CN112673021A - 抗体肿瘤靶向组装复合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于在肿瘤微环境中选择性激活目标免疫细胞的抗体肿瘤靶向组装复合物(ATTAC)。

Description

抗体肿瘤靶向组装复合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年7月2日提交的美国临时申请号62/693,125的权益，其内容通过引用以其全文并入本文。
发明领域
本申请涉及用于治疗癌症的靶向免疫细胞接合剂(trageted immune cellengaging agent)。
发明背景
癌症造成大量死亡、病痛和经济影响。靶向癌症的免疫治疗策略一直是转化临床研究的活跃领域。
已经探索了多种其他方法用于免疫疗法，但是这些现有方法中有许多都缺乏针对特定癌细胞的足够的特异性。例如，已将设计了半体(demibody)，每个半体具有与靶细胞上的不同抗原结合的scFv部分，允许与互补半体配对的Fc结构域，以及能够与互补半体上的另一个结合伴侣形成缔合(association)的结合伴侣。WO 2007/062466。然而，这些半体不一定对癌细胞特异，并且可在表达相同抗原的其他细胞上结合和具有活性。还参见WO2013/104804，其提供了具有与第一抗原结合的靶向部分和功能域的第一片段的第一多肽，以及具有与第二抗原结合的靶向部分和功能域的第二片段(与该功能域的第一片段互补)的第二多肽。同样，这种方法不一定对癌细胞特异，并且可在表达相同抗原的其他细胞上结合和具有活性。
其他人已经提出了双特异性T细胞接合抗体(BiTE)；然而，这些构建体通常对肿瘤环境的特异性不足。此外，BiTE还能够激活调节性T细胞(Treg)，促进在肿瘤部位的不希望的Treg活性。例如，在某些患者中，刺激性Treg已经与抑制性Treg的高水平增殖和快速的癌症进展相关联，称为过度进展性疾病(hyperprogressive disease)(参见Kamada等人，PNAS116(20)：9999-10008(2019))。过度进展性疾病的具体实例已见于经抗PD-1抗体治疗的患者，PD-1抗体激活并扩增某些肿瘤浸润性PD-1+ Treg细胞，然而担忧其他刺激Treg的手段可在少数患者体内产生类似的副作用。
采用更高特异性以使T细胞靶向癌细胞的其他方法没有任何用于选择哪些T细胞到达癌症部位或在癌症部位被激活的手段。WO 2017/087789。激活所有T细胞，包括对免疫肿瘤学方法无益的T细胞，用于治疗患者的癌症。
当前经由CD3激活T细胞的双特异性抗体方法存在两个问题。第一个问题是免疫应答的过度激活。尽管未广泛讨论，但与全抗体疗法相比，这些药剂惊人地有效且所给剂量极低。这部分是由于这些药剂在理论上能通过与CD3结合来激活每个T细胞的事实。当某人受到病毒感染时，其约1-10％的T细胞被激活，并且他们因为免疫应答会感到昏昏欲睡和不适。当更多的T细胞被激活时，这能导致更大的问题，包括细胞因子释放综合征(CRS)并在罕见情况下导致死亡。CRS可以通过从由生物制剂靶向的细胞释放细胞因子以及通过从募集的免疫效应细胞释放细胞因子来触发。因此，需要限制使用这些系统激活的T细胞总数。
当前BiTE疗法的第二个问题是，与BiTE结合的靶细胞附近的任何T细胞的CD3特异性激活。许多免疫细胞都响应CD3激活，包括CD4 T细胞(辅助、调节性、TH17等)和CD8 T细胞，这取决于哪些细胞与BiTE结合。这可意味着BiTE的功效因为不希望的T细胞被激活而丧失，例如调节性T细胞和TH17 T细胞被激活，从而抑制了T细胞如CD8 T细胞和细胞毒性CD4T细胞的细胞溶解功能。如果疗法仅激活特定类型的T细胞，例如仅激活CD8+ T细胞，则其也可以得到改善。本领域先前还没有提出过针对这个问题的解决方案。仅本发明发现了系统的益处，在所述系统中存在肿瘤靶向以提供对不希望的那些细胞的特异性，并且存在第二部分以选择性地结合所需的免疫细胞，后者可以在不想要的癌细胞部位处结合并杀死该癌细胞。
发明概述
根据说明书，本申请描述了使用抗体肿瘤靶向组装复合物(antibody tumor-targeting assembly complex，ATTAC)治疗癌症的药剂和方法。
在一些实施方案中，用于治疗患者中癌症的药剂包含：(a)包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分(a first component comprising a targeted immune cell bindingagent)，其包含：(i)靶向部分，其能够靶向癌症；和(ii)第一免疫细胞接合结构域(a firstimmune cell engaging domain)，当结合第二免疫细胞接合结构域(a second immunecell engaging domain)时，所述第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；(b)包含选择性免疫细胞结合剂的第二组分(a second component comprising a selective immune cell binding agent)，其包含：(i)能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞；和(ii)第二免疫细胞接合结构域，当结合第一免疫细胞接合结构域时，所述第二免疫细胞接合结构域能够具有免疫细胞接合活性，其中当第一和第二免疫细胞接合结构域均不与惰性结合伴侣(an inert bindingpartner)结合时，它们能够结合，其中第一免疫细胞接合结构域或第二免疫细胞接合结构域的至少一个与惰性结合伴侣结合，使得除非去除惰性结合伴侣，否则第一和第二免疫细胞接合结构域彼此不结合；并且进一步包含将第一惰性结合伴侣和与其结合的免疫细胞接合结构域分开的切割位点，其中所述切割位点是：(i)通过由癌细胞表达的酶被切割；(ii)通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；(iii)通过依赖补体的切割反应被切割；(iv)通过由与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。
在一些实施方案中，第一组分不与第二组分共价结合。在一些实施方案中，第一组分与第二组分共价结合。
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与在免疫细胞表面表达的抗原结合。在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分(theimmune cell selection moiety)选择性地靶向T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或工程化免疫细胞。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向T细胞。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，辅助T细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CD8、CD4或CXCR3。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分不特异性地结合调节性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分不特异性地结合TH17细胞。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与CD3结合。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与TCR结合。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向自然杀伤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CD2或CD56。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46或DNAM。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CD14、CD11b或CD40。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与以下结合：CD89(Fcα受体1)、CD64(Fcγ受体1)、CD32(Fcγ受体2A)或CD16a(Fcγ受体3A)。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CD15。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与以下结合：CD89(FcαR1)、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、CD11b(CR3、αMβ2)、TLR2、TLR4、CLEC7A(Dectin1)、甲酰肽受体1(FPR1)、甲酰肽受体2(FPR2)或甲酰肽受体3(FPR3)。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CD193、Siglec-8或EMR1。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与以下结合：CD89(Fcα受体1)、FcεRI、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)或TLR4。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向2D7、CD203c或FcεRIα。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与CD89(Fcα受体1)或FcεRI结合。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向γδT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向γδTCR。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与以下结合：γδTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB、DNAM-1或TLR(TLR2、TLR6)。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向Vα24或CD56。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与以下结合：αβ TCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB或IL-12R。
在一些实施方案中，能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向工程化免疫细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是CAR T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向CAR或免疫细胞上表达的标志物。在一些实施方案中，免疫选择部分靶向LNGFR或CD20。在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合由工程化免疫细胞表达的抗原。在一些实施方案中，由工程化免疫细胞表达的抗原是CD3。
在一些实施方案中，免疫细胞选择部分包含抗体或其抗原特异性结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合T细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合细胞毒性T细胞或辅助T细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合巨噬细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合自然杀伤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合嗜中性粒细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合嗜酸性粒细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合γδT细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合自然杀伤T细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合工程化免疫细胞上的抗原。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是CAR T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
在一些实施方案中，免疫选择部分包含适体。在一些实施方案中，适体特异性地结合T细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合细胞毒性T细胞或辅助T细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合巨噬细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合自然杀伤细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合嗜中性粒细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合嗜酸性粒细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合γδT细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合自然杀伤T细胞上的抗原。在一些实施方案中，适体特异性地结合工程化免疫细胞上的抗原。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是CAR T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
在一些实施方案中，适体包含DNA。在一些实施方案中，适体包含RNA。在一些实施方案中，适体是单链的。在一些实施方案中，适体是选自随机候选文库的选择性免疫细胞结合特异性适体。
在一些实施方案中，靶向部分是抗体或抗原特异性结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合癌症抗原。在一些实施方案中，靶向部分是适体。在一些实施方案中，适体特异性地结合癌症抗原。在一些实施方案中，适体包含DNA。在一些实施方案中，适体包含RNA。在一些实施方案中，适体是单链的。在一些实施方案中，适体是选自随机候选文库的靶细胞特异性适体。在一些实施方案中，适体是抗EGFR适体。在一些实施方案中，抗EGFR适体包含SEQ ID NO：95-164中的任何一个。在一些实施方案中，适体以1皮摩尔至500纳摩尔的Kd与癌细胞上的癌症结合。在一些实施方案中，适体以1皮摩尔至100纳摩尔的Kd与癌症结合。
在一些实施方案中，靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。在一些实施方案中、靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的全长序列。在一些实施方案中、靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40的截短形式、类似物、变体或衍生物。在一些实施方案中、靶向部分结合癌症上的靶标，包括IL-2受体、IL-4、IL-6、黑素细胞刺激激素受体(melanocyte stimulating hormonereceptor，MSH受体)、转铁蛋白受体(TR)、叶酸受体1(FOLR)、叶酸羟化酶(FOLH1)、EGF受体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR或CD40L。
在一些实施方案中，一个免疫细胞接合结构域包含VH结构域，另一个免疫细胞接合结构域包含VL结构域。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过切割位点与之分隔。
在一些实施方案中，第二免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过切割位点与之分隔。
本申请还描述了一种药剂，其中第一免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过第一切割位点与之分隔，第二免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过第二切割位点与之分隔。
在一些实施方案中，第一切割位点和第二切割位点是相同的切割位点。在一些实施方案中，第一切割位点和第二切割位点是不同的切割位点。
在一些实施方案中，至少一个切割位点是蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，由癌细胞表达的至少一种酶是蛋白酶。
在一些实施方案中，至少一个惰性结合伴侣特异性地结合免疫细胞接合结构域。在一些实施方案中，至少一个惰性结合伴侣是VH或VL结构域。
在一些实施方案中，当免疫细胞接合结构域是VH结构域时，惰性结合伴侣是VL结构域，当免疫细胞接合结构域是VL结构域时，惰性结合伴侣是VH结构域。
本申请还描述了在双组分系统中用于治疗癌症的包含选择性免疫细胞结合剂的药剂，其包含：(a)包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分，其包含：(i)能够靶向癌症的靶向部分；(ii)第一免疫细胞接合结构域，当结合第二免疫细胞接合结构域时，所述第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；(b)切割位点，其将第一免疫细胞接合结构域和惰性结合伴侣分开，其中所述切割位点是：(i)通过由癌细胞表达的酶被切割；(ii)通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；(iii)通过依赖补体的切割反应被切割；或(iv)通过由与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割，其中切割位点的切割导致惰性结合伴侣的丢失，从而与不是药剂(agent)的一部分的第二免疫细胞接合结构域结合。
在一些实施方案中，第一组分通过包含切割位点的接头与第二组分共价结合。
在一些实施方案中，切割位点是蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，蛋白酶切割位点在血液中是可切割的。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是凝血酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶或弗林蛋白酶(furin)的切割位点。
在一些实施方案中，蛋白酶切割位点可被肿瘤相关蛋白酶切割。在一些实施方案中，肿瘤相关蛋白酶的切割位点包含SEQ ID NO：1-84的任何一个。
本申请还描述了编码药剂的第一和第二组分的一组核酸分子。
本申请还描述了编码选择性免疫细胞结合剂的核酸分子。
本申请还描述了治疗患者中癌症的方法，包括施用本文所述的药剂。
在一些实施方案中，如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则选择性免疫细胞结合剂不靶向调节性免疫细胞上存在的标志物(包括但不限于CD4和CD25)。
在一些实施方案中，选择性免疫细胞结合剂不靶向TH17细胞上存在的标志物。在一些实施方案中，选择性免疫细胞结合剂激活了将靶向肿瘤细胞以进行裂解的T细胞。
