CN115175933A - Cd3抗原结合片段和包含其的组合物 - Google Patents

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菲利普·库恩
安德烈·弗伦泽尔
达拉格·麦肯
詹姆斯·麦克洛里
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Abstract

本公开内容涉及具有抗体结合片段的组合物，所述抗体结合片段特异性地结合CD3或其表位。一些实施方案包括具有增加的稳定性的组合物和抗体结合片段。也公开了包括这样的抗体结合片段的双特异性融合蛋白。

Description

CD3抗原结合片段和包含其的组合物
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年6月24日，名称为32808-775_601_SL.txt，且是3,106,733字节大小。
交叉引用声明
本申请要求2019年6月26日提交的标题为“CD3 ANTIGEN BINDING FRAGMENTS ANDCOMPOSITIONS COMPRISING SAME”的美国临时申请号62/866,746和2020年6月18日提交的标题为“CD3 ANTIGEN BINDING FRAGMENTS AND COMPOSITIONS COMPRISING SAME”的美国临时申请号63/041,059的权益，它们两者以整体并入本文。
发明背景
许多经批准的癌症治疗剂是杀死正常细胞以及肿瘤细胞的细胞毒性药物。这些细胞毒性药物的治疗益处取决于肿瘤细胞比正常细胞更敏感，从而允许使用不导致不可接受的副作用的剂量达到临床应答。但是，基本上所有这些非特异性药物都会对正常组织造成一些(如果不严重的话)损害，这经常限制治疗适合性。
通过指导免疫效应细胞杀死癌细胞，双特异性抗体可以提供细胞毒性药物的不同方案。双特异性抗体将源自两种单克隆抗体的不同结合特异性的益处组合到单一组合物中，能实现用单特异性抗体不可能实现的方法或覆盖的组合。在一个实施方案中，该方法依赖于双特异性抗体的一个臂与肿瘤相关的抗原或标志物的结合，而另一个臂在结合T细胞上的CD3分子后，通过释放效应分子诸如TNF-α、IFN-γ、白介素2、4和10、穿孔蛋白和粒酶，触发其细胞毒性活性。抗体工程的进展已经导致用于将效应细胞重定向至肿瘤靶标的许多双特异性抗体形式和组合物的开发，包括通过在肿瘤部位募集和活化T细胞的多克隆群体而起作用的双特异性抗体，并且这样做不需要共刺激或常规MHC识别。但是，某些患者仍具有双重问题，所述患者经历被称作“细胞因子风暴”或“细胞因子释放综合征”的严重副作用(Lee DW等人.Current concepts in the diagnosis and management of cytokinerelease syndrome.Blood.2014 124(2):188-195)，其由TNF-α和IFN-γ等细胞因子的释放介导，并且事实上一些双特异性组合物具有非常短的半衰期，从而为了在治疗窗内维持循环浓度足以达到治疗效果的时间或具有可变的效果，需要连续输注四至八周。因此，在开发用于癌症治疗的有效双特异性抗体方面存在未得到满足的需求。
发明概述
本发明涉及掺入嵌合融合蛋白中的抗分化簇3(CD3)抗原结合片段及其使用方法。
在一个方面，本文中公开了包含抗原结合片段的多肽，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，且其中所述抗原结合片段，a.特异性地结合分化簇3T细胞受体(CD3)；和b.包含分别具有SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在另一个方面，本文中公开了包含抗-CD3抗原结合片段的多肽，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，且其中所述抗原结合片段a.特异性地结合CD3；b.包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和c.表现出较高的热稳定性，如在体外测定中所证实的，(i)相对于由在SEQID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段更高的解链温度(melting termperature,Tm)，或(ii)在将所述抗-CD3抗原结合片段掺入抗-CD3双特异性抗体后，所述双特异性抗体表现出相对于对照双特异性抗体更高的Tm，其中所述抗-CD3双特异性抗体包含所述抗-CD3结合片段和结合除了CD3以外的抗原的参考抗原结合片段，且其中所述对照双特异性抗原结合片段由SEQ ID NO:41和所述参考抗原结合片段组成。
在一些实施方案中，抗原结合片段的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃。
在又一个方面，本文中公开了一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述抗原结合片段a.特异性地结合CD3；b.包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和c.包含FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，各自分别表现出与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，或与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸是相同的。在一些实施方案中，本文中公开的抗原结合片段是嵌合的或人源化的抗原结合片段。在其它实施方案中，抗原结合片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体(linear antibody)和单链可变片段(scFv)组成的组。
在一些实施方案中，CDR-H1和CDR-H2分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ IDNO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L2；具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，抗原结合片段进一步包含FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，各自分别表现出与SEQ ID NO:12、13、18和19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12、13、18和19的氨基酸序列是相同的。
在其它实施方案中，抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:14-17中的任一个的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；e.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和f.具有SEQ ID NO:26中的任一个的氨基酸序列的FR-H4。在其它实施方案中，抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。在另一个实施方案中，抗原结合片段包含：a.具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。在另一个实施方案中，抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的FR-H4。在某些实施方案中，抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
在一些实施方案中，抗原结合片段包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相同的可变重(VH)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合片段包含与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列相同的可变轻(VL)氨基酸序列。在其它实施方案中，抗原结合片段包含与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合片段特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。在其它实施方案中，抗原结合片段特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。在某些实施方案中，抗原结合片段结合选自CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε单元的CD3复合物亚基。在其它实施方案中，抗原结合片段结合CD3的CD3ε片段。
在某些实施方案中，抗原结合片段以在约10nM和约400nM之间的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在包含人或食蟹猴CD3抗原的体外抗原结合测定中所确定的。在其它实施方案中，抗原结合片段以小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM、或小于约350nM、或小于约400nM的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在另一个实施方案中，相对于由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的抗原结合片段，抗原结合片段表现出的对CD3的结合亲和力弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。
在一些实施方案中，抗原结合片段表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。在其它实施方案中，抗原结合片段表现出在6.0和6.6之间、包括端点的pI。在某些实施方案中，抗原结合片段表现出的pI比由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。
在其它实施方案中，本文中公开的多肽进一步包含第一释放区段肽(RS1)，其中所述RS1是哺乳动物蛋白酶切割的底物。在某些实施方案中，所述RS1是选自由天冬酰胺肽链内切酶(legumain)、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase组成的组的蛋白酶的底物。在另一个实施方案中，RS1包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，RS1包含选自以下的序列的氨基酸序列：RSR-2089、RSR-2295、RSR-2298、RSR-2488、RSR-2599、RSR-2485、RSR-2486、RSR-2728、RSN-2089、RSN-2295、RSN-2298、RSN-2488、RSN-2599、RSN-2485、RSN-2486、RSN-2728、RSC-2089、RSC-2295、RSC-2298、RSC-2488、RSC-2599、RSC-2485、RSC-2486和RSC-2728，它们中的每一个如在表5中所示。
在一些实施方案中，本文中公开的多肽进一步包含第一延长重组多肽(XTEN1)，其中XTEN1的特征在于，a.它具有至少约36个氨基酸或至少约100个氨基酸；b.XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和c.它具有至少4-6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。在一些实施方案中，XTEN1具有至少约36至约1000个氨基酸或至少约100至1000个氨基酸。在某些实施方案中，XTEN1包含选自SEQ ID NO:661-664中的至少三个的氨基酸序列。在其它实施方案中，XTEN1包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，XTEN1包含与选自以下的序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。
在某些实施方案中，本文中公开的多肽表达为融合蛋白，其中处于未切割状态的融合蛋白具有AF1-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-AF1的从N-端至C-端结构排列，其中AF1是第一抗原结合片段。
在某些方面，本文中公开了一种多肽，所述多肽包含RS1、RS2、AF1、AF2、XTEN1和XTEN2，其中：a.RS1和RS2各自是哺乳动物蛋白酶切割的底物且各自包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；b.AF1是对CD3具有结合特异性的单克隆抗体的抗原结合片段；c.AF2是包含对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH的抗原结合片段；d.XTEN1包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；e.XTEN2包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；f.所述多肽具有如下的从N-端至C-端结构排列：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1或XTEN2-RS2-双体-RS1-XTEN1，其中所述双体包含AF1和AF2的VL和VH；和g.相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗体片段，所述多肽表现出较高的热稳定性，如通过在体外测定中解链温度(Tm)的增加所确定的。
在一些实施方案中，AF1包含重链互补决定区(CDR-H)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段，表现出较高的热稳定性，如通过在体外测定中增加的解链温度(Tm)所确定的。在其它实施方案中，AF1包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述AF1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；且包含FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，各自分别表现出与SEQ ID NO:20或21、23、24和26的氨基酸的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:20或21、23、24和26的氨基酸是相同的。
在某些实施方案中，CDR-H1和CDR-H2分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ IDNO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在其它实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在其它实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:4中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在其它实施方案中，CDR-L包含：具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO:5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，AF1包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述AF1包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。在一个实施方案中，AF1包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。在另一个实施方案中，AF1包含：a.具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。在又一个实施方案中，AF1包含：a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；c.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的FR-L3；d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
在一些其它的实施方案中，AF1进一步包含FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，各自分别表现出与SEQ ID NO:12、13、14-17和19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12、13、14-17和19的氨基酸序列是相同的。
在一些实施方案中，AF1包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相同的可变重(VH)氨基酸序列。在某些实施方案中，AF1包含与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列相同的可变轻(VL)氨基酸序列。在某些实施方案中，AF1包含与SEQ IDNO:36-40中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，AF1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。在一些实施方案中，AF1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。在一些其它的实施方案中，AF1结合选自CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε片段的CD3复合物亚基。在另一个实施方案中，AF1结合CD3ε。在另一个实施方案中，AF1以约10nM和约400nM之间的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在某些实施方案中，AF1以小于约3nM、或小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在其它实施方案中，相对于由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的AF1，AF1以小至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴CD3，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。
在一些实施方案中，AF1的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如通过在体外测定中解链温度的增加所确定的。
在其它实施方案中，AF1表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。在某些实施方案中，AF1表现出在6.0和6.6之间、包括端点的pI。在其它实施方案中，AF1表现出的pI比由在SEQID NO:41中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
在另一个实施方案中，本文中公开的多肽进一步包含第二抗原结合片段(AF2)，所述第二抗原结合片段(AF2)特异性地结合除CD3以外的靶细胞标志物。在一些实施方案中，AF2通过柔性肽接头融合至AF1。在其它实施方案中，柔性接头包含2或3类选自由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的组的氨基酸。在某些实施方案中，(1)AF2片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)将AF1和AF2构造为(Fab‘)2或单链双体。
在一些实施方案中，AF2的CDR选自SEQ ID NO:719-918的序列。在某些实施方案中，AF2包含对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH。在其它实施方案中，VL选自SEQ ID NO:819-918的序列，且AF2的VH选自SEQ ID NO:719-818的序列。
在一些实施方案中，靶细胞标志物是肿瘤抗原。在一些实施方案中，靶细胞标志物选自1-40-β-淀粉样蛋白,4-1BB,5AC,5T4,707-AP,A激酶锚蛋白4(AKAP-4),激活素受体2B型(ACVR2B),激活素受体样激酶1(ALK1),腺癌抗原,脂肪分化相关蛋白,肾上腺素受体β3(ADRB3),AGS-22M6,α叶酸受体,甲胎蛋白(AFP),AIM-2,间变性淋巴瘤激酶(ALK),雄激素受体,血管生成素2,血管生成素3,结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2),炭疽毒素,AOC3(VAP-1),B细胞成熟抗原(BCMA),B7-H3(CD276),炭疽芽孢杆菌性炭疽,B细胞活化因子(BAFF),B淋巴瘤细胞,骨髓间质细胞抗原2(BST2),印迹位点的调节剂的同系物(Brotherof the Regulator of Imprinted Sites，BORIS),C242抗原,C5,CA-125,癌症抗原125(CA-125或MUC16),癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1),癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a),碳酸酐酶9(CA-IX),癌胚抗原(CEA),心脏肌球蛋白,CCCTC结合因子(CTCF),CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1),CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CD11,CD123,CD125,CD140a,CD147(basigin),CD15,CD152,CD154(CD40L),CD171,CD179a,CD18,CD19,CD2,CD20,CD200,CD22,CD221,CD23(IgE受体),CD24,CD25(IL-2受体的α链),CD27,CD274,CD28,CD3,CD3ε,CD30,CD300分子样家族成员f(CD300LF),CD319(SLAMF7),CD33,CD37,CD38,CD4,CD40,CD40配体,CD41,CD44v7,CD44v8,CD44v6,CD5,CD51,CD52,CD56,CD6,CD70,CD72,CD74,CD79A,CD79B,CD80,CD97,CEA相关抗原,CFD,ch4D5,染色体X开放读码框61(CXORF61),封闭蛋白18.2(CLDN18.2),封闭蛋白6(CLDN6),艰难梭菌,凝聚因子A,CLCA2,集落刺激因子1受体(CSF1R),CSF2,CTLA-4,C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A),C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1),C-X-C趋化因子受体类型4,细胞周期蛋白B1,细胞色素P4501B1(CYP1B1),cyp-B,巨细胞病毒,巨细胞病毒糖蛋白B,达比加群,DLL4,DPP4,DR5,大肠杆菌志贺毒素1型,大肠杆菌志贺毒素2型,外-ADP-核糖基转移酶4(ART4),含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2),EGF样结构域多倍体7(EGFL7),突变的延伸因子2(ELF2M),内毒素,肝配蛋白A2,肝配蛋白B2,肝配蛋白A型受体2,表皮生长因子受体(EGFR),表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII),上皮唾蛋白,上皮细胞粘附分子(EpCAM),上皮糖蛋白2(EGP-2),上皮糖蛋白40(EGP-40),ERBB2,ERBB3,ERBB4,ERG(跨膜蛋白酶,丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因),大肠杆菌,位于染色体12p的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML),呼吸道合胞病毒的F蛋白,FAP,IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89),Fc受体样5(FCRL5),胎儿乙酰胆碱受体,纤维蛋白IIβ链,成纤维细胞活化蛋白α(FAP),纤连蛋白外结构域-B,FGF-5,Fms样酪氨酸激酶3(FLT3),叶酸结合蛋白(FBP),叶酸水解酶,叶酸受体1,叶酸受体α,叶酸受体β,Fos相关抗原1,卷曲受体,岩藻糖基GM1,G250,G蛋白偶联受体20(GPR20),G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D),神经节苷脂G2(GD2),GD3神经节苷脂,糖蛋白100(gp100),磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3),GMCSF受体α-链,GPNMB,GnT-V,生长分化因子8,GUCY2C,突变的热激蛋白70-2(muthsp70-2),血凝素,甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1),乙型肝炎表面抗原,乙型肝炎病毒,HER1,HER2/neu,HER3,globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH),HGF,HHGFR,高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA),组蛋白复合物,HIV-1,HLA-DR,HNGF,Hsp90,HST-2(FGF6),人乳头瘤病毒E6(HPV E6),人乳头瘤病毒E7(HPV E7),人散射因子受体激酶,人端粒酶逆转录酶(hTERT),人TNF,ICAM-1(CD54),iCE,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IgE,IgE Fc区,IGF-1,IGF-1受体,IGHE,IL-12,IL-13,IL-17,IL-17A,IL-17F,IL-1β,IL-20,IL-22,IL-23,IL-31,IL-31RA,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6受体,IL-9,免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1),甲型流感血凝素,胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体),胰岛素样生长因子2(ILGF2),整联蛋白α4β7,整联蛋白β2,整联蛋白α2,整联蛋白α4,整联蛋白α5β1,整联蛋白α7β7,整联蛋白αIIbβ3,整联蛋白αvβ3,干扰素α/β受体,干扰素γ诱导的蛋白,白介素11受体α(IL-11Rα),白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2),肠羧基酯酶,激酶结构域区域(KDR),KIR2D,KIT(CD117),L1-细胞粘附分子(L1-CAM),天冬酰胺肽链内切酶,白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2),白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1),淋巴细胞抗原6(Ly-6),Lewis-Y抗原,LFA-1(CD11a),LINGO-1,脂磷壁酸,LOXL2,L-选择蛋白(CD62L),淋巴细胞抗原6复合物,基因座K 9(LY6K),淋巴细胞抗原75(LY75),淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK),淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF),M-CSF,乳腺分化抗原(NY-BR-1),MCP-1,黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1),黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2),细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP),黑素瘤相关的抗原1(MAGE-A1),间皮素,细胞表面有关的粘蛋白1(MUC1),MUC-2,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC7,MUC16,粘蛋白CanAg,髓磷脂相关的糖蛋白,肌肉生长抑制素,N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17),NCA-90(粒细胞抗原),连接素-4,神经生长因子(NGF),调节神经细胞凋亡的蛋白酶1,神经细胞粘附分子(NCAM),神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A,NOGO-B,NOGO-C),神经纤毛蛋白-1(NRP1),N-羟乙酰基神经氨酸,NKG2D,Notch受体,o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2),嗅觉受体51E2(OR51E2),癌胚胎抗原(h5T4),由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl),穴兔,OX-40,oxLDL,p53突变体,配对框蛋白Pax-3(PAX3),配对框蛋白Pax-5(PAX5),泛连接蛋白3(PANX3),P-钙粘着蛋白,磷酸钠协同转运蛋白,磷脂酰丝氨酸,胎盘特异性的1(PLAC1),血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα),血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β),聚唾液酸,顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES1),程序性细胞死亡蛋白1(PD-1),程序性死亡-配体1(PD-L1),前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9),前列腺酶,前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8),被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1),P15,P53,PRAME,前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性的膜抗原(PSMA),前列腺酸性磷酸酶(PAP),前列腺癌细胞,prostein,蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21),蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2),铜绿假单胞菌,狂犬病病毒糖蛋白,RAGE,Ras同源物家族成员C(RhoC),核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL),高级糖化终产物的受体(RAGE-1),受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1),肾普遍存在的1(RU1),肾普遍存在的2(RU2),呼吸道合胞病毒,Rh血型D抗原,猕猴因子,肉瘤易位断点,硬骨素(SOST),选择蛋白P,唾液酸基Lewis粘附分子(sLe),精子蛋白17(SPA17),鞘氨醇-1-磷酸,被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3),阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4),金黄色葡萄球菌,STEAP1,黏结蛋白聚糖1(SDC1)+A314,SOX10,存活素,存活素-2B,滑膜肉瘤,X断点2(SSX2),T细胞受体,TCRΓ交替读码框蛋白(TARP),端粒酶,TEM1,生腱蛋白C,TGF-β(例如，TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3),促甲状腺激素受体(TSHR),组织因子途径抑制剂(TFPI),Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr)),TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA),TNF-α,TRAIL-R1,TRAIL-R2,TRG,转谷氨酰胺酶5(TGS5),肿瘤抗原CTAA16.88,肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248),肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R),肿瘤蛋白p53(p53),MUC1的肿瘤特异性糖基化,肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TROP-2),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)+A327,TWEAK受体,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关的蛋白1(TYRP1或糖蛋白75),酪氨酸酶相关的蛋白2(TYRP2),尿空斑蛋白2(UPK2),血管内皮生长因子(例如，VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PIGF),血管内皮生长因子受体1(VEGFR1),血管内皮生长因子受体2(VEGFR2),波形蛋白,v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN),血管性假血友病因子(VWF),肾母细胞瘤蛋白(WT1),X抗原家族成员1A(XAGE1),β-淀粉样蛋白,κ-轻链,成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2),雌激素调节的LIV-1蛋白(LIV1,又称SLC39A6),神经营养性的受体酪氨酸激酶1(NTRK1,又称TRK),Ret原癌基因(RET),B细胞成熟抗原(BCMA,又称TNFRSF17),转铁蛋白受体(TFRC,又称CD71),活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM,又称CD166),生长抑素受体2(SSTR2),KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(cKIT),V-Set免疫调节性受体(VSIR,又称VISTA),糖蛋白Nmb(GPNMB),δ样典型Notch配体3(DLL3),白介素3受体亚基α(IL3RA,又称CD123),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),钙粘着蛋白3类型1,P-钙粘着蛋白(CDH3),肝配蛋白A4(EFNA4),蛋白酪氨酸激酶7(PTK7),溶质载体家族34成员2(SLC34A2,又称NaPi-2b),鸟苷酸环化酶C(GCC),含有PLAUR结构域的3(LYPD3,又称LY6或C4.4a),粘蛋白17,细胞表面有关的(MUC17),Fms有关的受体酪氨酸激酶3(FLT3),NKG2D配体(例如ULBP1,ULBP2,ULBP3,H60,Rae-1α,Rae-1β,Rae-1δ,Rae-1γ,MICA,MICB,hHLA-A),SLAM家族成员7(SLAMF7),白介素13受体亚基α2(IL13RA2),C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A,又称CLL-1),CEA细胞粘附分子5(CEACAM,又称CD66e),白介素3受体亚基α(IL3RA),CD5分子(CD5),UL16结合蛋白1(ILBP1),含有V-Set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1,又称B7-H4),硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4),黏结蛋白聚糖1(SDC1,又称CD138),白介素1受体辅助蛋白(IL1RAP),含有杆状病毒IAP重复的5(BIRC5,又称存活素),CD74分子(CD74),甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1,又称TIM1),SLIT和NTRK样家族成员6(SILTRK6),CD37分子(CD37),凝血因子III,组织因子(CD142,又称F3),AXL受体酪氨酸激酶(AXL),内皮素受体类型B(EDNRB,又称ETBR),钙粘着蛋白6(CDH6),成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3),碳酸酐酶6(CA6),MUC1的CanAg糖型,整联蛋白亚基αV(ITGAV),畸胎癌衍生的生长因子1(TDGF1,又称Crypto1),SLAM家族成员6(SLAMF6,又称CD352),和Notch受体3(NOTCH3)。
在一些实施方案中，AF2的CDR选自SEQ ID NO:719-918的序列的CDR序列。在某些实施方案中，AF2包含对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH。在某些实施方案中，VL序列选自SEQ ID NO:719-818的序列且VH序列选自SEQ ID NO:819-918的序列。
在一些实施方案中，AF2以在约0.1nM和约100nM之间的Kd特异性地结合靶细胞标志物，如在包含靶细胞标志物的体外抗原结合测定中所确定的。在某些实施方案中，AF2对靶细胞标志物的结合亲和力比AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。在某些实施方案中，AF2包含对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的CDR。
在某些实施方案中，本文中公开的多肽进一步包含第二释放区段(RS2)，其中所述RS2是哺乳动物蛋白酶切割的底物。在一些实施方案中，RS2是选自天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase的蛋白酶的底物。在其它实施方案中，RS2包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，RS1和RS2的序列是相同的。在又一个实施方案中，RS1和RS2的序列是不同的。在一些实施方案中，RS1和RS2各自是多种蛋白酶在每个释放区段序列内的一、二或三个切割位点处切割的底物。
在一些实施方案中，本文中公开的多肽进一步包含第二延长重组多肽(XTEN2)，其中XTEN2的特征在于，a.它具有至少约36个氨基酸或至少约100个氨基酸；b.XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和c.它具有至少4-6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。在其它实施方案中，XTEN2包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％包含选自SEQ ID NO:661-664中的至少三个的不重叠序列。在另一个实施方案中，XTEN2包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述XTEN2包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。
在其它实施方案中，多肽具有如下的从N-端至C-端结构排列：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-双体-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-双体-RS2-XTEN2，其中所述双体包含AF1和AF2的VL和VH，其中所述AF1特异性地结合CD3且AF2特异性地结合靶细胞标志物，且其中XTEN1和XTEN2具有不同的氨基酸长度或序列。
在一些其它的实施方案中，AF1通过柔性肽接头融合至AF2，其中a.AF2特异性地结合除CD3以外的第二参考抗原，使得所述多肽是能够结合CD3和第二参考抗原两者的双特异性抗原结合片段；b.所述双特异性抗原结合片段表现出与对照双特异性抗原结合片段相比更高的热稳定性，如通过在体外测定中解链温度(Tm)的增加所确定的，其中所述对照双特异性抗原结合片段包含SEQ ID NO:41和AF2。
