用至所述患者。
25.一种将细胞因子递送至患者的免疫细胞的方法，所述方法包括将权利要求13所述的组合物施用至所述患者，其中所述组合物的所述第一补充性功能性结构域和/或第二补充性功能性结构域包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ或TNF超家族的成员。
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