在一些实施方案中，如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则免疫细胞选择部分通过特异性结合CD8来靶向CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则免疫细胞选择部分通过特异性结合CXCR3来靶向CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，癌症是以下任意一种：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、淋巴增生性病症、骨髓增生异常病症(myelodysplastic disorder)、骨髓增生性疾病或癌前病变(premalignant disease)。
本申请还描述了将患者的免疫应答靶向癌症(targeting an immune responseof a patient to cancer)的方法，包括向患者施用本文所述的药剂。
其他目的和优点将部分在下面的描述中阐述，部分根据此描述将是显而易见的，或者可以通过实践获悉。这些目的和优点将特别是通过所附权利要求中指出的要素和组合来实现和获得。
应当理解，前面的概述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，且并不限制权利要求。
并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图示出了一个(多个)实施方案，其与说明书一道用于解释本文所述的原理。
附图简要说明
图1A-1B提供了用于治疗患者中癌症的药剂的代表图解。如图1A(时间点1)所示，药剂包含了包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分(ATTAC1)和包含选择性免疫细胞结合剂的第二组分(ATTAC 2)。ATTAC1特异性地结合癌细胞(圆圈和圆形结合部分)，ATTAC2特异性地结合免疫细胞(方框和方形结合部分)。ATTAC1和ATTAC2都包含能够具有免疫细胞接合活性(显示为豆形)的一半免疫细胞接合结构域。ATTAC1和ATTAC2只有在其彼此结合时才具有免疫细胞接合活性。因此，“靶向免疫细胞结合剂”是指能够靶向癌细胞并且当与选择性免疫细胞结合剂结合时能够具有免疫细胞接合活性的药剂。同样地，“选择性免疫细胞结合剂”是指能够选择性结合一种类型的免疫细胞并且当与靶向免疫细胞结合剂结合时能够具有免疫细胞接合活性(immune cell engaging activity)的药剂。至少一个免疫接合结构域和任选两个免疫接合结构域均被惰性结合伴侣掩蔽(此处两个均显示为掩蔽)。免疫活性部分(显示为三角形)保持未接合，直到至少一个(或任选两个)惰性结合结构域通过切割位点的切割被去除。将每个惰性结合伴侣和免疫细胞接合结构域分隔的切割位点显示为矩形。如图1B(时间点2)所示，惰性结合配偶体的酶促切割允许第一免疫细胞接合结构域和第二免疫接合结构域的缔合，以通过免疫细胞接合结构域(此处为VH-VL)与免疫细胞上的抗原(如三角形所示)的结合来特异性地激活免疫细胞。这个结果导致癌细胞的破坏。
图2A-2B显示了WO 2017/087789(图2A)中所讨论的双组分结构或T细胞接合抗体回路(TEAC)和本文所述的当前的ATTAC结构(图2B)的特异性的逻辑控制的比较。TEAC采用了具有(i)能够靶向癌症(“抗原1”)的靶向部分和(ii)切割位点(“蛋白酶1”)的第一组分，以及具有(i)能够靶向癌症(“抗原2”)的靶向部分和(ii)任选切割位点(“蛋白酶2”)的第二组分。当前的ATTAC结构消除了第二组分对癌症的特异性(不再包括靶向抗原2的部分)，并用能够选择性地靶向免疫细胞(“免疫细胞标志物”)的免疫细胞选择部分替代它。在ATTAC中，至少第一或第二组分包含切割位点，并且此处显示切割位点在第一组分上，且任选在第二组分上。相反的设置也适用。
图3A-3C显示了TEAC对T细胞的激活，表明用结合有FITC的抗体标记T细胞不会改变其识别肿瘤细胞表面的CD3分子并响应它而被激活的能力。用不同的结合有FITC的抗体标记T细胞；用EpCAM VH(SEQ ID NO：166)和EpCAM VL(SEQ ID NO：167)TEAC组分(20G6)标记靶细胞(MCF-7)。用BiTE(SEQ ID NO：168)标记对照。图3A显示了TEAC标记的肿瘤细胞的IFNγ释放。图3B(CD4 T细胞)和图3C(CD8 T细胞)通过CD69流式细胞术染色并使用高于背景的平均荧光强度(MFI)作为读数证明了T细胞的激活。当用结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM TEAC组分配对物有强烈应答。所结合的抗体不产生阻断。TEAC激活了CD4和CD8细胞，并且由于这两种细胞类型均表达CD3而未在它们之间进行区分。这个对照实验显示，TEAC在CD4和CD8之间是没有选择性的，并且使用FITC模型不改变预期结果。使用FITC模型不阻止T细胞的激活。图3A-C中所见的结果证明了在肿瘤细胞上有完整的抗CD3激活结构域时，所有T细胞亚群(CD4和CD8)的激活。
图4A-4C提供了ATTAC产生的选择性T细胞激活，在所使用的实验设计中，肿瘤细胞仅具有一个ATTAC组分且T细胞具有抗FITC ATTAC组分。用不同的结合有FITC的抗体对T细胞进行PL标记，然后用抗FITC ATTAC组分(CD3 VL(20G6)；SEQ ID NO：165)标记；用EpCAM VHATTAC组分(20G6；SEQ ID NO：166)标记靶细胞(MCF-7)。图4A显示了用ATTAC标记肿瘤细胞时的IFNγ释放。图4B(CD4 T细胞)和图4C(CD8 T细胞)通过CD69流式细胞术染色并使用高于背景的MFI作为读数证明了T细胞的激活。当用与CD8、CD52和CXCR3结合的结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM ATTAC组分/FITC ATTAC组分配对物有强烈应答。当使用抗CD8的结合有FITC的抗体时，CD8 T细胞被选择性激活而CD4 T细胞不被激活(如图4B和4C中的箭头所示)。
图5A-5I显示了T细胞在其表面上的蛋白表达，以及仅使ATTAC组分与CD52、CD8和CXCR3结合(经由FITC)导致T细胞的激活。测试了一系列T细胞抗原，如下所示：图5A(CD5)；图5B(CD8)；图5C(CD28)；图5D(CD45RO)；图5E(CD52)；图5F(HLA-DR)；图5G(CD19)；图5H(CD278(ICOS))；和图5I(CD279(PD-1))。
图6A-6F显示了FITC抗体不抑制TEAC对CD4 T细胞的激活。用不同的结合有FITC的抗体标记T细胞；用抗EpCAM VH和VL TEAC组分(20G6)标记靶细胞(MCF-7)。图6A显示了干扰素γ的释放。流式细胞仪原始数据显示了未标记的T细胞(图6B)或具有CD-19标记(图6C)、CD52标记(图6D)或CD8标记(Hit8a，6E)的T细胞。图6F整理了CD4 T细胞的流式细胞仪数据。当用结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM TEAC组分配对物有强烈应答。所结合的抗体不产生阻断。
图7A-7F显示了FITC抗体不抑制TEAC对CD8 T细胞的激活。如图6A-6F所述配组。当用结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM TEAC组分配对物有强烈应答。所结合的抗体不产生阻断。
图8A-8F显示了ATTAC对CD4 T细胞的选择性激活。如图6A-6F所述配组。当用与CD8、CD52或CXCR3结合的结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM ATTAC组分/FITCATTAC组分配对物有强烈应答。使用抗CD52或抗CXCR3的结合有FITC的抗体时，CD4 T细胞被激活。
图9A-9F显示了ATTAC对CD8 T细胞的选择性激活。如图6A-6F所述配组。当用与CD8、CD52或CXCR3结合的结合有FITC的抗体标记T细胞时，T细胞对EpCAM ATTAC组分/FITCATTAC组分配对物有强烈应答。当使用抗CD52、抗CXCR3或四种抗CD8的结合有FITC的抗体时，CD8 T细胞被激活。
图10A和10B显示了表达EpCAM的肿瘤细胞的FACS结果。过量表达EpCAM的MDA-MB-231细胞用抗EpCAM VH和VL标记，以形成抗CD8 ATTAC组分的结合结构域，并被肠激酶(蛋白酶)切割。仅T细胞时、EpCAM BiTE(SEQ ID NO：168；阳性对照)存在下、或当与未经处理的靶标MDA-MB-231细胞(阴性对照)一起培养时，T细胞的(图11D)或PBMC中的T细胞的(图11C)的激活对照包括干扰素释放。EpCAM VH是指抗EpCAM ATTAC1(靶向EpCAM癌症抗原并含有抗CD3 VH结构域(SEQ ID NO：166)的组分)。CD8 VL是指抗CD8 ATTAC2(靶向CD8并含有抗CD3VL结构域(SEQ ID NO：170)的组分)。
图12A-12C显示了ATTAC的浓度依赖性。用浓度增加的EpCAM VH ATTAC组分标记过表达EpCAM的MDA-MB-231细胞。用浓度增加的抗CD8VLATTAC组分(SEQ ID NO：172)标记T细胞或健康供体PBMC。图12A显示了将细胞共培养过夜并通过IFNγ释放测定其T细胞激活的结果。EpCAMx20G6-Vh是指抗EpCAM和抗CD3 VH ATTAC组分，而CD8x20G6-VL是指抗CD8和抗CD3 VL ATTAC组分。两个ATTAC组分的浓度不保持相等，以确定测定中是否存在主要(dominant)的ATTAC组分。抗CD8 ATTAC组分的惰性结合结构域被肠激酶(蛋白酶)切割。图12B显示了浓度增加的两种ATTAC组分的结果。对照包括来自在单独培养的PBMC中的T细胞、EpCAM BiTE(SEQ ID NO：168；阳性对照)存在下、或当与未处理的靶标MDA-MB-231细胞一起培养(阴性对照)时的干扰素释放(图12C)。
图13A和13B证明了在混合的T细胞激活测定中，使用与肿瘤细胞结合的ATTAC1和与结合至T细胞的FITC缀合抗体结合的ATTAC2来激活CD4或CD8 T细胞。用CD4-FITC、CD8-FITC或CD19-FITC(阴性对照)标记PBMC，并将其与结合有ATTAC1的肿瘤细胞一起培养。当抗CD4-FITC与T细胞结合时，仅CD4 T细胞被激活，而当抗CD8 FITC与T细胞结合时，只有CD8T细胞被激活。这证实了ATTAC2与T细胞亚群的结合仅激活那些与ATTAC2结合的T细胞，而不激活未结合有ATTAC2的其他T细胞亚群。
序列描述
表1A提供了本文引用的某些序列的列表。表1B提供了本文所用的某些构建体序列的列表。
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实施方案描述
I.ATTAC
术语ATTAC是指抗体肿瘤靶向组装复合物。使用复合物一词，本申请是指需要具有第一组分和第二组分两者以制备完整的功能性分子(即“复合物”)。术语复合物还指基于以下的布尔算子逻辑(Boolean operator logic)：(i)癌细胞上的抗原表达，(ii)蛋白酶位置，以及(iii)目标免疫细胞上的免疫细胞标志物。通过使用逻辑门控(logic gating)，我们避免了有关T细胞接合抗体的许多当前挑战。
ATTAC是指使用一个与癌症抗原结合的ATTAC组分(ATTAC component)和一个不与癌症抗原结合而是选择性地靶向免疫细胞的ATTAC组分。因此，ATTAC组分不具有平行配置(如在现有药剂中，ATTAC配对物的两个成员均与癌抗原结合)，而是具有反式配置。
在ATTAC组分或配对物中，包含(a)靶向免疫细胞结合剂的第一组分包含：
i.能够靶向癌症的靶向部分；
ii.第一免疫细胞接合结构域，当与第二免疫细胞接合结构域结合时，所述第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫细胞接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；
且(b)包含选择性免疫细胞结合剂的第二组分包含：
i.免疫细胞选择部分，其能够选择性地靶向免疫细胞；
ii.第二免疫细胞接合结构域，当与第一免疫细胞接合结构域结合时，所述第二免疫细胞接合结构域能够具有免疫细胞接合活性，其中当第一和第二免疫细胞接合结构域均不与惰性结合伴侣结合时，它们能够结合。
第一免疫细胞接合结构域或第二免疫细胞接合结构域的至少一个与惰性结合伴侣结合，使得除非去除惰性结合伴侣，否则第一和第二免疫细胞接合结构域彼此不结合。当存在惰性结合伴侣时，其通过切割位点与免疫细胞接合结构域结合，从而将惰性结合伴侣和与之结合的免疫细胞接合结构域分开，其中，所述切割位点是：
a.通过由癌细胞表达的酶被切割；
b.通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；
c.通过依赖补体的切割反应被切割；或
d.通过由与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。
A.单个多肽链或两个组分
在一些实施方案中，第一组分与第二组分共价结合。在一些实施方案中，第一组分不与第二组分共价结合。
在一些实施方案中，ATTAC由两个单独的组分构成(comprised of)。换句话说，ATTAC由作为独立多肽的第一和第二组分构成(comprised of)。
在一些组分中，ATTAC由单个多肽链构成(comprised of)。在一些实施方案中，第一和第二组分包含在单个氨基酸序列内。
当ATTAC由单个多肽链构成(comprised of)时，第一和第二组分可以通过接头而分隔。在一些实施方案中，所述接头共价结合第一和第二组分。在一些实施方案中，所述接头包含可切割的接头。在一些实施方案中，第一组分和第二组分之间的可切割的接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的切割位点是蛋白酶切割位点。SEQ ID NO：1-84列出了可以使用的一些示例性蛋白酶切割位点，但是本发明不限于此组蛋白酶切割位点且可以使用其他蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的切割位点是肿瘤相关蛋白酶切割位点。肿瘤相关蛋白酶是与肿瘤相关的蛋白酶。在一些实施方案中，与身体其他区域相比，肿瘤相关蛋白酶在肿瘤中具有更高的表达。表3A提供了肿瘤相关蛋白酶的示例，尽管在肿瘤中具有表达的任何蛋白酶都可以用于选择本发明的肿瘤相关蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，包含在共价结合第一组分和第二组分的接头内的切割位点是在血液中发现的蛋白酶的切割位点。在血液中发现的蛋白酶示例包括凝血酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和弗林蛋白酶。
B.免疫细胞选择部分
在一些实施方案中，ATTAC包含对特定免疫细胞特异的免疫细胞选择部分。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分对以下细胞特异：CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或工程化免疫细胞。工程化免疫细胞是指具有有新特异性的工程化受体的免疫细胞。工程化免疫细胞的示例包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK、NKT或γδT细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞选择部分靶向不是肿瘤抗原的免疫细胞标志物。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分允许ATTAC靶向免疫细胞，其中免疫细胞不是癌细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分不使ATTAC靶向淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。在一些实施方案中，ATTAC靶向实体瘤(换句话说，任何不是免疫细胞肿瘤的肿瘤)。
在一些实施方案中，免疫细胞选择部分不特异性结合调节性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选择部分不特异性结合TH17细胞。在一些实施方案中，选择性免疫细胞结合剂不靶向调节性免疫细胞上存在的标志物(包括但不限于CD4和CD25)。
表2列出了用于不同目标免疫细胞的一些代表性免疫细胞选择部分。
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C.能够靶向癌症的靶向部分
靶向部分通过将药剂递送至癌细胞的局部环境而在包含靶向免疫细胞接合剂的第一组分中起作用，从而实现局部化治疗策略。在某些实施方案中，靶向部分通过与癌细胞特异性结合来靶向癌细胞。在一些情况下，即使惰性结合伴侣结合第一免疫细胞接合结构域，靶向部分也特异性结合癌细胞。
在某些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段意指保留其对癌细胞上靶标的结合活性的任何抗体片段，例如scFv或其他功能性片段，包括缺乏轻链的免疫球蛋白、VHH、VNAR、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、抗体片段、双抗体(diabody)、scAB、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、Fd、CDR区，或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分或肽序列。VHH和VNAR是经典抗体的替代物，且即使它们产生自不同物种(分别为骆驼和鲨鱼)，我们也将把它们包含在抗体的抗原结合片段中。除非特别指出为“全长抗体”，否则当本申请提及抗体时，其本身包括提及其抗原结合片段。
某些抗体靶标(括号中是癌细胞类型的示例)可以包括：Her2/Neu(上皮恶性肿瘤)；CD22(B细胞，自身免疫性或恶性的)；EpCAM(CD326)(上皮恶性肿瘤)；EGFR(上皮恶性肿瘤)；PSMA(前列腺癌)；CD30(B细胞恶性肿瘤)；CD20(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD33(骨髓恶性肿瘤)；膜IgE(过敏性B细胞)；lgE受体(CD23)(过敏性疾病中的肥大细胞或B细胞)，CD80(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD86(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD2(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CA125(包括卵巢癌在内的多种癌症)；碳酸酐酶IX(包括肾细胞癌在内的多种癌症)；CD70(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD74(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD56(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CD40(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CD19(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；c-met/HGFR(胃肠道和肝恶性肿瘤；TRAIL-R1(多种恶性肿瘤，包括卵巢癌和结直肠癌)；DRS(多种恶性肿瘤，包括卵巢癌和结直肠癌)；PD-1(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；PD1L(包括上皮腺癌在内的多种恶性肿瘤)；IGF-1R(包括上皮腺癌在内的大多数恶性肿瘤)；VEGF-R2(与包括上皮腺癌在内的大多数恶性肿瘤相关的脉管系统；前列腺干细胞抗原(PSCA)(前列腺癌)；MUC1(上皮恶性肿瘤)；CanAg(肿瘤如结肠癌和胰腺癌)；间皮素(许多肿瘤包括间皮瘤以及卵巢癌和胰腺癌)；P-钙黏着蛋白(上皮恶性肿瘤，包括乳腺癌)；肌肉生长抑制素(myostatin)(GDF8)(许多肿瘤包括肉瘤、卵巢癌和胰腺癌)；Cripto(TDGF1)(上皮恶性肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌)；ACVRL 1/ALK1(多种恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤)；MUC5AC(上皮恶性肿瘤，包括乳腺癌)；CEACAM(上皮恶性肿瘤，包括乳腺癌)；CD137(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；CXCR4(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性的)；神经纤毛蛋白1(上皮恶性肿瘤，包括肺癌)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)(多种癌症，包括肝癌、脑癌和乳腺癌)；HER3/EGFR(上皮恶性肿瘤)；PDGFRa(上皮恶性肿瘤)；EphA2(多种癌症，包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌和小细胞肺癌)；CD38(骨髓瘤)；CD138(骨髓瘤)；α4-整联蛋白(AML、骨髓瘤、CLL和大多数淋巴瘤)。