在某些实施方案中，第二参考抗原是选自以下的靶细胞标志物：1-40-β-淀粉样蛋白,4-1BB,5AC,5T4,707-AP,A激酶锚蛋白4(AKAP-4),激活素受体2B型(ACVR2B),激活素受体样激酶1(ALK1),腺癌抗原,脂肪分化相关蛋白,肾上腺素受体β3(ADRB3),AGS-22M6,α叶酸受体,甲胎蛋白(AFP),AIM-2,间变性淋巴瘤激酶(ALK),雄激素受体,血管生成素2,血管生成素3,结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2),炭疽毒素,AOC3(VAP-1),B细胞成熟抗原(BCMA),B7-H3(CD276),炭疽芽孢杆菌性炭疽,B细胞活化因子(BAFF),B淋巴瘤细胞,骨髓间质细胞抗原2(BST2),印迹位点的调节剂的同系物(BORIS),C242抗原,C5,CA-125,癌症抗原125(CA-125或MUC16),癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1),癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a),碳酸酐酶9(CA-IX),癌胚抗原(CEA),心脏肌球蛋白,CCCTC结合因子(CTCF),CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1),CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CD11,CD123,CD125,CD140a,CD147(basigin),CD15,CD152,CD154(CD40L),CD171,CD179a,CD18,CD19,CD2,CD20,CD200,CD22,CD221,CD23(IgE受体),CD24,CD25(IL-2受体的α链),CD27,CD274,CD28,CD3,CD3ε,CD30,CD300分子样家族成员f(CD300LF),CD319(SLAMF7),CD33,CD37,CD38,CD4,CD40,CD40配体,CD41,CD44v7,CD44v8,CD44v6,CD5,CD51,CD52,CD56,CD6,CD70,CD72,CD74,CD79A,CD79B,CD80,CD97,CEA相关抗原,CFD,ch4D5,染色体X开放读码框61(CXORF61),封闭蛋白18.2(CLDN18.2),封闭蛋白6(CLDN6),艰难梭菌,凝聚因子A,CLCA2,集落刺激因子1受体(CSF1R),CSF2,CTLA-4,C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A),C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1),C-X-C趋化因子受体类型4,细胞周期蛋白B1,细胞色素P4501B1(CYP1B1),cyp-B,巨细胞病毒,巨细胞病毒糖蛋白B,达比加群,DLL4,DPP4,DR5,大肠杆菌志贺毒素1型,大肠杆菌志贺毒素2型,外-ADP-核糖基转移酶4(ART4),含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2),EGF样结构域多倍体7(EGFL7),突变的延伸因子2(ELF2M),内毒素,肝配蛋白A2,肝配蛋白B2,肝配蛋白A型受体2,表皮生长因子受体(EGFR),表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII),上皮唾蛋白,上皮细胞粘附分子(EpCAM),上皮糖蛋白2(EGP-2),上皮糖蛋白40(EGP-40),ERBB2,ERBB3,ERBB4,ERG(跨膜蛋白酶,丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因),大肠杆菌,位于染色体12p的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML),呼吸道合胞病毒的F蛋白,FAP,IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89),Fc受体样5(FCRL5),胎儿乙酰胆碱受体,纤维蛋白IIβ链,成纤维细胞活化蛋白α(FAP),纤连蛋白外结构域-B,FGF-5,Fms样酪氨酸激酶3(FLT3),叶酸结合蛋白(FBP),叶酸水解酶,叶酸受体1,叶酸受体α,叶酸受体β,Fos相关抗原1,卷曲受体,岩藻糖基GM1,G250,G蛋白偶联受体20(GPR20),G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D),神经节苷脂G2(GD2),GD3神经节苷脂,糖蛋白100(gp100),磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3),GMCSF受体α-链,GPNMB,GnT-V,生长分化因子8,GUCY2C,突变的热激蛋白70-2(muthsp70-2),血凝素,甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1),乙型肝炎表面抗原,乙型肝炎病毒,HER1,HER2/neu,HER3,globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH),HGF,HHGFR,高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA),组蛋白复合物,HIV-1,HLA-DR,HNGF,Hsp90,HST-2(FGF6),人乳头瘤病毒E6(HPV E6),人乳头瘤病毒E7(HPV E7),人散射因子受体激酶,人端粒酶逆转录酶(hTERT),人TNF,ICAM-1(CD54),iCE,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IgE,IgE Fc区,IGF-1,IGF-1受体,IGHE,IL-12,IL-13,IL-17,IL-17A,IL-17F,IL-1β,IL-20,IL-22,IL-23,IL-31,IL-31RA,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6受体,IL-9,免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1),甲型流感血凝素,胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体),胰岛素样生长因子2(ILGF2),整联蛋白α4β7,整联蛋白β2,整联蛋白α2,整联蛋白α4,整联蛋白α5β1,整联蛋白α7β7,整联蛋白αIIbβ3,整联蛋白αvβ3,干扰素α/β受体,干扰素γ诱导的蛋白,白介素11受体α(IL-11Rα),白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2),肠羧基酯酶,激酶结构域区域(KDR),KIR2D,KIT(CD117),L1-细胞粘附分子(L1-CAM),天冬酰胺肽链内切酶,白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2),白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1),淋巴细胞抗原6(Ly-6),Lewis-Y抗原,LFA-1(CD11a),LINGO-1,脂磷壁酸,LOXL2,L-选择蛋白(CD62L),淋巴细胞抗原6复合物,基因座K 9(LY6K),淋巴细胞抗原75(LY75),淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK),淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF),M-CSF,乳腺分化抗原(NY-BR-1),MCP-1,黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1),黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2),细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP),黑素瘤相关的抗原1(MAGE-A1),间皮素,细胞表面有关的粘蛋白1(MUC1),MUC-2,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC7,MUC16,粘蛋白CanAg,髓磷脂相关的糖蛋白,肌肉生长抑制素,N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17),NCA-90(粒细胞抗原),连接素-4,神经生长因子(NGF),调节神经细胞凋亡的蛋白酶1,神经细胞粘附分子(NCAM),神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A,NOGO-B,NOGO-C),神经纤毛蛋白-1(NRP1),N-羟乙酰基神经氨酸,NKG2D,Notch受体,o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2),嗅觉受体51E2(OR51E2),癌胚胎抗原(h5T4),由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl),穴兔,OX-40,oxLDL,p53突变体,配对框蛋白Pax-3(PAX3),配对框蛋白Pax-5(PAX5),泛连接蛋白3(PANX3),P-钙粘着蛋白,磷酸钠协同转运蛋白,磷脂酰丝氨酸,胎盘特异性的1(PLAC1),血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα),血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β),聚唾液酸,顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES1),程序性细胞死亡蛋白1(PD-1),程序性死亡-配体1(PD-L1),前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9),前列腺酶,前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8),被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1),P15,P53,PRAME,前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性的膜抗原(PSMA),前列腺酸性磷酸酶(PAP),前列腺癌细胞,prostein,蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21),蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2),铜绿假单胞菌,狂犬病病毒糖蛋白,RAGE,Ras同源物家族成员C(RhoC),核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL),高级糖化终产物的受体(RAGE-1),受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1),肾普遍存在的1(RU1),肾普遍存在的2(RU2),呼吸道合胞病毒,Rh血型D抗原,猕猴因子,肉瘤易位断点,硬骨素(SOST),选择蛋白P,唾液酸基Lewis粘附分子(sLe),精子蛋白17(SPA17),鞘氨醇-1-磷酸,被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3),阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4),金黄色葡萄球菌,STEAP1,黏结蛋白聚糖1(SDC1)+A314,SOX10,存活素,存活素-2B,滑膜肉瘤,X断点2(SSX2),T细胞受体,TCRΓ交替读码框蛋白(TARP),端粒酶,TEM1,生腱蛋白C,TGF-β(例如，TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3),促甲状腺激素受体(TSHR),组织因子途径抑制剂(TFPI),Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr)),TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA),TNF-α,TRAIL-R1,TRAIL-R2,TRG,转谷氨酰胺酶5(TGS5),肿瘤抗原CTAA16.88,肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248),肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R),肿瘤蛋白p53(p53),MUC1的肿瘤特异性糖基化,肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TROP-2),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)+A327,TWEAK受体,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关的蛋白1(TYRP1或糖蛋白75),酪氨酸酶相关的蛋白2(TYRP2),尿空斑蛋白2(UPK2),血管内皮生长因子(例如，VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PIGF),血管内皮生长因子受体1(VEGFR1),血管内皮生长因子受体2(VEGFR2),波形蛋白,v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN),血管性假血友病因子(VWF),肾母细胞瘤蛋白(WT1),X抗原家族成员1A(XAGE1),β-淀粉样蛋白,κ-轻链,成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2),雌激素调节的LIV-1蛋白(LIV1,又称SLC39A6),神经营养性的受体酪氨酸激酶1(NTRK1,又称TRK),Ret原癌基因(RET),B细胞成熟抗原(BCMA,又称TNFRSF17),转铁蛋白受体(TFRC,又称CD71),活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM,又称CD166),生长抑素受体2(SSTR2),KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(cKIT),V-Set免疫调节性受体(VSIR,又称VISTA),糖蛋白Nmb(GPNMB),δ样典型Notch配体3(DLL3),白介素3受体亚基α(IL3RA,又称CD123),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),钙粘着蛋白3类型1,P-钙粘着蛋白(CDH3),肝配蛋白A4(EFNA4),蛋白酪氨酸激酶7(PTK7),溶质载体家族34成员2(SLC34A2,又称NaPi-2b),鸟苷酸环化酶C(GCC),含有PLAUR结构域的3(LYPD3,又称LY6或C4.4a),粘蛋白17,细胞表面有关的(MUC17),Fms有关的受体酪氨酸激酶3(FLT3),NKG2D配体(例如ULBP1,ULBP2,ULBP3,H60,Rae-1α,Rae-1β,Rae-1δ,Rae-1γ,MICA,MICB,hHLA-A),SLAM家族成员7(SLAMF7),白介素13受体亚基α2(IL13RA2),C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A,又称CLL-1),CEA细胞粘附分子5(CEACAM,又称CD66e),白介素3受体亚基α(IL3RA),CD5分子(CD5),UL16结合蛋白1(ILBP1),含有V-Set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1,又称B7-H4),硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4),黏结蛋白聚糖1(SDC1,又称CD138),白介素1受体辅助蛋白(IL1RAP),含有杆状病毒IAP重复的5(BIRC5,又称存活素),CD74分子(CD74),甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1,又称TIM1),SLIT和NTRK样家族成员6(SILTRK6),CD37分子(CD37),凝血因子III,组织因子(CD142,又称F3),AXL受体酪氨酸激酶(AXL),内皮素受体类型B(EDNRB,又称ETBR),钙粘着蛋白6(CDH6),成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3),碳酸酐酶6(CA6),MUC1的CanAg糖型,整联蛋白亚基αV(ITGAV),畸胎癌衍生的生长因子1(TDGF1,又称Crypto1),SLAM家族成员6(SLAMF6,又称CD352)和Notch受体3(NOTCH3)。
在一些实施方案中，(1)本文中公开的AF2片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)将本文中公开的AF1和AF2构造为(Fab‘)2或单链双体。
在某些实施方案中，AF2对靶细胞标志物的结合亲和力比AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。
在一些其它的实施方案中，AF1和AF2各自表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。在另一个实施方案中，AF1和AF2各自表现出在5.5和6.6之间、包括端点的pI。在某些实施方案中，AF1的pI是在AF2的pI的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5个pH单位内。
在又一个方面，本文中公开了一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述抗原结合片段a.特异性地结合CD3的ε亚基；和b.包含含有SEQ ID NO:920的VH氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:919的VL氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合片段由SEQ ID NO:921组成。
在一个方面，本文中公开了药物组合物，其包含本文中公开的多肽和一种或更多种药学上合适的赋形剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制用于真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用。在另一个实施方案中，药物组合物呈液体形式。在另一个实施方案中，药物组合物是在用于单次注射的预充注射器中。在又一个实施方案中，将药物组合物配制为要在施用前重构的冻干粉末。
在另一个方面，本文中公开了本文公开的多肽在制备用于治疗受试者中的疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：上皮癌(carcinomas),霍奇金淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤,B细胞淋巴瘤,弥散性大B细胞淋巴瘤,T细胞淋巴瘤,滤泡性淋巴瘤,套细胞淋巴瘤,母细胞瘤,乳腺癌,结肠癌,前列腺癌,头颈癌,皮肤癌的任何形式,黑素瘤,生殖泌尿道癌,卵巢癌,具有恶性腹水的卵巢癌,阴道癌,外阴癌,尤因肉瘤,腹膜癌扩散,子宫浆液性癌,甲状旁腺癌,子宫内膜癌,宫颈癌,结肠直肠癌,具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤,子宫癌,腹膜肾癌中的间皮瘤,肺癌,喉癌,小细胞肺癌,非小细胞肺癌,胃癌,食管癌,胃癌,小肠癌,肝癌,肝细胞癌,视网膜母细胞瘤,肝母细胞瘤,脂肪肉瘤,胰腺癌,胆囊癌,睾丸癌,胆管癌,骨癌,唾液腺癌,甲状腺癌,颅咽管瘤,类癌瘤,上皮癌(epithelial cancer),卵巢雄性细胞瘤,腺癌,任何起源的肉瘤,原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓细胞性白血病、B细胞衍生的慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍,重症肌无力,格雷夫斯病(Morbus Basedow),卡波西肉瘤,神经母细胞瘤,桥本甲状腺炎,肾母细胞瘤或古德帕斯丘综合征。
在又一个方面，本文中公开了治疗受试者中的疾病的方法，其包括给有此需要的受试者施用一个或更多个治疗有效剂量的本文中公开的药物组合物。在某些实施方案中，受试者选自由小鼠、大鼠、猴和人组成的组。在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：上皮癌,霍奇金淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤,B细胞淋巴瘤,T细胞淋巴瘤,滤泡性淋巴瘤,套细胞淋巴瘤,母细胞瘤,乳腺癌,结肠癌,前列腺癌,头颈癌,皮肤癌的任何形式,黑素瘤,生殖泌尿道癌,卵巢癌,具有恶性腹水的卵巢癌,腹膜癌扩散,子宫浆液性癌,子宫内膜癌,宫颈癌,结肠直肠癌,具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤,子宫癌,腹膜肾癌中的间皮瘤,肺癌,小细胞肺癌,非小细胞肺癌,胃癌,食管癌,胃癌,小肠癌,肝癌,肝细胞癌,肝母细胞瘤,脂肪肉瘤,胰腺癌,胆囊癌,胆管癌,唾液腺癌,甲状腺癌,上皮癌,腺癌,任何起源的肉瘤,原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病,急性或慢性髓细胞性白血病,骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍,重症肌无力,格雷夫斯病,桥本甲状腺炎或古德帕斯丘综合征。
在其它实施方案中，以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用的一个或更多个治疗有效剂量将药物组合物施用给受试者。在某些实施方案中，以至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的阶段中的一个或更多个治疗有效剂量将药物组合物施用给受试者。在一些实施方案中，真皮内地、皮下地、静脉内地、动脉内地、腹内地、腹膜内地、鞘内地或肌肉内地施用剂量。
在一个方面，本文中公开了分离的核酸，所述核酸包含(a)编码本文中公开的多肽的多核苷酸；或(b)(a)的多核苷酸的互补物。
在一个有关的方面，本文中公开了表达载体，其包含本文中公开的多核苷酸序列和可操作地连接至所述多核苷酸序列的重组调节序列。
在另一个方面，本文中公开了分离的宿主细胞，其包含本文中公开的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞是原核生物。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。
附图简述
在所附权利要求书中具体阐述了本公开内容的各种特征。参考以下阐述示例性实施方案(其中利用了本发明的原理)的详细描述以及附图，将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，且其中附图：
图1(图1)描绘了双特异性抗原结合片段组合物的各种组分。图1A描绘了对靶细胞标志物具有亲和力的抗原结合片段。图1B描绘了对效应细胞具有亲和力的抗原结合片段。图1C和1D描绘了不同长度的XTEN多肽。图1E描绘了可切割的释放区段。
图2(图2)描绘了本文描述的多肽组合物的两种不同形式。图2A在左侧描绘了与释放区段和XTEN融合的与效应细胞结合的抗原结合片段，而箭头描绘了蛋白酶切割释放区段的作用，导致在右侧，XTEN从多肽的抗原结合片段释放，使得抗原结合片段由于不再被XTEN屏蔽而重新获得其完全结合亲和力潜力。图2B在左侧描绘了双特异性组合物，该双特异性组合物具有与效应细胞结合的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段。释放区段和XTEN也融合至对效应细胞具有亲和力的抗原结合片段，而箭头描绘了蛋白酶切割释放区段的作用，导致在右侧，XTEN和融合的抗原结合片段从多肽的释放，融合的抗原结合片段由于不再被XTEN屏蔽而然后重新获得其完整结合亲和力潜力。
图3(图3)描绘了双特异性抗原结合多肽的两种不同形式。在左侧，双特异性组合物具有与效应细胞结合的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段，其中释放区段(其中剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和XTEN融合至对效应细胞具有结合亲和力的抗原结合片段，而在右侧，双特异性组合物具有与效应细胞结合的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段，其中释放区段和XTEN融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段。
图4(图4)描绘了双特异性抗原结合多肽的三种不同形式。图4A描绘了双特异性组合物，其具有与效应细胞结合的scFv抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的scFv抗原结合片段，其中释放区段(其中剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和XTEN融合至每个抗原结合片段。图4B和4C是4A的变化形式，其中抗原结合片段处于双体构型，其中释放区段(其中剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和XTEN融合至分别与效应细胞或靶细胞标志物结合的抗原结合片段。
图5(图5)显示了在肿瘤组织(在顶部)和正常组织(在底部)附近的双特异性抗原结合多肽的示意性表示。与在正常组织中相比，双特异性抗原结合多肽优先在肿瘤组织处被切割以释放一个或更多个XTEN部分。被切割的双特异性抗原结合多肽能够结合T细胞和结合表达肿瘤特异性标志物的肿瘤细胞。
图6(图6)描绘了对照释放区段RSR-1517的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)，显示了所列蛋白酶的肽切割位点。
图7(图7)显示了在PBMC/SK-OV-3细胞(A)或PBMC/BT-474细胞(B)细胞毒性测定中N-端和C-端XTEN化的抗HER2-抗CD3 XPAT构建体(“HER2-XPAT”)对比未XTEN化的相同构建体(“HER2-PAT”)的体外细胞毒性活性。分别通过胱天蛋白酶3/7测定或发光ATP测定来评估细胞毒性。
图8(图8)表明，未XTEN化的HER2-CD3构建体的体外毒性与HER2表达相关。(A)显示了在有PBMC存在下在具有不同HER2表达的细胞系中未XTEN化的HER2-CD3构建体(“HER2-PAT”)的剂量响应。(B)显示了在有PBMC存在下在具有不同HER2表达的选定细胞系中未XTEN化的HER2-CD3构建体(“HER2-PAT”)对比XTEN化的HER2-CD3构建体(“HER2-XPAT”)的剂量响应。
图9A(图9A)图示了提出的HER2-PAT分子如何在T细胞和HER2阳性细胞之间形成免疫突触的模型。
图9B(图9B)表明，HER2-PAT和HER2-XPAT构建体能够在“天然的”T细胞(作为PBMC提供)中诱导T细胞活化的常规标志物。图B显示了在有HER2+细胞(SK-OV-3细胞)存在下未XTEN化的HER2-CD3构建体(“HER2-PAT”)对比XTEN化的HER2-CD3构建体(“HER2-XPAT”)对PBMC中的CD69+ T细胞(T细胞活化的早期标志物)上调的剂量响应，如通过流式细胞计量术所评估的。
图10A(图10A)表明，对比未XTEN化的HER2-PAT，HER2-XPAT在体外PBMC/心肌细胞模型中显示出显著降低的细胞毒性。
图11(图11)表明，HER2-PAT和HER2-XPAT构建体的T细胞活化依赖于HER2阳性细胞的参与。(A)显示了在体外Jurkat T细胞/BT-474模型中在有或没有BT-474 HER2+细胞存在下HER2-PAT或HER2-XPAT对T细胞的活化，如通过在Jurkat T细胞中由NFAT应答元件驱动的萤光素酶活性所测量的。(B)显示的类似数据表明在体外Jurkat T细胞/SK-OV-3模型中在有或没有SK-OV-3细胞存在下HER2-PAT或HER2-XPAT对T细胞的活化。
图12(图12)表明，在有HER2阳性细胞存在下，单(N-或C-)端XTEN化造成XTEN化的HER2-CD3分子对Jurkat细胞活化的中等减少。(A)显示了在有BT-474细胞存在下未XTEN化的HER2-CD3构建体、单端XTEN化的HER2-CD3构建体、或N-端和C-端XTEN化的HER2-CD3分子的Jurkat细胞活化的剂量响应。(B)显示了在有SK-OV-3细胞存在下未XTEN化的HER2-CD3构建体、单端XTEN化的HER2-CD3构建体、或N-端和C-端XTEN化的HER2-CD3分子的Jurkat细胞活化的剂量响应。
图13(图13)表明，N-端和C-端XTEN化的抗HER2-抗CD3分子(“XPAT”)和未XTEN化的HER2-CD3分子(“PAT”)在BT-474/人PBMC异种移植物模型中在减少肿瘤负荷方面是有效的，并且XTEN化的HER2-CD3分子(“XPAT”)的抗肿瘤活性取决于XTEN分子的切割。(A)显示了用媒介物+/-PBMC、XTEN化的HER2-CD3分子(“XPAT”)和未XTEN化的HER2-CD3分子(“PAT”)经25天治疗后的肿瘤体积。(B)显示了用媒介物+PBMC、XTEN化的HER2-CD3分子(“XPAT”)和具有不可切割的XTEN的XTEN化的HER2-CD3分子经25天治疗后的肿瘤体积。
图14(图14)表明，N-端和C-端XTEN化的HER2-CD3分子(“HER2-XPAT”)和未-XTEN化的HER2-CD3分子(“HER2-PAT”)有效增加肿瘤组织中活化的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞群体，所述肿瘤组织取自治疗后的BT-474/人PBMC异种移植物模型。(A)显示了在用媒介物、HER2-XPAT或HER2-PAT治疗后肿瘤中“活化的”(例如CD25+)CD4+细胞的百分比，如通过流式细胞计量术所评估的。(B)显示了在用媒介物、HER2-XPAT或HER2-PAT治疗后肿瘤中“活化的”(例如CD25+)CD8+细胞的百分比，如通过流式细胞计量术所评估的。
图14C(图14C)表明，HER2-XPAT的替代给药方案有效减少人源化的BT-474异种移植小鼠中的肿瘤负荷。
图15(图15)图示了，HER2-CD3分子的XTEN化降低HER2-CD3构建体在食蟹猴中的毒性。(A)显示了XTEN化的(“HER2-XPAT”)或未XTEN化的(“HER2-PAT”)在猴中的最大耐受剂量试验方案。(B)显示了XTEN化的或未XTEN化的分子在猴中给药后的血浆水平，表明XTEN化的构建体的最大耐受剂量是未XTEN化的分子的>1000x。
图16(图16)表明，在食蟹猴中，HER2-XTEN构建体在大于2.5mpk的剂量诱导T细胞边缘化(T cell margination)，但是在高达50mpk的剂量没有活化外周T细胞。(A)显示了对总淋巴细胞的影响，表明XTEN化的构建体在大于2.5mpk的剂量诱导总血液淋巴细胞的减少。(B)显示了HER2-XPAT2275对活化的CD4+和CD8+ T细胞群体的影响，表明在给药后对全身T细胞活化的影响是在给药前范围内。
图17(图17)表明，当在食蟹猴中施用剂时，HER2-CD3分子的XTEN化会减轻细胞因子释放综合征。(A)、(B)和(C)显示了在食蟹猴中由HER2-PAT或HER2-XPAT的剂量系列诱导的血清IL-6、TNFα或IFNγ的最大浓度，表明HER2-XPAT不会在测试剂量诱导可察觉的细胞因子释放。
发明详述
尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会明白，这样的实施方案仅通过示例的方式提供。现在本领域技术人员会做出众多变化形式、变化和置换而不脱离本发明。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。所附权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等同方案的范围内的方法和结构。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料都可以用于实践或试验本发明，但是下面描述了适合的方法和材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，无意成为限制性的。现在本领域技术人员会做出众多变化形式、变化和置换而不脱离本发明。
定义
在本申请的上下文中，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义：
如贯穿说明书和权利要求书所使用的，术语“一个”、“一种”和“所述”以它们表示“至少一个/种”、“至少第一个/种”、“一个/种或更多个/种”或“多于一个/种”所提及的组分或步骤的含义使用，除了其中在此后具体说明上限的情况以外。因此，本文中使用的一个“释放区段”是指“至少第一释放区段”，但包括多于一个释放区段。本领域普通技术人员考虑到本公开内容将知道组合的可操作限制和参数，以及任何单一剂的量。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可以包含经修饰的氨基酸，且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，诸如与标记组分缀合进行修饰。
应用于多肽的术语“单体”表示多肽作为单个连续氨基酸序列的状态，所述序列基本上不与具有相同或不同序列的一种或更多种额外多肽缔合。
本文中使用的术语“氨基酸”表示天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括、但不限于D或L光学异构体二者，以及氨基酸类似物和肽拟似物。标准的单字母或三字母代码可用于指定氨基酸。
术语“天然的L-氨基酸”或“L-氨基酸”是指以下的L光学异构体形式：甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用并涵盖各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、纳米抗体(nanobodies)、VHH抗体和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。全长抗体可以是例如单克隆的、重组的、嵌合的、去免疫化的、人源化的和人的抗体。抗体代表了一大类分子，其包括几种类型的分子，诸如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括例如杂合抗体或改变的抗体及其片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由天然存在的抗体或单克隆抗体的片段来执行。
“人源化的”抗体表示包含来自非人互补性决定区(CDR)的氨基酸残基和来自人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人抗体的那些(其可以包括氨基酸置换)，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些(其可以包括氨基酸置换)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法是本领域已知的或本文描述的。
本文中使用的“抗原结合片段”表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原特异性地结合(“产生免疫反应”)的抗原结合位点的分子。例子包括、但不限于：Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、双体、线性抗体(参见美国专利号5,641,870)、单结构域抗体、单结构域骆驼科抗体、可变单链片段(scFv)抗体分子以及由保留特异性结合抗原的能力的抗体片段形成的多特异性抗体。术语“抗原结合片段”还涵盖具有适合并识别并结合表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一种或更多种非共价结合相互作用会稳定分子结构和表位之间的复合物。如果与它结合其它参考抗原(包括多肽或其它物质)相比，抗原结合片段以更大的亲和力或亲合力结合抗原，则所述抗原结合片段与抗原“特异性地结合”或“免疫反应”。
“scFv”或“可变单链片段”在本文中互换地用于表示包含抗体的通过短的柔性肽接头连接在一起的重(“VH”)和轻(“VL”)链的可变区或者VH或VL链的两个拷贝的抗体片段形式，所述接头使scFv能够形成抗原结合所需的结构。scFv是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，并且可以在大肠杆菌或其它宿主细胞中以功能形式容易地表达。
“双体”表示通过在VH和VL结构域之间构建具有短接头(约5-10个残基)的scFv片段而制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体是两个“交叉”scFv片段的异源二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双体更完整地描述在例如US7635475。
术语“双特异性抗原结合片段”应理解为对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗原结合片段。
术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文中互换地用于表示抗体、抗体片段或基于抗体片段的分子所结合或具有特异性的结构或结合决定簇。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物或其部分。抗原也是对抗原具有结合亲和力的那些抗体或抗体片段的配体。非限制性的示例性抗原包括来自人、非人灵长类动物、鼠的CD3、HER2、EGFR和EpCAM(及其部分)及其其它同源物。
术语“CD3抗原结合片段”表示能够以足够的亲和力结合分化簇3(CD3)或CD3复合物的成员的抗原结合片段，使得该抗原结合片段可用作靶向CD3的诊断剂和/或治疗剂。
“靶细胞标志物”表示由靶细胞表达的分子，包括、但不限于可能存在于靶组织或细胞的内部或表面上的细胞表面受体、抗原、糖蛋白、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇或结合位点，其可以充当抗体的配体。
“靶组织”或“靶细胞”表示作为疾病状况(诸如、但不限于癌症或炎性病症)的原因或部分的组织或细胞。患病的靶组织或细胞的来源包括身体器官、肿瘤、癌细胞或癌细胞群，或形成基质或被发现与癌细胞群相关的细胞、骨、皮肤、产生细胞因子或促成疾病状况的因子的细胞。
术语“表位”表示抗体、抗体片段或结合结构域所结合的抗原分子上的特定位点。表位是抗体或抗体片段的配体。
“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。本文中使用的“更大的结合亲和力”是指更低的Kd值；例如，1x10-9M是比1x10-8M更大的结合亲和力。结合感兴趣的抗原(例如，肿瘤相关的靶细胞抗原)的抗体是以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断剂和/或治疗剂，且不与其它蛋白显著地交叉反应。
“解离常数”或“Kd”互换使用，且表示配体“L”和蛋白“P”之间的亲和力；即配体结合特定蛋白的紧密程度。它可以使用公式Kd＝[L][P]/[LP]计算，其中[P]、[L]和[LP]分别代表蛋白、配体和复合物的摩尔浓度。
术语“高变区”、“HVR”或“CDR”，当在本文中使用时，可互换地表示在序列中高变和/或形成在结构上限定的环和/或参与抗原识别的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。许多CDR描述正在使用中并且被包含在本文中；例如，CDR-L1表示轻链的第一个高变CDR区域，CDR-H2表示重链的第二个高变CDR区域，等等。Kabat互补性决定区(CDR)是基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
“框架”或“FR”残基是抗原结合片段中除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基，并且通常位于CDR之间或侧接CDR。许多FR描述正在使用中并被包含在本文中；例如，FR-L1表示轻链的第一个FR区域，FR-H2表示重链的第二个FR区域，等等。
“等电点”或“pI”在本文中互换地用于表示特定分子不携带净电荷或在统计平均值中为电中性时的pH。表示等电点的标准命名法是pH，使得单位是pH单位；例如，具有6.3的pI的抗原结合片段在pH 6.3的溶液中将具有中性电荷。等电点可以用数学方法确定，包括许多用于估计肽和蛋白的等电点的算法；例如，具有不同pK值的Henderson-Hasselbalch方程式。等电点也可以通过体外测定诸如毛细管电泳聚焦进行实验确定。
术语“释放区段”或“RS”表示主题组合物中的肽，其在序列中具有可被一种或更多种蛋白酶识别并切割的一个或更多个位点，从而实现抗原结合片段和XTEN从该组合物的释放。本文中使用的“哺乳动物蛋白酶”是指通常存在于哺乳动物的体液、细胞、组织中并且可以以更高的水平见于某些靶组织或细胞中(例如，在患病的组织(例如，肿瘤)中)的蛋白酶。RS序列可工程改造为被各种哺乳动物蛋白酶或多种哺乳动物蛋白酶切割，所述蛋白酶存在于受试者的靶组织中或附近或在体外测定中引入。可以使用能够识别限定的切割位点的其它等效蛋白酶(内源性的或外源性的)。特别考虑到，RS序列可以根据所使用的蛋白酶来调整和定制并且可以掺入接头氨基酸以与相邻多肽连接。