在某些模式中，抗体包括抗表皮生长因子受体抗体例如西妥昔单抗(Cetuximab)、抗Her2抗体、抗CD20抗体例如利妥昔单抗(Rituximab)、抗CD22抗体例如伊诺珠单抗(Inotuzumab)、G544或BU59、抗CD70抗体、抗CD33抗体例如hp67.6或吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、抗MUC1抗体例如GP1.4和SM3、抗CD40抗体、抗CD74抗体、抗P-钙黏着蛋白抗体、抗EpCAM抗体、抗CD138抗体、抗E-钙黏着蛋白抗体、(抗CEA抗体、抗FGFR3抗体以及抗α4-整联蛋白抗体例如那他珠单抗(natalizumab)。
表3A提供了癌症类型、可能的靶向部分以及由那些癌症类型表达的蛋白酶的非限制性示例。与癌症相关的蛋白酶可以称为肿瘤相关蛋白酶。为制备ATTAC，可以对癌症进行鉴别，选择靶向部分的靶标(按需要)，以及针对癌症类型选择一种或两种蛋白酶(按需要)。
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表3B提供了关于可以用不同的靶向部分靶向的癌症的其他信息，包括一些靶向部分可能能够靶向多种不同类型的癌症的事实。在ATTAC中，第一组分将包含能够靶向癌症的靶向部分。
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具有结合肿瘤抗原并且对肿瘤细胞具有特异性的抗体是本领域公知的。表3C总结了关于与肿瘤抗原结合并且可以用作本发明的靶向部分的示例性抗体的所选出版物。
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FDA维护有用于治疗癌症的已批准抗体药物的清单，其中许多与癌症抗原结合并且可以在这种情况下使用。参见FDA网站上的The Orange Book Online或Drugs@FDA。FDA还在clinicaltrials.gov数据库中维护有正在进行的临床试验的清单，其可以通过疾病名称进行搜索。表3D提供了对肿瘤细胞具有特异性的已批准抗体的代表性清单。表3E提供了正在开发的对肿瘤细胞具有特异性抗体的代表性清单。
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本领域公知的其他抗体可用作靶向部分以靶向给定的癌症。抗体及其各自的抗原包括纳武单抗(抗PD-1Ab)、TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125(仿制))、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿芙土珠单抗(afutuzumab)(抗CD20)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)(抗CEA)、amatuximab(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴维昔单抗(bavituximab)(抗磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(bectumomab)(抗CD22)、贝利木单抗(belimumab)(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA相关抗原)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、莫比伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)(抗CD44 v6)、博纳吐单抗(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、维布妥昔单抗(抗CD30(TNFRSF8))、美坎珠单抗(cantuzumab mertansine)(抗粘蛋白CanAg)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab ravtansine)(抗MUC1)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)(抗前列腺癌细胞)、卡芦单抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索单抗(抗EpCAM、CD3)、cBR96-多柔比星免疫结合物(抗刘易斯-Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、西地珠单抗(cedelizumab)(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA相关抗原)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗IGF-1受体)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(抗MUC1)、可那木单抗(conatumumab)(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、达西珠单抗(dacetuzumab)(抗CD40)、达克珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、达妥珠单抗(dalotuzumab)(抗胰岛素样生长因子I受体)、达雷木单抗(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、德姆茨单抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫单抗(detumomab)(抗B淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(drozitumab)(抗DR5)、杜利他单抗(duligotumab)(抗HER3)、杜昔单抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、依美昔单抗(ecromeximab)(抗GD3神经节苷脂)、依屈洛单抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、埃罗妥珠单抗(抗SLAMF7)、艾西莫单抗(elsilimomab)(抗IL-6)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受体)、依诺替单抗(enoticumab)(抗DLL4)、恩妥昔单抗(ensituximab)(抗5AC)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)(抗抗粘着因子)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu、CD3)、埃达珠单抗(etaracizumab)(抗整联蛋白αvβ3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、法妥珠单抗(farletuzumab)(抗叶酸受体1)、FBTA05(抗CD20)、非拉妥珠单抗(ficlatuzumab)(抗HGF)、芬妥木单抗(figitumumab)(抗IGF-1受体)、法兰妥单抗(flanvotumab)(抗TYRP1(糖蛋白75))、夫苏木单抗(fresolimumab)(抗TGF β)、伏妥昔单抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔单抗(galiximab)(抗CD80)、加尼妥单抗(ganitumab)(抗IGF-I)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33)、吉妥昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、glembatumumab vedotin(抗GPNMB)、古塞库单抗(guselkumab)(抗IL13)、伊巴珠单抗(抗CD4)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)、伊鲁库单抗(icrucumab)(抗VEGFR-1)、伊戈伏单抗(igovomab)(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSF1R)、IMC-TR1(TGFβRII)、伊马曲单抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、依克拉单抗(inclacumab)(抗选择素P)、雷星英达妥昔单抗(indatuximab ravtansine)(抗SDC1)、伊珠单抗奥加米星(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、英妥木单抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹单抗(抗CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(抗CEA)、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)(抗PDCD1)、来沙木单抗(lexatumumab)(抗TRAIL-R2)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗CD33)、利鲁单抗(lirilumab)(抗KIR2D)、莫星洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)(抗CD56)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁米昔单抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受体))、马帕木单抗(mapatumumab)(抗TRAIL-R1)、马妥昔单抗(margetuximab)(抗ch4D5)、马妥珠单抗(matuzumab)(抗EGFR)、马维里单抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受体a-链)、米拉珠单抗(milatuzumab)(抗CD74)、明瑞莫单抗(minretumomab)(抗TAG-72)、米妥莫单抗(mitumomab)(抗GD3神经节苷脂)、莫加利单抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、moxetumomab pasudotox(抗CD22)、他那可单抗(nacolomabtafenatox)(抗C242抗原)、埃托那普妥莫单抗(naptumomab estafenatox)(抗5T4)、那妥单抗(namatumab)(抗RON)、奈昔木单抗(necitumumab)(抗EGFR)、奈伐苏单抗(nesvacumab)(抗血管生成素2)、尼妥珠(nimotuzumab)(抗EGFR)、纳武单抗(nivolumab)(抗IgG4)、巯诺莫单抗(nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(抗CD20)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奥拉他单抗(olaratumab)(抗PDGF-Rα)、阿那妥单抗(onartuzumab)(抗c-MET)、恩妥昔单抗(ontuxizumab)(抗TEM1)、莫奥珠单抗(oportuzumabmonatox)(抗EpCAM)、奥戈伏单抗(oregovomab)(抗CA-125)、奥特鲁单抗(otlertuzumab)(抗CD37)、潘科曼单抗(pankomab)(抗MUC1肿瘤特异性糖基化)、帕撒单抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)、帕考珠单抗(pascolizumab)(抗IL-4)、帕特利单抗(patritumab)(抗HER3)、培马单抗(pemtumomab)(抗MUC1)、培妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2/neu)、匹利珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1)、维汀匹那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22)、品妥莫单抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、波妥珠单抗维多丁(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普鲁米单抗(pritumumab)(抗波形蛋白)、PRO131921(抗CD20)、奎珠单抗(quilizumab)(抗IGHE)、雷妥莫单抗(抗N-羟乙酰神经氨酸)、拉德鲁单抗(radretumab)(抗纤连蛋白外结构域-B)、雷莫芦单抗(抗VEGFR2)、利妥木单抗(rilotumumab)(抗HGF)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗IGF-1受体)、罗乐单抗(roledumab)(抗RHD)、罗维珠单抗(rovelizumab)(抗CD11&CD18)、沙马利单抗(samalizumab)(抗CD200)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomabpendetide)(抗TAG-72)、塞巴坦单抗(seribantumab)(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、SGN-CD33A(抗CD33)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗FAP)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗IL-6)、索利单抗(solitomab)(抗EpCAM)、松妥珠单抗(sontuzumab)(抗抗粘着因子)、他巴单抗(tabalumab)(抗BAFF)、泰坦他卡妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)(抗甲胎蛋白)、帕他莫单抗(taplitumomab paptox)(抗CD19)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)(抗腱糖蛋白C)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗CD40)、替妥木单抗(teprotumumab)(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、替昔单抗(ticilimumab)(抗CTLA-4)、替加珠单抗(tigatuzumab)(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、托西莫单抗(tositumomab)(抗CS20)、托维单抗(tovetumab)(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、曲利单抗(tregalizumab)(抗CD4)、曲美单抗(tremelimumab)(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)(抗EpCAM)、乌布妥昔单抗(ublituximab)(抗CD20)、乌洛单抗(urelumab)(抗4-1BB)、范蒂姆单抗(vantictumab)(抗卷曲受体)、伐利昔单抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐他珠单抗(vatelizumab)(抗ITGA2)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)、维森单抗(vesencumab)(抗NRP1)、维西珠单抗(visilizumab)(抗CD3)、伏洛昔单抗(volociximab)(抗整联蛋白α5β1)、玛汀沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumabmafodotin)(抗CD70)、伏妥木单抗(votumumab)(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、扎芦木单抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎诺米单抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎妥昔单抗(zatuximab)(抗HER1)、齐拉木单抗(ziralimumab)(抗CD147(basigin))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAP1)和GDC-0199(抗Bcl-2)。
结合这些抗原的抗体也可以用作靶向部分，尤其是对于以下所指出的癌症类型：氨基肽酶N(CD13)、膜联蛋白A1、B7-H3(CD276，各种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、刘易斯Y(癌)、刘易斯X(癌)、甲胎蛋白(癌)、CA242(结直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺特异性抗原(前列腺)、前列腺酸磷酸酶(前列腺)、表皮生长因子(癌)、CD2(霍奇金病、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自身免疫疾病、恶性腹水)、CD19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤、B细胞肿瘤、自身免疫疾病)、CD21(B细胞淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金淋巴瘤)、CD33(白血病、自身免疫疾病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑色素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、Merkel细胞癌以及液体肿瘤、多发性骨髓瘤)、CD66e(癌)、CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌)、CD123(白血病)、粘蛋白(癌)、CD221(实体瘤)、CD22(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC和其他癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体瘤)、CEACAM3(结直肠癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳腺癌、结直肠癌和肺癌)、DLL4(A-样-4)、EGFR(各种癌症)、CTLA4(黑色素瘤)、CXCR4(CD 184、血液肿瘤学、实体瘤)、内皮糖蛋白(Endoglin)(CD 105、实体瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子、膀胱癌、头癌、颈癌、结肠癌、NHL前列腺癌和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGR1(自身免疫疾病)、FOLR(叶酸受体、卵巢癌)、FGFR(癌)、GD2神经节苷脂(癌)、G-28(细胞表面抗原糖脂、黑色素瘤)、GD3独特型(癌)、热休克蛋白(癌)、HER1(肺癌、胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人绒毛膜促性腺激素(癌)、IGF1R(实体瘤、血癌)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多发性骨髓瘤、RA、卡斯特曼病(Castleman’s disease)、IL6依赖性肿瘤)、整联蛋白(αvβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、αvβ5，对于各种癌症)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE 4(癌)、抗转铁蛋白受体(癌)、p97(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1、非霍奇金B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、支气管癌和胃肠道癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结直肠癌)、gp100(黑色素瘤)、MARTI(黑色素瘤)、MPG(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A、小细胞肺癌、NHL)、核仁素(nucleolin)、Neu致癌基因产物(癌)、P21(癌)、nectin-4(癌)、抗-(N-羟乙酰神经氨酸的互补位、乳腺癌、黑色素瘤癌)、PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)、PSMA(前列腺肿瘤)、PSA(前列腺)、ROB04、TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72、AML、胃癌、结直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(癌症)、Tie(CD202b)、组织因子、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤、NHL、其他癌症、RA和SLE)、TPBG(滋养层糖蛋白、肾细胞癌)、TRAIL-R1(肿瘤坏死细胞凋亡诱导配体受体1、淋巴瘤、NHL、结直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD106、黑色素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2(CD309)(各种癌症)。已经综述了一些其他肿瘤相关抗原靶标(Gerber等人，mAbs 20091：247-253；Novellino等人，Cancer Immunol Immunother.200554：187-207，Franke等人，Cancer Biother Radiopharm.2000，15：459-76，Guo等人，Adv Cancer Res.2013；119：421-475，Parmiani等人.JImmunol.2007178：1975-9)。这些抗原的示例包括分化簇(CD4、CDS5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD166、.CD168、CD184、CDw186、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白A1、核仁素、内皮糖蛋白(CD105)、ROB04、氨基肽酶N、-样-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-ab1、酪氨酸酶、生存素(survivin)、hTERT、肉瘤易位断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、多唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYPIB I、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAXS、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2和Fos相关抗原1。
在一些实施方案中，能够靶向癌症的靶向部分不是抗体，而是另一种类型的靶向部分。已知多种能够靶向癌症的靶向部分，包括DNA适体、RNA适体、白蛋白、脂质运载蛋白、纤连蛋白、锚蛋白、CH1/2/3支架(包括abdurin(IgG CH2支架))、菲诺体(fynomer)、Obody、DARPin、knotin、高亲和性多聚体(avimer)、阿特里体(atrimer)、anticallin、affilin、亲和体(affibody)、双环肽、cys-结(cys-knot)、FN3(adnectin、centryrin、pronectin、TN3)和库尼茨型结构域(Kunitz domain)。这些靶向部分以及其他非抗体支架结构都可用于靶向癌细胞。较小的非抗体支架可从血流中快速被清除，并且具有比单克隆抗体更短的半衰期。它们还显示出更快的组织渗透，这归功于其从毛细血管腔快速渗出穿过血管内皮和基底膜。参见Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20(1)：1271-1283(2015)。许多靶向癌症的非抗体支架都已经在临床开发中，也有其他候选药物在临床前阶段。见Vazquez-Lombardi，表1。
Figure BDA0002954248730000651
在另一个实施方案中，靶向部分可以是已知在癌细胞上表达的蛋白的结合伴侣。这样的表达水平可以包括过表达。例如，表4中描述的结合伴侣可以结合癌细胞上的以下靶标：
Figure BDA0002954248730000652
Figure BDA0002954248730000661
结合伴侣不需要包含表4B中列出的结合伴侣的全长或野生型序列。所需要的是结合伴侣与癌细胞上的靶标结合，且因此可以包括本领域公知的截短形式、类似物、变体和衍生物。
另外，在一些实施方案中，结合伴侣可以是能够与已知在癌细胞上表达的蛋白结合的适体。与癌细胞例如癌细胞结合的适体是公知的，且其设计方法是已知的。
基于细胞的SELEX系统可用于从随机候选文库中选择一组靶细胞特异性适体。可以将ssDNA或ssRNA池溶解在结合缓冲液中并变性，并然后与靶细胞一起温育。洗涤后，可以通过加热将结合的DNA或RNA洗脱，并然后与阴性细胞(如需要)一起温育，离心，并除去上清液。可以用生物素标记的引物通过PCR对上清进行扩增。可以使用链霉亲和素包被的珠子从生物素化反义链中分离出所选的有义ssDNA或ssRNA。为了增加亲和力，可以通过增加洗涤时间、缓冲液体积和洗涤次数来增加洗涤强度。经过所需的选择轮数后，可以对所选的ssDNA或ssRNA池进行PCR扩增，并将其克隆到大肠杆菌(E.coli)中并进行测序。参见Shangguan等人，Aptamers evolved from live cells as effective molecular probesfor cancer study，PNAS 103(32：11838-11843(2006)；Lyu等人，Generating CellTargeting Aptamers for Nanotherapeutics Using Cell-SELEX，Theranostics 6(9)：1440-1452(2016)；也参见Li等人，Inhibition of Cell Proliferation by an Anti-EGFRAptamer，PLo S One 6(6)：e20229(2011)。这些参考文献中的设计适体的具体方法和与癌细胞结合的特定适体通过引用并入本文。
例如，适体可以包含SEQ ID NO：94至164。在一些实施方案中，适体可以包含SEQID NO：95。将这些适体定向到EGFR，并且仅作为能与在癌细胞上存在的靶标结合的适体的代表来提供。针对癌细胞上其他靶标的其他适体同样是本文描述的一部分，并通过如引用如下所述而并入本文：Zhu等人，Progress in Aptamer Mediated Drug DeliveryVehicles for Cancer Targeting，Theranostics 4(9)：931-944(2014)。
在一些实施方案中，本文所用的适体以纳摩尔至皮摩尔范围(例如1皮摩尔至500纳摩尔，或1皮摩尔至100纳摩尔)的Kd结合至癌细胞上的靶标。
其他特异性靶向部分包括表4C中提供的那些。
Figure BDA0002954248730000671
Figure BDA0002954248730000681
D.免疫细胞接合结构域
当第一免疫细胞接合结构域与第二免疫细胞接合结构域结合时，免疫细胞接合结构域的功能能够具有免疫细胞接合活性。当去除惰性结合伴侣时，在第一和第二免疫细胞接合结构域配对在一起时，，它们可以与免疫细胞结合。这种结合能导致免疫细胞的激活。
在第一和第二免疫细胞接合结构域没有配对的情况下，第一和第二免疫细胞接合结构域均不能单独与免疫细胞结合。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、NKT细胞或工程化免疫细胞。在一些实施方案中，当第一和第二免疫细胞接合结构域配对在一起时，可以激活免疫细胞。
1.T细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是T细胞接合结构域。靶向T细胞接合剂(the targeted T-cell engaging agent)包含不能单独与T细胞接合的第一T细胞接合结构域。相反，当与不是靶向T细胞接合剂的一部分的第二T细胞接合结构域结合时，第一T细胞接合结构域能够具有活性。因此，第一和第二T细胞接合结构域可以是在单独时不具有T细胞接合活性但在彼此配对时则具有T细胞接合活性的任何两个部分。换句话说，第一和第二T细胞接合结构域是功能性活性蛋白的互补性两半。
当两个T细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与T细胞表面上的CD3抗原和/或T细胞受体结合，它们激活了T细胞。CD3存在于所有T细胞上，由命名为γ、δ、ε、ζ和η的亚基组成。在没有TCR受体复合物的其他组分的情况下，CD3的胞质尾足以传导激活T细胞所必需的信号。通常来说，T细胞细胞毒性的激活首先依赖于TCR与主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的结合，后者本身与位于独立细胞上的外源抗原结合。在正常情况下，只有当这个最初的TCR-MHC结合发生后，负责T细胞克隆扩增的CD3依赖性信号级联和最终的T细胞细胞毒性才会发生。然而，在本发明的一些实施方案中，当双组分系统与CD3和/或TCR结合时，由于CD3和/或TCR分子的交联(模拟免疫突触形成)，细胞毒性T细胞的激活能在没有独立TCR-MHC的情况下发生。这意味着T细胞可以以克隆独立的方式，即以不依赖于T细胞携带的特异性TCR克隆的方式被细胞毒性地激活。这允许了整个T细胞区室的激活，而不是仅激活具有某种克隆身份的特定T细胞。
在一些实施方案中，第一T细胞接合结构域是VH结构域，第二T细胞接合结构域是VL结构域。在其他实施方案中，第一T细胞接合结构域是VL结构域，第二T细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二T细胞接合结构域在配对在一起时可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二T细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以对T细胞表面表达的抗原如CD3或TCR特异。如果抗原是CD3，则一个潜在的T细胞接合结构域可以衍生自莫罗单抗(muromonab)(莫罗单抗-CD3或OKT3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、福雷芦单抗(foralumab)或SP34。本领域技术人员知晓各种抗CD3抗体，其中一些已被批准用于疗法或已在人类患者中进行了临床测试(参见Kuhn和Weiner Immunotherapy 8(8)：889-906(2016))。表5展示了关于示例性抗CD3抗体的所选出版物。
Figure BDA0002954248730000691
Figure BDA0002954248730000701
Figure BDA0002954248730000711
对TCR包括αβ和γδTCR具有特异性的抗体也是公知的。表6展示了关于示例性抗TCR抗体的所选出版物。
Figure BDA0002954248730000712
2.自然杀伤细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是自然杀伤细胞接合结构域。当两个自然杀伤细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与NK细胞表面的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，NK细胞表面上的抗原可以是NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46或DNAM。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至自然杀伤细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了自然杀伤细胞的特异性接合。自然杀伤细胞的接合能导致其激活并诱导自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞因子释放。
当两个自然杀伤细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，自然杀伤细胞可以特异性地使癌症特异性ATTAC组分所结合的癌细胞裂解。癌细胞的杀伤可以由穿孔素/粒酶系统或FasL-Fas接合介导。除了这种潜在的细胞毒性功能外，自然杀伤细胞还能够分泌促炎细胞因子，包括干扰素γ和肿瘤坏死因子α，它们可以激活紧邻的巨噬细胞和树突细胞，从而增强抗癌免疫应答。
在一些实施方案中，第一自然杀伤细胞接合结构域是VH结构域，第二自然杀伤细胞接合结构域是VL结构域。在其他实施方案中，第一自然杀伤细胞接合结构域是VL结构域，第二自然杀伤细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二自然杀伤细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二自然杀伤细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以对在自然杀伤细胞表面表达的抗原特异，例如NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46和DNAM。
表7展示了关于对在自然杀伤细胞表面表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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3.巨噬细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是巨噬细胞接合结构域。如本文所用，“巨噬细胞”可以指单核吞噬系统的任何细胞，例如谱系限制性(lineage-committed)的骨髓前体、循环单核细胞、定居巨噬细胞和树突细胞(DC)。定居巨噬细胞的示例可以包括枯否细胞(Kupffer cell)和小神经胶质细胞。
当两个巨噬细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与巨噬细胞表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，巨噬细胞表面上的抗原可以是CD89(Fcα受体1)、CD64(Fcγ受体1)、CD32(Fcγ受体2A)或CD16a(Fcγ受体3A)。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至巨噬细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了巨噬细胞的特异性接合。巨噬细胞的接合可以导致巨噬细胞吞噬癌细胞。
在一些实施方案中，经由与巨噬细胞表面上的抗原结合来诱导巨噬细胞的吞噬作用不依赖于Fc受体的结合，其先前已证明是通过巨噬细胞杀死肿瘤细胞的方法。通常来说，完整抗体与癌细胞结合，且抗体的Fc部分与Fc受体结合并诱导吞噬作用。
在一些实施方案中，巨噬细胞表面上的toll样受体的接合(参见专利申请US20150125397A1)导致巨噬细胞的接合。
当两个巨噬细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，它们可以诱导巨噬细胞吞噬癌症特异性ATTAC组分所结合的癌细胞。
在一些实施方案中，第一巨噬细胞接合结构域是VH结构域，第二巨噬细胞接合结构域是VL结构域。在其他实施方案中，第一巨噬细胞接合结构域是VL结构域，第二巨噬细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二巨噬细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二巨噬细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于在巨噬细胞表面上表达的抗原，例如CD89(Fcα受体1)、CD64(Fcγ受体1)、CD32(Fcγ受体2A)和CD16a(Fcγ受体3A)或toll样受体。
表8展示了关于对在巨噬细胞表面表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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4.嗜中性粒细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是嗜中性粒细胞接合结构域。当两个嗜中性粒细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与嗜中性粒细胞表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞表面上的抗原可以是CD89(FcαR1)、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、CD11b(CR3、αMβ2)、TLR2、TLR4、CLEC7A(Dectin1)、甲酰肽受体1(FPR1)、甲酰肽受体2(FPR2)或甲酰肽受体3(FPR3)。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至嗜中性粒细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了嗜中性粒细胞的特异性接合。嗜中性粒细胞的接合能导致吞噬作用和细胞摄取。
当两个嗜中性粒细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，嗜中性粒细胞可以吞噬靶细胞。