术语“切割位点”表示在肽或多肽中相邻氨基酸之间的可以被酶(诸如蛋白酶)破坏或切割的位置；相邻氨基酸之间的肽键断裂。
术语“在……内”，当提及与第二多肽连接的第一多肽时，涵盖分别将第一或第二多肽的N端连接至第二或第一多肽的C端的额外组分的连接或融合，以及第一多肽向第二多肽的序列中的插入。例如，当RS组分在嵌合多肽组装体“内”连接时，该RS可以连接至N-端、C-端，或者可以插入在XTEN多肽的任何两个氨基酸之间。
在用于本文提供的组合物的形式时，“活性”表示，作用或效果，包括、但不限于抗原结合、拮抗剂活性、激动剂活性、细胞或生理应答、细胞裂解、细胞死亡或本领域对于该组合物的效应组分所公知的效果，无论是通过体外、离体或体内测定还是通过临床效果所测量的。
本文使用的“效应细胞”包括能够给靶细胞赋予作用的任何真核细胞。例如，效应细胞可以诱导靶细胞的膜完整性的丧失、固缩、核碎裂、细胞凋亡、裂解和/或死亡。在另一个实例中，效应细胞可以诱导靶细胞的分裂、生长、分化或者以其它方式改变靶细胞的信号转导。效应细胞的非限制性例子包括：浆细胞、T细胞、CD4细胞、CD8细胞、B细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、肥大细胞、树突细胞、调节性T细胞(RegT细胞)、辅助性T细胞、髓样细胞、巨噬细胞和NK细胞。
“效应细胞抗原”表示由效应细胞表达的分子，包括、但不限于细胞表面分子诸如蛋白、糖蛋白或脂蛋白。示例性的效应细胞抗原包括CD3复合物的蛋白或T细胞受体(TCR)、CD4、CD8、CD25、CD38、CD69、CD45RO、CD57、CD95、CD107和CD154，以及效应分子，诸如与效应细胞相缔合的、相结合的细胞因子，在效应细胞内表达的细胞因子，或由效应细胞表达和释放的细胞因子。效应细胞抗原可以充当主题嵌合多肽组装体的结合结构域的结合相应物。
本文中使用的“CD3”或“分化簇3”是指T细胞表面抗原CD3复合物，其包括呈单独形式或独立组合形式的所有已知CD3亚基，例如CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3β。CD3ε、γ和δ的细胞外结构域含有免疫球蛋白样结构域，因此被认为是免疫球蛋白超家族的一部分。CD3包括例如人CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)，其长度为207个氨基酸，以及人CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)，其长度为182个氨基酸。
本文中使用的术语“ELISA”表示如本文所述的或本领域以其它方式已知的酶联免疫吸附测定。
“宿主细胞”包括可以是或已经是已引入外源核酸的主题载体(诸如本文描述的那些)的接受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然的、意外的或有意的突变，后代不一定与原始母代细胞完全相同(在形态方面或者在总DNA互补物的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指已经从其天然环境的组分或从更复杂的混合物(诸如在蛋白纯化期间)鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染物组分是通常干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。对本领域技术人员而言明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的相应物区别开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段可与其天然存在相应物相区别，因为浓度或每体积的分子数目通常大于其天然存在的相应物的值。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的核酸”是从编码多肽的核酸的天然来源中通常伴随的至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子。例如，分离的编码多肽的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的编码多肽的核酸分子与在天然细胞中存在的特定编码多肽的核酸分子有区别。但是，分离的编码多肽的核酸分子包括在通常表达所述多肽的细胞中含有的编码多肽的核酸分子，其中例如，所述核酸分子处于不同于天然细胞的核酸分子的染色体或者染色体外位置。
“嵌合的”蛋白或多肽含有至少一个融合多肽，该融合多肽在序列中与天然存在的位置不同的位置包含至少一个区域。区域可以通常存在于单独的蛋白中并且在融合多肽中聚集在一起；或者它们可以通常存在于同一蛋白中但在融合多肽中处于新的排列。例如，通过化学合成，或通过产生和翻译其中肽区域以所需关系编码的多核苷酸，可以产生嵌合蛋白。
“融合的”和“融合体”在本文中可互换地使用，并且表示通过重组方式使两个或更多个肽或多肽序列连接在一起。“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列，所述第二氨基酸序列在自然界中不与其天然连接。
“XTEN化的”用于表示已经通过一种或更多种XTEN多肽(下文描述)与肽或多肽的连接或融合而修饰的肽或多肽，无论是通过重组还是化学交联方式。
“可操作地连接”是指，被连接的DNA序列是在阅读相或框架内。“框架内融合”表示，以维持原始ORF的正确读码框的方式连接两个或更多个开放读码框(ORF)以形成连续的更长ORF。例如，如果启动子或增强子影响多肽序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至多肽的编码序列。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或更多个区段的单一蛋白，所述区段对应于原始ORF编码的多肽(所述区段在自然界中通常不这样连接)。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中在氨基端至羧基端(N-端至C-端)方向上的氨基酸顺序，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽部分的直链序列。
“异源”是指衍生自在基因型上不同于它所对比的实体的其余部分的实体。例如，从其天然编码序列中取出并可操作地连接到非天然序列的编码序列的富含甘氨酸的序列是异源的富含甘氨酸的序列。在应用于多核苷酸、多肽时术语“异源”是指，多核苷酸或多肽衍生自在基因型上不同于它所对比的实体的其余部分的实体。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们表示任何长度的核苷酸，包括单个核酸以及多于一个核酸，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，且可以执行已知的或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的多于一个基因座(单个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。
术语“多核苷酸的互补物”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反向取向的多核苷酸分子，使得它可以完全保真地与参考序列杂交。
在应用于多核苷酸时“重组”是指，多核苷酸是重组步骤的各种组合的产物，所述重组步骤可以包括克隆、限制和/或连接步骤，以及导致重组蛋白在宿主细胞中的表达的其它程序。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换地使用。它们表示含有至少一个开放读码框的多核苷酸，所述开放读码框在转录和翻译后能够编码特定蛋白。基因或基因片段可以是基因组的或cDNA，只要多核苷酸含有至少一个开放读码框，其可以覆盖整个编码区或其片段。“融合基因”是由连接在一起的至少两个异源多核苷酸组成的基因。
本文中使用的“编码区”或“编码序列”是多核苷酸的一部分，其由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不会翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)不是编码区的一部分。编码区的边界通常由在5'末端的起始密码子(其编码所得多肽的氨基末端)以及在3'末端的翻译终止密码子(其编码所得多肽的羧基末端)决定。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上。因此，单个载体可仅含有单个编码区，或包含两个或更多个编码区，例如，单个载体可分别编码如下所述的结合结构域-A和结合结构域-B。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的结合结构域的核酸融合或未融合。异源编码区包括、但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。
术语“下游”表示位于参考核苷酸序列的3'的核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列表示与转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录的起始位点的下游。
术语“上游”表示位于参考核苷酸序列的5'的核苷酸序列。在某些实施方案中，上游核苷酸序列表示位于编码区或转录起始点的5'侧的序列。例如，大多数启动子位于转录的起始位点的上游。
“同源性”或“同源”表示两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用诸如BestFit之类的程序来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵，诸如blosum45或blosum80，以优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些，并且与那些序列相比具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％、且甚至更优选地99％序列同一性。当在相当长度的序列上最佳比对时，同源的多肽优选地具有至少70％、优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％-99％相同的序列同一性。
在应用于多核酸时“连接”表示在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键从而将它们连接在一起的过程。为了将DNA片段或基因连接在一起，DNA的末端必须相互相容。在某些情况下，末端在内切核酸酶消化后将直接相容。但是，可能需要首先将内切核酸酶消化后通常产生的交错末端转化为平头末端以使它们相容进行连接。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括使多核苷酸与其靶序列杂交到比其它序列可检测到地更大程度(例如，相对于背景至少2倍)的条件。通常，杂交的严格性部分地参照进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是这样的条件：其中盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，在pH 7.0至8.3，且温度对于短多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30℃和对于长多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃—例如，“严格条件”可以包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，和在0.1×SSC/1％SDS中在60℃至65℃洗涤三次，每次洗涤持续15分钟。可替换地，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1×SSC至2×SSC变化，其中SDS以约0.1％存在。这样的洗涤温度通常选择为比特定序列在确定的离子强度和pH的热解链点低约5℃至20℃。Tm是使50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH)。用于计算Tm的方程和核酸杂交条件是众所周知的，并且可以参见：Sambrook,J.等人,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,2001。通常，封闭试剂用于封闭非特异性杂交。这样的封闭试剂包括，例如，剪切的和变性的约100-200μg/ml的鲑鱼精DNA。有机溶剂，诸如浓度为约35％-50％v/v的甲酰胺，也可以在特定情况下使用，诸如用于RNA:DNA杂交。这些洗涤条件的有用变化形式对于本领域普通技术人员来说将是明显的。
在应用于多核苷酸序列时，术语“同一性百分比”、“序列同一性百分比”和“％同一性”表示，使用标准化的算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。这样的算法可以以标准化的和可重复的方式在被对比的序列中插入缺口以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的对比。同一性百分比可以在整个定义的多核苷酸序列的长度上测量，或可以在更短的长度上测量，例如，在取自较大的、定义的多核苷酸序列的片段的长度上，例如，至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这样的长度仅仅是示例性的，并且应当理解，在本文中、在表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可用于描述可在其上面测量同一性百分比的长度。如下计算序列同一性百分比：在对比窗口上对比两个最佳比对的序列，确定匹配位置(在此处在两个多肽序列中出现相同的残基)的数目，将匹配位置的数目除以在对比窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。当要对比不同长度的序列时，最短的序列定义了对比窗口的长度。当计算序列同一性时不考虑保守置换。
关于本文鉴定的多肽序列的术语“同一性百分比”、“序列同一性百分比”和“％同一性”定义为，在比对序列并在必要的情况下引入缺口以达到最大序列同一性百分比以后，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分，由此产生最佳比对，在查询序列中与可比较长度的第二个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的各种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被对比序列的全长上实现最佳比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个定义的多肽序列的长度上测量，或可以在更短的长度上测量，例如，在取自较大的、定义的多肽序列的片段的长度上，例如，至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这样的长度仅仅是示例性的，并且应当理解，在本文中、在表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可用于描述可在其上面测量同一性百分比的长度。
在多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”表示序列内部同源性的程度，诸如，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。例如，通过分析相同序列的频率，可以测量重复性。
本文中使用的术语“表达”表示使多核苷酸产生基因产物(例如，RNA或多肽)的过程。它包括、但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任意其它RNA产物，以及将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。本文中使用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。本文描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如，多腺苷酸化或剪接)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质添加、与其它蛋白亚基的缔合或蛋白水解性切割)的多肽。
“载体”或“表达载体”可互换地使用，且表示核酸分子，优选地在适当的宿主中自我复制，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种以上功能的载体。“表达载体”是多核苷酸，其当被引入适当的宿主细胞时，可以被转录和翻译成一种或更多种多肽。“表达系统”通常是指包含表达载体的合适宿主细胞，所述表达载体可以起作用以产生期望的表达产物。
在应用于多肽时，“血清降解抗性”表示多肽在血液或其组分中耐受降解的能力，其通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。可以如下测量血清降解抗性：将蛋白与人(或小鼠、大鼠、狗、猴，在适当时)血清或血浆组合，通常持续数天(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)，通常在约37℃。可以使这些时间点的样品在蛋白质印迹测定上运行，并用抗体检测蛋白。抗体可以针对蛋白中的标签。如果蛋白在蛋白质印迹上显示单条带，其中蛋白的大小与注射的蛋白的大小相同，则没有发生降解。在该示例性的方法中，通过蛋白质印迹或等效技术判断，在50％的蛋白被降解的时间点是蛋白的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
术语“t1/2”、“半衰期”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换地使用，并且如本文所用是指计算为ln(2)/Kel的终末半衰期。Kel是通过对数浓度对比时间曲线的末端线性部分的线性回归计算的终末清除速率常数。半衰期通常表示沉积在活生物体中的施用物质的量的一半通过正常生物学过程代谢或消除所需的时间。当将给定多肽的清除曲线构建为时间的函数时，该曲线通常是双相的，具有快速的α相和较长的β相。在人类中人抗体的典型β相半衰期为21天。可以使用来自任何体液的定时样品来测量半衰期，但最通常在血浆样品中测量。
术语“分子量”通常表示分子中组分原子的原子量的总和。在理论上，可以通过将分子中组分原子的原子质量相加来确定分子量。当应用于多肽的上下文中时，如下计算分子量：基于氨基酸组成，累加组合物中每种类型的氨基酸的分子量，或通过与SDS电泳凝胶中的分子量标准进行对比来估计。分子的计算分子量可以不同于分子的“表观分子量”，后者通常表示通过一种或更多种分析技术确定的分子的分子量。“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，且当在多肽的上下文中使用时，所述术语表示特定氨基酸或多肽序列表现出的表观分子量的相对增加或减少的量度。可以确定表观分子量，例如，使用尺寸排阻色谱法(SEC)或类似的方法，通过与球状蛋白标准进行对比，如以“表观kD”单位测量的。表观分子量因子是表观分子量与“分子量”之比；后者的计算方法是，基于如上所述的氨基酸组成相加，或通过与SDS电泳凝胶中的分子量标准进行对比来估计。在美国专利号8,673,860中描述了表观分子量和表观分子量因子的确定。
“确定成分培养基”表示这样的培养基：其包含培养物中细胞的存活和/或生长所必需的营养和激素需求，使得培养基的组分是已知的。传统上，已经通过添加生长和/或存活所需的营养和生长因子来配制确定成分培养基。通常，确定成分培养基提供来自一个或更多个以下类别的至少一种组分：a)所有必需氨基酸，且通常是二十种氨基酸加半胱氨酸的基本组；b)能量来源，通常以碳水化合物诸如葡萄糖的形式；c)在低浓度所需的维生素和/或其它有机化合物；d)游离脂肪酸；e)痕量元素，其中痕量元素被定义为无机化合物或天然存在的元素，其通常需要在非常低的浓度，通常在微摩尔范围内。确定成分培养基还可以任选地补充来自以下任一类别的一种或更多种组分：a)一种或更多种促有丝分裂剂；b)盐和缓冲剂，例如，钙、镁和磷酸盐；c)核苷和碱基，例如，腺苷和胸苷、次黄嘌呤；d)蛋白和组织水解物。
术语“激动剂”以最宽的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子具体包括天然多肽、肽、小有机分子等的激动剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体。鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或更多种生物活性的可检测到的变化。
本文中使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”、或“缓解”或“改善”在本文中可互换地使用。这些术语表示获得有益或期望结果(包括、但不限于治疗益处和/或预防益处)的方案。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在障碍。并且，治疗益处如下实现：根除或改善一种或更多种生理学症状或改善与潜在障碍相关的一种或更多种临床参数，从而在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍受潜在障碍折磨。为了预防益处，可以将组合物施用给处于发生特定疾病的风险中的受试者，或施用给报告疾病的一种或更多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
本文中使用的“治疗效果”或“治疗益处”表示生理效果，包括、但不限于在受试者中减轻、改善或预防疾病或改善与潜在障碍相关的一种或更多种临床参数，或以其它方式增强受试者的身体或精神健康，这是由于本发明的多肽的施用，而不是诱导产生针对生物活性蛋白所具有的抗原表位的抗体的能力。为了预防益处，可以将组合物施用给处于发展特定疾病、先前疾病、疾病的状况或症状复发的风险中的受试者，或施用给报告疾病的一种或更多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
本文中使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”表示单独地或作为组合物的一部分的药物或生物活性蛋白的量，当以一个或重复剂量施用给受试者时，其能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测到的有益效果。这样的效果不一定是绝对有益的。治疗有效量的确定充分在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文中提供的详细公开内容。
本文中使用的术语“治疗上有效且无毒的剂量”表示本文定义的组合物的耐受剂量，其足够高以造成肿瘤或癌细胞的耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而在受试者中没有或基本上没有重大毒性效应。这样的治疗上有效且无毒的剂量可以通过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应该低于诱发严重不良副作用的剂量。
本文中使用的术语“治疗指数”表示药物变得有毒时的血液浓度与药物有效时的浓度之比。治疗指数的一个示例性比率是LD50:ED50，其中LD50是在受试者群体中导致50％死亡率的剂量，且ED50是在受试者群体中产生有效性的剂量。
本文中使用的术语“给药方案”表示连续施用组合物的多次剂量(即，至少两剂或更多剂)的时间表，其中以治疗有效量施用剂量以对受试者中疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数、终点或特征产生持续的有益效果。
本文中使用的“施用”是指给受试者施用一定剂量的化合物(例如，本发明的抗-CD3抗体)或组合物(例如，包括本发明的抗-CD3抗体的药物组合物)的方法。
“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，受试者或个体是人。
术语“癌”和“癌性的”表示或描述哺乳动物中通常以失调的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的例子包括、但不限于：上皮癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌的任何形式、黑素瘤、生殖泌尿道癌、卵巢癌、具有恶性腹水的卵巢癌、腹膜癌扩散、子宫浆液性癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、子宫癌、腹膜肾癌中的间皮瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胃癌、小肠癌、肝癌、肝细胞癌、肝母细胞瘤、脂肪肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、唾液腺癌、甲状腺癌、上皮癌、腺癌、任何起源的肉瘤、原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓细胞性白血病、骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎或古德帕斯丘综合征。
本文中使用的“肿瘤”表示所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)，以及所有癌前和癌变细胞和组织。本文中使用的术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性障碍”、“增殖性障碍”和“肿瘤”不是相互排斥的。
本文中使用的“肿瘤特异性标志物”表示在癌细胞上或癌细胞中发现的抗原，相对于正常细胞或组织，所述抗原可能但不一定在癌细胞中或癌细胞上以更高的数目发现。
I).一般技术
除非另有说明，否则本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，它们是在本领域的技术范围内。参见Sambrook,J.等人,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001；“Current protocols in molecular biology”,F.M.Ausubel,等人.编,1987；系列“Methods in Enzymology,”Academic Press,SanDiego,CA.；“PCR 2:a practical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编,Oxford University Press,1995；“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.和Lane,D.编,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；“Goodman&Gilman‘s ThePharmacological Basis of Therapeutics,”第11版,McGraw-Hill,2005；和Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,”第4版,John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000，它们的内容通过引用整体并入本文。
可以在多种培养基中培养宿主细胞。商购可得的培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Sigma)适用于培养真核细胞。此外，可以使动物细胞在缺乏血清但补充了激素、生长因子或特定细胞类型的存活和/或生长所需的任何其它因子的确定成分培养基中生长。支持细胞存活的确定成分培养基会维持细胞的生存力、形态、代谢能力和潜在的分化能力，而促进细胞生长的确定成分培养基会提供细胞增殖或繁殖所需的所有化学物质。控制哺乳动物细胞体外存活和生长的一般参数在本领域中已充分确立。可以在不同的细胞培养系统中控制的物理化学参数是例如pH、pO2、温度和渗透压。细胞的营养需求通常在被开发成提供最佳环境的标准培养基制剂中提供。营养物可分为几类：氨基酸及其衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、复合脂质、核酸衍生物和维生素。除了维持细胞代谢的营养物外，大多数细胞还需要来自以下至少一组的一种或更多种激素：类固醇、前列腺素、生长因子、垂体激素和肽激素，以在无血清培养基中增殖(Sato,G.H.,等人.“Growth of Cells in Hormonally DefinedMedia”,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982)。除了激素外，细胞可能还需要运输蛋白诸如转铁蛋白(血浆铁运输蛋白)、血浆铜蓝蛋白(一种铜运输蛋白)和高密度脂蛋白(一种脂质载体)才能在体外存活和生长。每种细胞类型的最佳激素或运输蛋白组会有所不同。这些激素或运输蛋白中的大多数外源地添加，或者在极少数情况下，发现了不需要特定因子的突变细胞系。本领域技术人员无需过度实验即可了解维持细胞培养所需的其它因子。
用于原核宿主细胞生长的生长培养基包括营养物肉汤(液体营养培养基)或LB培养基(Luria Bertani)。合适的培养基包括确定成分培养基和未确定成分的培养基(undefined media)。一般而言，培养基含有碳源，诸如细菌生长所需的葡萄糖、水和盐。培养基还可以包括氨基酸和氮的来源，例如牛肉或酵母提取物(在未确定成分的培养基中)或已知量的氨基酸(在确定成分培养基中)。在一些实施方案中，生长培养基是LB肉汤，例如LBMiller肉汤或LB Lennox肉汤。LB肉汤包含蛋白胨(酪蛋白的酶消化产物)、酵母提取物和氯化钠。在一些实施方案中，使用包含抗生素的选择性培养基。在这种培养基中，只有对抗生素具有抗性的期望细胞才会生长。
II).CD3抗原结合片段组合物
在第一方面，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含抗原结合片段(AF1)，所述片段对在效应细胞的表面上表达的效应细胞抗原具有特异性结合亲和力，所述效应细胞选自浆细胞、T细胞、B细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、肥大细胞、树突细胞、调节性T细胞(RegT细胞)、辅助性T细胞、髓样细胞和NK细胞。在一个实施方案中，抗原结合片段对在T细胞的表面上表达的效应细胞抗原具有结合亲和力。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含抗原结合片段，所述抗原结合片段对CD3具有结合亲和力。在另一个实施方案中，抗原结合片段对CD3复合物的成员具有结合亲和力，所述成员包括处于单独形式或独立组合形式的CD3复合物的所有已知CD3亚基；例如，CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3β。
结合CD3抗原的抗原结合片段特别适用于以组合物形式与第二抗原结合片段(AF2)配对，所述第二抗原结合片段与患病细胞或组织的靶细胞标志物或抗原具有结合亲和力，以实现患病细胞或组织的细胞杀伤。结合特异性可以由互补性决定区或CDR(诸如轻链CDR或重链CDR)决定。在许多情况下，结合特异性由轻链CDR和重链CDR决定。与其它参考抗原相比，重链CDR和轻链CDR的给定组合会提供对CD3具有更大亲和力和/或特异性的给定结合槽。
本公开内容涵盖的抗原结合片段的来源可以衍生自天然存在的抗体或其片段、非天然存在的抗体或其片段、人源化抗体或其片段、合成抗体或其片段、杂合抗体或其片段或经工程改造的抗体或其片段。产生针对给定靶标志物的抗体的方法是本领域众所周知的。例如，单克隆抗体可以使用Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。抗体及其片段的结构、抗体的重链和轻链的可变区(VH和VL)、单链可变区(scFv)、互补性决定区(CDR)和结构域抗体(dAb)是被良好理解的。产生具有靶细胞标志物的期望抗原结合片段的多肽的方法是本领域已知的。
相对于本领域已知的CD3抗体和抗原结合片段，本公开内容的某些结合CD3的抗原结合片段已经被特异性地修饰以增强它们在本文描述的多肽实施方案中的稳定性。单克隆抗体和其它抗体的蛋白聚集仍然是其可开发性方面的一个重大问题，并且仍然是抗体生产的主要关注领域。抗体聚集可以由其结构域的部分解折叠触发，导致单体-单体结合，随后是成核和聚集体生长。尽管抗体和基于抗体的蛋白的聚集倾向可以受外部实验条件影响，但它们强烈依赖于由其序列和结构决定的固有抗体特性。尽管众所周知，蛋白在其折叠状态下仅略微稳定，但通常不太了解大多数蛋白在其解折叠或部分解折叠状态下固有地易于聚集，并且得到的聚集体可以是极其稳定的和长寿的。聚集倾向的降低也被证明伴随着表达滴度的增加，这表明减少蛋白聚集在整个开发过程中是有益的，并且可以为临床研究提供一条更有效的途径。对于治疗性蛋白，聚集体是在患者中产生有害免疫应答的重要风险因素，并且可以通过多种机制形成。控制聚集可以提高蛋白稳定性、可制造性、损耗率、安全性、制剂、滴度、免疫原性和溶解性。蛋白的固有特性，诸如大小、疏水性、静电和电荷分布，在蛋白溶解度中起着重要作用。由表面疏水性引起的治疗性蛋白的低溶解度已被证明使制剂开发更加困难，并可能在体内导致不良的生物分布、不希望的药代动力学行为和免疫原性。降低候选单克隆抗体的整体表面疏水性还可以提供与纯化和给药方案相关的益处和成本节约。单个氨基酸可以通过结构分析鉴定为有助于抗体中的聚集潜力，并且可以位于CDR以及框架区。具体地，可以预测残基在给定抗体中造成疏水性问题的高风险。在一个实施方案中，本公开内容提供了具有特异性结合CD3的能力的AF1，其中AF1相对于亲本抗体或抗体片段在框架区中具有疏水性氨基酸的至少一个氨基酸置换，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。在另一个实施方案中，CD3 AF1在一个或更多个框架区中具有疏水性氨基酸的至少两个氨基酸置换，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
在主题抗原结合片段的上下文中，等电点(pI)是抗体片段不具有净电荷时的pH。如果pH低于抗体片段的pI，则它将具有净正电荷。较大的正电荷倾向于与增加的血液清除和组织保留相关，通常具有较短的半衰期。如果pH大于抗体片段的pI，它将具有负电荷。负电荷通常导致减少的组织摄取和更长的半衰期。可能通过对框架残基的突变来操纵这种电荷。这些考虑为本文描述的实施方案的抗原结合片段的序列的设计提供了信息，其中相对于用作起始点的亲本抗体进行了单独的氨基酸置换。多肽的等电点可以在体外测定中以数学或实验方式确定。等电点(pI)是蛋白净电荷为零时的pH，且可以使用蛋白序列中特定氨基酸的电荷来计算。电荷的估计值被称为酸解离常数或pKa值，并用于计算pI。通过方法诸如毛细管等电聚焦(参见Datta-Mannan,A.,等人.The interplay of non-specificbinding,target-mediated clearance and FcRn interactions on thepharmacokinetics of humanized antibodies.mAbs 7:1084(2015)；Li,B.,等人.Framework selection can influence pharmacokinetics of a humanizedtherapeutic antibody through differences in molecule charge.mAbs 6,1255-1264(2014))或本领域已知的其它方法，可以在体外确定pI。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，包含AF1的主题多肽包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述AF1(a)特异性地结合分化簇3T细胞受体(CD3)，其可以包括呈单独形式或独立地组合的形式的所有已知的CD3亚基，例如CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3β。在一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的抗原结合片段是嵌合的或人源化的抗原结合片段。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的抗原结合片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体和单链可变片段(scFv)组成的组。在N-端至C-端可以以(CDR-H)-(CDR-L)或(CDR-H)-(CDR-L)取向构造具有CDR-H和CDR-L的抗原结合片段。
在一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽含有包含CDR-L和CDR-H的AF1，其中所述AF1(a)特异性地结合分化簇3T细胞受体(CD3)；和(b)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3。在本公开内容的一些实施方案中，AF1包含分别具有SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含AF1，其中所述AF1包含CDR-L和CDR-H，其中所述AF1：(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和(c)包含重链框架区(FR-H)FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，各自分别表现出与SEQID NO:22、23、25和26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸序列是相同的。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF1，其中所述AF1包含CDR-L和CDR-H，其中所述AF1：(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和(c)包含重链框架区(FR-H)FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，且进一步包含轻链框架区(FR-L)FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，所述重链框架区(FR-H)FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4各自分别表现出与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸序列是相同的，所述轻链框架区(FR-L)FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4各自分别表现出与SEQ ID NO:12、13、18和19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12、13、18和19的氨基酸序列是相同的。