在一些实施方案中，第一嗜中性粒细胞接合结构域是VH域，而第二嗜中性粒细胞接合结构域是VL域。在其他实施方案中，第一嗜中性粒细胞接合结构域是VL结构域，而第二嗜中性粒细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二嗜中性粒细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二嗜中性粒细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于嗜中性粒细胞表面上表达的抗原，例如CD89(FcαR1)、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、CD11b(CR3、αMβ2)、TLR2、TLR4、CLEC7A(Dectin1)、FPR1、FPR2或FPR3。
表9展示了对嗜中性粒细胞表面上表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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5.嗜酸性粒细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是嗜酸性粒细胞接合结构域。当两个嗜酸性粒细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与嗜酸性粒细胞表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞表面上的抗原可以是CD89(Fcα受体1)、FcεRI、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)或TLR4。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至嗜酸性粒细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了嗜酸性粒细胞的特异性接合。嗜酸性粒细胞的接合能导致脱粒和释放预先形成的阳离子蛋白，例如EPO、主要碱性蛋白1(MBP1)和嗜酸性粒细胞相关核糖核酸酶(EAR，称为ECP)以及嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素。
当两个嗜中性粒细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，嗜中性粒细胞可吞噬靶细胞或分泌嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)；最后，他们可以激活其呼吸爆发级联反应以杀死被吞噬的细胞。
在一些实施方案中，第一嗜酸性粒细胞接合结构域是VH域，而第二嗜酸性粒细胞接合结构域是VL域。在其他实施方案中，第一嗜酸性粒细胞接合结构域是VL结构域，而第二嗜酸性粒细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二嗜酸性粒细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二嗜酸性粒细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于嗜酸性粒细胞表面上表达的抗原，例如CD89(Fcα受体1)、FcεRI、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)或TLR4。
表10展示了关于对嗜酸性粒细胞表面上表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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6.嗜碱性粒细胞接合结构域
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是嗜碱性粒细胞接合结构域。当两个嗜碱性粒细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与嗜碱性粒细胞表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，嗜碱性粒细胞表面上的抗原可以是CD89(Fcα受体1)或FcεRI。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至嗜碱性粒细胞上的表面蛋白上并使系统的另一半结合至癌细胞上允许了嗜碱性粒细胞的特异性接合。嗜碱粒细胞的接合可以导致释放嗜碱性粒细胞颗粒成分，例如组胺、蛋白聚糖和蛋白水解酶。他们还分泌白三烯(LTD-4)和细胞因子。
当两个嗜碱性粒细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，嗜碱性粒细胞可以脱粒。
在一些实施方案中，第一嗜碱性粒细胞接合结构域是VH域，且第二嗜碱性粒细胞接合结构域是VL域。在其他实施方案中，第一嗜碱性粒细胞接合结构域是VL结构域，且第二嗜碱性粒细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二嗜碱性粒细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二嗜碱性粒细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于嗜碱性粒细胞表面上表达的抗原，例如CD89(Fcα受体1)或FcεRI。
表11展示了关于对嗜碱性粒细胞表面上表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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7.γδT细胞
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是γδT细胞接合结构域。如本文所用，γδT细胞是指具有由一条γ链(γ)和一条δ链(δ)组成的TCR的T细胞。
当两个γδT细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与γδT细胞表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，γδT细胞表面上的抗原可以是γδTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB、DNAM-1或TLR(例如TLR2、TLR6)。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至γδT细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了γδT细胞的特异性接合。γδT细胞的接合能导致靶细胞的细胞溶解并释放促炎细胞因子，例如TNFα和IFNγ。
当两个γδT细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，γδT细胞可以杀死靶细胞。
在一些实施方案中，第一γδT细胞接合结构域是VH结构域，第二γδT细胞接合结构域是VL结构域。在其他实施方案中，第一γδT细胞接合结构域是VL结构域，第二γδT细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二γδT细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(通过这种方式，此表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二γδT细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于γδT细胞表面上表达的抗原，例如γδTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB、DNAM-1或TLR(TLR2、TLR6)。
表12展示了关于对在γδT细胞表面上表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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8.自然杀伤T细胞(NKT细胞)
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是NKT接合结构域。NKT细胞是指表达Vα24和Vβ11TCR受体的T细胞。
当两个NKT接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以与NKT表面上的抗原结合以接合这些细胞。在一些实施方案中，NKT表面上的抗原可以是αβTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB或IL-12R。
在一些实施方案中，使两组分系统的一半结合至NKT上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了NKT的特异性接合。NKT的接合能导致靶细胞的细胞溶解。
当两个NKT接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，NKT可以裂解靶细胞并释放促炎性细胞因子。
在一些实施方案中，第一NKT接合结构域是VH域，第二NKT接合结构域是VL域。在其他实施方案中，第一NKT接合结构域是VL域，第二NKT接合结构域是VH域。在这些实施方案中，第一和第二NKT接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(通过这种方式，其表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二NKT接合结构域是一对VH和VL结构域，则VH和VL结构域可以特异于NKT表面上表达的抗原特异，例如αβTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB或IL-12R。
表13展示了关于对NKT表面上表达的抗原特异的一些示例性抗体的所选出版物。
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9.工程化免疫细胞
在一些实施方案中，免疫细胞接合结构域是工程化免疫细胞接合结构域。
在一些实施方案中，工程化免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)细胞。在一些实施方案中，CAR包含能够紧密结合肿瘤抗原的细胞外结构域(例如，scFv)，其与部分衍生自由免疫细胞天然表达的受体的信号传导结构域融合。示例性的CAR描述在Facts about ChimericAntigen Receptor(CAR)T-Cell Therapy，Leukemia和Lymphoma Society，2017年12月中。CAR可包含对肿瘤抗原特异的scFV区、细胞内共刺激结构域以及接头和跨膜区。例如，CAR T细胞中的CAR可以包含与部分衍生自T细胞受体的信号传导域融合的肿瘤抗原胞外结构域。CAR也可以包含共刺激结构域，例如CD28、4-1BB或OX40。在一些实施方案中，由免疫细胞表达的CAR与肿瘤靶抗原的结合导致了免疫细胞的激活、增殖和靶细胞消除。因此，可以使用一系列在其scFV区、细胞内共刺激结构域以及接头和跨膜区不同的CAR，以产生工程化免疫细胞。
示例性的工程化免疫细胞包括CAR T细胞、NK细胞、NKT细胞和γδ细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞衍生自患者自己的免疫细胞。在一些实施方案中，患者的肿瘤表达与CAR的scFV结合的肿瘤抗原。
迄今研究的潜在CAR靶标包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、ROR1、Igk轻链、BCMA、LNGFR和NKG2D。然而，CAR技术将可用于开发针对多种肿瘤抗原的工程化免疫细胞。
在一些实施方案中，工程化免疫细胞是基因工程化免疫细胞。
当两个工程化免疫细胞接合结构域在双组分系统中缔合在一起时，它们可以结合工程化免疫细胞表面上的抗原以接合这些细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞表面上的抗原可以是在本申请所述的对T细胞、NK细胞、NKT细胞或γδ细胞具有特异性的接合结构域。
在一些实施方案中，使双组分系统的一半结合至工程化免疫细胞上的表面蛋白并使系统的另一半结合至癌细胞允许了工程化免疫细胞的特异性接合。工程化免疫细胞的接合能导致激活这些细胞的效应应答(effector response)，例如其靶标的细胞溶解和细胞因子的释放。
当两个工程化免疫细胞接合结构域在ATTAC中缔合在一起时，工程化免疫细胞可以杀死靶细胞。
在一些实施方案中，第一工程化免疫细胞接合结构域是VH结构域，而第二工程化免疫细胞接合结构域是VL结构域。在其他实施方案中，第一工程化免疫细胞接合结构域是VL结构域，而第二工程化免疫细胞接合结构域是VH结构域。在这些实施方案中，第一和第二工程化免疫细胞接合结构域在配对在一起时，可以包含scFv(通过这种方式，其表示是等同于scFv但实际上VH和VL不是单链构型)。
如果第一和第二工程化免疫细胞接合结构域是一对VH和VL结构域，则根据用于工程化的细胞类型，VH和VL结构域可以对工程化免疫细胞表面上表达的抗原特异。
E.惰性结合伴侣
ATTAC还包含至少一个惰性结合伴侣，其能够结合与其结合的免疫细胞接合结构域并阻止其与另一免疫接合结构域结合，除非发生某些情况。当免疫细胞接合结构域与至少一个惰性结合伴侣结合时，其不具有免疫细胞接合活性。
换句话说，所述至少一个惰性结合伴侣通过阻断免疫接合结构域与其互补配对物(另一个免疫细胞接合结构域)结合并阻止两个结构域连接在一起而具有免疫细胞接合活性，来削弱该免疫接合结构域的功能。这样，惰性结合伴侣与免疫细胞接合结构域结合，使得除非去除惰性结合伴侣，否则免疫细胞接合结构域不与另一免疫细胞接合结构域结合。关于所述的不结合，本申请不排除非特异性结合或低结合水平(例如，≤1％，≤5％，≤10％)。
在一些实施方案中，第一免疫细胞接合结构域与惰性结合伴侣结合。与第一免疫细胞接合结构域结合的惰性结合伴侣阻止了第一免疫细胞接合结构域与第二免疫细胞结合结构域的结合。
在一些实施方案中，第二免疫细胞接合结构域与惰性结合伴侣结合。与第二免疫细胞接合结构域结合的惰性结合伴侣阻止了第二免疫细胞接合结构域与第一免疫细胞结合结构域的结合。
在一些实施方案中，第一和第二免疫细胞接合结构域均与惰性结合伴侣结合。与第一和第二免疫细胞接合结构域结合的惰性结合伴侣阻止了两个免疫细胞接合结构域彼此的结合。
在一些实施方案中，惰性结合伴侣与免疫细胞接合结构域特异性结合。
在一些实施方案中，所述至少一个惰性结合伴侣是VH或VL结构域。在一些实施方案中，当ATTAC中的免疫细胞接合结构域是VH结构域时，惰性结合伴侣可以是VL结构域，且当第一免疫细胞接合结构域是VL结构域时，惰性结合伴侣可以是VH结构域。
如果第一组分包含靶向部分和VL免疫细胞接合结构域以及VH惰性结合伴侣，则在一些实施方案中，VH惰性结合伴侣具有与VL免疫细胞接合结构域结合的平衡解离常数，其大于VL免疫细胞接合结构域与第二组分中的其VH免疫细胞接合结构域伴侣的平衡解离常数。在一些实施方案中，当将VH转换为VL时，上述同样适用，反之亦然。
使用惰性结合伴侣作为构建体中免疫细胞接合结构域的错配伴侣可以使构建体(construct)更稳定并且更易于制造。在一些实施方案中，第一和第二免疫接合结构域均可与本文所述的惰性结合伴侣结合。在一些实施方案中，仅其中一个免疫结合结构域与惰性结合伴侣结合。
1.未激活的VH或VL结构域作为惰性结合伴侣
在一些实施方案中，当免疫细胞接合结构域是VH或VL结构域时，惰性结合伴侣与相应的VL或VH结构域同源，所述相应的VL或VH结构域能与所述免疫细胞结合结构域配对以形成功能性抗体并与免疫细胞抗原结合。这个免疫细胞抗原可以是存在于任何免疫细胞上的抗原，免疫细胞包括T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或工程化免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞抗原是CD3。
在一些实施方案中，惰性结合伴侣是VH或VL，当与免疫细胞接合结构域的其相应的VL或VH配对时其不能与抗原特异性结合，原因是在惰性结合伴侣中产生的一个或多个突变抑制了与靶抗原的结合。在一些实施方案中，惰性结合伴侣的VH或VL可以与对免疫细胞抗原特异的VH或VL相差一个或多个氨基酸。换句话说，可以在对靶免疫细胞抗原特异的VH或VL中产生一个或多个突变以产生惰性结合伴侣。
这些突变可以是，例如在对免疫细胞抗原特异的VH或VL的多肽序列中的取代、插入或缺失，以产生惰性结合伴侣。在一些实施方案中，对免疫细胞抗原特异的VH或VL中的突变可以在CDR1、CDR2或CDR3内产生，以产生惰性结合伴侣。在一些实施方案中，用作惰性结合伴侣的VH或VL可以保留与免疫细胞接合结构域配对的能力，但是所产生的配对的VH/VL结构域与免疫细胞抗原的结合降低。在一些实施方案中，惰性结合伴侣具有正常的亲和力以结合其相应的免疫细胞接合结构域，但是，与不包含惰性结合伴侣的突变的配对的VH/VL相比，配对的VH/VL对免疫细胞抗原的结合亲和力更低。例如，所述更低的亲和力可以是与免疫细胞抗原的结合低20倍、100倍或1000倍。
在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域是对免疫细胞抗原特异的VH，惰性结合伴侣是针对相同抗原的VL结构域，其具有一个或多个突变使得配对的VH/VL与抗原的结合降低或不与抗原结合。在一些实施方案中，第一免疫细胞结合结构域是对免疫细胞抗原特异的VL，惰性结合伴侣是针对相同抗原的VH结构域，其具有一个或多个突变使得配对的VH/VL与抗原的结合降低或不与抗原结合。
在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域是对免疫细胞抗原特异的VH，惰性结合伴侣是针对相同抗原的VL结构域，其具有一个或多个突变使得配对的VH/VL与抗原的结合降低或不与抗原结合。在一些实施方案中，第二免疫细胞结合结构域是对免疫细胞抗原特异的VL，惰性结合伴侣是针对相同抗原的VH结构域，其具有一个或多个突变使得配对的VH/VL与抗原的结合降低或不与抗原结合。
2.从无关抗体获得的惰性结合伴侣
在一些实施方案中，用作惰性结合伴侣的VH或VL与免疫细胞接合结构域的VL或VH无关。换句话说，惰性结合伴侣与通常与免疫细胞接合结构域的VL或VH缔合的相应VH或VL的序列之间的同源性可以很小或没有序列同源性。在一些实施方案中，用作惰性结合伴侣的VH或VL所来自的抗体或scFv可以不同于用作免疫细胞接合结构域的VL或VH。
如果两个组分均具有惰性结合伴侣，则在一些实施方案中，一个组分的VH惰性结合伴侣和另一组分的VL惰性结合伴侣可以来自不同的抗体。
F.切割位点
作为综述，切割位点可以是(i)通过由癌细胞表达的酶被切割；(ii)通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；(iii)通过依赖补体的切割反应被切割；(iv)通过与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。在一些实施方案中，切割位点是蛋白酶切割位点。
切割位点的作用是从第一免疫细胞接合结构域释放惰性结合伴侣。切割位点可以以不同方式起作用，以在癌细胞的微环境中从一个或两个免疫细胞接合结构域释放惰性结合伴侣。根据所采用的策略，切割可以发生在癌细胞内部或癌细胞外部。如果切割发生在癌细胞外部，则免疫细胞接合结构域无需先内化到细胞中并以经典的抗原加工途径被接合，即可被呈递。
在某些实施方案中，至少一个切割位点可以通过由癌细胞表达的酶被切割。例如，已知癌细胞表达某些酶，例如蛋白酶，且可以将这些用于这种策略中以切割ATTAC的一个或多个切割位点。通过非限制性示例的方式，组织蛋白酶B切割FR、FK、VA和VR等等；组织蛋白酶D切割PRSFFRLGK(SEQ ID NO：45)，ADAM28切割KPAKFFRL(SEQ ID NO：1)、DPAKFFRL(SEQID NO：2)、KPMKFFRL(SEQ ID NO：3)和LPAKFFRL(SEQ ID NO：4)；MMP2切割例如AIPVSLR(SEQID NO：46)、SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO：47)、HPVGLLAR(SEQ ID NO：48)、GPLGVRGK(SEQ IDNO：49)和GPLGLWAQ(SEQ ID NO：50)。也可以采用表1A或3A中列出的其他切割位点。与癌症相关的蛋白酶切割位点和蛋白酶是本领域公知的。Oncomine(www.oncomine.org)是在线癌症基因表达数据库，因此，当将本发明的药剂用于治疗癌症时，技术人员可以搜索Oncomine数据库以识别将适用于治疗给定癌症类型的一个特定蛋白酶切割位点(或两个蛋白酶切割位点)。其他数据库包括European Bioinformatic Institute(www.ebi.ac.uk)，尤其是(www.ebi.ac.uk/gxa)。蛋白酶数据库包括ExPASy Peptide Cutter(ca.expasy.org/tools/peptidecutter)和PMAP.Cut DB(cutdb.burnham.org)。