在另一个实施方案中，本文描述的主题组合物实施方案的多肽包含AF1，其中所述AF1包含CDR-L和CDR-H，其中所述AF1(a)特异性地结合CD3；和(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列。在前述的另一个实施方案中，多肽包含AF1，其进一步包含(a)具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1，(b)具有SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含含有CDR-L和CDR-H的AF1，其中所述AF1(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列，且进一步包含(c)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；(d)具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和(e)具有SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含含有CDR-L和CDR-H的AF1，其中所述AF1(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列，且进一步包含(c)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；(d)具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和(e)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含含有CDR-L和CDR-H的AF1，其中所述AF1(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包含SEQ IDNO:8、9和10的氨基酸序列，且进一步包含(c)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；(d)具有SEQ ID NO:4中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和(e)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含含有CDR-L和CDR-H的AF1，其中所述AF1(a)特异性地结合CD3；(b)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列，且进一步包含(c)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；(d)具有SEQ ID NO:5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和(e)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在段落的前述实施方案中，AF1可以进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，它们连接各自的CDR区域。在段落的前述实施方案的某些情况下，AF1进一步包含：FR-L1，其表现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列是相同的；FR-L2，其表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列是相同的；FR-L3，其表现出与SEQ ID NO:14-17中的任一个的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或SEQ ID NO:14-17中的任一个的氨基酸序列是相同的；FR-L4，其表现出与SEQ ID NO:19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:19的氨基酸序列是相同的；FR-H1，其表现出与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21中的任一个的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21中的任一个的氨基酸序列是相同的；FR-H2，其表现出与SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列是相同的；FR-H3，其表现出与SEQ ID NO:24的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:24的氨基酸序列是相同的；和FR-H4，其表现出与SEQ ID NO:26中的任一个的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:26中的任一个的氨基酸序列是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，AF1进一步包含：FR-L1，其表现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列是相同的；FR-L2，其表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列是相同的；FR-L3，其表现出与SEQ ID NO:14的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列是相同的；FR-L4，其表现出与SEQID NO:19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列是相同的；FR-H1，其表现出与SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列是相同的；FR-H2，其表现出与SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列是相同的；FR-H3，其表现出与SEQ ID NO:24的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列是相同的；和FR-H4，其表现出与SEQ ID NO:26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:26的氨基酸序列是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，AF1进一步包含：FR-L1，其表现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列是相同的；FR-L2，其表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列是相同的；FR-L3，其表现出与SEQ ID NO:15的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:15的氨基酸序列是相同的；FR-L4，其表现出与SEQ ID NO:19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列是相同的；FR-H1，其表现出与SEQ ID NO:21的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列是相同的；FR-H2，其表现出与SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列是相同的；FR-H3，其表现出与SEQID NO:24的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列是相同的；和FR-H4，其表现出与SEQ ID NO:26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，AF1包含：FR-L1，其表现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列是相同的；FR-L2，其表现出与SEQID NO:13的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列是相同的；FR-L3，其表现出与SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列是相同的；FR-L4，其表现出与SEQ ID NO:19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列是相同的；FR-H1，其表现出与SEQ ID NO:21的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列是相同的；FR-H2，其表现出与SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:23的氨基酸序列是相同的；FR-H3，其表现出与SEQ ID NO:24的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列是相同的；和FR-H4，其表现出与SEQ ID NO:26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，包含AF1的多肽包含：FR-L1，其表现出与SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列是相同的；FR-L2，其表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列是相同的；FR-L3，其表现出与SEQ ID NO:17的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列是相同的；FR-L4，其表现出与SEQ ID NO:19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列是相同的；FR-H1，其表现出与SEQ ID NO:21的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列是相同的；FR-H2，其表现出与SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列是相同的；FR-H3，其表现出与SEQ ID NO:24的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列是相同的；和FR-H4，其表现出与SEQ ID NO:26的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:26的氨基酸序列是相同的。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，主题多肽可以包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力。AF1可以以VL-VH或VH-VL取向构造并通过接头肽融合。
在一种情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含含有VH氨基酸序列的AF1，所述VH氨基酸序列与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相同。在另一种情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含含有VL氨基酸序列的AF1，所述VL氨基酸序列与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ IDNO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列相同。在另一种情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力且各自分别与SEQ ID NO:27和28的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:27和28的氨基酸序列是相同的。在其它情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力且各自分别与SEQ ID NO:29和28的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:29和28的氨基酸序列是相同的。在另一种情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力且各自分别与SEQ ID NO:30和31的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:30和31的氨基酸序列是相同的。在又一种情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力且各自分别与SEQ ID NO:32和31的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:32和31的氨基酸序列是相同的。在其它情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1包含VL区域和VH区域，所述区域赋予特异性地结合CD3的能力且各自分别与SEQ IDNO:33和31的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:33和31的氨基酸序列是相同的。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，主题多肽包含结合CD3的AF1，其中所述AF1被构造为具有特异性地结合CD3的能力的scFv。在一个实施方案中，AF1包含与SEQ IDNO:36-40中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在某些情况下，本文描述的多肽实施方案的CD3 AF1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。在其它情况下，本文描述的多肽实施方案的CD3AF1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。在一个实施方案中，本文描述的多肽实施方案的CD3 AF1结合选自CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε单元的CD3复合物亚基。在一个实施方案中，本文描述的多肽实施方案的AF1结合CD3的CD3ε片段。
在另一个方面，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF1，所述AF1结合CD3蛋白复合物并且与本领域已知的CD3结合抗体或AF1相比具有增强的稳定性。此外，本公开内容的某些CD3 AF1被设计成给它们整合到其中的嵌合双特异性抗原结合组合物赋予更高程度的稳定性，这可导致改善的融合蛋白的表达和回收、增加的储存期限和当施用给受试者时增强的稳定性。在一种方法中，与本领域已知的某些CD3结合抗体和抗原结合片段相比，本公开内容的某些CD3 AF1被设计成具有更高程度的热稳定性。因此，用作它们整合到其中的嵌合双特异性抗原结合片段组合物的组分的CD3 AF1表现出有利的药学性能，包括高热稳定性和低聚集倾向，从而导致在制造和储存过程中改善的表达和回收，以及促进长血清半衰期。生物物理性能诸如热稳定性经常受抗体可变结构域限制，它们的固有性能差异很大。高热稳定性经常与高表达水平和其它期望的性能相关，包括不易聚集(Buchanan A,等人.Engineering a therapeutic IgG molecule to address cysteinylation,aggregationand enhance thermal stability and expression.MAbs2013；5:255)。通过测量“解链温度”(Tm)来确定热稳定性，Tm被定义为一半分子变性时的温度。每个异源二聚体的解链温度指示其热稳定性。确定Tm的体外测定是本领域已知的，包括在以下实施例中描述的方法。使用技术诸如示差扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)，可以测量异源二聚体的解链点。可替换地，使用圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)，可以测量异源二聚体的热稳定性。
本公开内容的CD3结合片段和包含所述抗-CD3结合片段的抗-CD3双特异性抗体的热变性曲线以及参考结合表明，与由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段或对照双特异性抗体相比，本公开内容的各种构建体更耐受热变性，其中所述对照双特异性抗原结合片段包含SEQ ID NO:41和结合除了CD3以外的抗原的参考抗原结合片段。在一个实施方案中，本文描述的实施方案的多肽包含抗-CD3 AF1，其中所述AF1包含CDR-L和CDR-H，且其中所述AF1:特异性地结合CD3；包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQID NO:10的氨基酸序列，并表现出较高的热稳定性，如在体外测定中所证实的，其中(i)相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段，所述多肽表现出更高的解链温度(Tm)，或(ii)在将所述抗-CD3 AF1掺入抗-CD3双特异性抗体后，相对于对照双特异性抗体，所述双特异性抗体表现出更高的Tm，其中所述抗-CD3双特异性抗体包含所述抗-CD3结合片段和结合除了CD3以外的抗原的参考抗原结合片段，且其中所述对照双特异性抗原结合片段由SEQ ID NO:41和所述参考抗原结合片段组成。例如，在某些情况下，对照双特异性抗体与主题多肽相同，但是AF1被SEQ ID NO:41的抗原结合片段替换。实施方案的参考抗原结合片段意图包括结合本文描述的任何靶细胞标志物(包括、但不限于EGFR、HER2、EpCAM和CD19、以及其它公开的靶细胞标志物)的抗原结合片段。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含抗-CD3 AF1，其中所述AF1的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃。在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含抗-CD3 AF1，其中所述AF1的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃-10℃、或高至少3℃-9℃、或高至少4℃-8℃、或高至少5℃-7℃。在又一个实施方案中，本公开内容提供了双特异性抗原结合多肽，所述双特异性抗原结合多肽包含抗-CD3 AF1，其中所述AF1包含CDR-L和CDR-H，且其中所述AF1:特异性地结合CD3；包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列和结合除了CD3以外的抗原的第二抗原结合片段，并表现出较高的热稳定性，如在体外测定中所证实的，其中相对于对照双特异性抗体对照，所述双特异性抗原结合多肽表现出更高的解链温度(Tm)，所述对照双特异性抗体对照包含在SEQ ID NO:41中所示的序列和结合除了CD3以外的抗原的参考抗原结合片段。
在一个有关的方面，本公开内容提供了各种多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，所述多肽被掺入嵌合的、双特异性抗原结合片段组合物中，所述组合物被设计成具有这样的等电点(pI)：与包含本领域已知的CD3结合抗体或抗原结合片段的相应组合物相比，该等电点(pI)赋予本公开内容的组合物增强的稳定性。在一个实施方案中，本文所述的多肽实施方案可以包含结合CD3的抗原结合片段，其中AF1表现出在5.8和6.6之间、包括端点的pI。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，其中AF1表现出的pI比由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5个pH单位。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含结合CD3的AF1，所述AFl融合至结合除了CD3以外的抗原的第二抗原结合片段，其中CD3 AF1表现出的pI是在不结合CD3的抗原结合片段的pI的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5个pH单位内。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含结合CD3的AF1，所述AF1融合至结合除了CD3以外的抗原的第二抗原结合片段，其中CD3 AF1表现出的pI是在第二抗原结合片段的pI的至少约0.1至约1.5、或至少约0.3至约1.2、或至少约0.5至约1.0、或至少约0.7至约0.9个pH单位内，如通过计算(参见实施例)或体外测定所证实的。在一个实施方案中，第二抗原结合片段对选自由以下组成的组的非CD3抗原具有特异性结合亲和力：EpCAM、EGFR、HER2、CD19或本文中公开的任何靶细胞标志物实施方案(包括、但不限于表8的靶细胞标志物)。特别意在通过这样的设计，其中两个抗原结合片段的pI是在这样的范围内，所得的融合的抗原结合片段将给它们整合到其中的嵌合双特异性抗原结合片段组合物赋予更高程度的稳定性，从而导致呈可溶性非聚集形式的融合蛋白的改善的表达和提高的回收，配制的嵌合双特异性多肽组合物的增加的储存期限，以及当将组合物施用给受试者时增强的稳定性。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，主题多肽包含以在约10nM和约400nM之间、或在约50nM和约350nM之间、或在约100nM和300nM之间的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3的AF1，如在包含人或食蟹猴CD3抗原的体外抗原结合测定中所确定的。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含以小于约10nM、或约50nM、或约100nM、或约150nM、或约200nM、或约250nM、或约300nM、或约350nM、或者小于约400nM的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3的AF1，如在体外抗原结合测定中所确定的。为了清楚起见，具有400nM的Kd的抗原结合片段比具有10nM的Kd的抗原结合片段更弱地结合其配体。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF1，所述AF1表现出的对CD3的结合亲和力比由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的抗原结合片段的结合亲和力弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF1，所述AF1表现出的对CD3的结合亲和力比第二抗原结合片段的结合亲和力弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或至少1000倍，所述第二抗原结合片段掺入特异性地结合除了CD3以外的抗原的多肽中，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。在前述实施方案中，除了CD3以外的抗原选自、但不限于HER2、EGFR、EpCAM或CD19或本文中公开的任何靶细胞标志物实施方案，包括、但不限于表8的靶细胞标志物。使用结合或竞争性结合测定，诸如具有芯片结合的受体或结合蛋白的Biacore测定或ELISA测定(如在美国专利5,534,617中所述)、在本文实施例中描述的测定、放射-受体测定或本领域已知的其它测定，可以测定主题组合物对靶配体的结合亲和力。然后可以使用标准方法，诸如Scatchard分析，如在van Zoelen,等人,Trends Pharmacol Sciences(1998)19)12):487中所述，或本领域已知的其它方法，确定结合亲和力常数。可以采用相同方法来制备双特异性抗原结合片段构建体，所述构建体具有呈任意组合或取向(即，在N-端至C-端取向为AF1-AF2或AF2-AF1)的针对CD3和本文描述的靶细胞标志物的抗原结合片段。
表1：CD3 CDR序列
构建体 CDR区域 氨基酸序列 SEQ ID NO:
3.23,3.30,3.31,3.32 CDR-L1 RSSNGAVTSSNYAN 1
3.24 CDR-L1 RSSNGEVTTSNYAN 2
3.9 CDR-L1 RSSTGAVTTSNYAN 3
3.23,3.30,3.31,3.32,3.9 CDR-L2 GTNKRAP 4
3.24 CDR-L2 GTIKRAP 5
3.23,3.24,3.30,3.31,3.32 CDR-L3 ALWYPNLWVF 6
3.9 CDR-L3 ALWYSNLWVF 7
3.23,3.24,3.30,3.31,3.32,3.9 CDR-H1 GFTFNTYAMN 8
3.23,3.24,3.30,3.31,3.32,3.9 CDR-H2 RIRSKYNNYATYYADSVKD 9
3.23.3.24,3.30,3.31,3.32 CDR-H3 HENFGNSYVSWFAH 10
3.9 CDR-H3 HGNFGNSYVSWFAY 11
表2：CD3 FR序列
Figure BDA0003525090100000491
Figure BDA0003525090100000501
表3：VL&VH序列
Figure BDA0003525090100000502
Figure BDA0003525090100000511
表4：scFv序列
Figure BDA0003525090100000521
Figure BDA0003525090100000531
Figure BDA0003525090100000541
III).释放区段
在另一个方面，本公开内容涉及适合包含在本文所述的主题组合物中的释放区段(RS)肽，其为一种或更多种哺乳动物蛋白酶的底物，所述蛋白酶与疾病组织或在疾病组织附近发现的细胞相关或由其产生。这样的蛋白酶可以包括、但不限于诸如金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等蛋白酶类别。RS尤其用于给主题组合物赋予前药形式，其可以通过哺乳动物蛋白酶对RS的切割而被活化。如本文中所述的，将RS掺入本文所述的主题组合物实施方案中，将掺入的抗原结合片段连接至XTEN(其构型在下文更完整地描述)，使得在通过一种或更多种以RS为底物的蛋白酶的作用而切割RS后，抗原结合片段和XTEN从组合物中释放，并且不再被XTEN屏蔽的抗原结合片段重新获得它们的结合其各自配体的全部潜力。在一个特定特征中，RS充当发现与疾病组织或细胞(诸如但不限于肿瘤、癌症细胞和炎症性组织)密切相关或共定位的蛋白酶的底物，并且在RS的切割后，否则会被主题组合物的XTEN屏蔽(且因此对它们各自的配体具有更低结合亲和力)的抗原结合片段从组合物中释放并重新获得它们的结合靶标和/或效应细胞配体的全部潜力。在另一个实施方案中，主题多肽组合物的RS包含作为位于靶细胞内的细胞蛋白酶的底物的氨基酸序列。在本文描述的主题组合物的另一个特定特征中，作为两类或三类蛋白酶的底物的RS被设计成具有能够在RS序列的不同位置被不同蛋白酶切割的序列，一个代表性例子描绘在图6中。因此，作为两类、三类或更多类蛋白酶的底物的RS在RS序列中具有两个、三个或多于一个不同的切割位点，但单种蛋白酶的切割仍然导致抗原结合片段和XTEN从包含RS的组合物的释放。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种可活化多肽，所述可活化多肽包含一个或更多个释放区段，其中所述释放区段是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物。在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含第一释放区段(RS1)序列，其中RS1是哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中RS1是选自由天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase组成的组的蛋白酶的底物。在其它情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含第一释放区段(RS1)序列，其中RS1是选自由以下组成的组的一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物：穿膜肽酶,脑啡肽酶(neprilysin)(CD10),PSMA,BMP-1,A解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM),ADAM8,ADAM9,ADAM10,ADAM12,ADAM15,ADAM17(TACE),ADAM19,ADAM28(MDC-L),具有凝血酶敏感蛋白基序的ADAM(ADAMTS),ADAMTS1,ADAMTS4,ADAMTS5,MMP-1(胶原酶1),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-2(MMP-2,明胶酶A),基质金属蛋白酶-3(MMP-3,基质溶素1),基质金属蛋白酶-7(MMP-7,基质溶解因子1),基质金属蛋白酶-8(MMP-8,胶原酶2),基质金属蛋白酶-9(MMP-9,明胶酶B),基质金属蛋白酶-10(MMP-10,基质溶素2),基质金属蛋白酶-11(MMP-11,基质溶素3),基质金属蛋白酶-12(MMP-12,巨噬细胞弹性蛋白酶),基质金属蛋白酶-13(MMP-13,胶原酶3),基质金属蛋白酶-14(MMP-14,MT1-MMP),基质金属蛋白酶-15(MMP-15,MT2-MMP),基质金属蛋白酶-19(MMP-19),基质金属蛋白酶-23(MMP-23,CA-MMP),基质金属蛋白酶-24(MMP-24,MT5-MMP),基质金属蛋白酶-26(MMP-26,基质溶解因子2),基质金属蛋白酶-27(MMP-27,CMMP),天冬酰胺肽链内切酶,组织蛋白酶B,组织蛋白酶C,组织蛋白酶K,组织蛋白酶L,组织蛋白酶S,组织蛋白酶X,组织蛋白酶D,组织蛋白酶E,分泌酶,尿激酶(uPA),组织型纤溶酶原激活物(tPA),纤溶酶,凝血酶,前列腺特异性的抗原(PSA,KLK3),人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),弹性蛋白酶,类胰蛋白酶,II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP),DESC1,hepsin(HPN),matriptase,matriptase-2,TMPRSS2,TMPRSS3,TMPRSS4(CAP2),成纤维细胞活化蛋白(FAP),激肽释放酶相关的肽酶(KLK家族),KLK4,KLK5,KLK6,KLK7,KLK8,KLK10,KLK11,KLK13和KLK14。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的包含第一释放区段(RS1)序列的多肽，其中RS1是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中RS1包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，RS1包含选自以下的序列的氨基酸序列：RSR-2089、RSR-2295、RSR-2298、RSR-2488、RSR-2599、RSR-2485、RSR-2486、RSR-2728、RSN-2089、RSN-2295、RSN-2298、RSN-2488、RSN-2599、RSN-2485、RSN-2486、RSN-2728、RSC-2089、RSC-2295、RSC-2298、RSC-2488、RSC-2599、RSC-2485、RSC-2486和RSC-2728，它们中的每一个如在表5中所示。如以下主题多肽组合物的构型和性能的描述中更充分地描述的，释放区段融合在抗原结合片段和XTEN多肽之间，使得在释放区段的切割后，XTEN从组合物中释放。
在其它实施方案中，本公开内容提供了用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的包含第一释放区段(RS1)序列和第二释放区段(RS2)的多肽，其中RS1和RS2是相同的。在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于掺入主题多肽组合物中的包含第一释放区段(RS1)序列和第二释放区段(RS2)的多肽，其中RS1和RS2是不同的。在前述实施方案中的某些情况下，RS1和RS2各自是选自由天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase组成的组的哺乳动物蛋白酶切割的底物。在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的包含RS1和RS2序列的多肽，其中RS1和RS2各自是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中RS1和RS2各自包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，RS1和RS2各自包含选自以下的序列的氨基酸序列：RSR-2089、RSR-2295、RSR-2298、RSR-2488、RSR-2599、RSR-2485、RSR-2486、RSR-2728、RSN-2089、RSN-2295、RSN-2298、RSN-2488、RSN-2599、RSN-2485、RSN-2486、RSN-2728、RSC-2089、RSC-2295、RSC-2298、RSC-2488、RSC-2599、RSC-2485、RSC-2486和RSC-2728，其中每个如在表5中所示。如以下与主题多肽组合物的构型和性能的描述相关的段落中更充分地描述的，释放区段融合在抗原结合片段和XTEN多肽之间，使得在每个释放区段的切割后，相邻的XTEN从组合物中释放。
表5：释放区段和氨基酸序列
Figure BDA0003525090100000571
Figure BDA0003525090100000581
Figure BDA0003525090100000591
Figure BDA0003525090100000601
Figure BDA0003525090100000611
Figure BDA0003525090100000621
Figure BDA0003525090100000631
Figure BDA0003525090100000641
Figure BDA0003525090100000651
Figure BDA0003525090100000661
Figure BDA0003525090100000671
Figure BDA0003525090100000681
Figure BDA0003525090100000691
Figure BDA0003525090100000701
Figure BDA0003525090100000711
Figure BDA0003525090100000721
Figure BDA0003525090100000731
Figure BDA0003525090100000741
Figure BDA0003525090100000751
Figure BDA0003525090100000761
在另一个方面，用于掺入本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽中的释放区段(RS1和/或RS2)可以设计为选择性敏感的，以便对它们作为其底物的各种蛋白酶具有不同的切割速率和不同的切割效率。由于与健康组织或在循环中相比，可在患病组织(包括、但不限于肿瘤、血癌或炎症组织或炎症部位)中发现不同浓度的给定蛋白酶，本公开内容提供了具有单个氨基酸序列的RS，所述单个氨基酸序列被工程改造成对给定蛋白酶具有更高或更低的切割效率，以便确保当接近靶细胞或组织及其共定位的蛋白酶时，与健康组织或循环中释放区段的切割速率相比，多肽优先从前药形式转化为活性形式(即，通过抗原结合片段和XTEN在释放区段的切割以后从多肽的分离和释放)，使得与保持在循环中的前药形式相比，释放的抗原结合片段具有更大的结合患病组织中的配体的能力。通过这样的选择性设计，可以提高所得组合物的治疗指数，从而导致相对于不包含这样的位点特异性活化的常规治疗剂减少的副作用。
本文中使用的切割效率被定义为，当在进行反应的生化测定(进一步详述于实施例中)中各自经受蛋白酶时，包含被切割的释放区段的试验底物的百分比与被切割的对照底物AC1611的百分比之比的log2值，其中初始底物浓度为6μM，将反应在37℃温育2小时，然后通过加入EDTA进行终止，用通过非还原SDS-PAGE分析的消化产物和未切割底物的量来建立切割的释放区段的百分比之比。如下计算切割效率：
Figure BDA0003525090100000771
Figure BDA0003525090100000772
因而，-1的切割效率意味着与对照底物相比，被切割的试验底物的量为50％，而+1的切割效率意味着与对照底物相比，被切割的试验底物的量为200％。相对于对照，试验蛋白酶更高的切割速率将导致更高的切割效率，并且相对于对照，试验蛋白酶更慢的切割率将导致更低的切割效率。如在实施例中详述的，具有氨基酸序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ IDNO:42)的对照RS序列AC1611(RSR-1517)被确定为，当在体外生化测定中测试各种蛋白酶的切割速率时，具有蛋白酶天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、uPA和matriptase的适当基线切割效率。通过在RS肽的各个位置处的氨基酸的选择性置换，创建了RS的文库，并针对7种蛋白酶的组进行了评价(在实施例中更完整地详述)，从而产生了用于建立适当氨基酸置换的指南的图谱，以便实现具有期望切割效率的RS。在制备具有期望切割效率的RS时，优选使用亲水氨基酸A、E、G、P、S和T的置换，但是可以在给定位置处置换其它L-氨基酸以调整切割效率，使得释放区段至少保留一些对蛋白酶切割的敏感性。
IV).XTEN多肽
在另一个方面，本公开内容涉及多肽，所述多肽至少包含第一延长重组多肽(XTEN)，所述第一延长重组多肽(XTEN)掺入在本文描述的主题组合物实施方案中，由此增加构建体的质量和大小并且还用于当分子处于完整的未切割状态时大大降低抗原结合片段的结合其配体的能力，如下文更充分地描述。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，其包含与位于抗原结合片段和XTEN之间的RS的末端融合的单个XTEN。在其它实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含第一和第二XTEN(XTEN1和XTEN2)，所述第一和第二XTEN分别融合至位于每个抗原结合片段和XTEN之间的RS1和RS2的N-端和C-端。
不受理论的约束，XTEN的掺入可以并入主题组合物的设计中以赋予某些性能：1)提供具有XTEN的多肽组合物，当组合物处于其完整的前药形式时，所述XTEN屏蔽抗原结合片段并降低它们对靶细胞标志物和效应细胞抗原的结合亲和力；ii)提供具有XTEN的多肽组合物，所述XTEN在施用给受试者时提供延长的半衰期，iii)有助于完整组合物的溶解性和稳定性，从而增强主题组合物的药学性能；和iv)提供具有XTEN的多肽组合物，所述XTEN减少正常组织和器官中的外渗，仍允许在血管系统中具有较大孔径的患病组织(例如，肿瘤)中一定程度的外渗，但仍可通过某些哺乳动物蛋白酶的作用从组合物中释放，从而允许组合物的抗原结合片段更容易渗入患病组织例如肿瘤，并结合效应细胞和肿瘤细胞上的靶细胞标志物并连接在一起。为了满足这些需要，本公开内容提供了组合物，所述组合物包含一种或更多种XTEN，其中XTEN为所得组合物提供增加的质量和流体动力学半径。实施方案的XTEN多肽在主题组合物的设计中提供了某些优点，即不仅为组合物提供了增加的质量和流体动力学半径，而且其柔性的非结构化特征可以提供对组合物的抗原结合片段的屏蔽效果，从而降低与不表达或表达低水平的靶细胞标志物和/或效应细胞抗原的正常组织或正常组织的血管系统中的抗原的结合。此外，XTEN向主题组合物中的掺入可以提高单链抗体结合片段在其表达和回收过程中的溶解度和适当折叠。
XTEN是具有非天然存在的、基本上非重复的序列的多肽，其在生理条件下具有低度或没有二级或三级结构，以及在以下段落中描述的一种或更多种额外性能。在一些实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含一种或更多种XTEN，所述XTEN具有至少约36、72、96、100、144、200、288、292、293、300、576、584、800、864、867、868、900个或至少约1000个或更多个氨基酸。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含XTEN1，其中XTEN1的特征在于，它具有至少约36或100个氨基酸残基，其中XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)和它具有至少4-6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含XTEN1，所述XTEN1具有至少约36至约1000、至少约100至1000、或至少100至约900、或至少约144至约868、或至少约288-868个氨基酸残基。在其它情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含XTEN1，所述XTEN1具有至少约36至约1000、至少约100至约1000、或至少100至约900、或至少约144至约868、或至少约288-868个氨基酸残基，其中90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自4-6类选自由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的组的氨基酸。在其它情况下，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含XTEN1，其中XTEN1的特征在于，它具有至少约36至约1000个氨基酸残基或至少约100至约1000个氨基酸残基，XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自六类选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了本文描述的任何实施方案的多肽，所述多肽包含XTEN1，其中XTEN1的特征在于，它具有至少约36至约1000、至少约100至约1000、或至少约100至约900、或至少144至约868个氨基酸残基，其中XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自SEQ ID NO:661-664的序列中的至少三个。在某些情况下，XTEN1序列可以通过SEQ ID NO:661-664的12个氨基酸单元的任意组合进行组装，使得以12个氨基酸为增量可以达到至少36个氨基酸或更长的任何长度；例如，36、48、60、72、84、96个氨基酸等。在其它情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含XTEN1，其中XTEN1的特征在于，它具有至少约36至约1000、至少约100至约1000、或至少约100至约900、或至少144至约868个氨基酸残基，其中XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的XTEN可以具有HHHHHH(SEQ ID NO:1150)、HHHHHHHH(SEQ ID NO:1151)或序列EPEA(SEQ ID NO:1149)的亲和标签，其附加到组合物的XTEN的N-或C-端以促进组合物纯化至至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％纯度，这通过本领域已知的色谱法方法；例如，IMAC色谱法或C-tagXL色谱法，或以下实施例中描述的方法。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含XTEN1，其中XTEN1包含与AE36具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列(包含选自SEQ ID NO:661-664的序列中的任意三个的序列)，或选自以下的序列的序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，主题多肽包含XTEN1和XTEN2。在下文中描述了包含XTEN1和XTEN2以及其它组分的多肽的构型。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含XTEN1和XTEN2，其中XTEN1和XTEN2各自特征在于，它具有至少约36至约1000个氨基酸残基或至少约100至约1000个氨基酸残基，其中XTEN1和XTEN2序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自SEQ ID NO:661-664的序列中的至少三个。在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，所述多肽包含XTEN1和XTEN2，其中XTEN1和XTEN2各自特征在于，各自具有至少约36至约1000个氨基酸残基或至少约100至约1000个氨基酸残基，其中XTEN1和XTEN2序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自SEQID NO:665-718和922-926的序列。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含XTEN1和XTEN2，其中XTEN1和XTEN2各自包含与选自以下的序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。在段落的前述实施方案的某些情况下，XTEN1和XTEN 2是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，段落的前述实施方案的XTEN1和XTEN2具有不同的氨基酸序列。在某些情况下，具有2个XTEN的任何多肽组合物实施方案的XTEN1融合至多肽的C-端且选自由AE293、AE300、AE584和AE868组成的组。在其它情况下，具有2个XTEN的任何多肽组合物实施方案的XTEN2融合至多肽的N-端且选自由AE144_7A、AE292、AE576和AE8645组成的组。在其它情况下，具有2个XTEN的任何多肽组合物实施方案的XTEN1融合至多肽的C-端且选自由AE293、AE300、AE584和AE868组成的组，且XTEN 2融合至N-端且选自由AE144_7A、AE292、AE576和AE864组成的组。
表6：XTEN序列基序
基序名称 氨基酸序列 SEQ ID NO:
AE1 GSPAGSPTSTEE 661
AE2 GSEPATSGSETP 662
AE3 GTSESATPESGP 663
AE4 GTSTEPSEGSAP 664
表7：XTEN序列
Figure BDA0003525090100000811
Figure BDA0003525090100000821
Figure BDA0003525090100000831
Figure BDA0003525090100000841
Figure BDA0003525090100000851
Figure BDA0003525090100000861
Figure BDA0003525090100000871
Figure BDA0003525090100000881
Figure BDA0003525090100000891
Figure BDA0003525090100000901
Figure BDA0003525090100000911
Figure BDA0003525090100000921
Figure BDA0003525090100000931
Figure BDA0003525090100000941
Figure BDA0003525090100000951
Figure BDA0003525090100000961
Figure BDA0003525090100000971
Figure BDA0003525090100000981
Figure BDA0003525090100000991
本公开内容涵盖本文描述的任何实施方案的组合物，其包含表7中长度的中间长度的XTEN，以及长度比表7中的那些更长的XTEN，诸如其中将表6的12个氨基酸的基序添加到表7的XTEN的N-或C-末端。
在另一个实施方案中，本公开内容涵盖本文描述的任何实施方案的多肽组合物，其包含XTEN1和XTEN2，其可进一步包含分别在多肽组合物的N-端处的HHHHHH(SEQ ID NO:1150)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:1151)的His标签和/或在C-端处的序列EPEA(SEQ ID NO:1149)，以促进组合物纯化至至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％纯度，这通过本领域已知的色谱法方法，包括、但不限于IMAC色谱法、C-tagXL亲和基质和其它这样的方法，包括、但不限于以下实施例中描述的那些。
根据本公开内容可以使用的XTEN序列的其它例子公开在美国专利公开号2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1或国际专利公开号WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2、WO 2014/011819 A2或WO 2015/023891。
V).靶细胞标志物抗原结合片段
在另一个方面，本公开内容涉及对除CD3之外的靶细胞标志物抗原具有特异性结合亲和力的抗原结合片段，其可掺入本文描述的任何主题组合物实施方案中。得到的双特异性组合物(对CD3具有结合亲和力的第一抗原结合片段(AF1)通过短的柔性肽接头连接到对第二非CD3抗原具有结合亲和力的第二抗原结合片段(AF2))是双特异性的，其中每个抗原结合片段对它们各自的配体具有特异性结合亲和力。应当理解，在这样的组合物中，针对疾病组织的靶细胞标志物的抗原结合片段与针对效应细胞标志物的第二抗原结合片段组合使用以使效应细胞紧密靠近疾病组织的细胞，以便实现患病组织的细胞的细胞裂解。此外，AF1和AF2可以掺入包含可切割的释放区段和XTEN的专门设计的多肽中，以给组合物赋予前药特征，所述组合物在靠近疾病组织时在释放区段的切割后通过融合的AF1和AF2的释放而变得活化，所述疾病组织具有能够在释放区段序列中的一个或更多个位置切割释放区段的蛋白酶。
在一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含对靶细胞标志物具有特异性结合亲和力的AF2，所述靶细胞标志物在细胞表面上、在细胞质膜中或在与癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和需要局部活化多肽的其它病症相关的靶细胞内表达。在一个实施方案中，AF2对其具有特异性结合亲和力的抗原选自包括、但不限于以下的抗原：1-40-β-淀粉样蛋白,4-1BB,5AC,5T4,707-AP,A激酶锚蛋白4(AKAP-4),激活素受体2B型(ACVR2B),激活素受体样激酶1(ALK1),腺癌抗原,脂肪分化相关蛋白,肾上腺素受体β3(ADRB3),AGS-22M6,α叶酸受体,甲胎蛋白(AFP),AIM-2,间变性淋巴瘤激酶(ALK),雄激素受体,血管生成素2,血管生成素3,结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2),炭疽毒素,AOC3(VAP-1),B细胞成熟抗原(BCMA),B7-H3(CD276),炭疽芽孢杆菌性炭疽,B细胞活化因子(BAFF),B淋巴瘤细胞,骨髓间质细胞抗原2(BST2),印迹位点的调节剂的同系物(BORIS),C242抗原,C5,CA-125,癌症抗原125(CA-125或MUC16),癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1),癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a),碳酸酐酶9(CA-IX),癌胚抗原(CEA),心脏肌球蛋白,CCCTC结合因子(CTCF),CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1),CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CD11,CD123,CD125,CD140a,CD147(basigin),CD15,CD152,CD154(CD40L),CD171,CD179a,CD18,CD19,CD2,CD20,CD200,CD22,CD221,CD23(IgE受体),CD24,CD25(IL-2受体的α链),CD27,CD274,CD28,CD3,CD3ε,CD30,CD300分子样家族成员f(CD300LF),CD319(SLAMF7),CD33,CD37,CD38,CD4,CD40,CD40配体,CD41,CD44v7,CD44v8,CD44v6,CD5,CD51,CD52,CD56,CD6,CD70,CD72,CD74,CD79A,CD79B,CD80,CD97,CEA相关抗原,CFD,ch4D5,染色体X开放读码框61(CXORF61),封闭蛋白18.2(CLDN18.2),封闭蛋白6(CLDN6),艰难梭菌,凝聚因子A,CLCA2,集落刺激因子1受体(CSF1R),CSF2,CTLA-4,C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A),C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1),C-X-C趋化因子受体类型4,细胞周期蛋白B1,细胞色素P4501B1(CYP1B1),cyp-B,巨细胞病毒,巨细胞病毒糖蛋白B,达比加群,DLL4,DPP4,DR5,大肠杆菌志贺毒素1型,大肠杆菌志贺毒素2型,外-ADP-核糖基转移酶4(ART4),含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2),EGF样结构域多倍体7(EGFL7),突变的延伸因子2(ELF2M),内毒素,肝配蛋白A2,肝配蛋白B2,肝配蛋白A型受体2,表皮生长因子受体(EGFR),表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII),上皮唾蛋白,上皮细胞粘附分子(EpCAM),上皮糖蛋白2(EGP-2),上皮糖蛋白40(EGP-40),ERBB2,ERBB3,ERBB4,ERG(跨膜蛋白酶,丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因),大肠杆菌,位于染色体12p的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML),呼吸道合胞病毒的F蛋白,FAP,IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89),Fc受体样5(FCRL5),胎儿乙酰胆碱受体,纤维蛋白IIβ链,成纤维细胞活化蛋白α(FAP),纤连蛋白外结构域-B,FGF-5,Fms样酪氨酸激酶3(FLT3),叶酸结合蛋白(FBP),叶酸水解酶,叶酸受体1,叶酸受体α,叶酸受体β,Fos相关抗原1,卷曲受体,岩藻糖基GM1,G250,G蛋白偶联受体20(GPR20),G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D),神经节苷脂G2(GD2),GD3神经节苷脂,糖蛋白100(gp100),磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3),GMCSF受体α-链,GPNMB,GnT-V,生长分化因子8,GUCY2C,突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2),血凝素,甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1),乙型肝炎表面抗原,乙型肝炎病毒,HER1,HER2/neu,HER3,globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH),HGF,HHGFR,高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA),组蛋白复合物,HIV-1,HLA-DR,HNGF,Hsp90,HST-2(FGF6),人乳头瘤病毒E6(HPV E6),人乳头瘤病毒E7(HPV E7),人散射因子受体激酶,人端粒酶逆转录酶(hTERT),人TNF,ICAM-1(CD54),iCE,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IgE,IgE Fc区,IGF-1,IGF-1受体,IGHE,IL-12,IL-13,IL-17,IL-17A,IL-17F,IL-1β,IL-20,IL-22,IL-23,IL-31,IL-31RA,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6受体,IL-9,免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1),甲型流感血凝素,胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体),胰岛素样生长因子2(ILGF2),整联蛋白α4β7,整联蛋白β2,整联蛋白α2,整联蛋白α4,整联蛋白α5β1,整联蛋白α7β7,整联蛋白αIIbβ3,整联蛋白αvβ3,干扰素α/β受体,干扰素γ诱导的蛋白,白介素11受体α(IL-11Rα),白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2),肠羧基酯酶,激酶结构域区域(KDR),KIR2D,KIT(CD117),L1-细胞粘附分子(L1-CAM),天冬酰胺肽链内切酶,白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2),白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1),淋巴细胞抗原6(Ly-6),Lewis-Y抗原,LFA-1(CD11a),LINGO-1,脂磷壁酸,LOXL2,L-选择蛋白(CD62L),淋巴细胞抗原6复合物,基因座K 9(LY6K),淋巴细胞抗原75(LY75),淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK),淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF),M-CSF,乳腺分化抗原(NY-BR-1),MCP-1,黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1),黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2),细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP),黑素瘤相关的抗原1(MAGE-A1),间皮素,细胞表面有关的粘蛋白1(MUC1),MUC-2,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC7,MUC16,粘蛋白CanAg,髓磷脂相关的糖蛋白,肌肉生长抑制素,N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17),NCA-90(粒细胞抗原),连接素4,神经生长因子(NGF),调节神经细胞凋亡的蛋白酶1,神经细胞粘附分子(NCAM),神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A,NOGO-B,NOGO-C),神经纤毛蛋白-1(NRP1),N-羟乙酰基神经氨酸,NKG2D,Notch受体,o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2),嗅觉受体51E2(OR51E2),癌胚胎抗原(h5T4),由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl),穴兔,OX-40,oxLDL,p53突变体,配对框蛋白Pax-3(PAX3),配对框蛋白Pax-5(PAX5),泛连接蛋白3(PANX3),P-钙粘着蛋白,磷酸钠协同转运蛋白,磷脂酰丝氨酸,胎盘特异性的1(PLAC1),血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα),血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β),聚唾液酸,顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES1),程序性细胞死亡蛋白1(PD-1),程序性死亡-配体1(PD-L1),前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9),前列腺酶,前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8),被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1),P15,P53,PRAME,前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性的膜抗原(PSMA),前列腺酸性磷酸酶(PAP),前列腺癌细胞,prostein,蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21),蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2),铜绿假单胞菌,狂犬病病毒糖蛋白,RAGE,Ras同源物家族成员C(RhoC),核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL),高级糖化终产物的受体(RAGE-1),受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1),肾普遍存在的1(RU1),肾普遍存在的2(RU2),呼吸道合胞病毒,Rh血型D抗原,猕猴因子,肉瘤易位断点,硬骨素(SOST),选择蛋白P,唾液酸基Lewis粘附分子(sLe),精子蛋白17(SPA17),鞘氨醇-1-磷酸,被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3),阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4),金黄色葡萄球菌,STEAP1,黏结蛋白聚糖1(SDC1)+A314,SOX10,存活素,存活素-2B,滑膜肉瘤,X断点2(SSX2),T细胞受体,TCRΓ交替读码框蛋白(TARP),端粒酶,TEM1,生腱蛋白C,TGF-β(例如，TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3),促甲状腺激素受体(TSHR),组织因子途径抑制剂(TFPI),Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr)),TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA),TNF-α,TRAIL-R1,TRAIL-R2,TRG,转谷氨酰胺酶5(TGS5),肿瘤抗原CTAA16.88,肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248),肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R),肿瘤蛋白p53(p53),MUC1的肿瘤特异性糖基化,肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TROP-2),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)+A327,TWEAK受体,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关的蛋白1(TYRP1或糖蛋白75),酪氨酸酶相关的蛋白2(TYRP2),尿空斑蛋白2(UPK2),血管内皮生长因子(例如，VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PIGF),血管内皮生长因子受体1(VEGFR1),血管内皮生长因子受体2(VEGFR2),波形蛋白,v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN),血管性假血友病因子(VWF),肾母细胞瘤蛋白(WT1),X抗原家族成员1A(XAGE1),β-淀粉样蛋白,κ-轻链,成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2),雌激素调节的LIV-1蛋白(LIV1,又称SLC39A6),神经营养性的受体酪氨酸激酶1(NTRK1,又称TRK),Ret原癌基因(RET),B细胞成熟抗原(BCMA,又称TNFRSF17),转铁蛋白受体(TFRC,又称CD71),活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM,又称CD166),生长抑素受体2(SSTR2),KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(cKIT),V-Set免疫调节性受体(VSIR,又称VISTA),糖蛋白Nmb(GPNMB),δ样典型Notch配体3(DLL3),白介素3受体亚基α(IL3RA,又称CD123),溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1),钙粘着蛋白3类型1,P-钙粘着蛋白(CDH3),肝配蛋白A4(EFNA4),蛋白酪氨酸激酶7(PTK7),溶质载体家族34成员2(SLC34A2,又称NaPi-2b),鸟苷酸环化酶C(GCC),含有PLAUR结构域的3(LYPD3,又称LY6或C4.4a),粘蛋白17,细胞表面有关的(MUC17),Fms有关的受体酪氨酸激酶3(FLT3),NKG2D配体(例如ULBP1,ULBP2,ULBP3,H60,Rae-1α,Rae-1β,Rae-1δ,Rae-1γ,MICA,MICB,hHLA-A),SLAM家族成员7(SLAMF7),白介素13受体亚基α2(IL13RA2),C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A,又称CLL-1),CEA细胞粘附分子5(CEACAM,又称CD66e),白介素3受体亚基α(IL3RA),CD5分子(CD5),UL16结合蛋白1(ILBP1),含有V-Set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1,又称B7-H4),硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4),黏结蛋白聚糖1(SDC1,又称CD138),白介素1受体辅助蛋白(IL1RAP),含有杆状病毒IAP重复的5(BIRC5,又称存活素),CD74分子(CD74),甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1,又称TIM1),SLIT和NTRK样家族成员6(SILTRK6),CD37分子(CD37),凝血因子III,组织因子(CD142,又称F3),AXL受体酪氨酸激酶(AXL),内皮素受体类型B(EDNRB,又称ETBR),钙粘着蛋白6(CDH6),成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3),碳酸酐酶6(CA6),MUC1的CanAg糖型,整联蛋白亚基αV(ITGAV),畸胎癌衍生的生长因子1(TDGF1,又称Crypto1),SLAM家族成员6(SLAMF6,又称CD352)和Notch受体3(NOTCH3)。
可从其衍生出用于掺入本文所述主题组合物的任何多肽实施方案中的AF2的治疗性单克隆抗体是本领域已知的。这样的治疗性抗体可以包括，但不限于：利妥昔单抗，IDEC/Genentech/Roche(参见，例如，美国专利号5,736,137)，用于治疗许多淋巴瘤、白血病和一些自身免疫障碍的嵌合抗-CD20抗体；奥法木单抗，被批准用于慢性淋巴细胞白血病和被开发用于滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎和复发缓解型多发性硬化的抗-CD20抗体；鲁卡木单抗(HCD122)，用于非霍奇金或霍奇金淋巴瘤的抗-CD40抗体(参见，例如，美国专利号6,899,879)；AME-133，结合表达CD20的细胞以治疗非霍奇金淋巴瘤的抗体；维妥珠单抗(hA20)，结合表达CD20的细胞以治疗免疫性血小板减少性紫癜的抗体；被开发用于治疗低级B-细胞淋巴瘤的HumaLYM；和奥瑞珠单抗，其为用于治疗类风湿性关节炎的抗-CD20单克隆抗体(参见，例如，美国专利申请20090155257)；曲妥珠单抗(参见，例如，美国专利号5,677,171)，被批准用于治疗乳腺癌的人源化的抗-HER2/neu抗体；培妥珠单抗，被开发用于治疗前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的抗-HER2二聚化抑制剂抗体(参见，例如，美国专利号4,753,894)；西妥昔单抗，用于治疗表达表皮生长因子受体(EGFR)的KRAS野生型转移性结肠直肠癌和头颈癌的抗-EGFR抗体(参见美国专利号4,943,533；PCT WO96/40210)；帕尼单抗(panitumumab)，对表皮生长因子受体(也被称作EGF受体、EGFR、ErbB-1和HER1，目前销售用于治疗转移性结肠直肠癌(参见美国专利号6,235,883))特异性的全人单克隆抗体；扎芦木单抗，用于治疗头和颈的鳞状细胞癌的针对表皮生长因子受体(EGFR)的完全人IgG1单克隆抗体(参见，例如，美国专利号7,247,301)；尼妥珠单抗，被开发用于治疗头和颈的鳞状细胞癌、鼻咽癌和神经胶质瘤的针对EGFR的嵌合抗体(参见，例如，美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883)；马妥珠单抗，被开发用于治疗结肠直肠癌、肺癌、食管癌和胃癌的针对表皮生长因子受体(EGFR)的人源化单克隆抗体(参见，例如，美国专利申请20090175858A1)；西妥昔单抗，用于治疗转移性结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌的针对表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合(小鼠/人)单克隆抗体(参见，例如，美国专利号6,217,866)；阿仑珠单抗，销售用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和T细胞淋巴瘤的针对CD52的人源化单克隆抗体；替伊莫单抗，被开发用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的某些形式的抗-CD20单克隆抗体；吉妥珠单抗奥加米星，连接至细胞毒性螯合剂tiuxetan的抗-CD33(p67蛋白)抗体，其附着放射性同位素，用于治疗急性髓性白血病；ABX-CBL，抗-CD147抗体；ABX-IL8，抗-IL8抗体；ABX-MA1，抗-MUC18抗体；潘妥莫单抗(R1549,90Y-muHMFG1)，开发中的抗-MUC1；Therex(R1550)，抗-MUC1抗体；AngioMab(AS1405)，由Antisoma开发；HuBC-1，由Antisoma开发；由Antisoma开发的Thioplatin(AS1407)；ANTEGREN(那他珠单抗)，抗-α-4-β-1(VLA4)和α-4-β-7抗体；VLA-1mAb，抗-VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，抗-淋巴毒素β受体(LTBR)抗体；CAT-152，抗-TGF-β2抗体；J695，抗-IL-12抗体；CAT-192，开发的抗-TGFβ1抗体；CAT-213，开发的抗-嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体；LYMPHOSTAT-B，抗-Blys抗体；TRAIL-R1mAb，抗-TRAIL-R1抗体；赫赛汀，抗-HER受体家族抗体；抗-组织因子(ATF)，抗-组织因子抗体；Xolair(奥马珠单抗)，抗-IgE抗体；MLN-02抗体(以前的LDP-02)；HuMax
Figure BDA0003525090100001051
抗-CD4抗体；tocilizuma,抗-IL6R抗体；HuMax-IL15，抗-IL15抗体,HuMax-Inflam；HuMax-癌，抗-类肝素酶I抗体；HuMax-淋巴瘤,HuMax-TAC；IDEC-131，抗-CD40；IDEC-151(克立昔单抗)，抗-CD4抗体；IDEC-114，抗-CD80抗体；IDEC-152，抗-CD23；抗-KDR抗体,DC101，抗-flk-1抗体；由Imclone开发的抗-VE钙粘着蛋白抗体；CEA-CIDE(拉贝珠单抗)，由Immunomedics开发的抗-癌胚抗原(CEA)抗体；Yervoy(伊匹木单抗)，用于治疗黑素瘤的抗-CTLA4抗体；
Figure BDA0003525090100001052
(依帕珠单抗)，抗-CD22抗体；AFP-Cide，由Immunomedics开发；MyelomaCide，由Immunomedics开发；LkoCide，由Immunomedics开发；ProstaCide，由Immunomedics开发；MDX-010，抗-CTLA4抗体；MDX-060，抗-CD30抗体；MDX-070；由Medarex开发的MDX-018；OSIDEM(IDM-1)，抗-HER2抗体；
Figure BDA0003525090100001053
-CD4，抗-CD4抗体；HuMax-IL15，抗-IL15抗体；抗-细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体,MOR201；曲美木单抗，抗-CTLA-4抗体；抗-a 5β1整联蛋白，由Protein DesignLabs开发；抗-IL-12，由Protein Design Labs开发；ING-1，由Xoma开发的抗-Ep-CAM抗体；和MLN01，抗-Beta2整联蛋白抗体；本段落中所有上述引用的抗体参考文献明确地通过引用并入本文。上述抗体的序列可以从公众可得到的数据库、专利或参考文献中获得。此外，适合用于掺入本公开内容的主题组合物中的针对癌症、肿瘤或靶细胞标志物的单克隆抗体和VH和VL序列(以及，在一些情况下，具有指示的可掺入AF2中的CDR序列)的非限制性例子呈现在表8中。
根据上文提及的抗原结合片段实施方案，如果识别靶细胞标志物抗原的结合位点具有高结合亲和力以高效捕获待破坏的靶细胞，则可能是有利的。本公开内容的任何实施方案的主题多肽具有以下优点：它们可以多次用于杀死肿瘤细胞，因为在优选的实施方案中，AF2靶细胞抗原结合片段具有在10-7至10-10M范围内的Kd值的亲和力，如在体外结合测定中所确定的。如果双特异性抗原结合片段结合靶细胞标志物的亲和力太高，则组合物结合表达的靶细胞并保留在其表面上，使其不能释放并结合另一个细胞。在一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含AF2，其中AF2以在约0.1nM和约100nM之间、或约0.5至约50nM、或约1.0至约10nM的Kd特异性地结合靶细胞标志物，如在包含靶细胞标志物的体外抗原结合测定中所确定的。在另一个实施方案中，AF2以小于约0.1nM、或小于约0.5nM、或小于约1.0nM、或小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM的结合亲和力(如通过在体外结合测定中的Kd所确定的)特异性地结合靶细胞标志物。在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF2，其中AF2对靶细胞标志物的结合亲和力比AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。在另一个实施方案中，与AF2对靶细胞标志物抗原的更大结合亲和力相比，本公开内容的任何主题实施方案的AF1抗原结合片段具有低至少一个数量级、至少两个数量级或至少三个数量级的对CD3抗原的更低结合亲和力，如在体外测定中作为Kd常数所确定的。应该理解，较大结合亲和力是指较低的Kd值；例如，1×10-9M是比1×10-8M更大的结合亲和力。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了多肽，所述多肽包含AF2，其中所述AF2包含对靶细胞标志物抗原具有结合亲和力的单克隆抗体的CDR。在另一个实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含AF2，其中所述AF2包含衍生自对靶细胞标志物抗原具有结合亲和力的单克隆抗体的CDR，其中AF2的CDR选自在SEQ ID NO:719-918的VL和VH序列内的CDR。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，主题多肽包含AF2，其中所述AF2包含对靶细胞标志物抗原具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH。在某些情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含AF2，其中所述AF2包含对靶细胞标志物抗原具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH，其中所述VL包含与SEQ ID NO:719-918的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ IDNO:719-918的氨基酸序列相同的氨基酸序列，且VH包含与SEQ ID NO:719-818的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQID NO:719-818的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
应当理解，术语“抗原结合片段”用于本文公开的组合物实施方案的应用旨在包括这样的抗体部分或片段：其保留结合作为相应完整抗体的配体的抗原的能力。在这样的实施方案中，抗原结合片段可以是、但不限于，CDR和插入框架区、抗体的轻链和/或重链的可变或高变区(VL、VH)、可变片段(Fv)、Fab'片段、F(ab')2片段、Fab片段、单链抗体(scAb)、VHH骆驼科抗体、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体、互补性决定区(CDR)、结构域抗体(dAb)、BHH或BNAR类型的单结构域重链免疫球蛋白、单结构域轻链免疫球蛋白或本领域已知的含有能够结合抗原的抗体片段的其它多肽。两个抗原结合片段的VL和VH也可以以单链双体构型配置；即，AF1和AF2的VL和VH配置有适当长度的接头以允许排列为双体。
在某些实施方案中，抗原结合片段的VL和VH通过相对长的接头融合，所述接头由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个亲水氨基酸组成，当连接时在一起，其具有柔性特性。在一个实施方案中，本文描述的任何scFv实施方案的VL和VH通过亲水氨基酸的接头连接，所述接头选自序列GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG(SEQ ID NO:1142)、TGSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSGT(SEQ ID NO:1143)、GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEG(SEQ IDNO:1144)或GSAAPTAGTTPSASPAPPTGGSSAAGSPST(SEQ ID NO:1145)。在其它情况下，主题组合物的AF1和AF2通过具有3、4、5、6或7个氨基酸的亲水氨基酸的短接头连接到一起。在一个实施方案中，短接头序列选自以下的组：序列SGGGGS(SEQ ID NO:1146)、GGGGS(SEQ ID NO:1147)、GGSGGS(SEQ ID NO:1148)、GGS或GSP。在另一个实施方案中，本公开内容提供了组合物，所述组合物包含单链双体，其中在折叠后，第一结构域(VL或VH)与最后一个结构域(VH或VL)配对形成一个scFv，且在中间的两个结构域配对形成另一个scFv，其中第一个和第二个结构域以及第三个和最后一个结构域通过前述短接头之一融合在一起，并且第二和第三可变结构域通过前述长接头之一融合。短接头和长接头的选择可以防止相邻可变结构域的错误配对，从而促进包含第一抗原结合片段和第二抗原结合片段的VL和VH的单链双体构型的形成。
表8：靶细胞标志物抗体和序列
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VI).双特异性抗原结合组合物-构型和功能性能
在另一个方面，本公开内容涉及新颖的嵌合的、双特异性的抗原结合组合物，其结合效应细胞(例如，T细胞)的CD3蛋白复合物的抗原或表位以及与患病细胞或组织相关的第二靶细胞标志物。因此，它们可以被称作T细胞衔接物。如下文更充分描述的，双特异性抗原结合组合物以可活化的前药形式配置，其赋予优于双特异性T细胞衔接物和本领域已知的有关化合物的优点。本公开内容的各种组合物具有性能，包括在它们的生产和纯化过程中增强的稳定性，当对受试者施用时在循环中增强的稳定性和增加的半衰期，在预期治疗部位而不是在正常健康组织中被活化的能力，以及当通过释放区段的蛋白水解性切割以及融合的AF1和AF2的释放而活化时对靶细胞和效应细胞表现出的结合亲和力至少与相应的常规双特异性IgG抗体相当。在AF1和AF2对效应细胞和靶细胞的结合后，形成免疫突触，其实现效应细胞的活化并促进随后通过细胞凋亡或细胞裂解对靶细胞的破坏。
本文描述的本公开内容的各种主题双特异性抗原结合组合物被专门设计为前药形式，因为一个或更多个XTEN组分屏蔽抗原结合片段，从而降低它们的结合其配体的能力，直到通过位于释放区段内的任何蛋白酶切割位点的蛋白酶切割而从组合物中释放。已知与患病细胞或组织相关的蛋白酶包括、但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，包括、但不限于本文所述的特定蛋白酶。与非前药形式的双特异性T细胞衔接物治疗剂相比，双特异性抗原结合组合物的这种前药性能提高了组合物对患病组织或细胞的特异性。相反，通过在靶细胞或患病组织的微环境(其中靶细胞标志物和能够切割释放区段的蛋白酶被高度表达)中特异性地活化双特异性抗原结合组合物，构建体的双特异性抗原结合片段和XTEN在释放区段的切割后被释放，且融合的抗原结合片段可以以高度特异性的方式将细胞毒性效应细胞与表达靶细胞标志物的细胞交联，从而将T细胞的细胞毒性潜力导向靶细胞。在蛋白酶切割后，抗原结合片段不再被屏蔽，并有效地重新获得其结合带有靶细胞标志物的靶细胞和效应细胞(诸如细胞毒性T细胞，通过结合CD3抗原，该抗原形成T细胞受体复合物的一部分)的全部潜力，从而造成T细胞活化，其介导表达特定靶细胞标志物的靶细胞的随后切割。因此，预期本公开内容的双特异性抗原结合组合物表现出强的、特异性的和有效的靶细胞杀伤。在这样的情况下，细胞会被选择性消除，从而降低毒副作用的可能性。
在一个方面，本公开内容提供了包含两个抗原结合片段的可活化的双特异性抗原结合片段组合物，其中第一抗原结合片段靶向效应细胞，且第二抗原结合片段靶向与疾病组织或细胞相关的细胞标志物；它们两者都对其各自的配体具有特异性结合亲和力。在具有第一和第二抗原结合片段(分别是AF1和AF2)的主题组合物的设计中对至少三个性能的考虑是值得注意的：1)具有双特异性抗原结合片段的组合物，其能够结合效应细胞和靶细胞并将它们连接到一起，从而形成免疫突触；2)具有XTEN的组合物，所述XTEN i)当组合物处于完整前药形式时，屏蔽两个抗原结合片段并降低它们的结合靶标和效应细胞配体的能力，ii)当施用给受试者时提供延长的半衰期，iii)与患病组织(例如，肿瘤)相比，减少完整组合物从正常组织和器官的循环中的外渗，并且iv)与常规的双特异性细胞毒性的抗体治疗剂相比赋予增加的安全性谱；和3)当RS在患病组织附近被一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割时被活化，从而释放融合的双特异性抗原结合片段，使得它们重新获得其对靶配体的完全结合亲和力潜力。主题组合物的设计利用了XTEN和释放区段(RS)组分的性能，并且它们相对于双特异性抗原结合片段的定位实现了前述性能，如以下示例性实施例中的结果所证明的。