在一些实施方案中，至少一个切割位点可通过癌细胞内部的pH敏感的切割反应被切割。如果将ATTAC内化到细胞中，则切割反应可以在细胞内部发生并可以由癌细胞外部微环境与细胞内部之间的pH值变化触发。具体而言，已知一些癌症类型在癌细胞内部具有酸性环境。当内部癌细胞类型具有与细胞外微环境(特别是糖萼(glycocalyx))不同的特征性pH时，可以采用这种方法。因为pH切割可在溶菌酶中在所有细胞中发生，当使用pH敏感的切割位点时，对靶向剂的选择可能需要更高的特异性(如需要)。例如，当使用pH敏感的切割位点时，可能需要仅与癌细胞结合或高度优选地与癌细胞结合的靶向剂(例如，与间皮素结合的抗体用以治疗肺癌)。
在某些实施方案中，至少一个切割位点可以通过补体依赖的切割反应被切割。一旦ATTAC与癌细胞结合，就可以触发患者的补体级联反应。在这种情况下，通过使用对补体蛋白酶敏感的切割位点，补体级联反应也可以用于从第一免疫细胞接合结构域切割惰性结合伴侣。例如，C1r和C1s以及C3转化酶(C4B，2a和C3b，Bb)是丝氨酸蛋白酶。C3/C5和C5也是补体蛋白酶。也可以使用甘露糖相关结合蛋白(MASP)，其是也参与补体级联反应并负责将C4和C2切割为C4b2b(C3转化酶)的丝氨酸蛋白酶。例如但不限于，C1s切割YLGRSYKV和MQLGRX。MASP2被认为可切割SLGRKIQI。补体组分C2a和补体因子Bb被认为可切割GLARSNLDE。
在一些实施方案中，至少一个切割位点可以通过由与ATTAC中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。例如，通过使蛋白酶结合至将蛋白酶递送至癌细胞微环境的靶向剂，可以将任何蛋白酶同时引导至该位置。靶向剂可以是本文所述的任何靶向剂。蛋白酶可以通过肽或化学接头被固定在靶向剂上，并且在与靶向剂结合时可以保持足够的酶活性。
在一些实施方案中，第一组分和第二组分均与惰性结合伴侣错配。在一些实施方案中，第一组分和第二组分中的蛋白酶切割位点是相同的。在其他实施方案中，第一组分和第二组分中的蛋白酶切割位点是相同蛋白酶的不同切割位点。在其他实施方案中，第一组分和第二组分中的蛋白酶切割位点是不同蛋白酶的切割位点。在采用两种不同蛋白酶的一些实施方案中，癌细胞表达两种蛋白酶。
在一些实施方案中，在第一组分中，处于未切割状态的惰性结合伴侣分别干扰VL或VH免疫接合结构域与第二组分中的其伴侣VH或VL免疫细胞接合结构域的特异性结合。在一些实施方案中，处于未切割状态的惰性结合伴侣分别抑制VL或VH免疫细胞接合结构域与第二组分中的其伴侣VH或VL免疫细胞接合结构域的结合，从而使得VL或VH免疫细胞接合结构域与第二组分中的处于未切割状态的其伴侣VH或VL免疫细胞接合结构域的解离常数(Kd)分别比VL或VH免疫细胞接合结构域与第二组分中的处于切割状态的其伴侣VH或VL免疫细胞接合结构域的Kd大至少100倍。
G.接头
除切割位点外，可以任选使用接头将ATTAC的单独部分连接在一起。接头包括将这些部分连接在一起的任何化学部分。在一些实施方案中，接头可以是柔性接头。接头包括肽、聚合物、核苷酸、核酸、多糖和脂质有机物质(例如聚乙二醇)。在一些实施方案中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是约2-100个、10-50个或15-30个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度可以是至少10个，至少15个或至少20个氨基酸并且长度不超过80个，不超过90个或不超过100个氨基酸。在一些实施方案中，接头是具有单个或重复的以下的肽接头：GGGGS(SEQ ID NO：85)、GGGS(SEQ ID NO：86)、GS(SEQ ID NO：87)、GSGGS(SEQ ID NO：88)、GGSG(SEQ ID NO：89)、GGSGG(SEQ ID NO：90)、GSGSG(SEQ ID NO：91)、GSGGG(SEQ ID NO：92)、GGGSG(SEQ ID NO：93)和/或GSSSG(SEQ ID NO：94)序列。
在一些实施方案中，接头是马来酰亚胺(MPA)或SMCC接头。
H.制备方法
可以使用基因工程技术来制备本文所述的ATTAC。具体而言，可以在合适的宿主中表达核酸以产生ATTAC。例如，可以制备包含编码ATTAC的核酸序列的载体，所述ATTAC含有其所有组分部分和接头，并且载体可以用于转化合适的宿主细胞。
根据宿主的性质和将核酸引入宿主的方式，以及是否需要游离基因(episomal)维持或整合，也可以在载体中使用各种调控元件。
也可以采用化学连接技术，例如使用马来酰亚胺或SMCC接头。
在结合伴侣是适体的情况下，本领域普通技术人员将理解如何使适体与蛋白结合，即免疫细胞接合结构域。可以使用硫醇键或其他的标准结合化学使适体结合。可以使马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或SH基团固缚适体上，以使其结合到免疫细胞接合结构域上。
II.药物组合物
ATTAC可以用作药物组合物。这样，它们可以与药学上可接受的载体一起制备。如果需要胃肠道外施用，可以在例如无菌、无热原的注射用水或无菌、无热原的盐水中提供ATTAC。或者，可以以冻干的形式提供ATTAC，用于添加无菌液体载体以重悬。
III.ATTAC的使用方法
本文所述的ATTAC可用于在以癌细胞的存在为特征的患者中治疗疾病的方法，包括向患者施用包含至少第一和第二组分的ATTAC，每个组分在以上各种实施方案中均已详细描述。另外，本文所述的药剂也可以用于将患者自身的免疫应答靶向至癌细胞的方法，包括向患者施用ATTAC。
在一些实施方案中，患者患有癌症或公认的癌前状态。在一些实施方案中，患者未检测到癌症，但是处于发展癌症的高风险中，包括具有与癌症风险增加相关的突变。在一些实施方案中，处于发展癌症的高风险中的患者患有具有高转化风险的癌前肿瘤。在一些实施方案中，处于发展癌症的高风险中的患者具有与高风险相关的基因谱。在一些实施方案中，基于循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞的存在来确定患者中癌症或癌前状态的存在。在一些实施方案中，治疗是预先性或预防性的。在一些实施方案中，治疗减慢或阻止癌症的发生或复发。
可以由患者的医师选择向患者施用的药剂的量，以提供治疗所讨论病况的有效量。可以在足以在患者体内其作用的相近时间段内，以同一制剂或两种不同制剂的形式施用ATTAC的第一组分和第二组分。
接受治疗的患者可以是人。患者可以是灵长类动物或任何哺乳动物。或者，患者可以是动物，例如家养动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如实验室啮齿动物，例如小鼠、大鼠或兔子)或在农业中重要的动物(例如马、牛、绵羊或山羊)。
癌症可以是实体或非实体恶性肿瘤。癌症可以是任何癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、淋巴增生性病症、骨髓增生异常病症、骨髓增生性疾病或癌前病变。
在一些实施方案中，ATTAC治疗的患者患有以高水平的调节性T细胞的存在为特征的肿瘤(参见表1的Fridman WH等人，Nature Reviews Cancer 12：298-306(2012))。在患有以高水平的调节性T细胞的存在为特征的肿瘤的患者中，ATTAC疗法可以优于其他非选择性地靶向T细胞的疗法，例如非选择性BiTE。在一些实施方案中，ATTAC疗法避免了调节性T细胞的接合。在一些实施方案中，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的激活的T细胞不是调节性T细胞。在一些实施方案中，ATTAC疗法不激活调节性T细胞。
在一些实施方案中，使用生物标志物的存在来选择接受ATTAC的患者。本领域已知多个肿瘤标志物，例如在www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet上描述的那些。在一些实施方案中，肿瘤标志物是ALK基因重排或过表达；甲胎蛋白；β-2-微球蛋白；β-人绒毛膜促性腺激素；BRCA1或BRCA2基因突变；BCR-ABL融合基因(费城染色体(Philadelphia chromosome))；BRAF V600突变；C-kit/CD117；CA15-3/CA27.29；CA19-9；CA-125；降钙素；癌胚抗原(CEA)；CD20；嗜铬粒蛋白A(CgA)；染色体3、7、17或9p21；上皮来源的循环肿瘤细胞
Figure BDA0002954248730001001
细胞角蛋白片段21-1；EGFR基因突变分析；雌激素受体(ER)/孕激素受体(PR)；纤维蛋白/纤维蛋白原；HE4；HER2/neu基因扩增或蛋白过表达；免疫球蛋白；KRAS基因突变分析；乳酸脱氢酶；神经元特异性烯醇化酶(NSE)；核基质蛋白22；程序性死亡配体1(PD-L1)；前列腺特异性抗原(PSA)；甲状腺球蛋白；尿激酶纤溶酶原激活子(uPA)；纤溶酶原激活子抑制剂(PAI-1)；5-蛋白标签(5-protein signature)
Figure BDA0002954248730001002
21-基因标签(21-gene signature)(Oncotype
Figure BDA0002954248730001005
)；或70-基因标签
Figure BDA0002954248730001004
可以单独施用或与其他形式的疗法联合施用ATTAC，其他形式的疗法包括手术、放疗、传统化学疗法或免疫疗法。
在一些实施方案中，免疫疗法是检查点阻断剂(checkpoint blockade)。检查点阻断剂是指抑制或阻断对免疫功能抑制的抑制性检查点分子的药剂。在一些实施方案中，检查点阻断剂靶向CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、CD40、TIGIT、TIM3、VISTA或HLA-G。
在一些实施方案中，免疫疗法是免疫细胞因子或细胞因子融合物。细胞因子是指身体天然产生以激活和调节免疫系统的细胞信号传导蛋白。细胞因子融合物是指包含全部或部分细胞因子的工程化分子。例如，细胞因子融合物可以包含与允许靶向肿瘤的抗体结合的全部或部分细胞因子，例如Darleukin(参见Zegers等人(2015)Clin.Cancer Res.，21，1151-60)、Teleukin(参见WO2018087172)。
在一些实施方案中，免疫疗法是癌症治疗疫苗接种。在一些实施方案中，癌症治疗疫苗接种增强了身体对抗癌症的天然防御。这些可以针对共同的肿瘤抗原(例如E6、E7、NY-ESO、MUC1或HER2)或针对个体化的突变新抗原。
实施例
实施例1：用ATTAC标记T细胞
为了促进ATTAC平台的初始测试并证明概念性验证，使用采用FITC的模型系统。用针对免疫细胞标志物的FITC标记的抗体染色免疫细胞，并将抗FITC ATTAC组分用于初始测试。
因此，在这个模型中，抗FITC ATTAC组分(SEQ ID NO：165)充当衔接子ATTAC组分，由此，首先，可使用FITC标记的抗体来标记目标免疫细胞上的不同靶抗原。使用衔接子ATTAC组分意味着，可以使用构成所需两个组分的一半的一个ATTAC组分来测定免疫细胞表面上的大量抗原。然后，仅当FITC标记的抗体与目标细胞结合时，免疫细胞随之会被标记上抗FITC ATTAC组分。抗FITC ATTAC组分将含有一半的免疫细胞激活结构域，而另一半的免疫细胞激活结构域来自与不想要的肿瘤细胞上的抗原结合的第二ATTAC组分。
在这个实验中，我们计数T细胞(4x106个)，并在RPMI+10％NBS中洗涤两次。将T细胞重悬至每毫升2.6x106个，并添加95μl到15ml Falcon管中，并添加5μl FITC抗体(不添加任何物质到未处理的T细胞中)，然后在室温下温育30分钟。
通过添加5ml培养基并离心沉降来洗去多余的抗体。除去上清液并将细胞重悬于残余培养基(约80μl)中。向每个管中添加100μl培养基。
向每个管中添加20μl抗FITC ATTAC组分(SEQ ID NO：165-300μg/ml)，使得最终浓度为30μg/ml-在室温下温育30分钟。
通过加入5ml培养基并离心沉降来洗去多余的ATTAC组分。除去上清液并将细胞重悬至每毫升0.3x106个，然后以每孔100μl添加到96孔U底平板中。
然后通过抗FITC ATTAC组分用CD3-VL(来自20G6抗CD3克隆)标记T细胞。
实施例2：用ATTAC标记肿瘤细胞
不希望的肿瘤细胞用ATTAC的组合或T细胞接合抗体(TEAC)组分标记，其与EpCAM结合，并且一旦在细胞表面加工，即重组产生功能性抗CD3激活结构域。TEAC是指其中的两个组分均靶向癌细胞的试剂盒或组合物(参见WO2017/087789)。TEAC缺少ATTAC中所包含的免疫细胞选择部分。这个配对用作阳性对照，因为这个配对通过分泌细胞因子产生T细胞应答。
为了与抗FITC ATTAC组分配对，不希望的肿瘤细胞用与肿瘤细胞上的EpCAM结合的ATTAC组分标记，并且一旦在细胞表面加工，就会表达对应于抗FITC ATTAC组分的CD3结构域，因此，一旦具有抗FITC ATTAC组分的T细胞和具有抗EpCAM ATTAC组分的肿瘤细胞混合在一起，就会有功能性的抗CD3 VH-VL结构域来激活想要的T细胞亚群。计数MCF-7细胞(12x106个)，并在RPMI+10％NBS中洗涤两次。
重悬在培养基中，使得每160μl中有300,000个细胞，并添加2.56ml到两个15mlFalcon管中，这两个Falcon管标记有(i)EpCAM VH TEAC组分(SEQID NO：166)和EpCAM VLTEAC组分(SEQ ID NO：167)(当两个组分均靶向癌细胞且两个组分均不含免疫细胞选择部分时，这两组分形成TEAC[用作对照])和(ii)仅EpCAM VH ATTAC组分(SEQ ID NO：166)。另添加160ul到另外两个Falcon管，其为(iii)BiTE标记的(SEQ ID NO：168)和(iv)未经处理的。
将320μl EpCAM-20G6 VL TEAC组分(300pg/ml)和320μl EpCAM-20G6VH TEAC组分(300μg/ml)混合在一起，并添加640μl到管(i)中。添加320μl EpCAM-20G6 VH ATTAC组分(300μg/ml)到管(ii)中。每个ATTAC/TEAC组分的终浓度是30μg/ml。在室温下温育30分钟。
通过添加5ml培养基并离心沉降来洗去多余的ATTAC/TEAC组分。除去上清液并将细胞重悬至每毫升1x106个，并以每孔100μl添加到已含有T细胞的每孔中(见上文)。
在管(i)中，肿瘤细胞用含有VH和VL的TEAC组分标记。在试管(ii)中，肿瘤细胞仅用含有抗CD3的VH结构域的EpCAM ATTAC组分标记，且这能补充可在T细胞上发现的抗CD3的VL结构域。
实施例3：对照
作为阳性对照，肿瘤细胞用BiTE(SEQ ID NO：168)标记，以证明如果完整的抗CD3分子在肿瘤细胞的表面上，则T细胞可以被激活。作为阴性对照，将T细胞与未处理的肿瘤细胞一起温育，以证明如果肿瘤细胞表面上没有抗CD3分子，则T细胞不会被激活。
对于经BiTE处理的细胞，添加20μl BiTE(SEQ ID NO：168-20μg/ml)。BiTE的终浓度是2μg/ml。在室温下温育30分钟。
通过添加5ml培养基并离心沉降来洗去多余的BiTE。除去上清液并将细胞重悬至每毫升1x106个，且每孔添加100μl。
对于未处理的靶细胞，不添加任何物质。在室温下温育30分钟。
添加5ml培养基并离心沉降。除去上清液并重悬细胞至每毫升1x106个，且每孔添加100μl。
在37℃下将平板温育过夜，并使用100μl上清液用于IFN-γELISA，然后合并来自三重复孔的细胞并用于FACS染色。
实施例4：IFN-γELISA
对于IFN-γELISA测定法，使用来自ThermoFisher的试剂盒(Cat#88-7316-77)。
通常的IFNγ测定法背景：已知体外细胞因子标志物的表达，例如IFNγ的表达，对T细胞应答具有预测价值，并因此可预测体内结果。如Ghanekar等人，Clin Diag LabImmunol j8(3)：628-31(2001)中所描述的，通过细胞因子流式细胞术(CFC)测量的CD8+ T细胞中的IFNγ表达是细胞毒性T淋巴细胞应答的替代标志物。Ghanekar的第628页。先前的研究显示，CD8+ T细胞的IFNγ表达与CTL效应细胞的活性之间的相关性强。Ghanekar的第630页。先前的研究显示，使用IFNγ表达的数据可以在临床环境中评估CD8+ T细胞应答时允许更高的准确性。Ghanekar的第631页。这表明了已知本文的细胞因子表达测定对于体内和临床应答具有预测价值。尽管本文的方法因为存在多种评估IFNγ表达的方法而没有完全遵循Ghanekar的方法步骤，但Ghanekar证明了IFNγ的表达是T细胞活性的指标(proxy)。
实施例5：流式细胞术
将细胞在3ml FACS缓冲液(PBS+2％血清)中洗涤，并弃去上清液。用抗CD3、CD4、CD8和CD69(T细胞激活标志物)的抗体将细胞染色30分钟。用FACS缓冲液洗去多余的抗体。将细胞过滤，然后在流式细胞仪上运行。
实施例6：结果
图3A-3C提供了来自TEAC的选择性T细胞激活的结果。这个实验证明，用结合有FITC的抗体标记T细胞不会改变其识别肿瘤细胞表面上的CD3分子并响应于此而被激活的能力。靶细胞将被EpCAM-CD3VH和EpCAM-CD3VL TEAC组分结合(并因此具有抗CD3分子的两半)。如图3A所示，如预期，在用TEAC标记的肿瘤细胞进行的所有测试中，IFNγ的释放量非常相似，因此，结合有FITC的抗体在T细胞表面没有明显的抑制作用，即没有被所结合的抗体阻断。
对照的表现良好，BiTE引起强的T细胞激活，且将它们与未标记的靶细胞(细胞表面没有抗CD3)一起温育时，没有T细胞激活。因此，更具体地说，这个对照实验显示，TEAC在CD4和CD8之间不具有选择性，且使用FITC模型不会改变预期结果。使用FITC模型不会阻止T细胞激活。图3A-C中所见的结果显示了当肿瘤细胞上具有完整的抗CD3激活结构域时，被激活的所有T细胞亚群(CD4和CD8)。
图3B和3C通过CD69流式细胞术染色并使用高于背景的平均荧光强度作为读数(readout)证明了T细胞的激活。与IFNγ的结果类似，CD4 T细胞的激活(图3B)再次证明了标记T细胞的抗体没有抑制作用。使用CD8 T细胞可见类似的结果(图3C)。
图4A-C提供了ATTAC选择性激活T细胞的进一步证据。相同实验的这一部分是图3的重复，但是这次，肿瘤细胞仅具有一个ATTAC组分(EpCAM VH(SEQ ID NO：166))；一半的抗CD3分子)且T细胞具有抗FITC ATTAC组分(抗FITC VH(SEQ ID NO：165)；互补的半个抗CD3分子)。当将IFNγ结果视作T细胞激活的指标时(图4A)，仅当T细胞用CD52、CD8和CXCR3标记时，T细胞被激活。当用结合有FITC的抗体标记的T细胞标记与CD8、CD52和CXCR3结合时，可见T细胞对EpCAM ATTAC组分/FITC ATTAC组分配对物的强应答。图4B(CD4 T细胞)和图4C(CD8 T细胞)通过CD69流式细胞术染色并使用高于背景的MFI作为读数证明了T细胞的激活。当使用抗CD8 FITC ATTAC组分时，可见CD8 T细胞的选择性激活，并且没有CD4T细胞的激活(参见图4B中和图4C中的箭头)。
因此，即使所有T细胞均在其细胞表面上表达所列蛋白(参见图5A-5I)，仅在ATTAC组分与CD52、CD8和CXCR3结合(经由FITC)时才允许T细胞的激活。
在进行实验之前用结合有FITC的抗体对T细胞进行染色，以证明FITC将在T细胞表面用于与抗FITC ATTAC组分结合。
图4B和4C通过CD69流式细胞术染色并使用高于背景的平均荧光强度作为读数再次证明了T细胞的激活。CD4和CD8 T细胞都将表达CD52、CD5、CXCR3和HLA-DR。因此，预期结果显示用这些抗体标记的CD4和CD8 T细胞均被激活，并且与IFNγELISA的结果相符。