在一个实施方案中，本文所述的任何双特异性抗原结合片段组合物实施方案的多肽具有两个抗原结合片段(AF1和AF2)、单个RS和单个XTEN，所述多肽在未切割状态下可以具有AF2-AF1-RS1-XTEN1、AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN1-RS1-AF2-AF1、XTEN1-RS1-AF1-AF2或双体-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-双体的从N-端至C-端结构排列，其中所述双体包含AF1和AF2的VL和VH。
在其它方面，本公开内容提供了具有两个抗原结合片段(AF1和AF2)、两个RS和两个XTEN的双特异性抗原结合组合物。在这些组合物的设计中对以下内容的考虑是值得注意的：通过添加第二个XTEN进一步降低未切割的组合物对AF1和AF2抗体片段的相应配体的结合亲和力，以进一步减少当施用给受试者时所述组合物与健康组织或细胞的意外结合，从而与仅具有一个RS和一个XTEN的组合物相比进一步提高主题组合物的治疗指数。当在体外测定时，相对于具有单个RS和XTEN的那些组合物，第二RS和第二XTEN的添加导致完整的未切割的多肽与AF1和AF2抗体片段的相应配体的结合亲和力的惊人降低，并且当以治疗有效剂量施用时，还导致在疾病的动物模型中降低的毒性，如下面的实施例中所述。在具有两个抗原结合片段、两个RS和两个XTEN的主题组合物的实施方案中，在未切割状态下，组合物可以具有以下从N-端至C-端结构排列：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-双体-RS1-XTEN1(其中所述双体包含AF1和AF2的VL和VH)，或XTEN1-RS1-双体-RS2-XTEN2(其中所述双体包含AF1和AF2的VL和VH)。
各种设计的组合物的一个特征是，当双特异性抗原结合组合物的RS被靶细胞环境中的哺乳动物蛋白酶切割并从前药形式转化为活化或脱辅蛋白形式时，在双特异性抗原结合片段和XTEN从组合物切割和释放后，融合的AF1和AF2结合效应细胞(例如，携带CD3的T细胞)和携带靶细胞标志物抗原(其能够被AF2结合)的患病细胞(例如，肿瘤或癌细胞)并将它们连接在一起，从而活化效应细胞。在一个实施方案中，其中双特异性抗原结合组合物的RS被切割并且抗原结合片段被释放，随后效应细胞和靶细胞的同时结合可导致效应细胞的至少3倍、或10倍、或30倍、或100倍、或300倍、或1000倍活化，其中通过细胞因子、细胞裂解蛋白的产生或靶细胞的裂解来评估活化，这在基于体外细胞的测定中评估。在另一个实施方案中，释放的、融合的AF1和AF2对携带CD3抗原的T细胞和携带靶细胞标志物抗原的患病细胞的同时结合形成免疫突触，其中结合导致能够裂解患病细胞的T细胞衍生的效应分子的释放。用于测量效应细胞活化和/或细胞裂解的体外测定的非限制性例子包括细胞膜完整性测定、混合细胞培养测定、基于FACS的碘化丙啶测定、锥虫蓝流入测定、光度测量酶释放测定、ELISA、辐射测量51Cr释放测定、萦光测量铕释放测定、钙黄绿素AM释放测定、光度测量MTT测定、XTT测定、WST-1测定、阿拉玛蓝测定、辐射测量3H-Thd掺入测定、测量细胞分裂活性的克隆原测定、测量线粒体跨膜梯度的萦光测量罗丹明123测定、通过基于FACS的磷脂酰丝氨酸暴露而监测的细胞凋亡测定、基于ELISA的TUNEL试验测定、胱天蛋白酶活性测定和细胞形态学测定或本领域已知的用于测定细胞因子、细胞裂解蛋白或细胞的裂解的其它测定或在下文实施例中描述的方法。
不受限于特定理论，据信，使用如上所述的双特异性抗原结合组合物形式，在RS的切割后，释放的融合的AF1和AF2能够通过募集细胞毒性效应细胞杀死靶细胞，而无需任何预刺激和/或共刺激。进一步，对效应细胞的预刺激和/或共刺激的独立性可能对由释放的、融合的AF1和AF2抗原结合片段介导的异常高的细胞毒性有很大贡献。在一些实施方案中，释放的AF1和AF2(其中AF1保持通过接头肽与AF2融合)被设计成具有结合特异性，使得它具有结合紧密接近的细胞毒性效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞))并连接在一起的能力，通过AF2连接至预选的靶细胞标志物，其对与肿瘤细胞、癌症细胞或与患病组织相关的细胞有关的靶细胞标志物具有结合特异性,从而影响免疫突触以及释放的细胞因子和效应分子对靶肿瘤或癌细胞的选择性、定向和局部作用，结果是肿瘤或癌细胞被损坏或破坏，从而对受试者产生治疗益处。释放的与效应细胞抗原结合的AF1能够调节效应细胞的一种或更多种功能，从而导致或促成对AF2所结合的靶细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞裂解作用。效应细胞抗原可以由效应细胞或其它细胞表达。在一个实施方案中，效应细胞抗原在效应细胞的细胞表面上表达。效应细胞抗原的非限制性例子是CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD38、CD45RO、CD56、CD57、CD69、CD95、CD107和CD154。因而，本领域技术人员将理解，与在其中施用组合物的具有得到的治疗益处的受试者的健康组织或健康细胞相比，主题组合物的构型旨在选择性地或不成比例地将组合物的活性形式递送至靶肿瘤组织或癌细胞。从前述显而易见，本公开内容提供了呈设计构型的一大类多肽以实现期望的性能。
本公开内容的一个目的是，主题双特异性抗原结合组合物的设计，其具有由完整循环组合物的XTEN赋予的屏蔽效应和伴随的降低的结合效应细胞和靶组织的潜力，导致与未连接至屏蔽部分(诸如XTEN)的双特异性抗原结合组合物相比，当对受试者施用时，在全身暴露期间Th1T细胞相关的细胞因子或其它促炎介质的减少产生，使得总体副作用和安全性谱(例如，治疗指数)得到改善。作为细胞免疫的重要组成部分，IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生是Th1应答的标志(Romagnani S.T-cell subsets(Th1versus Th2).Ann AllergyAsthma Immunol.2000.85(1):9-18)，特别是在抗-CD3刺激的T细胞中(Yoon,S.H.Selective addition of CXCR3+CCR4-CD4+Th1cells enhances generation ofcytotoxic T cells by dendritic cells in vitro.Exp Mol Med.2009.41(3):161-170)，并且IL-4、IL-6和IL-10也是在双特异性抗体组合物的细胞毒性反应中很重要的促炎性细胞因子(Zimmerman,Z.,等人.Unleashing the clinical power of T cells:CD19/CD3 bi-specific T cell engager
Figure BDA0003525090100001491
antibody composition blinatumomab as apotential therapy.Int.Immunol.(2015)27(1):31-37)。在一个实施方案中，与在可比较条件(例如，等同摩尔浓度)下进行的基于体外细胞的细胞因子刺激测定中的对应蛋白酶处理过的组合物的对应的释放的AF1和AF2(在通过RS的蛋白水解释放以后，其保持融合在一起)刺激的Th1和/或细胞因子水平相比，当在基于体外细胞的细胞因子刺激测定中使完整的、未切割的多肽与效应细胞和靶细胞接触时，本文所述实施方案的完整的、未切割的双特异性抗原结合组合物可表现出减少了至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少1000倍的导致Th1和/或促炎性细胞因子产生的潜力。Th1和/或促炎性细胞因子的非限制性例子是IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ。在前述的一个实施方案中，在体外测定中测定Th1细胞因子的产生，所述体外测定包含效应细胞诸如PBMC或CD3+ T细胞以及具有本文公开的靶细胞标志物抗原的靶细胞。在另一个实施方案中，可以从血液、流体或组织样品评估细胞因子，所述样品取自其中已经施用了多肽组合物的受试者。在前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、猴和人。但是，在本文描述的实施方案的主题双特异性抗原结合组合物的优点中，已经发现，组合物的细胞裂解性能不需要细胞因子的预刺激；通过抗原结合片段与结合至靶细胞的效应细胞的免疫突触的形成足以在靶细胞中实现细胞裂解或细胞凋亡。尽管如此，促炎性细胞因子的产生是评估主题多肽组合物的效能或作用的有用标志物；无论是通过体外测定还是在施用主题双特异性抗原结合组合物后监测具有疾病组织(例如，诸如肿瘤)的受试者的治疗。
在受试者中使用双特异性抗原结合组合物的背景下，在本公开内容的一个目的中，设计主题双特异性抗原结合组合物以通过XTEN的添加利用与健康血管系统相比肿瘤或发炎组织中的血管系统的孔径差异，从而减少正常组织中完整双特异性抗原结合组合物的外渗，但在肿瘤血管系统的渗漏环境或患病组织中的其它炎症区域中，完整的组装体可以外渗并被患病组织环境中的蛋白酶活化，从而将抗原结合片段释放到效应物和靶细胞(参见，例如，图5)。在双特异性抗原结合组合物的RS的情况下，该设计利用了这样的情况：当双特异性抗原结合组合物靠近产生一种或更多种蛋白酶的患病组织(例如，肿瘤)时，对由肿瘤表达的一种或更多种蛋白酶敏感的RS序列能够被蛋白酶切割(在上文更全面地描述)。蛋白酶的作用切割组合物的释放区段(RS)，将抗原结合片段与XTEN分开，导致组分的分子量和流体动力学半径降低，特别是对于释放的融合的AF1和AF2。如将理解的，组合物的分子量和流体动力学半径的降低还赋予了这样的特性：释放的、融合的AF1和AF2能够在溶液中更自由地移动，穿过组织和肿瘤中的更小的孔隙空间，以及更容易从肿瘤血管系统的较大孔中外渗，且更容易渗透到肿瘤中，从而增加与效应细胞和肿瘤细胞结合并连接到一起的能力。这样的性质可以通过不同的测定来测量。因而，本领域技术人员会明白，在使用主题组合物治疗受试者的背景下，双特异性抗原结合组合物以前药形式存在，并且当通过与疾病组织或细胞共定位的蛋白酶作用进入某个细胞环境时转化为更具活性的形式。在通过靶组织中一种或更多种蛋白酶的作用从组合物释放后，对效应细胞抗原具有结合特异性的AF1以及对患病细胞的靶细胞标志物抗原具有结合特异性的融合的AF2重新获得其结合效应细胞和靶细胞并连接在一起从而形成免疫突触的全部能力。免疫突触的形成造成效应细胞被活化，各种信号途径开启新的基因转录，并通过胞吐作用释放其囊泡中的效应分子内容物。根据效应细胞的类型，释放不同的细胞因子和淋巴因子；例如，1型辅助性T细胞(Th1)释放细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α，而2型辅助性T细胞(Th2)释放细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(其刺激B细胞)，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)释放细胞毒性分子如穿孔蛋白和粒酶(其杀死靶标)(统称为“效应分子”)。特别预期，在通过双特异性抗原结合组合物释放的双特异性抗原结合片段同时结合效应细胞和靶肿瘤细胞并将其连接在一起后，在非常低的效应与靶标(E:T)比率，被效应细胞释放到细胞之间的免疫突触中的效应分子作用于肿瘤细胞，导致损伤、穿孔蛋白介导的裂解、粒酶B诱导的细胞死亡和/或肿瘤细胞的细胞凋亡。因而，在另一个方面，各种设计的组合物的特征在于，当将可活化的双特异性抗原结合片段组合物施用给具有疾病诸如肿瘤的受试者时，前药形式保留在正常组织的循环系统中，但能够外渗到肿瘤的渗透性更强的血管系统中，使得组装体的前药形式被与肿瘤共定位的蛋白酶活化，并且释放的抗原结合片段结合在一起并连接效应细胞(例如，T细胞)和表达被组合物的AF2靶向的靶细胞标志物的肿瘤细胞，于是效应细胞被活化并实现肿瘤细胞的裂解。换句话说，在某些情况下，肿瘤组织中渗透性更强的血管系统可能允许双特异性抗原结合多肽外渗到组织中，其中肿瘤相关的蛋白酶可以作用于释放区段(RS)，切割它并释放结合部分，其反过来可以结合效应细胞和肿瘤相关细胞并将其连接在一起。在正常组织的情况下，外渗可能被更紧密的血管系统屏障阻断，或者在双特异性抗原结合多肽确实外渗到一定程度的情况下，双特异性抗原结合多肽可能主要保持“原”形式，因为在健康组织中可能没有足够的蛋白酶来释放结合部分，从而导致不形成免疫突触的净效应。在某些情况下，与对应的完整的、未切割的双特异性抗原结合组合物相比，与肿瘤细胞和效应细胞二者结合的受试者肿瘤中释放的、融合的AF1和AF2表现出至少10倍、或至少30倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少400倍、或至少500倍、或至少1000倍的增强的活化效应细胞的能力。在其它情况下，与在肿瘤中尚未切割的对应的完整的双特异性抗原结合组合物相比，与肿瘤细胞和效应细胞二者结合的受试者肿瘤中释放的、连接的AF1和AF2表现出至少10倍、或至少30倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少400倍、或至少500倍、或至少1000倍的增强的裂解肿瘤细胞的能力。在前述实施方案中，效应细胞活化和/或细胞毒性可以通过本领域已知的常规方法测定，诸如活化的效应细胞的细胞计量测量、细胞因子测定、肿瘤大小的测量或通过组织病理学。在前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、狗、猴和人。具体而言，特别考虑将主题组合物设计成使得在施用给患有具有AF2可结合的靶细胞标志物的疾病的受试者后，与本领域已知的常规双特异性抗体相比，双特异性抗原结合组合物表现出增强的治疗指数和降低的副作用发生，这通过XTEN对前药形式的抗原结合片段的结合亲和力的屏蔽效应和空间位阻的组合实现，但能够在靶组织(例如，肿瘤)附近或内部释放双特异性AF1和AF2(通过在RS中包含切割序列实现)，所述靶组织产生RS为其底物的蛋白酶。
VII).双特异性抗原结合组合物的方法和用途
在另一个方面，本公开内容提供了在医疗环境中特别有用的可活化的双特异性抗原结合组合物和包含双特异性抗原结合组合物的药物组合物；例如，用于预防、治疗和/或改善某些疾病，诸如，但不限于，癌症、肿瘤或炎性疾病。为了用于治疗疾病，本发明的双特异性抗原结合组合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定障碍、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用调度和医学从业人员已知的其它因素。
许多治疗策略已被用于设计多肽组合物，其用于治疗患有癌性疾病的受试者的方法中，包括通过靶向TcR信号传递来调节T细胞应答，特别是使用在临床上广泛用于免疫抑制方案的抗-人CD3单克隆抗体的VL和VH部分。CD3特异性的单克隆OKT3是第一种被批准用于人类的此类单克隆(Sgro,Toxicology 105(1995),23-29)，并且在临床上广泛用作移植中的免疫抑制剂(Chatenoud L:Immunologic monitoring during OKT3therapy.ClinTransplant 7:422-430,1993)。此外，抗-CD3单克隆药物可诱导部分T细胞信号传递和克隆无反应性(Smith,J.Exp.Med.185(1997),1413-1422)。OKT3与T细胞膜中的CD3复合物发生反应并阻断其功能；CD3复合物与T细胞的抗原识别结构(TCR)相关，这对于信号转导至关重要。这些和其它这样的CD3特异性抗体能够诱导各种T细胞应答，包括细胞因子产生(VonWussow,Human gamma interferon production by leukocytes induced withmonoclonal antibodies recognizing T cells.J.Immunol.127:1197-1200(1981))，增殖和抑制性T细胞诱导。在癌症中，已经尝试利用细胞毒性T细胞来裂解癌细胞。不受理论的约束，为了实现靶细胞裂解，据信细胞毒性T细胞需要细胞与细胞的直接接触；在细胞毒性T细胞上的TCR必须识别并衔接靶细胞上的适当抗原。这造成免疫突触，进而在细胞毒性T细胞内启动信号传递级联，造成T细胞活化和多种细胞毒性的细胞因子和效应分子的产生。穿孔蛋白和粒酶是高毒性分子，它们储存在预先形成的颗粒中，这些颗粒存在于活化的细胞毒性T细胞中。在靶细胞的识别后，衔接的细胞毒性T细胞的细胞质颗粒向细胞毒性T细胞膜迁移，最终与其融合并以定向方式将其内容物释放到免疫突触中，在靶细胞的膜内形成孔，从而破坏肿瘤细胞质膜。产生的孔作为粒酶的入口点；所述粒酶是诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶家族。
本文描述的主题双特异性抗原结合组合物(其中对T细胞的CD3具有特异性结合亲和力的AF1与对靶细胞标志物具有特异性结合亲和力的AF2紧密融合)是T细胞衔接物，一旦通过释放区段的切割从组合物的完整前药形式释放，其能够重新获得它们的结合T细胞和靶细胞的全部潜力，从而形成免疫突触，其促进T细胞的活化并促进随后通过细胞凋亡或细胞裂解对肿瘤细胞的破坏。
本公开内容涵盖双特异性抗原结合组合物的使用方法，该组合物被工程改造成除了效应细胞之外还靶向一系列恶性细胞，诸如肿瘤，以便启动靶细胞裂解并实现有益的治疗结果，因为设计双特异性抗原结合组合物，使得AF1结合并衔接CD3以活化细胞毒性T细胞，而AF2可以设计为靶向多种不同的具有特定恶性肿瘤特征的靶细胞标志物；将它们连接在一起以创建免疫突触。在该设计的一个特别优点中，细胞毒性效应细胞与带有靶细胞标志物的细胞的物理结合消除了对抗原加工、MHCI/β2-微球蛋白以及共刺激分子的需要。重要的靶细胞标志物的例子包括、但不限于本文公开的标志物。由于可以工程改造到主题双特异性抗原结合组合物的各种实施方案中的此类靶细胞标志物的范围(在上文更广泛地描述)，应当理解，得到的组合物将具有针对多种疾病的效用，包括血液学癌症和实体瘤。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种治疗患有肿瘤的受试者的方法。被治疗的肿瘤可以包含源自选自由以下组成的组的细胞的肿瘤细胞：间质细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、淋巴细胞性细胞、血管细胞、平滑肌细胞、间充质细胞、乳腺组织细胞、前列腺细胞、肾细胞、脑细胞、结肠细胞、卵巢细胞、子宫细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、胃细胞、生殖泌尿道细胞、子宫颈细胞、子宫细胞、小肠细胞、肝细胞、胰腺细胞、胆囊细胞、胆管细胞、食管细胞、唾液腺细胞、肺细胞和甲状腺细胞。在组合物的另一个优点中，由于在桥接的靶癌细胞的损伤/破坏期间细胞毒性效应细胞不被消耗，在造成一个靶细胞的裂解后，活化的效应细胞可以释放并通过局部组织向其它靶癌细胞移动，再次结合AF1-AF2和靶抗原，并启动额外的细胞裂解。此外，预期在局部环境如实体瘤中，效应细胞分子诸如穿孔蛋白和粒酶的释放将导致对肿瘤细胞的损伤，所述肿瘤细胞邻近但未被双特异性结合结构域的给定分子结合，从而导致肿瘤的生长停滞或消退。
因此，本公开内容的效用将被理解为，在向患有具有靶细胞标志物的癌症或肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的包含本文所述的双特异性抗原结合组合物的药物组合物后，与癌症或肿瘤细胞相关或共定位的蛋白酶可以作用于所述组合物，从而释放融合的AF1和AF2，使得可以通过靶细胞和效应细胞的连接而产生免疫突触，结果是能够裂解靶细胞的效应细胞衍生的效应分子被释放到突触中，导致靶癌症或肿瘤细胞的细胞凋亡、细胞裂解或死亡。此外，本领域技术人员会明白，一旦通过释放的结合结构域与效应细胞和靶癌细胞的结合而形成免疫突触，双特异性抗原结合组合物的使用可导致比“单一杀伤”更持久和更普遍的有益治疗效果。
在一个方面，本公开内容涉及治疗受试者中的疾病(诸如癌症或炎症性障碍)的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者中的疾病的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的任何实施方案的双特异性抗原结合组合物。药物组合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体或抗体部分在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中主题组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。预防有效量表示在实现期望预防结果所必需的时间段内需要的药物组合物的量。
本文描述的双特异性抗原结合组合物的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起显著毒性。双特异性抗原结合组合物的毒性和治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定。细胞培养测定和动物研究可用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)。有毒和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的双特异性抗原结合组合物是优选的。在一个方面，根据本公开内容的双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定适合人类使用的剂量范围。剂量优选是在包括ED50在内的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。取决于多种因素，例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的状况等，剂量可以在该范围内变化。精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师考虑到患者的状况来选择(参见，例如，Fingl等人,1975，见：ThePharmacological Basis of Therapeutics,第1章,第1页)。熟练的技术人员容易认识到，在许多情况下，双特异性抗原结合组合物可能不提供治愈，但可能仅提供部分益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的双特异性抗原结合组合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是小鼠、大鼠、狗、猴或人。
本发明的双特异性抗原结合组合物可以在治疗中与一种或更多种其它剂组合施用。例如，本文描述的任何实施方案的双特异性抗原结合分子可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖为治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病而施用的任何剂。这样的额外的治疗剂可以包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。在某些方面，额外的治疗剂是免疫调节剂、免疫肿瘤学抗体、细胞抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂或增加细胞对细胞凋亡诱导物的敏感性的药剂。在一个特定方面，额外的治疗剂是抗癌剂，例如微管干扰剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂或抗血管生成剂。
在治疗受试者中的疾病的方法的一个实施方案中，治疗的疾病可以是上皮癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌的任何形式、黑素瘤、生殖泌尿道癌、卵巢癌、具有恶性腹水的卵巢癌、阴道癌、外阴癌、尤因肉瘤、腹膜癌扩散、子宫浆液性癌、甲状旁腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、子宫癌、腹膜肾癌中的间皮瘤、肺癌、喉癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胃癌、小肠癌、肝癌、肝细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、脂肪肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、睾丸癌、胆管癌、骨癌、唾液腺癌、甲状腺癌、颅咽管瘤、类癌瘤、上皮癌、卵巢雄性细胞瘤、腺癌、任何起源的肉瘤、原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓细胞性白血病、B细胞衍生的慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍、重症肌无力、格雷夫斯病、卡波西肉瘤、神经母细胞瘤、桥本甲状腺炎、肾母细胞瘤或古德帕斯丘综合征。治疗有效量可以在帮助治疗(例如，治愈或降低严重程度)或预防(例如，降低复发的可能性)癌症或肿瘤方面产生有益效果。在治疗受试者中的疾病的方法的另一个实施方案中，以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用的一个或更多个治疗有效剂量将药物组合物施用给受试者。在方法的另一个实施方案中，以至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的时间段内的两个或更多个治疗有效剂量将药物组合物施用给受试者。在方法的另一个实施方案中，将第一低先导剂量施用给受试者，随后是在至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的给药时间表中的一个或更多个较高维持剂量。施用的初始先导剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg，且施用的一个或更多个随后维持剂量选自由以下组成的组：至少约0.02mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg、或至少约2.0mg/kg、或至少5.0mg/kg。在方法的另一个实施方案中，真皮内地、皮下地、静脉内地、动脉内地、腹内地、腹膜内地、鞘内地或肌肉内地将药物组合物施用给受试者。在方法的另一个实施方案中，以一个或更多个治疗上有效的团注剂量(bolus doses)或通过5分钟至96小时的输注(只要耐受最大安全性和效力)将药物组合物施用给受试者。在方法的另一个实施方案中，以一个或更多个治疗上有效的团注剂量或通过5分钟至96小时的输注将药物组合物施用给受试者，其中所述剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg、或至少约2.0mg/kg、或至少约5.0mg/kg。在方法的另一个实施方案中，以一个或更多个治疗上有效的团注剂量或通过在5分钟至96小时的阶段内的输注将药物组合物施用给受试者，其中给受试者的施用导致受试者中至少约0.1ng/mL到至少约2μg/mL或更多的完整的、未切割的双特异性抗原结合组合物的Cmax血浆浓度，其维持至少约3天、至少约7天、至少约10天、至少约14天或至少约21天。治疗有效剂量是至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg或至少约2.0mg/kg。在一个实施方案中，初始剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg，且后续剂量选自由以下组成的组：至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg或至少约2.0mg/kg。在前述实施方案中，给受试者的施用导致受试者中至少约0.1ng/mL到至少约2ng/mL或更多的多肽的血浆浓度，持续至少约3天、至少约7天、至少约10天、至少约14天或至少约21天。在方法的前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、狗、猴或人。
VIII).核酸序列
在另一个方面，本发明涉及编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的分离的多核苷酸序列以及与编码多肽组合物实施方案的多核苷酸分子互补的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸序列或所述多核苷酸序列的互补物，所述分离的多核苷酸序列编码本文描述的任何实施方案的AF1序列、或AF2序列、或释放区段序列(RS1和RS2)、或XTEN序列。在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸序列或所述多核苷酸序列的互补物，所述分离的多核苷酸序列编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物。在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列编码多肽或双特异性抗原结合组合物，其中所述多核苷酸序列与表9所示的多核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在另一个方面，本公开内容涉及生产编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的多核苷酸序列或与所述多核苷酸序列互补的序列(包括其同源变体)的方法，以及表达由多核苷酸序列表达的蛋白的方法。一般而言，方法包括产生编码本文描述的任何实施方案的蛋白性多肽或双特异性抗原结合组合物的多核苷酸序列，和将编码基因掺入适合宿主细胞的表达载体中。为了产生本文描述的任何实施方案的编码的多肽或双特异性抗原结合组合物，所述方法包括用表达载体转化适当的宿主细胞，和在造成或允许本文描述的任何实施方案的所得的多肽或双特异性抗原结合组合物在转化的宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，从而产生多肽或双特异性抗原结合组合物，其通过本文所述的方法或通过本领域已知的标准蛋白纯化方法回收。将分子生物学中的标准重组技术用于制造本公开内容的多核苷酸和表达载体。
根据本公开内容，编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的核酸序列(或其互补物)被用于产生指导在适当宿主细胞中的表达的重组DNA分子。多种克隆策略适用于实施本公开内容，其中许多用于产生包含编码本公开内容的组合物的基因或其互补物的构建体。在一个实施方案中，将克隆策略用于产生编码构建体的基因，该构建体包含编码多肽或双特异性抗原结合组合物的核苷酸，其用于转化宿主细胞以表达所述组合物。在该段落描述的上文所述的前述实施方案中，基因可以包含编码本文公开的构型中的抗原结合片段、释放区段和XTEN的核苷酸。
在一种方法中，首先制备构建体，其含有编码多肽或双特异性抗原结合组合物构建体的DNA序列。在实施例中描述了用于制备此类构建体的示例性方法。然后将该构建体用于产生表达载体，其适合于转化宿主细胞诸如原核或真核宿主细胞以表达和回收多肽构建体。如果需要，宿主细胞是大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞选自BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、杂交瘤细胞、NIH3T3细胞、COS、HeLa、CHO或酵母细胞。在实施例中描述了用于产生表达载体、转化宿主细胞以及表达和回收XTEN的示例性方法。
编码多肽或双特异性抗原结合组合物构建体的基因可以在一个或更多个步骤中制备，这完全合成或者通过与酶促过程(诸如限制性酶介导的克隆、PCR和重叠延伸)组合的合成，包括在实施例中更充分描述的方法。例如，本文公开的方法可用于连接编码期望长度和序列的各种组分(例如，结合结构域、接头、释放区段和XTEN)基因的多核苷酸序列。使用基因合成的标准技术，从寡核苷酸组装编码多肽组合物的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算法进行基因设计，所述密码子使用和氨基酸组成适合用于在多肽或双特异性抗原结合组合物的生产中利用的大肠杆菌或哺乳动物宿主细胞。在本公开内容的一种方法中，如上所述，创建并然后组装编码构建体的组分的多核苷酸文库。然后组装所得基因，并将所得基因用于转化宿主细胞并产生和回收多肽组合物用于评价其性能，如本文所述。
然后可以将所得的编码多肽或双特异性抗原结合组合物序列的多核苷酸单独克隆进表达载体中。通过各种程序将核酸序列插入到载体中。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入一个或更多个适当的限制性内切核酸酶位点。载体组分通常包括、但不限于以下中的一种或更多种：信号序列、复制起点、一种或更多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些组分中的一种或更多种的合适载体的构建采用熟练的技术人员已知的标准连接技术。这样的技术是本领域众所周知的并且在科学和专利文献中得到了良好描述。各种载体是公众可得到的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式，其可以方便地进行重组DNA程序，并且载体的选择通常取决于它要引入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒。可替换地，载体可以是这样的载体：当被引入宿主细胞时，其整合到宿主细胞基因组中并与它已经整合进的一条或更多条染色体一起复制。一旦引入合适的宿主细胞，抗原结合片段或双特异性抗原结合组合物的表达就可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白测定来确定。例如，轻链CDR或重链CDR、抗原结合片段或双特异性抗原结合组合物的转录mRNA的存在可以通过常规杂交测定(例如RNA印迹分析)、扩增程序(例如RT-PCR)、SAGE(美国专利号5,695,937)和基于阵列的技术(参见例如美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934)使用与抗原结合单元多核苷酸的任何区域互补的探针进行检测和/或定量。
本公开内容提供了包含复制和控制序列的质粒表达载体的用途，所述复制和控制序列与宿主细胞相容并被宿主细胞识别并且可操作地连接至编码多肽的基因以用于多肽的受控表达。载体通常带有复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白的序列。此类载体序列对于各种细菌、酵母和病毒而言是众所周知的。可以使用的有用表达载体包括例如染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。“表达载体”表示含有DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作地连接至合适的控制序列，所述控制序列能够影响编码多肽的DNA在合适的宿主中的表达。要求是，载体在选择的宿主细胞中是可复制和有活力的。可以根据需要使用低拷贝数或高拷贝数载体。
合适的载体包括、但不限于SV40和pcDNA的衍生物以及已知的细菌质粒诸如colEI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(在Smith,等人,Gene 57:31-40(1988)中描述)、pMB9及其衍生物、质粒诸如RP4、噬菌体DNA诸如噬菌体I的众多衍生物诸如NM98 9、以及其它噬菌体DNA诸如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒诸如2微米质粒或2m质粒的衍生物、以及着丝粒和整合酵母穿梭载体；可用于真核细胞的载体诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如经过修饰以使用噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等。也可用于本公开内容中的酵母表达系统包括、但不限于非融合pYES2载体(Invitrogen)、融合体pYESHisA、B、C(Invitrogen)、pRS载体等。载体的控制序列包括实现转录的启动子、控制这样的转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。表达载体中适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等人,Nature,275:615(1978)；Goeddel等人,Nature,281:544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP 36,776]和杂合启动子诸如tac启动子[deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]，所有这些可操作地连接至编码XTEN多肽的DNA。用于细菌系统的启动子还可以含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其可操作地连接至编码多肽的DNA。
还可以通过检查表达的双特异性抗原结合组合物的抗原结合片段或组分来确定载体的表达。本领域有多种技术可用于蛋白分析。它们包括、但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫萦光测定和SDS-PAGE。
IX).制备多肽和双特异性抗原结合组合物的方法
在另一个方面，本公开内容提供了制备主题组合物的方法。在一个实施方案中，方法包括：在促进多肽或双特异性抗原结合组合物的表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的核酸构建体，然后使用标准的纯化方法(例如，柱色谱法、HPLC等)回收多肽或双特异性抗原结合组合物，其中组合物被回收，其中表达的多肽或双特异性抗原结合组合物的至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的结合片段被正确折叠。在制备方法的另一个实施方案中，表达的多肽或双特异性抗原结合组合物被回收，其中至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的多肽或双特异性抗原结合组合物以单体、可溶形式回收。
在另一个方面，本公开内容涉及使用大肠杆菌或哺乳动物宿主细胞以功能蛋白的高发酵表达水平制备多肽和双特异性抗原结合组合物以及提供编码构建体的表达载体的方法，所述构建体可用于方法中以高表达水平产生细胞毒性活性多肽构建体组合物。在一个实施方案中，方法包括以下步骤：1)制备编码本文公开的任何实施方案的多肽的多核苷酸，2)将多核苷酸克隆到表达载体中，该表达载体可以是在适当转录和翻译序列的控制下的质粒或其它载体，以用于在生物系统中高水平表达蛋白，3)用表达载体转化适当的宿主细胞，以及4)在适合表达多肽组合物的条件下在常规营养培养基中培养宿主细胞。如果需要，宿主细胞是大肠杆菌。通过该方法，多肽的表达导致至少0.05g/L、或至少0.1g/L、或至少0.2g/L、或至少0.3g/L、或至少0.5g/L、或至少0.6g/L、或至少0.7g/L、或至少0.8g/L、或至少0.9g/L、或至少1g/L的宿主细胞表达产物的发酵滴度，并且其中至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的表达蛋白被正确折叠。本文中使用的术语“被正确折叠”是指，组合物的抗原结合片段组分具有特异性地结合其靶配体的能力。在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种生产多肽或双特异性抗原结合组合物的方法，所述方法包括：在有效表达多肽产物的条件下，在发酵反应中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的载体，所述多肽包括多肽或双特异性抗原结合组合物，当发酵反应在600nm波长达到至少130的光密度时，所述多肽产物的浓度超过约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g的所述多肽，并且其中表达的蛋白的抗原结合片段被正确折叠。在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种产生多肽或双特异性抗原结合组合物的方法，所述方法包括：在有效表达多肽产物的条件下，在发酵反应中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码该组合物的载体，当发酵反应在600nm波长达到至少130的光密度时，所述多肽产物的浓度超过约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g的所述多肽，并且其中表达的多肽产物是可溶的。
以下是本公开内容的组合物的组成和评价的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它的实施方案。
实施例
实施例1：具有两个释放区段的双特异性抗原结合多肽的构建。
为了生成可以通过限制性消化除去单个scFv的质粒，将pCW1700(其编码抗EpCAM-抗CD3(UCHT1)双特异性串联scFv，具有RSR2486释放区段、AE866XTEN和6X His标签亲和标签(SEQ ID NO:1150))用SacII和BstXI消化，除去抗EpCAM结合结构域的3'端、抗EpCAM和抗CD3结构域之间的接头以及抗CD3结构域的5'端。合成了编码相同区域的DNA片段，在抗EpCAM结合结构域和接头之间的连接部处具有沉默点突变，以引入Bsu36I位点。使用In-Fusion试剂盒(New England Biolabs)将合成的DNA片段克隆到消化的骨架中以组装pJB0035。随后将pJB0035用NheI和BsaI消化以除去BSRS1释放区段序列。合成具有与NheI和BsaI突出端退火的单链尾巴的编码RSR2486的重叠单链寡核苷酸。将寡核苷酸在一起退火并连接到消化的pJB0035中，产生pCW1880，pCW1880编码抗EpCAM-抗CD3(UCHT1)双特异性串联scFv、RSR2486、XTEN866和6X His标签亲和标签(SEQ ID NO:1150)。
为了产生具有各种CD3结合结构域变体的质粒，将pCW1880用Bsu36I和NheI消化以除去UCHT1抗CD3 scFv。合成编码设计的CD3变体的DNA片段。每个基因片段包括在限制性位点的5‘和3‘的30个核苷酸以充当用于Gibson DNA组装的DNA重叠。使用Gibson克隆试剂盒(SGI-DNA,Carlsbad,CA)将合成的DNA片段克隆到消化的骨架中以组装pJB0205、pJB0206、pJB0207和pJB0208。
为了产生具有N-端和C-端XTEN二者的双特异性抗原结合多肽，将AE292 XTEN使用引物从质粒PCR扩增，所述引物包括与N-端上的骨架DNA和与C-端上的不可切割的释放区段(RSR3058,氨基酸序列TTGEAGEAAGATSAGATGP(SEQ ID NO:100))同源的17-21bp 5‘同源区域。使用引物扩增编码抗EpCAM抗体4D5MOCB的轻链和部分重链的第二PCR产物，所述引物包括与N-端上的RSR3058和C-端上的4D5MOCB的重链同源的16-21bp 5‘同源区域。使用In-Fusion质粒组装试剂盒(TakaraBio)将这些PCR片段克隆进用BsiWI-SacII消化的骨架载体中，所述骨架载体编码4D5MOCB重链/抗CD3串联scFv的其余部分、RSR3058不可切割的释放区段的第二个拷贝和具有6xHIS(SEQ ID NO:1150)亲和标签的AE837 XTEN。最终的载体在PhoA启动子和STII分泌前导序列的控制下编码双特异性抗原结合多肽，其具有以下组分(以N-端至C-端)：AE292XTEN、不可切割的RSR3058释放区段、抗EpCAM-抗CD3双特异性串联scFv，以及融合至具有6xHIS(SEQ ID NO:1150)亲和标签的AE867 XTEN的RSR3058。得到的构建体是pJB0084(表9)。
将pJB0084用作模板来产生双特异性抗原结合多肽构建体，该构建体编码AE292XTEN、可切割的释放区段RSR2295、抗EpCAM-抗CD3双特异性串联scFv，以及融合至AE868XTEN的RSR2295。质粒利用了两种以pJB0084为模板的PCR产物；第一种编码6xHIS(SEQ IDNO:1150)亲和标签和AE292 XTEN，其具有与载体骨架同源的5‘同源区域和编码第一个RSR2295的3‘同源区域，第二种编码抗EpCAM-抗CD3双特异性串联scFv，其具有编码在串联scFv的5‘和3‘的RSR2295释放区段的5‘和3‘同源区域。第三种片段编码的AE868 XTEN具有C-标签亲和标签(氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:1149))，其具有编码第二RSR2295的5‘同源区域和与骨架载体同源的3‘同源区域。使用In-Fusion质粒组装试剂盒将三种PCR片段克隆到已用BsiWI-NotI消化的pJB0084中。最终的载体pJB0169在PhoA启动子和DNA序列的STII分泌前导序列的控制下编码双特异性抗原结合多肽分子，其具有以下组分(以N-端至C-端)：6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE292 XTEN、RSR2295释放区段、抗EGFR-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、具有C-标签亲和标签的AE868 XTEN。
为了构建pJB0163和pJB0179，将pJB0169用DraIII和BtsI消化以除去5‘RSR2295、抗EGFR-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295，和AE868 XTEN的前72个氨基酸。对于pJB0163，合成了DNA片段，其编码RSR3058、抗CD3轻链、抗EGFR轻链和重链、抗CD3重链、RSR3058，和AE868 XTEN的前72个氨基酸。对于pJB0179，合成了DNA片段，其编码RSR2295、抗CD3轻链、抗EGFR轻链和重链、抗CD3重链、RSR2295，和AE868 XTEN的前72个氨基酸。基因片段也包括在限制位点的5‘和3‘的30个核苷酸以充当用于Gibson DNA组装的DNA重叠。使用Gibson克隆试剂盒(SGI-DNA,Carlsbad,CA)将合成的DNA片段克隆进消化的pJB0169骨架中以组装pJB0163和pJB0179。
将pJB0179用BsaI和BbvCI消化以除去抗CD3和抗EGFR结合结构域编码序列。将编码抗HER2轻链和重链的PCR产物用引物扩增，引物包括与N-端上的骨架DNA同源的18bp 5‘同源区域和与第二PCR产物同源的21bp 3‘同源区域。使用pJB0205作为模板用引物扩增编码抗CD3 scFv序列变体(CD3.23)的第二PCR产物，引物包括与N-端上的第一PCR产物同源的18bp 5‘同源区域和与载体骨架同源的23bp 3‘同源区域。使用Gibson克隆试剂盒(SGI-DNA,Carlsbad,CA)将两种PCR产物克隆进消化的骨架中以组装pAH0011。
将pJB0163用BsaI和BstEII消化以除去抗CD3和抗EGFR结合结构域编码序列。将编码抗HER2轻链和重链的PCR产物用引物扩增，引物包括与N-端上的骨架DNA同源的18bp 5‘同源区域和与第二PCR产物同源的21bp 3‘同源区域。使用pJB0205作为模板用引物扩增编码抗CD3 scFv序列变体(CD3.23)的第二PCR产物，引物包括与N-端上的第一PCR产物同源的18bp 5‘同源区域和与载体骨架同源的23bp 3‘同源区域。使用Gibson组装试剂盒(SGI-DNA,Carlsbad,CA)将两种PCR产物克隆进消化的骨架中以组装pAH0013。
为了产生pJB0244和pJB0245，将pAH0011和pAH0013用BsaI和BsrDI消化以除去抗Her2(Her2.1)轻链和重链编码序列。用引物扩增编码抗Her2(Her2.2)轻链和重链的PCR产物，所述引物包括与N-端上的各自载体骨架的3‘末端同源的25bp 5‘同源区域和与载体骨架的5‘末端同源的25bp3‘同源区域。使用Gibson克隆试剂盒(SGI-DNA,Carlsbad,CA)将pJB0244的PCR产物克隆进消化的pAH0011骨架中以组装pJB0244，pJB0244在PhoA启动子和STII分泌前导序列的控制下编码6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE292 XTEN、RSR2295、抗HER2-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、具有C-标签亲和标签的AE868 XTEN868，具有表9中提供的DNA序列和编码的氨基酸序列。将pJB0245的PCR产物克隆进pAH0013骨架中以生成pJB0245，pJB0245在PhoA启动子和STII分泌前导序列的控制下编码6xHIS亲和标签(SEQID NO:1150)、AE292 XTEN、RSR3058释放区段、抗HER2-抗CD3双特异性串联scFv、RSR3058、具有C-标签亲和标签的AE868 XTEN。
为了引入具有等电点改变和除去氨基酸序列中潜在聚集位点的新CD3scFv，用BsaI和BbvCI消化pJB0244以除去HER2和CD3 scFv二者。合成了编码与CD3.33配对的抗EGFRscFv变体的DNA片段，其包括在5‘和3‘末端二者与消化的载体的40bp同源性，以促进GibsonDNA组装。质粒pJB0358-pJB0372组装有6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE292 XTEN、RSR2295和单个的共15种与抗CD3 scFv配对的抗EGFR scFv变体、RSR2295、具有C-标签亲和标签的AE868 XTEN的结构。
通过最初用BtsI消化pJB0368和pJB0373以除去抗CD3 scFv而产生pAH0025和pAH0026。定购DNA片段，其编码抗CD3.32 scFv，抗CD3.32 scFv的侧翼是与消化的骨架同源的40bp同源区域。通过Gibson组装将这些片段引入pJB0368和pJB0373以产生质粒，该质粒编码6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE292 XTEN、RSR2295、抗EGFR-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、具有C-标签亲和标签的AE868 XTEN，其用两种不同的抗EGFR结合结构域EGFR.23和EGFR.2构建，以产生具有表9中提供的DNA序列和编码的氨基酸序列的pAH0025和pAH0026构建体。
为了产生具有缩短的C-端XTEN的双特异性抗原结合多肽构建体，用BtsI和EcoRI消化pJB0244以除去C-端XTEN和C-标签。从pJB0244扩增编码AE584XTEN序列和C-标签的PCR片段。合成编码载体骨架的第二片段，其具有在EcoRI位点后面的40bp同源性，其中34碱基尾巴与第一个片段重叠。使用Gibson组装试剂盒将这两个片段克隆进消化的pJB0244骨架中以产生质粒pJB0354，pJB0354编码6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE292、RSR2295、抗HER2-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、AE584XTEN和C-标签亲和标签。为了生成pJB0355，从pJB0244扩增了编码AE293 XTEN序列和C-标签的PCR片段。使用Gibson组装试剂盒将其与上述第二个片段一起克隆到消化的pJB0244骨架中以产生质粒pJB0355，该质粒编码6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、XTEN292、RSR2295、抗Her2-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、AE300 XTEN和C-标签亲和标签(DNA和氨基酸序列在表9中)。还构建了pJB0354和pJB0355的不可切割变体(分别地，pJB0377和pJB0378)，用序列EAGRSANHTPAGLTGP(SEQ IDNO:88)代替RSR2295。
为了产生具有缩短的N-端和C-端XTEN的蛋白，扩增了三种PCR产物。第一种PCR产物由N-端His标签和从pCW1199扩增的AE144_7A XTEN组成。第二种PCR产物由N-端释放位点2295、抗HER2-抗CD3双特异性串联scFv以及C-端释放位点2295和XTEN序列的286个氨基酸组成。通过Gibson组装将这两种片段克隆到通过PCR扩增产生的骨架中以形成pJB0380，所述骨架包括在其5‘末端上的最后17个XTEN氨基酸(包括与第二PCR产物的30bp同源性和STII信号肽、6xHis标签(SEQ ID NO:1150))和在其3‘末端上的5个XTEN残基(包括与第一PCR产物的5‘末端的39bp同源性)。pJB0380编码6xHIS亲和标签(SEQ ID NO:1150)、AE144_7A XTEN、RSR2295、抗HER2-抗CD3双特异性串联scFv、RSR2295、AE293 XTEN和C-标签亲和标签(DNA和氨基酸序列在表9中)。还构建了pJB0380的不可切割变体(pJB0379)，用序列EAGRSANHTPAGLTGP(SEQ ID NO:88)代替RSR2295。将采用相同方法以任何组合或取向(即，以N-端至C-端取向的AF1-AF2或AF2-AF1)制备构建体，其具有CD3.24、CD3.30、CD3.31、CD3.33 scFv和用于针对本文描述的靶细胞标志物的抗原结合片段的scFv。
表9：构建体的DNA和氨基酸序列
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表10：构建体的氨基酸序列
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实施例2：与亲本CD3 scFv相比评价CD3 scFv序列变体
实验的目的是评价四种CD3序列变体，以确定与CD3.9亲本scFv相比，所述变体是否具有增强的性能。
1.解链温度(Tm)的确定
测量每种scFv变体的解链温度以确定其热稳定性。简而言之，将在200μL的1％BSA-PBST中的均匀量的scFv等分到PCR管中。将管在几种不同的温度(50℃、51.4℃、53.7℃、57.3℃、61.7℃、65.5℃和68℃)温育一小时。将50μL每个样品添加到涂有
Figure BDA0003525090100006412
靶抗原(Creative Biomart)或BSA(参考以解决粘稠度)的ELISA板上。ELISA板的孔预先填充了1％BSA-PBST(50μl/孔)。将板在室温温育1小时。用含有0.05％吐温的水洗涤板三次以除去未结合的scFv。通过添加抗YOL抗体(Thermo Scientific#MA180189)(在1％BSA-PBST(0.05％)中1:500稀释)检测结合的scFv，该抗体检测重链和轻链之间的接头中的猪α-微管蛋白基序。将样品在室温温育1小时。用含有0.05％吐温的水洗涤板三次以除去未结合的scFv。通过添加抗大鼠-HRP抗体(Thermo Scientific#31470)(在1％BSA-PBST(0.05％)中1:7500稀释)(100μl/孔)并在室温温育1小时，检测抗YOL抗体。用含有0.05％吐温的水洗涤板三次以除去未结合的抗体。使用TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物(100μL/孔，在室温6分钟)使板显色。用H2SO4(0.5M,100μL/孔)停止反应。将相对活性测量为在450nm的吸光度读数。绘制了每个温度的吸光度。将解链温度确定为每个样品的EC50，也就是使scFv的结合降低到最大信号的50％时的温度。结果列于表11。
结果：测定结果证实，CD3 scFv 3.23和3.24具有的Tm比亲本CD3.9高5℃，而CD3.25和CD3.26(序列示于表12)scFv具有的Tm与亲本CD3.9相当。
2.与CD3的结合亲和力的确定
使用ForteBio BLItz仪器测量每种scFv的结合亲和力。在PBS(300μL/管)中制备每种scFv的稀释系列，对于CD3.24-26以一比一稀释步骤从1000nM开始到62.5nM，对于CD3.23以一比一稀释步骤从400nM开始到25nM。将生物素化的
Figure BDA0003525090100006421
抗原(CreativeBiomart)在PBS中稀释至30ug/ml的终浓度。将链霉抗生物素生物传感器(ForteBio)在PBS中活化10分钟。为了进行测量，将链霉抗生物素生物传感器应用于BLItz仪器。将含有300μLPBS的管转移到BLItz仪器中30秒。将含有生物素化的
Figure BDA0003525090100006422
(30ug/ml,300μL/管)的管转移到BLItz仪器以测量抗原被传感器的捕获持续120秒。将含有300μL PBS的管转移到BLItz仪器持续30秒以测量基线信号。将含有测试scFv(30ug/ml,300μL/管)的试管转移到BLItz仪器以测量scFv与载有抗原的生物传感器的结合120秒。将含有300μL PBS的管转移到BLItz仪器120秒以测量scFv从载有抗原的生物传感器的解离。对每种scFv稀释重复该方案。使用BLI软件(ForteBio)确定每种抗体的KD。结果显示在表11中，其显示了CD3结合变体的解链温度和结合亲和力，证明变体诸如CD3.23具有降低的对CD3的结合亲和力。
使用ForteBio Octet Red仪器测量二价抗HER2、抗CD3 XTEN化的结合剂AC2275(参见实施例24)对靶标(HER2和CD3)的结合亲和力。在PBSTB缓冲液(10mM磷酸氢二钠、1.8mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、0.5％BSA、0.005％吐温-20)中进行该测定。为了结合人HER2或食蟹猴HERa2，在PBSTB缓冲液(500μL/管)中以一比一稀释步骤从64nM开始到1nM制备每种分析物的稀释系列。为了结合人CD3或食蟹猴CD3，在PBSTB缓冲液(500μL/管)中以一比一稀释步骤从1010nM开始到16nM制备每种分析物的稀释系列。将靶标在PBSTB中稀释至33ug/ml的终浓度。将抗人Fc生物传感器(ForteBio)在PBSTB缓冲液中活化10分钟。为了进行测量，将一组抗人Fc生物传感器放置在传感器架上并转移到Octet Red仪器。将含有200μL PBSTB缓冲液、甘氨酸缓冲液、靶标和分析物的96孔非结合不透明板转移到Octet Red仪器。将生物传感器转移到PBSTB缓冲液中600秒以进行平衡。为了活化，将生物传感器转移到10mM甘氨酸缓冲液,pH 1.5中10秒，并移到PBSTB缓冲液中10秒。重复活化步骤另外2次。将生物传感器转移到目标孔100秒进行加载步骤。将生物传感器转移到PBSTB缓冲液中600秒进行基线测量。将生物传感器转移到分析物的孔中200-400秒以进行结合步骤。将生物传感器转移到分析物的孔中300-400秒以进行解离步骤。对每个靶标重复该方案。使用Octet数据分析软件(ForteBio)确定每种抗体的结合亲和力。结果示于表11A中。
结果：测定结果证实，与亲本CD3.9相比，CD3序列变体都对CD3具有降低的结合亲和力。
表11：Tm和结合亲和力结果
scFv构建体 解链温度(℃) 结合亲和力(nM)
CD3.9 57 75
CD3.23 62 175
CD3.24 62 296
CD3.25 57 215
CD3.26 57 221
表11A：AC2275的结合亲和力结果
靶标 结合亲和力(nM)
人HER2-Fc 4.5
食蟹猴HER2-Fc 1.2
人CD3∈-Fc 111
食蟹猴CD3∈-Fc 170
表12：scFv序列
Figure BDA0003525090100006431
Figure BDA0003525090100006441
结论：已经鉴定了两种新的抗-CD3 scFv，它们具有改进的热稳定性。每种新的scFv相对于CD3.9具有8个至9个突变，主要位于CDR中。与亲本CD3.9相比，这些突变已经降低了scFv对其靶标(CD3)的亲和力，但利用CD3.23的双特异性T细胞衔接物在细胞杀伤测定中以及在体内仍然是有效的。
实施例3：包含双特异性抗原结合片段、释放区段和XTEN的稳定和不稳定嵌合融合 多肽的发酵和纯化
以下实施例描述了两种高度相似的嵌合双特异性抗原结合片段组合物的产生(不同之处仅在于所用的抗CD3抗原结合片段)、观察到的两种构建体之间聚集趋势的不一致、以及抗CD3抗原结合片段的序列对稳定的可溶产物的生产、回收和纯化具有显著影响的发现。
构建体ID pJB0169是具有八个不同结构域的分子。从N-端到C-端，该分子由N-端多组氨酸标签(His6(SEQ ID NO:1150))、非结构化的292氨基酸链(XTEN_AE293)、蛋白酶可切割的释放区段(RS)、抗EGFR scFv(aEGFR.2)、抗CD3 scFv(aCD3.9)、另一个蛋白酶可切割的释放区段(RS)、非结构化的864氨基酸链和四个C-末端残基谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸(C-标签)(XTEN_AE868)组成。
构建体ID pJB0231是类似配置的分子；从N-端到C-端，该分子由N-端多组氨酸标签(His6(SEQ ID NO:1150))、非结构化的292氨基酸链(XTEN_AE292)、蛋白酶可切割的释放区段(RS)、抗EGFR scFv(aEGFR.2)、抗CD3 scFv(aCD3.23)、另一个蛋白酶可切割的释放区段(RS)、非结构化的864氨基酸链和四个C-末端残基谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸(C-标签)(XTEN_AE868)组成。
表达：将两种分子(pJB0169和pJB0231)在专有的大肠杆菌AmE098菌株中表达，并通过N-端分泌前导序列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-(SEQ ID NO:1155))分配到周质中，该前导序列在易位过程中被切割。在37℃用无动物复合培养基使发酵培养物生长，并且在磷酸盐耗尽之前将温度转变到26℃，在磷酸盐耗尽后继续发酵12小时。在收获期间，将发酵全肉汤(fermentation whole broth)离心以沉淀细胞。在收获时，记录总体积和湿细胞重量(WCW；沉淀与上清液的比率)，并收集沉淀的细胞和在-80℃冷冻。
澄清：将每种分子(pJB0169和pJB0231)的冷冻细胞沉淀在pH 4.5的裂解缓冲液(60mM乙酸,350mM NaCl)中3倍重新悬浮，并将细胞通过匀浆化进行裂解。使匀浆物在pH4.5和2℃-8℃絮凝过夜。将絮凝的匀浆物离心，并保留上清液。将上清液用水稀释约3倍，然后用NaCl调节至7±1mS/cm。然后将上清液调至0.1％(m/m)硅藻土并通过叶轮混合。将上清液穿过以0.22μm过滤器结尾的过滤器系列(filter train)过滤。将滤液用磷酸氢二钠调节至pH 7.0。
纯化：每种分子(pJB0169和pJB0231)最初从澄清的裂解物中捕获，并通过蛋白L色谱法(TOYOPEARL AF-rProtein L-650F)进行纯化。随后，使用IMAC色谱法(GE IMACSepharose 6FF)选择N-端His6-标签(SEQ ID NO:1150)，然后使用C-标签亲和色谱法(CaptureSelect C-tagXL Affinity Matrix)选择C-端EPEA-标签(SEQ ID NO:1149)。使用阴离子交换色谱法(BIA CIMmultus QA整体料(monolith))除去HMWC并精制至最终纯度。
分析：通过SEC-HPLC监测过程中间体的聚集状态。SEC-HPLC方法使用Phenomenex3μm SEC-4000 300x7.8mm(P/N 00H-4514-K0)、20分钟等度方法以1mL/min进行，同时监测在220nm的吸光度。pJB0169单体在6.2分钟从分析柱洗脱，且HMWC从4.8-6.0分钟洗脱。将SEC-HPLC质量测量为与4.8-6.4分钟的总曲线下面积相比在6.2分钟的相对曲线下面积。
结果：在每个单元操作之后构建体pJB0169和构建体pJB0231的聚集总结(SEC-HPLC％单体)呈现在表13中。≥95％单体的回收率是最终精制后的质量阈值，作为将分子考虑为稳定或可加工的标准。
表13：分析结果
Figure BDA0003525090100006451
Figure BDA0003525090100006461
结论：将构建体pJB0169通过SEC-HPLC纯化至靶单体质量(≥95％单体)，表明该构建体是稳定的且与回收和纯化操作二者相容。但是，构建体pJB0231无法纯化到靶单体质量，在最终精制后仅达到79％单体，表明构建体是不稳定的或与回收或纯化操作(或其组合)不相容。因为pJB0169和pJB0231之间的唯一区别是抗CD3 scFv序列，所以假设抗CD3.23scFv在由各种成分组成的双特异性分子的背景下是不相容的。
稳定性改进和评估：新的scFv(抗EGFR.23和抗CD3.32)被设计为经由以下提高稳定性：(1)减少表面疏水性，和(2)通过在选定位置置换氨基酸来减少配对的scFv分子(通过短肽接头融合)之间的等电点差异。构建体pAH0025和pAH0026代表对pJB0169的设计迭代，其中pAH0025含有抗CD3.32 scFv变体，且pAH0026含有抗CD3.32 scFv变体和EGFR.23 scFv变体二者。将构建体pAH0025和pAH0026如上进行表达、澄清、纯化和分析；将监测在整个纯化过程中的SEC-HPLC结果并与pJB0169和pJB0231进行对比以评估相对稳定性。新设计配对预计比pJB0231更稳定，并预计会显示出单体含量百分比的伴随改善，如通过SEC-HPLC所测量的，遵循下文制成表格的表14(或其子集)中列出的单元操作。满足≥95％单体的纯度目标的任何构建体都被认为是稳定的或可加工的。
表14：分析结果
Figure BDA0003525090100006462
Figure BDA0003525090100006471
实施例4：抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的结合亲和力。
使用具有huEp-CHO 4-12B(用人EpCAM转染的CHO细胞系)和Jurkat细胞的流式细胞计量术，测量抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽构建体与人EpCAM和人CD3的结合亲和力。
通过与萦光地标记的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽的竞争结合，测量抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽的结合表达EpCAM的和表达CD3的细胞的结合常数。通过将Alexa Fluor 647 C2马来酰亚胺(Thermo Fisher,目录号A20347)缀合至含有半胱氨酸的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽突变体(MMP-9处理的pCW1645)，制备萦光地标记的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽。在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，在4℃对10,000个细胞进行结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore GuavaeasyCyte流式细胞仪上分析。发现萦光地标记的经蛋白酶处理的pCW1645的结合具有1nM(对hEp-CHO 4-12B)和4nM(对CD3+ Jurkat细胞)的表观Kd值。
在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，用1.5nM萦光地标记的经蛋白酶处理的pCW1645在4℃对10,000个hEp-CHO 4-12B细胞进行竞争结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore Guava easyCyte流式细胞仪上分析。萦光地标记的经蛋白酶处理的pCW1645与经切割的双特异性抗原结合多肽(pJB0189 hEp.2-hCD3.9或AC1984 hEp.2-hCD3.23)对hEp-CHO 4-12B细胞的竞争结合产生了对于hEp.2(帕尼单抗)而言0.5nM的表观结合常数。
在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，用10nM萦光地标记的经蛋白酶处理的pCW1645在4℃对10,000个Jurkat细胞进行竞争结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore Guava easyCyte流式细胞仪上分析。萦光地标记的经蛋白酶处理的pCW1645与经切割的双特异性抗原结合多肽(pJB0189 hEp.2-hCD3.9或AC1984 hEp.2-hCD3.23)对Jurkat细胞的竞争结合产生了对于CD3结合而言75nM(对于hCD3.9)和300nM(对于hCD3.23)和对于EpCAM结合而言0.5nM的表观结合常数。
结论：CD3.23对Jurkat细胞上的CD3的结合亲和力是300nM，其比CD3.9的亲和力弱4倍。hEp.2对Jurkat细胞上的EpCAM的结合亲和力是0.5nM。
实施例5：抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的结合亲和力。
使用具有hHER2-CT26(用人HER2转染的CT26细胞系)和Jurkat细胞的流式细胞计量术，测量抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽构建体对人HER2和人CD3的结合亲和力。
通过用萦光地标记的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽的竞争结合，测量抗HER2 x抗CD3双特异性抗原结合多肽的结合表达HER2的和表达CD3的细胞的结合常数。通过将Alexa Fluor 647 C2马来酰亚胺(Thermo Fisher,目录号A20347)缀合至具有hHER2.2-hCD3.23和两个XTEN的含有半胱氨酸的双特异性抗原结合多肽突变体(MMP-9处理的pJB0297(参见表14B))，制备萦光地标记的双特异性抗原结合多肽。通过将Alexa Fluor647 C2马来酰亚胺(Thermo Fisher,目录号A20347)缀合至含有半胱氨酸的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽突变体(MMP-9处理的pJB0297)，制备萦光地标记的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽。在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，在4℃对10,000个细胞进行结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore Guava easyCyte流式细胞仪上分析。预期萦光地标记的经蛋白酶处理的pJB0297的结合具有在低nM浓度(对hHER2-CT26)和约300nM(对CD3+ Jurkat细胞)的表观Kd值。与萦光地标记的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽对hHER2-CT26和CD3+ Jurkat细胞的结合相比，预期萦光地标记的pJB0297与两个XTEN的结合具有弱约10倍至100倍的表观Kd值。
在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，在接近来自前述结合实验的Kd的萦光地标记的经蛋白酶处理的pJB0297浓度，在4℃对10,000个hHER2-CT26细胞进行竞争结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore Guava easyCyte流式细胞仪上分析。预期萦光地标记的经蛋白酶处理的pJB0297与pJB0244双特异性抗原结合多肽竞争结合hHER2-CT26细胞具有与萦光地标记的pJB0297的直接结合常数类似的表观结合常数。
在100μL结合缓冲液(2％FCS,5mM EDTA,HBSS)的总体积中，用约300nM(或接近来自前述结合实验的Kd的浓度)的萦光地标记的经蛋白酶处理的pJB0297在4℃对10,000个Jurkat细胞进行竞争结合实验1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中并立即在Millipore Guava easyCyte流式细胞仪上分析。预期萦光地标记的经蛋白酶处理的pJB0297与pJB0244双特异性抗原结合多肽竞争结合Jurkat细胞具有与萦光地标记的pJB0297的直接结合常数类似的表观结合常数，其预期是在低微摩尔至纳摩尔浓度范围内。
表14B：pJB0297-DNA和氨基酸序列
Figure BDA0003525090100006491
Figure BDA0003525090100006501
Figure BDA0003525090100006511
Figure BDA0003525090100006521
Figure BDA0003525090100006531
Figure BDA0003525090100006541
Figure BDA0003525090100006551
Figure BDA0003525090100006561
实施例6：抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的人/食蟹猴交叉反应性
在基于人细胞的测定系统和食蟹猴细胞的测定系统二者中对比了活化的经切割的(使得掩蔽的XTEN被除去)抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物(pJB0244的蛋白酶处理以产生pJB0244A)的重定向的细胞毒性，以研究食蟹猴是否可以充当用于药理学和毒理学安全性的相关物种。
人和食蟹猴外周血单个核细胞(PBMC)用作效应细胞，且HER2转染的CT26细胞用作靶标。通过从得自当地血库或Bioreclamation IVT的全血或富含淋巴细胞的血沉棕黄层制剂进行ficoll密度梯度离心，从筛选的健康供体分离出人类PBMC。冷冻保存的正常食蟹猴PBMC得自IQ Biosciences。将PBMC在37℃水浴中快速解冻，并用培养基(RPMI+FBS 10％)在1300rpm离心5分钟，并然后除去上清液。将人和食蟹猴PBMC二者以下面所讨论的适当细胞密度在RPMI-1640/FBS 10％中在5％CO2加湿培养箱中在37℃重新悬浮并培养直至使用。通过将全长huHER2或食蟹猴HER2 cDNA转染到小鼠CT26肿瘤细胞中并选择嘌呤霉素抗性克隆，产生稳定表达人(CT26-huHER2)或食蟹猴HER2(CT26-cyHER2)的CT26细胞。在有嘌呤霉素存在下进行克隆的选择和表达的扩增。
将胱天蛋白酶Glo 3/7测定用于确定蛋白酶处理的可切割的抗HER2 x抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物(pJB0244)的细胞裂解活性。胱天蛋白酶3/7测定在针对胱天蛋白酶-3/7活性、萤光素酶活性和细胞裂解进行优化的试剂中利用促发光的胱天蛋白酶-3/7DEVD-氨基萤光素底物(“DEVD”公开的SEQ ID NO:1156)和热稳定的萤光素酶。添加试剂导致细胞裂解，然后是底物的胱天蛋白酶切割。这会释放游离氨基萤光素，其被萤光素酶消耗，产生与胱天蛋白酶-3/7活性/细胞裂解成正比的“发光型”发光信号。
如下分析蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物对CT26-huHER2和CT26-cyHER2转染的细胞的细胞毒性性能：首先在包含RPMI/FBS 10％的测定培养基中，分别将人和食蟹猴PBMC的细胞密度调至2×106个细胞/mL。将CT26-huHER2和CT26-cyHER2转染的细胞以5×105个细胞/mL重新悬浮在包含RPMI/FBS 10％的测定培养基中，以达到5:1的效应物与靶标之比。在96孔圆底板中在每个测定孔中将50μL的PBMC的等分试样与40μL的CT26-huHER2/CT26-cyHER2转染的细胞的等分试样共培养。将未掩蔽的(蛋白酶处理的)抗HER2 x抗CD3组合物样品在测定培养基中稀释至期望的剂量浓度并以10μL加入各自实验孔，使总测定体积达到100μL。将未掩蔽的(无侧接XTEN)抗HER2×抗CD3组合物评价为从1nM开始的8-点、5×系列稀释剂量浓度以得到0.00006nM至1nM的最终剂量范围。用于背景的测定对照具有完整的未处理的抗HER2 x抗CD3组合物(pJB0244)，此时也仅建立了具有CT26转染的细胞的PBMC细胞。然后将含有未掩蔽的蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物和各自测定对照(全部一式两份地测试)的实验孔的板在37℃、5％CO2加湿培养箱中温育过夜。
使用Promega胱天蛋白酶-Glo 3/7测定试剂盒和按照生产商的说明书，测量由于细胞裂解释放进上清液中的胱天蛋白酶3/7的量。在开始测定之前，允许胱天蛋白酶-Glo3/7试剂解冻并平衡至室温。从培养箱中取出含有处理过的细胞的96孔板，并允许其平衡至室温。向酶促板的每个孔中加入100μl胱天蛋白酶-Glo 3/7试剂。然后将板盖住，避光并允许在室温温育30分钟。在期望的温育时段后，使用板振荡器以300-500rpm轻轻混合孔中的内容物30秒。根据照度计生产商的指示，在读板照度计中测量每个样品的发光。
然后如下进行数据分析：然后将未掩蔽的经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3组合物的剂量浓度针对测量的细胞毒性(相对发光单位)作图，并使用GraphPad prism软件用4-参数逻辑回归方程式推导出产生半数最大应答(EC50)的蛋白浓度。
在有人PBMC存在下CT26-huHER2转染的细胞向未掩蔽的经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3组合物的暴露产生了浓度依赖的细胞毒性剂量曲线，EC50为0.5pM。对于CT26-cyHER2转染的细胞和食蟹猴PBMC，经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3组合物产生了浓度依赖的细胞毒性剂量曲线，EC50为1.2pM。
结论：数据指示，经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3(pJB0244A)与食蟹猴HER2(如在CT26-cyHER2转染的细胞中)和食蟹猴CD3(如在食蟹猴PBMC中)具有交叉反应性。与表达食蟹猴HER2的细胞相比，表达人HER2的靶细胞被人PBMC细胞更有效地裂解。与食蟹猴PBMC细胞相比，人PBMC细胞显示出高2.4倍的用经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3组合物进行重定向裂解的效能。总之，未掩蔽的经蛋白酶处理的抗HER2×抗CD3组合物关于人和食蟹猴PBMC细胞的重定向裂解显示剂量依赖性活性，并与来自人和食蟹猴物种二者的HER2抗原反应。
实施例7：抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的细胞毒性测定
通过使用人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应物并且HER2阳性人癌细胞诸如BT-474、SK-Br-3、SK-OV-3、JIMT-1、MDA-MB-231和MCF-7(基于HER2表达水平)作为靶标，评估了未掩蔽的(pJB0244A，通过MMP-9的蛋白水解除去XTEN)、掩蔽的(pJB0244A，具有2个XTEN和2个可通过蛋白水解切割的释放区段)和不可切割的(pJB0245，2个XTEN和释放区段被对蛋白水解不敏感的肽替换)抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的重定向的细胞毒性。通过从得自当地血库或Bioreclamation IVT的全血或富含淋巴细胞的血沉棕黄层制剂进行ficoll密度梯度离心，从筛选的健康供体分离出PBMC。将人PBMC细胞以下面讨论的适当细胞密度在RPMI-1640/FBS 10％中在5％CO2加湿培养箱中在37℃重新悬浮并培养直到使用。从ATCC得到肿瘤细胞系，并按照ATCC的推荐在培养基中生长。将胱天蛋白酶Glo 3/7测定用于确定未掩蔽的抗HER2×抗CD3组合物(pJB0244A)、掩蔽的(具有2个通过释放区段连接至抗原结合片段的XTEN)和不可切割的抗HER2 x抗CD3组合物(分别地，pJB0244和pJB0245)的细胞裂解活性。
胱天蛋白酶3/7测定在针对胱天蛋白酶-3/7活性、萤光素酶活性和细胞裂解进行优化的试剂中利用促发光的胱天蛋白酶-3/7DEVD-氨基萤光素底物(“DEVD”公开的SEQ IDNO:1156)和热稳定的萤光素酶。添加试剂导致细胞裂解，然后是底物的胱天蛋白酶切割。这会释放游离氨基萤光素，其被萤光素酶消耗，产生与胱天蛋白酶-3/7活性成正比的“发光型”发光信号。
如下分析所有人癌细胞系中未掩蔽的、掩蔽的或不可切割的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的细胞毒性性能：首先在包含RPMI和10％FBS的测定培养基中，将人癌细胞(靶标)和人PBMC细胞(效应物)的细胞密度分别调至5×105个细胞/mL和2×106个细胞/mL。为了实现5:1的效应物与靶标之比，在96孔圆底板中在每个测定孔中将50μL人PBMC细胞的等分试样与40μL人癌细胞的等分试样共培养。将未掩蔽的、掩蔽的和不可切割的抗HER2×抗CD3组合物样品在测定培养基中稀释至期望的剂量浓度，并以10μL加入各自实验孔中，使总测定体积达到100μL。将未掩蔽的aHER2×抗CD3组合物(例如pJB0244A)评价为从1nM开始的12-点、5x系列稀释剂量浓度，以获得0.0000001nM至1nM的最终剂量范围。将掩蔽的(例如pJB0244)和不可切割的(pJB0245)双特异性抗原结合多肽组合物分析为从200nM开始的12点、5×系列稀释剂量浓度，得出0.00002nM至200nM的最终剂量范围。没有抗HER2×抗CD3组合物、只有靶细胞和效应细胞的背景测定对照也被包括在测定中。然后将含有未掩蔽的、掩蔽的和不可切割的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物和各自测定对照(都一式两份地测试)的实验孔的板在37℃、5％CO2加湿培养箱中温育过夜。
使用Promega胱天冬蛋白酶-Glo 3/7测定试剂盒，按照生产商的说明书，测量由细胞裂解引起的释放到上清液中的胱天蛋白酶3/7的量。在开始测定之前，允许胱天蛋白酶-Glo 3/7试剂解冻并平衡至室温。从培养箱中取出含有处理过的细胞的96孔板，并允许平衡至室温，然后将100μl胱天蛋白酶-Glo 3/7试剂加入板中的每个孔中。然后将板盖住，避光并允许在室温温育30分钟。温育时段后，使用板振荡器以300-500rpm轻轻混合孔中的内容物30秒。根据照度计生产商的指示，在读板照度计中测量每个样品的发光。
然后如下进行数据分析：然后将未掩蔽的、掩蔽的和不可切割的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的剂量浓度针对细胞毒性(以相对发光单位测量)作图，并使用GraphPad prism软件用4-参数逻辑回归方程式推导出产生半数最大应答(EC50)的蛋白浓度。