图4B和4C中带有CD8标记的结果在此处是最重要的，因为它们表明了ATTAC可以相对于一种类型的T细胞而特异性激活另一种类型的T细胞。当所有T细胞均标记有CD8-FITCATTAC组分和抗FITC ATTAC组分时，这些蛋白将仅结合CD8 T细胞而非CD4 T细胞。一旦将所有的T细胞与表达互补ATTAC组分的肿瘤细胞温育过夜，从流式细胞术中通过CD69染色可以看出CD4 T细胞没有被激活，但CD8 T细胞被激活。
图6A-8F中的结果使用了与上述相同的方法，且与图3A-C和4A-C中所示实验的不同之处仅在于，在运行实验之前使用了新鲜分离的未经刺激的T细胞以及添加了更多的结合有FITC的抗体用于标记T细胞。
图6A-6F提供了TEAC选择性激活T细胞而不被FITC抗体阻断的其他证据。
靶细胞具有EpCAM-CD3VH和EpCAM-CD3VL两者(因此具有抗CD3分子的两半)。如图6A所示，如预期，在用EpCAM VH/VL TEAC配对物标记的肿瘤细胞进行的所有测试中，IFNγ的释放量非常相似，因此，结合有FITC的抗体在T细胞表面没有明显的抑制作用，即没有被所结合的抗体阻断。
图6A中的对照表现良好，BiTE引起强的T细胞激活，且将它们与未标记的靶细胞(细胞表面没有抗CD3)一起温育时，没有T细胞激活。
图6B-6E是代表性的原始数据流式细胞图，且图6F整理了CD4 T细胞的T细胞激活数据。图6B-6E中的短划线图显示了未经处理的T细胞的CD69染色，其充当CD69激活的背景水平。图6B-6E中的实线图显示了与ATTAC标记的肿瘤细胞一起温育过夜的T细胞的CD69染色。图6B-6E示出了代表性的原始数据流式细胞图，并在图6F中示出了经整理的数据。
如预期，所有抗体标记的T细胞均存在非常相似的CD4 T细胞激活，因为两个TEAC组分均已结合至肿瘤细胞。
图7A-7F提供了与图6A-F类似的信息，但涉及CD8 T细胞。图7F显示了所有抗体标记的T细胞的CD8 T细胞激活相似，因为两个TEAC组分均已结合至肿瘤细胞。图7B-7E示出了代表性的原始数据流式细胞图，且图7F中示出了经整理的数据。
图8A-8F提供了附加信息并基于图6A-6F和7A-7F，但是这次，肿瘤细胞被一个ATTAC组分(一半的抗CD3分子)结合，且T细胞被抗FITC ATTAC组分(互补的一半抗CD3分子)结合。当将IFγ结果视为T细胞激活的指标时，仅当用CD52、CD8(四个不同的抗CD8抗体克隆)和CXCR3标记T细胞时，T细胞被激活(图8A)。同样，图8B-8E示出了代表性的原始数据流式细胞图，且图8F示出了经整理的数据。
仅当与CD52和CXCR3抗体结合时才可见CD4 T细胞的激活，而当与包括CD8抗体的其他抗体结合时不可见CD4 T细胞的激活。
图9A-9F提供了与图8A-8F所示类似的实验，但是针对的是CD8 T细胞。如经整理的数据(图9F)所示，CD52和CXCR3抗体以与激活CD4 T细胞的方式相同的方式激活CD8 T细胞，但这次，CD8抗体也激活CD8 T细胞。
这些数据支持使用CD8 FITC抗体和抗FITC ATTAC组分作为使抗CD3VL在T细胞表面上(在此它可以与通过结合EpCAM ATTAC组分而存在于肿瘤细胞表面的抗CD3 VH配对)的手段，来特异性激活CD8 T细胞而不是CD4T细胞。
实施例7：使用抗CD8ATTAC的FAC分析实验
实验是直接针对免疫细胞进行的，而不是使用采用FITC的模型系统。
ATTAC包括两个组分。在这些实施例中，为方便起见，将包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分称为ATTAC1，并将包含所选免疫细胞结合剂的第二组分称为ATTAC2。
在一些实验中，将包含能够靶向癌症的靶向部分的组分与也包含能够靶向癌症以产生TEAC的靶向部分的第二组分一起使用。TEAC在本文中用作对照。TEAC对照显示出在两个组分均靶向癌细胞时被诱导的活性。
用抗EpCAM ATTAC1(含有抗CD3 VH结构域(SEQ ID NO：166))标记过量表达EpCAM的MDA-MB-231细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。
用抗CD8 ATTAC2(含有抗CD3 VL结构域(SEQ ID NO：170))标记来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。
用抗EpCAM TEAC标记对照细胞。对于使用抗EpCAM TEAC(SEQ ID NO：166和167)的实验，两个组分都结合肿瘤细胞上的EpCAM(没有与免疫细胞结合的靶向部分)。因此，在这个对照实验中，TEAC配对物将不会赋予免疫细胞选择部分特异性。
然后将PBMC与肿瘤细胞以1∶2的PBMC对肿瘤细胞比例进行共培养。可通过添加外源蛋白酶(肠激酶)使ATTAC变为蛋白水解可激活的，其中添加或不添加蛋白酶到混合细胞中。然后将共培养的细胞在37℃下温育过夜。
温育后，将共培养的细胞在FACS缓冲液(PBS+2％血清)中洗涤，并将其用CD3 APC-Cy7、CD4 PE、CD8 APC和CD69 FITC标记用于流式细胞术，以确定CD4和CD8 T细胞亚群的T细胞激活水平(通过CD69染色的增加来测量)。
在添加肠激酶(蛋白酶)的情况下，用抗EpCAM ATTAC1和抗CD8ATTAC2处理后可见CD8 T细胞的激活增加(图10B，短划线)。在不添加外源蛋白酶时对于标记的PBMC(图10B，实线)，或对于未经处理的PBMC(填充直方图)，此ATTAC配对物没有激活。这些结果证实ATTAC活性需要蛋白水解激活。此外，在蛋白酶的存在下，用抗EpCAM ATTAC1和抗CD8ATTAC2处理后，CD4 T细胞亚群没有激活(图10A，短划线)，这与未经处理的PBMC结果相似(填充直方图)。
当TEAC的两个组分均结合到肿瘤细胞上(对照，其中TEAC组分配对物两者均与EpCAM结合)以在肿瘤细胞表面上形成功能性抗CD3部分时，如CD69染色所测量，CD4 T细胞(图10A，点线)和CD8 T细胞(图10B，点线)均被激活。
这些结果显示，在蛋白酶的存在下，用EpCAM ATTAC VH(ATTAC1)和CD8 ATTAC VL(ATTAC2)进行处理激活了CD8 T细胞，但不激活CD4 T细胞。相反，用EpCAM TEAC组分配对物进行处理激活了CD4和CD8 T细胞两者。
因此，ATTAC可用于特异性激活CD8 T细胞，这对于成功的抗肿瘤免疫应答至关重要。
实施例8：使用抗CD8 ATTAC的干扰素γ释放实验
也使用干扰素γ释放来评估靶向肿瘤细胞抗原的ATTAC1和靶向免疫细胞抗原的ATTAC2的活性。在这个实施例中，ATTAC1包含能够通过靶向在肿瘤细胞上表达的EpCAM来靶向癌症的靶向部分和抗CD3 VH结构域。ATTAC2包含能够通过靶向CD8来选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分和抗CD3 VH结构域。
用浓度增加的抗EpCAM ATTAC1(含有抗EpCAM功能和抗CD3 VH结构域(SEQ ID NO：166)；称为“EpCAM VH”)标记肿瘤细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。用浓度增加的抗CD8 ATTAC2(含有抗CD8功能和抗CD3 VL结构域(SEQ ID NO：170)；称为“CD8 VL”)标记来自健康供体的PBMC(图11A)或培养的T细胞(图11B)，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。然后将PBMC或T细胞与肿瘤细胞以1∶4的PBMC对肿瘤细胞比例进行共培养。通过添加外源蛋白酶(肠激酶)使ATTAC变为蛋白水解可激活的，其中添加或不添加蛋白酶到混合细胞中。然后将共培养的细胞在37℃下温育过夜。
共培养后，测定上清液中干扰素γ(IFN-γ)的存在，其意味着激活的T细胞释放细胞因子。当在外源蛋白酶存在下培养细胞时，PBMC(图11A)和培养的T细胞(图11B)的干扰素γ释放均呈剂量依赖性增加，但当蛋白酶不存在时，干扰素γ的释放不增加。与培养的T细胞相比，PBMC中干扰素γ的基线水平较高，这可能是由于PBMC样品中存在NK细胞，而NK细胞能产生干扰素γ。
图11A和11B中的结果证明了T细胞应答的产生需要ATTAC的蛋白水解激活。此外，ATTAC应答是剂量依赖性的。
在实验对照中，当单独培养T细胞(图11D)或PBMC培养物中的T细胞(图11C)或与未经处理的肿瘤细胞一起培养(靶标+T细胞组)时，根据干扰素γ释放的测量，T细胞没有激活。作为阳性对照，当与用EpCAM结合的双特异性T细胞接合子(BiTE；SEQ ID NO：168)标记的肿瘤细胞一起培养时，T细胞被激活。
实施例9：ATTAC的浓度依赖性分析
测试了ATTAC配对物的浓度依赖性，其中ATTAC1靶向肿瘤细胞抗原，ATTAC2靶向免疫细胞抗原。
用浓度增加的抗EpCAM ATTAC1(含有抗CD3 VH结构域；SEQ ID NO：166)标记肿瘤细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。用浓度增加的抗CD8 ATTAC2(含有抗CD3 VL结构域；SEQ ID NO：170)标记来自健康供体的PBMC(图12A)，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。使ATTAC1和ATTAC2的浓度处于不同的摩尔浓度，而不是使ATTACl和ATTAC2保持在等摩尔浓度，以确定T细胞的激活(通过测定干扰素γ)是否会偏向两个ATTAC组分的其中一个。一旦肿瘤细胞和PBMC均已被各自的ATTAC组分标记，则将细胞在37℃共培养过夜。
数据证明，当ATTAC1和2的浓度以等摩尔浓度增加时，存在强烈的T细胞激活(图12A)。当浓度偏向ATTAC1或ATTAC2时，T细胞激活水平降低，这表明ATTACl和ATTAC2为等摩尔浓度时，T细胞(在PBMC中)的激活最强。图12B显示，随着ATTAC1和ATTAC2的等摩尔浓度增加增加的T细胞激活(以图12A中的短划线显示)，不偏向所使用的任一ATTAC组分，并且ATTAC1和ATTAC2在激活T细胞方面等同重要。
图12C显示了来自在PBMC中单独培养或与未经处理的靶细胞一起培养的T细胞的干扰素释放的对照数据。作为阳性对照，图12C显示了当用BiTE(SEQ ID NO：168)标记培养的靶细胞时，来自PBMC中T细胞的干扰素释放强烈。
实施例10：ATTAC对T细胞亚群的选择性激活
还使用采用FITC的模型系统测试了T细胞亚群的选择性激活。
用抗EpCAM ATTAC1(含有抗CD3 VH结构域(SEQ ID NO：166))标记肿瘤细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。用针对CD4、CD8或CD19的结合有FITC的抗体标记来自健康供体的PBMC，并通过洗涤去除多余的抗体。用抗FITC ATTAC2(含有抗CD3 VL结构域(SEQ IDNO：165))进一步标记PBMC，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。然后将PBMC与肿瘤细胞以1∶2的PBMC对肿瘤细胞比例进行共培养。通过添加外源蛋白酶(肠激酶)使ATTAC变为蛋白水解可激活的，其中添加或不添加蛋白酶到混合细胞中。然后将共培养的细胞在37℃下温育过夜。
在这些实验中，FITC标记的CD19细胞是阴性对照，因为表达CD19的细胞通常不表达CD3。因此，抗FITC ATTAC组分与CD19阳性细胞的结合不会导致经由来自ATTAC组分配对物的配对抗CD3 VH/VL的激活。
温育后，将共培养的细胞在FACS缓冲液(PBS+2％血清)中洗涤，并用CD3 APC-Cy7、CD4 PE、CD8 APC和CD69 BV421标记，用于流式细胞术，以确定CD4和CD8 T细胞亚群的T细胞激活水平(通过CD69染色的增加来测量)。通过洗涤除去多余的抗体，并通过流式细胞术对细胞进行分析。仅当用抗CD4 FITC抗体标记PBMC时，CD4 T细胞才被显著激活(与未经处理的T细胞的背景激活相比)(图13A)。在这种情况下，含有抗CD3 VL结构域的抗FITC ATTAC2将仅与CD4 T细胞结合，并且激活这个T细胞亚群。用抗CD8或抗CD19 FITC抗体标记的PBMC不会引起CD4 T细胞的显著激活，因为CD4细胞不表达这些抗原。
相比之下，仅当用抗CD8 FITC抗体标记PBMC时，CD8T细胞才被显著激活(与未经处理的T细胞的背景激活相比)(图13B)。在这种情况下，含有抗CD3 VL结构域的抗FITCATTAC2仅与CD8 T细胞结合，并且激活这个T细胞亚群。用抗CD4或抗CD19 FITC抗体标记的PBMC不会引起CD8 T细胞的激活，因为CD8细胞不表达这些抗原。
这些数据显示了ATTAC激活在较复杂的T细胞混合物中的特定T细胞亚群的能力。如图13A和13B所示，即使使用相同的靶细胞和相同的PBMC，也可以使用不同的ATTAC2组分来激活不同的免疫细胞亚群。
特定免疫细胞亚群的选择性激活可以在治疗上有用。例如，仅激活细胞毒性T细胞的ATTAC可以避免激活不希望的T细胞，例如调节性T细胞。此外，使用需要被肿瘤相关蛋白酶切割的ATTAC可以允许激活肿瘤微环境内的免疫细胞。通过这种方式，ATTAC可以为激活肿瘤微环境中的特定免疫细胞亚群提供特异性。
实施例11：使用抗CD8 ATTAC例如SEQ ID NO：169和170的预示性ATTAC实验
用抗CD8 ATTAC组分标记外周血单核细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。抗CD8 ATTAC组分含有一半的抗CD3激活结构域(VL)。将用含有相应的一半抗CD3激活域(VH)(SEQ ID NO：166)的抗EpCAM ATTAC组分标记不希望的肿瘤细胞系。ATTAC将因此能够特异性激活在外周血单核细胞内的CD8 T细胞上的CD3。可以通过ELISA检测IFNγ的分泌，或通过流式细胞术检测标志物例如CD69和CD38激活，从而对CD8 T细胞的激活进行测定。
实施例12：使用抗CD4 ATTAC例如SEQ ID NO：171的预示性ATTAC实验
用抗CD4 ATTAC组分标记外周血单核细胞，并通过洗涤除去多余的ATTAC组分。抗CD4 ATTAC组分含有一半的抗CD3激活域(VL)(SEQ ID NO：166)。将用含有相应的一半抗CD3激活域(VH)的抗EpCAM ATTAC组分标记不想要的肿瘤细胞系。ATTAC将因此能够特异性激活在外周血单核细胞内的CD4 T细胞上的CD3。可以通过ELISA检测IFNγ的分泌，或通过流式细胞术检测标志物例如CD69和CD38激活，从而对CD4 T细胞的激活进行测定。
实施例13：实施方案
以下编号的项提供了本文所述的实施方案，尽管此处列举的实施方案不是限制性的。
项1.一种用于治疗患者中癌症的药剂，其包含：
a.包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分，其包含：
i.靶向部分，其能够靶向癌症；
ii.第一免疫细胞接合结构域，当结合第二免疫细胞接合结构域时，所述第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；
b.包含选择性免疫细胞结合剂的第二组分，其包含：
i.免疫细胞选择部分，其能够选择性地靶向免疫细胞；
ii.第二免疫细胞接合结构域，当结合第一免疫细胞接合结构域时，所述第二免疫细胞接合结构域能够具有免疫细胞接合活性，其中当第一和第二免疫细胞接合结构域均不与惰性结合伴侣结合时，它们能够结合，
其中第一免疫细胞接合结构域或第二免疫细胞接合结构域中的至少一个与惰性结合伴侣结合，使得除非去除惰性结合伴侣，否则第一和第二免疫细胞接合结构域彼此不结合；并且
进一步包含切割位点，其将惰性结合伴侣和与其结合的免疫细胞接合结构域分开，其中切割位点是：
i.通过由癌细胞表达的酶被切割；
iii.通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；
iv.通过依赖补体的切割反应被切割；或
v.通过由与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。
项2.如项1所述的药剂，其中第一组分不与第二组分共价结合。
项3.如项1所述的药剂，其中第一组分与第二组分共价结合。
项4.如项1-3中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与免疫细胞表面上表达的抗原结合。
项5.如项1-4中任一项所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或工程化免疫细胞。
项6.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向T细胞。
项7.如项6所述的药剂，其中T细胞是细胞毒性T细胞。
项8.如项7所述的药剂，其中细胞毒性T细胞是CD8+ T细胞。
项9.如项6所述的药剂，其中T细胞是辅助T细胞。
项10.如项9所述的药剂，其中辅助T细胞是CD4+ T细胞。
项11.如项6-10中任一项所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CD8、CD4或CXCR3。
项12.如项6-11中任一项所述的药剂，其中免疫细胞选择部分不特异性结合调节性T细胞。
项13.如项6-12中任一项所述的药剂，其中免疫细胞选择部分不特异性结合TH17细胞。
项14.如项6-13中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与CD3结合。
项15.如项6-13中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够与TCR结合。
项16.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向自然杀伤细胞。
项17.如项16所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CD2或CD56。
项18.如项16-17中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46或DNAM。
项19.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向巨噬细胞。
项20.如项19所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CD14、CD11b或CD40。
项21.如项19-20中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合CD89(Fcα受体1)、CD64(Fcγ受体1)、CD32(Fcγ受体2A)或CD16a(Fcγ受体3A)。
项22.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜中性粒细胞。
项23.如项22所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CD15。
项24.如项22-23中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合CD89(FcαR1)、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、CD11b(CR3、αMβ2)、TLR2、TLR4、CLEC7A(Dectin1)、甲酰基肽受体1(FPR1)、甲酰基肽受体2(FPR2)或甲酰基肽受体3(FPR3)。
项25.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜酸性粒细胞。
项26.如项25所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CD193、Siglec-8或EMR1。
项27.如项25-26中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合CD89(Fcα受体1)、FcεRI、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)或TLR4。
项28.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向嗜碱性粒细胞。
项29.如项28所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向2D7、CD203c或FcεRIα。
项30.如项28-29中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合CD89(Fcα受体1)或FcεRI。
项31.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向γδT细胞。
项32.如项31所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向γδTCR。
项33.如项31-32中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合γδTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB、DNAM-1或TLR(TLR2、TLR6)。
项34.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向自然杀伤T细胞。
项35.如项34所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向Vα24或CD56。
项36.如项34-35中任一项所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合αβTCR、NKG2D、CD3复合物(CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η)、4-1BB或IL-12R。
项37.如项5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的免疫细胞选择部分选择性地靶向工程化免疫细胞。
项38.如项37所述的药剂，其中工程化免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
项39.如项37-38所述的药剂，其中免疫细胞选择部分靶向CAR或免疫细胞上表达的标志物。
项40.如项37-39所述的药剂，其中免疫选择部分靶向LNGFR或CD20。
项41.如项37-40所述的药剂，其中免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合由工程化免疫细胞表达的抗原。
项42.如项37-41所述的药剂，其中由工程化免疫细胞表达的抗原是CD3。
项43.如项1-42中任一项所述的药剂，其中免疫细胞选择部分包含抗体或其抗原特异性结合片段。
项44.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合T细胞上的抗原。
项45.如项43的任一项所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合细胞毒性T细胞或辅助T细胞上的抗原。
项46.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合巨噬细胞上的抗原。
项47.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合自然杀伤细胞上的抗原。
项48.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合嗜中性粒细胞上的抗原。
项49.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合嗜酸性粒细胞上的抗原。
项50.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合γδT细胞上的抗原。
项51.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合自然杀伤T细胞上的抗原。
项52.如项43所述的药剂，其中抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合工程化免疫细胞上的抗原。
项53.如项43所述的药剂，其中工程化免疫细胞是CAR T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
项54.如项1-42中任一项所述的药剂，其中免疫选择部分包含适体。
项55.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合T细胞上的抗原。
项56.如项55所述的药剂，其中T细胞是细胞毒性T细胞或辅助T细胞。
项57.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合巨噬细胞上的抗原。
项58.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合自然杀伤细胞上的抗原。
项59.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合嗜中性粒细胞上的抗原。
项60.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合嗜酸性粒细胞上的抗原。
项61.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合γδT细胞上的抗原。
项62.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合自然杀伤T细胞上的抗原。
项63.如项54所述的药剂，其中适体特异性结合工程化免疫细胞上的抗原。
项64.如项54所述的药剂，其中工程化免疫细胞是CAR T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
项65.如项54-64中任一项所述的药剂，其中适体包含DNA。
项66.如项54-64中任一项所述的药剂，其中适体包含RNA。
项67.如项65-66中任一项所述的药剂，其中适体是单链的。
项68.如项54-67中任一项所述的药剂，其中适体是选自随机候选文库的选择性免疫细胞结合特异性适体。
项69.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分是抗体或抗原特异性结合片段。
项70.如项69所述的药剂，其中所抗体或其抗原特异性结合片段与癌症抗原特异性结合。
项71.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分是适体。
项72.如项71所述的药剂，其中适体与癌症抗原特异性结合。
项73.如项71-72中任一项所述的药剂，其中适体包含DNA。
项74.如项71-72中任一项所述的药剂，其中适体包含RNA。
项75.如项73-74中任一项所述的药剂，其中适体是单链的。
项76.如项71-75中任一项所述的药剂，其中适体是选自随机候选文库的靶细胞特异性适体。
项77.如项71-76中任一项所述的药剂，其中适体是抗EGFR适体。
项78.如项77的任一项所述的药剂，其中抗EGFR适体包含SEQ ID NO：95-164中的任一个。
项79.如项71-78中任一项所述的药剂，其中适体以1皮摩尔至500纳摩尔的Kd与癌细胞上的癌症结合。
项80.如项71-79中任一项所述的药剂，其中适体以1皮摩尔至100纳摩尔的Kd与癌症结合。
项81.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分包含IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。
项82.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分包含以下的全长序列：IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。
项83.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分包含以下的截短形式、类似物、变体或衍生物：IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、转铁蛋白、叶酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、干细胞因子、胰岛素样生长因子(IGF)或CD40。
项84.如项1-68中任一项所述的药剂，其中靶向部分结合癌症上的靶标，所述靶标包括IL-2受体、IL-4、IL-6、黑素细胞刺激激素受体(MSH受体)、转铁蛋白受体(TR)、叶酸受体1(FOLR)、叶酸羟化酶(FOLH1)、EGF受体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR或CD40L。
项85.如项1-84中任一项所述的药剂，其中一个免疫细胞接合结构域包含VH结构域，另一个免疫细胞接合结构域包含VL结构域。
项86.如项1-85中任一项所述的药剂，其中第一免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过切割位点与之分隔。
项87.如项1-86中任一项所述的药剂，其中第二免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合并通过切割位点与之分隔。
项88.如项1-87中任一项所述的药剂，其中
a.第一免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合，并通过第一切割位点与之分隔，且
b.第二免疫细胞结合伴侣与惰性结合伴侣结合，并通过第二切割位点与之分隔。
项89.如项88所述的药剂，其中第一切割位点和第二切割位点是相同的切割位点。
项90.如项88所述的药剂，其中第一切割位点和第二切割位点是不同的切割位点。
项91.如项1-90中任一项所述的药剂，其中至少一个切割位点是蛋白酶切割位点。
项92.如项1-91中任一项所述的药剂，其中由癌细胞表达的至少一种酶是蛋白酶。
项93.如项1-92中任一项所述的药剂，其中至少一个惰性结合伴侣与免疫细胞接合结构域特异性结合。
项94.如项93所述的药剂，其中至少一个惰性结合伴侣是VH或VL结构域。
项95.如项94所述的药剂，其中
a.当免疫细胞接合结构域是VH结构域时，惰性结合伴侣是VL结构域，且
b.当免疫细胞接合结构域是VL结构域时，惰性结合伴侣是VH结构域。
项96.如项3所述的药剂，其中第一组分通过包含切割位点的接头与第二组分共价结合。
项97.如项96所述的药剂，其中切割位点是蛋白酶切割位点。
项98.如项97所述的药剂，其中蛋白酶切割位点在血液中是可切割的。
项99.如项98所述的药剂，其中蛋白酶切割位点是凝血酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶或弗林蛋白酶的切割位点。
项100项.如项97所述的药剂，其中蛋白酶切割位点可被肿瘤相关蛋白酶切割。
项101.如项100所述的药剂，其中肿瘤相关蛋白酶切割位点包含SEQ ID NO：1-84中的任一个。
项102.一种用于治疗患者中癌症的包含选择性免疫细胞结合剂的药剂，其包含：
a.包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分，其包含：
i.靶向部分，其能够靶向癌症；
ii.第一免疫细胞接合结构域，当结合第二免疫细胞接合结构域时，所述第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；
b.切割位点，其分隔第一免疫细胞接合结构域和惰性结合伴侣，其中切割位点是：
i.通过由癌细胞表达的酶被切割；
ii.通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；
iii.通过依赖补体的切割反应被切割；或
iv.通过由与药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割，
其中切割位点的切割导致惰性结合伴侣的丢失，并允许与不是药剂的一部分的第二免疫细胞接合结构域结合。
项103.编码项1-101中任一项所述的药剂的第一和第二组分的一组核酸分子。
项104.编码项102所述的选择性免疫细胞结合剂的核酸分子。
项105.一种治疗患者中癌症的方法，其包括施用项1-101中任一项所述的药剂。
项106.如项105所述的方法，其中如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则选择性免疫细胞结合剂不靶向调节性免疫细胞上存在的标志物(包括但不限于CD4和CD25)。
项107.如项105-106中任一项所述的方法，其中选择性免疫细胞结合剂不靶向TH17细胞上存在的标志物。
项108.如项105-107中任一项所述的方法，其中选择性免疫细胞结合剂激活将靶向肿瘤细胞以进行裂解的T细胞。
项109.如项105-108中任一项所述的方法，其中如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则免疫细胞选择部分通过特异性结合CD8而靶向CD8+ T细胞。
项110.如项105-108中任一项所述的方法，其中如果患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则免疫细胞选择部分通过特异性结合CXCR3而靶向CD8+T细胞和CD4+ T细胞。
项111.如项105-110中任一项所述的方法，其中癌症是以下任一种：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、淋巴增生性病症、骨髓增生异常病症、骨髓增生性疾病或癌前病变。
项112.一种将患者的免疫应答靶向癌症的方法，包括对患者施用项1-101中任一项所述的药剂。
等同物
前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实践实施方案。在前描述和实施例详述了某些实施方案，并且描述了发明人所预期的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容可在文本中展现得多么详细，实施方案都可以以多种方式来实施，并且应当根据所附权利要求及其任何等同物来解释。
如本文所用，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语“约”通常是指本领域的普通技术人员会认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所述范围的+/-5-10％)。当诸如至少和大约的术语在所列数值或范围之前时，这些术语修饰提供数值或范围的全部。在一些情况下，术语“约”可以包括四舍五入到最接近的有效数字的数值。

Claims (20)

1.一种用于治疗患者中癌症的药剂，其包含：
a.包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分，其包含：
i.靶向部分，其能够靶向癌症；
ii.第一免疫细胞接合结构域，当结合第二免疫细胞接合结构域时，第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；
b.包含选择性免疫细胞结合剂的第二组分，其包含：
i.免疫细胞选择部分，其能够选择性地靶向免疫细胞；
ii.第二免疫细胞接合结构域，当结合第一免疫细胞接合结构域时，第二免疫细胞接合结构域能够具有免疫细胞接合活性，其中当第一和第二免疫细胞接合结构域均不与惰性结合伴侣结合时，它们能够结合，
其中第一免疫细胞接合结构域或第二免疫细胞接合结构域中的至少一个与惰性结合伴侣结合，使得除非去除惰性结合伴侣，否则第一和第二免疫细胞接合结构域彼此不结合；并且
进一步包含切割位点，其将惰性结合伴侣和与其结合的免疫细胞接合结构域分隔，其中所述切割位点是：
i.通过由癌细胞表达的酶被切割；
iii.通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；
iv.通过依赖补体的切割反应被切割；或
v.通过由与所述药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割。
2.如权利要求1所述的药剂，其中所述第一组分不与所述第二组分共价结合。
3.如权利要求1所述的药剂，其中所述第一组分与所述第二组分共价结合。
4.如权利要求1所述的药剂，其中所述免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合在所述免疫细胞表面上表达的抗原。
5.如权利要求1所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的所述免疫细胞选择部分选择性地靶向T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)或工程化免疫细胞。
6.如权利要求5所述的药剂，其中能够选择性地靶向免疫细胞的所述免疫细胞选择部分选择性地靶向T细胞，任选地，其中所述T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
7.如权利要求1所述的药剂，其中所述免疫细胞选择部分靶向CD8、CD4或CXCR3，或不特异性结合调节性T细胞。
8.如权利要求1所述的药剂，其中所述免疫细胞接合结构域在彼此结合时能够结合CD3或TCR。
9.如权利要求1所述的药剂，其中所述免疫细胞选择部分包含适体或抗体或其抗原特异性结合片段，任选地，其中所述适体或抗体或其抗原特异性结合片段特异性结合T细胞上的抗原。
10.如权利要求1所述的药剂，其中所述靶向部分是适体或抗体或其抗原特异性结合片段，任选地，其中所述适体或抗体或其抗原特异性结合片段特异性地结合癌症抗原。
11.如权利要求1所述的药剂，其中所述靶向部分结合癌症上的靶标，所述靶标包括IL-2受体、IL-4、IL-6、黑素细胞刺激激素受体(MSH受体)、转铁蛋白受体(TR)、叶酸受体1(FOLR)、叶酸羟化酶(FOLH1)、EGF受体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR或CD40L。
12.如权利要求1所述的药剂，其中一个免疫细胞接合结构域包含VH结构域，另一个免疫细胞接合结构域包含VL结构域，任选地，其中至少一个惰性结合伴侣是VH或VL结构域。
13.如权利要求1所述的药剂，其中所述第一免疫细胞接合结构域和/或第二免疫细胞接合结构域与惰性结合伴侣结合并通过切割位点与其分隔，任选地，其中至少一个切割位点是蛋白酶切割位点。
14.如权利要求13所述的药剂，其中
a.当所述免疫细胞接合结构域是VH结构域时，所述惰性结合伴侣是VL结构域，且
b.当所述免疫细胞接合结构域是VL结构域时，所述惰性结合伴侣是VH结构域。
15.如权利要求3所述的药剂，其中所述第一组分通过包含切割位点的接头与所述第二组分共价结合，任选地，其中所述切割位点是蛋白酶切割位点。
16.一种包含选择性免疫细胞结合剂的药剂，用于在试剂盒或组合物中治疗癌症，其包含：
a.包含靶向免疫细胞结合剂的第一组分，其包含：
i.靶向部分，其能够靶向癌症；
ii.第一免疫细胞接合结构域，当结合第二免疫细胞接合结构域时，第一免疫细胞接合结构域能够具有免疫接合活性，其中第二免疫细胞接合结构域不是第一组分的一部分；
iii.切割位点，其分隔第一免疫细胞接合结构域和惰性结合伴侣，其中所述切割位点是：
1.通过由癌细胞表达的酶被切割；
2.通过癌细胞内的pH敏感的切割反应被切割；
3.通过依赖补体的切割反应被切割；或
4.通过由与所述药剂中的靶向部分相同或不同的靶向部分共定位于癌细胞的蛋白酶被切割，
其中所述切割位点的切割导致惰性结合伴侣的丢失，并允许与不是所述药剂的一部分的第二免疫细胞接合结构域结合。
17.编码权利要求1所述的药剂的第一和第二组分的一组核酸分子。
18.一种治疗患者中癌症的方法，包括施用权利要求1所述的药剂，其中所述癌症是以下任一种：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、淋巴增生性病症、骨髓增生异常病症、骨髓增生性疾病或癌前病变。
19.如权利要求18所述的方法，其中，如果所述患者在肿瘤中具有调节性T细胞，则所述选择性免疫细胞结合剂不靶向调节性免疫细胞上存在的标志物(包括但不限于CD4和CD25)。
20.一种将患者的免疫应答靶向癌症的方法，包括向所述患者施用权利要求1所述的药剂。
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