如在表15中所示，当在HER2高BT-474、SK-Br-3和SK-OV-3细胞系中评价时，未掩蔽的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合组合物(pJB0244A)的EC50活性是在1pM至4pM的范围内。未掩蔽的组合物的活性比掩蔽的pJB0244组合物高至少14,000倍，后者具有在14,140pM至66,020pM的范围内的EC50活性。
当使用HER2中等表达JIMT-1细胞系进行评价时，与掩蔽的pJB0244和不可切割的pJB0245的>200,000pM的EC50活性相比，未掩蔽的pJB0244A的EC50活性为52pM。
当在HER2低表达细胞系诸如MDA-MB-231和MCF-7中进行评价时，未掩蔽的pJB0244A的EC50活性分别为124pM和139pM。观察到掩蔽的pJB0244和不可切割的pJB0245具有>200,000pM的EC50活性。
结论：结果表明，未掩蔽的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合组合物的活性是HER2-受体密度依赖性的，在HER2高表达和HER2中等表达细胞系中具有强大的杀伤强度并且在HER2低表达细胞系中具有较低的杀伤程度。与未掩蔽的双特异性组合物的活性趋势一致，带有两个XTEN的掩蔽的双特异性的抗HER2 x抗CD3 ProTIA(pJB0244)提供细胞毒性活性的强大阻断，具有至少大于14,000倍的EC50活性降低。
表15：在人癌细胞系中的细胞毒性确定
Figure BDA0003525090100006601
ND：低于检测限度
实施例8：抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物在正常人乳腺、皮肤和肺 细胞系中的细胞毒性。
还在正常人原代心肌细胞和正常乳腺、正常皮肤和正常肺细胞系中评价了未掩蔽的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0244A)。在本实验中，以与上述相同的方式将效应物PBMC以5:1的比例独立地与靶正常人乳腺、皮肤或肺细胞混合。HER2高BT-474细胞系用作阳性测定对照。将未掩蔽的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽测试为从1nM开始的8点、5×系列稀释剂量曲线浓度，以获得0.000064nM至1nM的最终剂量范围。如上所述进行胱天蛋白酶-Glo 3/7测定。如预期的，未掩蔽的pJB0244A在HER2高BT-474细胞系中产生强大的细胞毒性活性，EC50为1.5pM。已知表达一定水平的HER2的人心肌细胞产生26pM的EC50。相比之下，未掩蔽的抗HER2×抗CD3双特异性抗原结合多肽使用测试浓度在正常乳腺、皮肤和肺细胞系中未引起可检测到的细胞毒性(表16)。
表16：在细胞系中的细胞毒性确定
Figure BDA0003525090100006611
实施例9：抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的体外胱天蛋白酶3/7测 定
在凋亡细胞的胱天蛋白酶3/7活性的基于体外细胞的测定中，评估了未掩蔽的(通过蛋白水解除去XTEN)、掩蔽的(具有可通过蛋白水解切割的2个XTEN和2个释放区段)、和不可切割的(2个XTEN和释放区段被对蛋白水解不敏感的肽替换)抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的重定向的细胞毒性。类似于上文实施例中描述的胱天蛋白酶细胞毒性测定，将PBMC与EGFR阳性肿瘤靶细胞以10个效应细胞对1个靶细胞的比例混合。使用10-点、5×系列稀释的剂量浓度测试所有抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物。在0.000012nM至10nM的最终剂量范围评价未掩蔽的抗EGFR x抗CD3组合物。在0.00064nM至250nM的最终剂量范围分析掩蔽的和不可切割的双特异性抗原结合多肽组合物。适当的EGFR阳性人肿瘤靶细胞系包括FaDu(头和颈的鳞状细胞癌，SCCHN)、SCC-9(SCCHN)、HCT-116(带有KRAS突变的结肠直肠)、NCI-H1573(带有KRAS突变的结肠直肠)、HT-29(带有BRAF突变的结肠直肠)和NCI-H1975(EGFR T790M突变)。选择细胞系以代表具有野生型EGFR和T790M、KRAS和BRAF突变的结肠直肠和SCCHN肿瘤。
在细胞裂解后，通过胱天蛋白酶3/7的发光胱天蛋白酶3/7底物切割以产生“发光型”发光信号(Promega胱天蛋白酶-Glo 3/7目录号G8091)的量测量培养物上清液中释放的胱天蛋白酶3/7。发光的量与胱天蛋白酶活性的量成正比。
结果：如在表17中所示，当在EGFR KRAS突变体HCT-116细胞系中评价时，掩蔽的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽的EC50活性为3,408pM。不可切割变体活性的EC50>100,000pM，并且未掩蔽的组合物的未掩蔽的EC50活性为0.8pM。
当在EGFR BRAF突变体HT-29细胞系中评价时，掩蔽的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽的EC50活性为10,930pM。不可切割的和未掩蔽的组合物的EC50活性分别为>100,000pM和0.8pM。
在所测试的两种EGFR突变体细胞系中，掩蔽的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽的活性比未掩蔽的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽低约4,000至14,000倍。如预期的，不可切割变体的活性是评价的3种形式中活性最低的，具有大于100,000pM的EC50。
结论：结果证实，抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽对EGFR KRAS-和BRAF-突变体细胞系具有细胞毒性活性。带有两个XTEN的掩蔽的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽提供了细胞毒性活性的强阻断，与未掩蔽形式相比，细胞毒性低4000至14,000倍。
表17：未掩蔽的、掩蔽的/可切割的和不可切割的抗EGFR×抗CD3变体在HT-29和 HCT-116人细胞系中的体外细胞毒性活性
Figure BDA0003525090100006621
实施例10：含有RSR-1517的XTEN AC1611的酶活化、储存和消化。
本实施例证实，在试管中，含有RSR-1517的XTEN构建体AC1611可以被各种肿瘤相关的蛋白酶切割，包括重组人uPA、matriptase、天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9和MMP-14。AC1611的氨基酸序列列于下表18中。
1.酶活化
使用的所有酶均从R&D Systems获得。重组人u-纤溶酶原激活物(uPA)和重组人matriptase作为活化的酶提供并储存在-80℃直到使用。重组小鼠MMP-2、重组人MMP-7和重组小鼠MMP-9作为酶原提供，并需要用4-氨基醋酸苯汞(APMA)活化。首先将APMA溶解在0.1MNaOH中至10mM的终浓度，然后使用0.1M HCl将pH重新调整为中性。在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中将APMA储液进一步稀释至2.5mM。为了活化MMP原，将在50mMTris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中的1mM APMA和100μg/mL MMP原在37℃温育1小时(MMP-2,MMP-7)或24小时(MMP-9)。为了活化MMP-14，将0.86μg/mL重组人弗林蛋白酶和40μg/mL MMP原-14在50mM Tris pH 9、1mM CaCl2中在37℃温育1.5小时。为了活化天冬酰胺肽链内切酶，将100μg/mL天冬酰胺肽链内切酶原在50mM醋酸钠pH 4、100mM NaCl中在37℃温育2小时。将100％超纯甘油添加到所有活化的酶(包括uPA和MTSP1)中至50％甘油的终浓度，然后在-20℃储存数周。
2.酶消化
测试了一组酶以确定每种酶对AC1611的切割效率。按照以下酶与底物摩尔比和条件将6μM底物与每种酶一起温育：uPA(1:25在50mM Tris pH 8.5中)、matriptase(1:25在50mM Tris pH 9、50mM NaCl中)、天冬酰胺肽链内切酶(1:20在50mM MES pH 5、250mM NaCl中)、MMP-2(1:1200在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中)、MMP-7(1:1200在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中)、MMP-9(1:2000在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中)和MMP-14(1:30在50mM Tris pH 8.5、3mM CaCl2、1μM ZnCl2中)在20μL反应中。将反应在37℃温育两小时，然后如下停止：在MMP反应的情况下添加EDTA至20mM，在uPA和matriptase反应的情况下在85℃加热15分钟，以及在天冬酰胺肽链内切酶的情况下将pH调至8.5。
3.切割效率的分析。
通过在SDS-PAGE上加载2μL未消化的底物(在12μM)和4μL消化的(在6μM)反应混合物并用Stains-All(Sigma Aldrich)染色，对样品进行分析以确定切割产物的百分比。使用ImageJ软件分析相应的条带强度并确定切割百分比。在由各种蛋白酶在释放区段处切割后，底物含有RSR-1517的XTEN将产生两个片段，且较大的片段用于％切割计算(反应产物的量除以进入反应的总初始底物)，而较小产物的条带强度因为太低而无法量化。对于uPA、matriptase、天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14，在当前标准实验条件下AC1611的切割百分比分别为31％、14％、16％、40％、51％、38％、30％。
结论：我们选择了一个特定的释放区段RSR-1517(氨基酸序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ ID NO:42))并确定了它的切割谱，如所有七种酶在当前标准实验条件下的切割百分比所定义的。该释放区段具有所有酶的中等切割效率，使得在筛选过程中，较快或较慢变体的切割将落在测定窗口内以实现准确排序。
表18：具有释放区段RSR-1517的AC1611的氨基酸序列
Figure BDA0003525090100006641
实施例11：使用RSR-1517(AC1611)作为对照筛选释放区段
这里我们选择uPA作为实例来展示如何进行释放区段筛选。对所有七种肿瘤相关蛋白酶应用相同的程序来定义每种底物的相对切割谱，这是七个数字的阵列，以描述与对照底物RSR-1517相比可以被每种酶良好地切割的程度。表19的所有多肽都具有AC1611的氨基酸序列，但指定构建体的释放区段肽被替换为AC1611的EAGRSANHEPLGLVAT序列(SEQ IDNO:42)；例如，BSRS-4具有LAGRSDNHSPLGLAGS(SEQ ID NO:1157)的释放区段序列，但在其它方面具有与AC1611的完全序列同一性。
1.酶消化
在单独的Eppendorf管中将所有含有释放区段的XTEN变体和对照AC1611在50mMTris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中稀释至12μM。制备uPA的主混合物，使得在与每种底物1:1混合后，总反应体积为20μL，初始底物浓度为6μM，且酶与底物的比例在1:20至1:3000之间变化(取决于酶)，以便在终点处可以看到反应产物和未切割的底物。所有反应均在37℃温育2小时，然后通过添加EDTA至20mM终浓度来停止。通过非还原SDS-PAGE和随后的Stains-All分析所有产物。对于每块凝胶，AC1611消化产物始终被包括为染色对照，以使不同凝胶之间的差异染色归一化。
2.相对切割效率计算
单个底物的切割百分比通过ImageJ软件进行分析并如前所述计算。对于每个变体，如下计算相对切割效率：
Figure BDA0003525090100006651
在上述实验条件下，相对切割效率中的+1值指示，与AC1611对照相比，底物产生了多达两倍的产物，而相对切割效率中的-1值指示，与AC1611对照相比，底物仅产生了多达50％的产物。
在本实验中，AC1611的切割百分比(％切割)为20％，如通过ImageJ量化的。在本实验中筛选的底物显示出21％、39％、1％、58％、24％、6％、15％、1％、1％和25％的切割，其中1％基本上代表低于检测限并且不指示准确值。基于上述公式计算的相对切割效率分别为0.08、0.95、-4.34、1.51、0.26、-1.76、-0.47、-4.34、-4.34和0.32。
结论：与同一实验中的AC1611相比，我们确定了10种释放区段变体在经受uPA时的相对切割效率。按照类似的程序，我们使用RSR1517(AC1611)作为参考对照，确定了134种释放区段的切割谱，其结果列于表19中。这些释放区段涵盖了单个酶以及组合的切割效率的广泛范围。例如，RSR-1478对于MMP-14具有-2.00值，这意味着当用MMP-14消化时，与参考对照RSR-1517相比，该底物仅产生25％的产物。某些释放区段，诸如RSR-1951，看起来是测试的所有七种蛋白酶的更好底物。如果全身毒性是低的/可控的，而效力(部分取决于切割发生以使双特异性抗原结合多肽成为活化形式的速度)需要改进，则这些更快的释放区段可能被证明在临床中是有用的。
表19：当使用RSR-1517作为对照经受七种人蛋白酶时释放区段的切割谱
Figure BDA0003525090100006661
Figure BDA0003525090100006671
Figure BDA0003525090100006681
ND＝未确定
实施例12：使用RSR-1517作为内部对照的竞争性消化
开发这种竞争性测定以最大限度地减少同一实验中不同小瓶中的反应之间酶浓度或反应条件的任何变异性。为了解析(resolve)同一实施例中的对照底物和感兴趣的RS二者，构建了新的对照质粒。
1.含有RSR-1517的内部对照的分子克隆
两个内部对照质粒AC1830(HD2-V5-AE144-RSR-1517-XTEN288)和AC1840(HD2-V5-AE144-RSR-1517-XTEN432)以与实施例10中描述的AC1611类似的方式构建，唯一差别是C-端XTEN的长度。
2.酶消化
通过在测定缓冲液中混合和稀释纯化的AC1830或AC1840和感兴趣的RS，来制备2×底物溶液，使得单个底物的最终浓度为6μM。制备酶主混合物，使得与2×底物溶液1:1混合后，总反应体积为20μL，每种组分的终底物浓度为3μM，且酶与底物比如在测定开发中所选择。将反应在37℃温育2小时，然后按上述程序停止。
3.相对切割效率计算
通过非还原4-12％SDS-PAGE分析反应混合物。由于内部对照和感兴趣的底物具有不同的分子量，一旦切割，四个条带应在同一样品泳道中可见。可以计算两者的切割百分比，并且可以从实施例10中的相同公式推导出相对切割效率：
Figure BDA0003525090100006691
唯一的差别是，现在两个值都是从同一个小瓶中的反应混合物计算出，而以前是从共有相同酶混合物的两个反应计算出。
结论：与实施例10中描述的测定相比，我们预计这种使用RSR-1517作为内部对照的竞争性消化测定具有较小的测定间变异性。我们预计采用这种方法进行未来的释放区段筛选。
实施例11A：在建立的乳腺肿瘤模型中带有一个或两个XTEN的抗EpCAM x抗CD3双 特异性抗原结合多肽的抗肿瘤性能
在建立的乳腺肿瘤模型中，在第0天将BT-474肿瘤细胞在基质胶存在下独立地皮下植入NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)或NSG(NOD.Cg-Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠。(NOG或NSG小鼠是携带IL-2Rγ突变的NOD/SCID小鼠，所述突变导致小鼠缺乏T、B和NK细胞、巨噬细胞功能失调、树突细胞功能失调和补体活性降低)。当BT-474肿瘤体积达到100-200mm3时，则静脉内引入人PBMC。用媒介物、未经蛋白酶处理的带有一种XTEN聚合物的抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽(例如pJB0189)和带有两种XTEN聚合物的抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽(例如pJB0176)开始静脉内处理，每周三剂，持续四周。组群1是媒介物治疗组，组群2是0.5mg/kg的pJB0189治疗组，且组群3是0.5mg/kg的pJB0176治疗组。
用卡尺在两个垂直维度上每周测量肿瘤两次，预计45天，并通过应用(宽度2 X长度)/2公式计算肿瘤体积。还密切监测体重、一般外观和临床观察诸如癫痫发作、震颤、嗜睡、过度反应、立毛、费力/快速呼吸、肿瘤的着色和溃疡以及死亡，作为治疗相关毒性的量度。通过应用以下公式计算每个治疗组的百分比肿瘤生长抑制指数(％TGI)：((组2媒介物对照的平均肿瘤体积-双特异性抗原结合多肽治疗的平均肿瘤体积)/组2媒介物对照的平均肿瘤体积)x100。％TGI≥60％的治疗组被认为具有治疗活性。
结果：在中间第27天，媒介物治疗的组群1小鼠没有抑制肿瘤进展，具有的肿瘤负荷为219±30mm3，证明单独的人效应细胞本身不能引起抗肿瘤作用。如预期的，在人效应细胞存在下用0.5mg/kg的pJB0189抗EpCAM x抗CD3双特异性抗原结合多肽(组群2)的处理表现出明显的抗肿瘤消退，％TGI为68％。重要的是，在有人效应细胞存在下，用0.5mg/kg的pJB0176抗EpCAM×抗CD3双特异性抗原结合多肽(组群3)的处理也引发了强大的抗肿瘤应答，产生了76％的％TGI。
结论：中间数据提示，在体内BT-474肿瘤环境中，0.5mg/kg的未经蛋白酶处理的带有两个XTEN的抗EpCAM x抗CD3双特异性抗原结合多肽(即，pJB0176)与未经蛋白酶处理的带有一个XTEN聚合物的抗EpCAM x抗CD3双特异性抗原结合多肽(即，pJB0189)一样有效。值得注意的是，在所有双特异性抗原结合多肽治疗组和媒介物对照中均未观察到显著的体重减轻，表明所有治疗均被良好耐受。
实施例13：通过流式细胞计量术评估的细胞结合。
还通过基于流式细胞计量术的测定，利用CD3阳性人Jurkat细胞和EGFR阳性人细胞，评价了抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的双特异性结合，所述EGFR阳性人细胞选自HT-29、HCT-116、NCI-H1573、NCI-H1975、FaDu和SCC-9或表达EGFR的稳定CHO细胞系。将CD3+和EGFR+细胞与一定剂量范围的未处理的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(PJB0169，包含2个XTEN和2个RS)、蛋白酶处理的PJB0169和抗CD3 scFv和抗EGFR scFv阳性对照一起在结合缓冲液中在4℃温育30min，所述结合缓冲液含有含2％BSA和5mM EDTA的HBSS。用结合缓冲液洗涤以除去未结合的测试物质后，将细胞与FITC-缀合的抗His标签抗体(Abcam目录号ab1206)在4℃温育30分钟。通过用结合缓冲液洗涤除去未结合的FITC-缀合抗体，并将细胞重新悬浮在结合缓冲液中以便在FACS Calibur流式细胞仪(BectonDickerson)或等效仪器上采集。将所有流式细胞计量术数据使用FlowJo软件(FlowJo LLC)或等效软件进行分析。
虽然预计抗EGFR scFv不会与Jurkat细胞结合，但抗CD3 scFv、未处理的PJB0169和蛋白酶处理的PJB0169都预计会与Jurkat细胞结合，如与单独的FITC-缀合的抗His标签抗体一起温育的Jurkat细胞相比时萦光强度的增加所表明的。类似地，抗EGFR scFv、蛋白酶处理的和未处理的PJB0169均预期与EGFR阳性细胞结合，而抗CD3 scFv预期不会与EGFR阳性细胞结合。预见到，这些数据将反映抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的识别CD3和EGFR抗原二者的双特异性结合能力，所述CD3和EGFR抗原分别在Jurkat和表达EGFR的人细胞系组上表达。此外，由于XTEN聚合物对表面结合提供了一些干扰，预计未处理的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽对CD3和EGFR抗原二者的结合亲和力低于蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽。
实施例14：通过流式细胞计量术评估的细胞裂解。
利用人PBMC和EGFR阳性细胞系通过流式细胞计量术评价了抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的细胞裂解。用萦光膜染料CellVue Maroon染料(Affymetrix/eBioscience,目录号88-0870-16)根据生产商的说明书标记EGFR阳性的HCT-116靶细胞(或选自HT-29、NCI-H1573、NCI-H1975、FaDu和SCC-9或表达EGFR的稳定CHO细胞系的靶细胞)。可替换地，还可以使用PKH26(Sigma,目录号MINI26和PKH26GL)。简而言之，将HCT-116细胞用PBS洗涤两次，然后将2×106个细胞重新悬浮在与CellVue Maroon标记试剂盒一起提供的0.1mL稀释剂C中。在单独的管中，将2μL CellVue Maroon染料与0.5mL稀释剂C混合，并且然后将0.1mL添加到HCT-116细胞悬浮液中。将细胞悬浮液和CellVue Maroon染料混合并在室温温育2分钟。然后通过添加0.2mL胎牛血清(FCS)猝灭标记反应。将标记的细胞用完全细胞培养基(含有10％FCS的RPMI-1640)洗涤两次，并通过锥虫蓝排除确定活细胞的总数。为了在每孔200μL的总体积中实现10:1的效应物与靶标之比，在没有或有指示剂量范围浓度的蛋白酶处理的和未处理的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(PJB0169，包含2个XTEN和2个RS)样品存在下，在96孔圆底板中，每孔将1×105个PBMC与1×104个经CellVue Maroon标记的HCT-116细胞共培养。24小时后，用Accutase(Innovative Cell Technologies，目录号AT104)收获细胞并用2％FCS/PBS洗涤。在Guava easyCyte流式细胞仪(Millipore)上采集细胞之前，将细胞重新悬浮在100μL补充了2.5微克/mL 7-AAD(Affymetrix/eBioscience,目录号00-6993-50)的2％FCS/PBS中，以区分活细胞(7-AAD阴性)和死细胞(7-AAD阳性)。用guavaSoft软件(Millipore)分析FACS数据；并通过将7-AAD阳性/CellVueMaroon阳性细胞的数目除以CellVue Maroon阳性细胞的总数计算出死靶细胞的百分比。
使用GraphPad Prism通过4参数-逻辑回归方程式分析细胞毒性百分比相对于双特异性抗原结合多肽浓度的剂量响应杀伤曲线；并从而确定诱导半数最大细胞细胞毒性百分比的双特异性抗原结合多肽的浓度。
预计使用流式细胞计量术的细胞毒性结果与用其它细胞毒性测定(包括LDH和胱天蛋白酶)获得的结果一致。在没有PBMC存在下HCT-116细胞向蛋白酶切割的和未切割的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的暴露预计不会产生影响。类似地，在没有靶细胞的双特异性抗原结合多肽存在下，预计PBMC不会被活化。预期这些结果表明，双特异性抗原结合多肽组合物需要簇集在靶细胞的表面上才能刺激PBMC的细胞毒性活性。在有PBMC和靶细胞存在下，由于用蛋白酶预处理或未处理的双特异性抗原结合多肽，将存在浓度依赖性的细胞毒性效应。此外，预期结果表明，与蛋白酶切割的双特异性抗原结合多肽组合物相比，在有PBMC存在下HCT-116细胞向未处理的双特异性抗原结合多肽(无蛋白酶)的暴露将显示降低的细胞毒性。
实施例15：抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的T细胞活化标志物测 定。
为了测量抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽诱导的活化标志物(CD69和CD25)，在有抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽(PJB0169，包含2个XTEN和2个RS)存在下在96孔圆底板中，在每个测定孔中将1×105个PBMC或纯化的CD3+细胞在含有10％FCS的RPMI-1640中与1×104个HCT-116或HT-29细胞共培养(即，效应物与靶标之比为10:1)，总最终体积为200μL。在37℃、5％CO2加湿培养箱中温育20小时后，将细胞用PECy5-缀合的抗CD4、APC-缀合的抗CD8、PE-缀合的抗CD25和FITC-缀合的抗CD69(所有抗体来自BioLegend)在FACS缓冲液(1％BSA/PBS)中在4℃染色，用FACS缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮在FACS缓冲液中以在Guava easyCyte流式细胞仪(Millipore)上采集。
预计三种双特异性抗原结合多肽分子的T细胞活化标志物表达趋势与通过细胞毒性测定(包括LDH和胱天蛋白酶)所观察到的趋势相似。预计未处理的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0169)对PBMC或CD3+细胞的CD8和CD4群体上的CD69的活化活性低于蛋白酶处理的pJB0169双特异性抗原结合多肽；并且预计不可切割的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0172)的活性低于未处理的pJB0169。
实施例16：使用受刺激的正常健康人PBMC和完整的和蛋白酶处理的抗EGFR×抗 CD3双特异性抗原结合多肽对人Th1/Th2细胞因子的细胞测量珠阵列分析
作为完整的对比切割的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0169，包含2个XTEN和2个RS)在基于细胞的体外测定中刺激T细胞相关细胞因子的释放的能力的安全性评估，使用细胞测量珠阵列(CBA)在上清液上分析了一组细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ，所述上清液来自用蛋白酶处理的和未处理的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽样品刺激过的培养的人PBMC。将抗人CD3抗体OKT3用作阳性对照，且未处理的孔充当阴性对照。
简而言之，通过允许孔在生物安全通风柜中蒸发过夜，将OKT3(0、10nM、100nM和1000nM)和蛋白酶处理的和未处理的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽(10nM、100nM、1000nM和2000nM的pJB0169)干燥包被到96孔平底板上。然后将孔用PBS轻轻洗涤一次，并将在200μL中的1×106个PBMC添加到每个孔中。然后将板在37℃、5％CO2温育24小时，然后从每个孔收集组织培养物上清液，并使用经过验证的商业CBA试剂盒(BD CBA人Th1/Th2细胞因子试剂盒,目录号551809)按照生产商的说明书通过流式细胞计量术分析释放的细胞因子。
预计OKT3会诱导评价的所有细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)的强烈分泌，但未处理的孔不会，从而证实CBA细胞因子测定的性能。用蛋白酶处理的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽的刺激预计会触发显著的细胞因子表达，尤其是对于测试的所有细胞因子，在高于100nM的浓度时。相比之下，当完整的未切割的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽分子是10nM至2000nM的浓度范围的刺激物时，预见到IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的基线水平。这些数据支持，与其中EGFR x抗CD3部分从组合物释放的经蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽相比，完整的双特异性抗原结合多肽组合物的XTEN聚合物提供了相当大的屏蔽效应并阻碍了PBMC刺激的细胞因子应答。
实施例17：在有纯化的CD3阳性T细胞存在下抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多 肽组合物的细胞毒性测定。
为了证实双特异性抗原结合多肽分子的细胞毒性活性由CD3阳性T细胞介导，在有纯化的人CD3阳性T细胞存在下，在EGFR+人细胞系(例如HCT-116或HT-29)中评价了没有释放区段的不可切割的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0172，包含2个XTEN)和蛋白酶处理的和未处理的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0169，包含2个XTEN和2个RS)。纯化的人CD3阳性T细胞购自BioreclamationIV，其中使用MagCellect人CD3+ T细胞分离试剂盒通过阴性选择从健康供体的全血中分离它们。在本实验中，将纯化的人CD3阳性T细胞与EGFR+细胞系以约10:1的比例混合，并且所有三种双特异性抗原结合多肽分子均在如上所述的LDH测定中作为12-点、5×系列稀释剂量曲线进行测试。预计用CD3+细胞分析的三种双特异性抗原结合多肽分子的活性趋势与用PBMC对相同细胞系的谱相似。预计未经处理的pJB0169的活性低于蛋白酶处理的pJB0169；且预计不可切割的pJB0172的活性低于未经处理的pJB0169。这样的结果将证实，双特异性抗原结合多肽分子的细胞毒性活性确实由CD3阳性T细胞介导。被包含在可切割的抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽分子中的释放区段对蛋白酶的敏感性可能因细胞系而异，所述蛋白酶假定从测定混合物中的肿瘤细胞和/或活化的CD3阳性T细胞释放。
实施例18：抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物的T细胞活化标志物和细 胞因子释放测定。
为了测量抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽诱导的细胞因子表达，在有抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(pJB0169，包含2个XTEN和2个RS)存在下在96-孔圆底板中，在每个测定孔中将纯化的CD3+细胞与HCT-116细胞共培养(即，效应物与靶标之比为约10:1)，总终体积为200μL。在37℃、5％CO2加湿培养箱中温育20小时后，收获细胞上清液用于细胞因子测量。该测定也可以用选自HT-29、NCI-H1573、NCI-H1975、FaDu和SCC-9的其它靶细胞以及PBMC代替纯化的CD3+细胞进行。
使用人Th1/Th2细胞因子细胞测量珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences目录号550749)按照生产商的说明书，量化分泌到细胞培养上清液中的白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ的细胞因子分析。在没有双特异性抗原结合多肽存在下，预期纯化的CD3+细胞不会分泌高于背景的细胞因子。在有EGFR阳性靶细胞和纯化的CD3+细胞存在下，预计pJB0169会活化T细胞并分泌一系列T细胞细胞因子，其中含有高比例的Th1细胞因子诸如IFN-γ和TNF-α。与完整的pJB0169相比，较低浓度的蛋白酶处理的pJB0169预计会活化T细胞并分泌T细胞细胞因子，从而支持XTEN聚合物在双特异性抗原结合多肽中的屏蔽作用。
实施例19：抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽组合物在早期治疗HT-29体内模 型中的抗肿瘤性能。
进行了体内效力实验以在免疫缺陷的NOD/SCID小鼠中评价基于pJB0169构建体的EGFR-CD3双特异性抗原结合多肽组合物，所述免疫缺陷的NOD/SCID小鼠的特征在于T和B细胞的缺乏以及受损的天然杀伤细胞。将小鼠维持在无菌的标准化的环境条件下，并根据美国机构动物护理协会评价和使用委员会(US Institutional Animal Care Associationfor Assessment and Use Committee)(IACUC实验室动物护理认证(AAALAC))指南进行实验。使用EGFR BRAF突变体人HT-29腺癌异种移植物模型评价蛋白酶处理的和蛋白酶未处理的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(例如pJB0169)的效力。简而言之，在第0天，将6只NOD/SCID小鼠皮下植入右胁腹，每只小鼠3×106个HT-29细胞(组群1)。在同一天，给每组各由6只NOD/SCID小鼠组成的组群2至7在右胁腹皮下注射每只小鼠6×106个的人PBMC和3x106个HT-29细胞的混合物。在HT-29或HT-29/PBMC混合物接种后四小时，开始治疗。给组群1和2静脉内地注射媒介物(PBS+0.05％吐温80)，给组群3和4分别注射0.05mg/kg完整的抗EGFR×抗CD3双特异性构建体和0.5mg/kg用蛋白酶处理过以从多肽除去XTEN的抗EGFR x抗-CD3双特异性构建体，给组群5和6注射0.143mg/kg和1.43mg/kg完整的抗EGFR x抗CD3双特异性构建体，并给组群7注射50mg/kg西妥昔单抗作为阳性对照。组群1至6进一步接受从第1天至第7天每天施用的七个额外剂量(总共8剂)。给组群7每周施用两次西妥昔单抗，持续4周，共施用8剂。
用卡尺在两个垂直维度上每周两次测量小鼠的肿瘤，预计33天，并通过应用(宽度2×长度)/2公式计算肿瘤体积。还密切监测体重、一般外观和临床观察诸如癫痫发作、震颤、嗜睡、过度反应、立毛、费力/快速呼吸、肿瘤的着色和溃疡以及死亡，作为治疗相关毒性的量度。通过应用以下公式计算每个治疗组的百分比肿瘤生长抑制指数(％TGI)：((组群2媒介物对照的平均肿瘤体积-试验物治疗的平均肿瘤体积)/组群2媒介物对照的平均肿瘤体积)x100。％TGI≥60％的治疗结果被认为具有治疗活性。
结果：在第33天，媒介物治疗的携带肿瘤细胞的组群1小鼠仅具有250±113mm3的平均肿瘤负荷。在有人效应细胞存在下用媒介物治疗的组群2小鼠没有抑制肿瘤进展，具有238±228mm3的平均肿瘤负荷，表明单独的人效应细胞本身不能引起抗肿瘤作用。在有人效应细胞存在下用0.05mg/kg和0.5mg/kg的蛋白酶处理的抗EGFR×抗CD3构建体治疗(分别是组群3和4)表现出明显的抗肿瘤消退，两个治疗组的％TGI为99％。重要的是，在有人效应细胞存在下，用0.143mg/kg和1.43mg/kg的抗EGRF x抗CD3双特异性抗原结合组合物治疗(分别是组群5和6)也以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长，0.143mg/kg剂量组的％TGI为70％，并且1.43mg/kg组群为96％。数据提示，在0.143mg/kg和1.43mg/kg剂量，足够量的抗EGFR×抗CD3构建体被体内肿瘤环境中的蛋白酶有效切割成更有活性的、未XTEN化的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合片段以产生观察到的效力。值得注意的是，用50mg/kg西妥昔单抗治疗的组群7没有诱导肿瘤消退，％TGI为-20％。
结论：结果表明，抗EGFR×抗CD3双特异性构建体可以在体内有效切割成活性形式，并且在EGFR BRAF突变体HT-29肿瘤环境中可有效抑制肿瘤进展。此外，在实验条件下，抗EGFR×抗CD3双特异性构建体在抗肿瘤活性方面优于西妥昔单抗对照。值得注意的是，在所有试验物治疗组和媒介物中没有观察到显著的体重减轻。
实施例20：蛋白酶活化的带有一个或两个XTEN的抗Her2 x抗CD3双特异性抗原结 合多肽在建立的卵巢肿瘤模型中的抗肿瘤性能
在建立的鼠卵巢肿瘤模型中，在第0天将5×106个SK-OV-3肿瘤细胞在基质胶存在下独立地皮下植入五十八只NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)小鼠。(NOG小鼠是携带IL-2Rγ突变的NOD/SCID小鼠，所述突变导致小鼠缺乏T、B和NK细胞、巨噬细胞功能失调、树突细胞功能失调和补体活性降低)。当SK-OV-3肿瘤体积达到大约60mm3时，给六只NOG小鼠静脉内地施用100μL PBS并指定为组群1。给其余未分配的52只小鼠静脉内地注射5X 106个的人PBMC/小鼠。当平均肿瘤体积达到大约150mm3时，根据肿瘤体积将52只NOG小鼠中的36只分配到6个研究组，每组6只小鼠。这些组被分配为研究组群2至7。以每组等摩尔浓度开始用媒介物、蛋白酶未处理的带有一个XTEN聚合物的抗Her2 x抗CD3双特异性抗原结合多肽(即，pCW1628)、带有两个XTEN聚合物的抗Her2×抗CD3双特异性抗原结合多肽(例如pJB0244)和蛋白酶处理的抗Her2×抗CD3双特异性抗原结合多肽(其中XTEN从构建体切掉)的治疗，每周施用三个静脉内剂量，持续三周。组群1和2是媒介物治疗组，组群3是0.82mg/kg(6nmol/kg)的pCW1628治疗组，组群4是0.35mg/kg(6nmol/kg)的蛋白酶处理的抗Her2×抗CD3构建体(没有XTEN)治疗组，且组群5至7是分别在1mg/kg(6nmol/kg)、2.5mg/kg(15nmol/kg)和6.0mg/kg(36nmol/kg)的pJB0244双特异性构建体治疗组。
用卡尺在两个垂直维度上每周两次测量肿瘤，最多35天，并通过应用(宽度2×长度)/2公式计算肿瘤体积。还密切监测体重、一般外观和临床观察诸如癫痫发作、震颤、嗜睡、过度反应、立毛、费力/快速呼吸、肿瘤的着色和溃疡以及死亡，作为治疗相关毒性的量度。通过应用以下公式计算每个治疗组的百分比肿瘤生长抑制指数(％TGI)：((组群2媒介物对照的平均肿瘤体积-试验物治疗的平均肿瘤体积)/组群2媒介物对照的平均肿瘤体积)x100。％TGI≥60％的治疗组被认为具有治疗活性。
结果：在第35天，媒介物治疗的组群1和2小鼠没有抑制肿瘤进展，具有1122±243mm3和844±258mm3的肿瘤负荷，表明单独的人效应细胞本身不能引起抗肿瘤作用。如预期的，在人效应细胞存在下，用0.35mg/kg的蛋白酶处理的抗Her2×抗CD3双特异性构建体治疗(组群4)表现出明显的抗肿瘤消退，％TGI为100％。在人效应细胞存在下，用0.82mg/kg的pCW1628、带有一个XTEN聚合物的抗Her2 x抗CD3双特异性构建体治疗(组群3)也引发了强大的抗肿瘤应答，产生了100％的％TGI。重要的是，用带有两个XTEN聚合物的抗Her2×抗CD3治疗观察到剂量依赖性的抗肿瘤应答。在1mg/kg施用的pJB0244(组群5)被认为是治疗上无活性的，％TGI为51％。将pJB0244的剂量水平增加至2.5mg/kg产生69％的治疗活性％TGI，并且增加至6mg/mL产生98％的％TGI。
结论：数据提示，在体内SK-OV-3肿瘤环境中，在6mg/kg(36nmol/kg)的蛋白酶未处理的带有两个XTEN的抗Her2×抗CD3双特异性构建体(例如，pJB0244)与6nmol/kg的蛋白酶未处理的带有一个XTEN聚合物的抗Her2×抗CD3(例如，pCW1628)一样有效，以及与6nmol/kg的蛋白酶处理的抗Her2×抗CD3双特异性构建体分子(除去了XTEN)一样有效。值得注意的是，与组群2媒介物对照相比，在所有试验物治疗组中没有观察到显著的体重减轻，表明所有治疗都被良好耐受。
实施例21：抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽在非人灵长类动物中的单剂量 和多剂量药代动力学确定
在未经治疗的
Figure BDA0003525090100006771
健康的非人灵长类动物(NHP)(例如，食蟹猴)中评价了带有2个XTEN聚合物的抗EGFR×抗CD3双特异性抗原结合多肽(即，pJB0169)在单次和多次静脉内施用后的药代动力学(PK)和一般耐受性。简而言之，通过头静脉向一只雌性和一只雄性猴子静脉内地输注8.5μg/kg组合物。监测两只动物两周。在没有观察到不良事件后，动物接受多剂量方案，该方案以每三天一剂启动，持续三周(在研究中总共9剂)。多剂量阶段从第15天开始，并在第36天结束。在整个研究中的特定时间点，收集血液用于测定药代动力学、细胞因子、血液学和血清化学。
在研究持续时间期间，动物监测包括体重、体温和笼边观察，每天一次或两次。监测动物的一般健康和外观；疼痛和痛苦的迹象，发烧、寒战、恶心、呕吐和皮肤完整性。在给药日，在组合物施用之前和之后，检查动物的注射部位反应。在给药前和第一个单剂量后24小时测定血液学和血清化学。在给药前和第一个单剂量后72小时内以适当间隔和在多剂量阶段中评价细胞因子。
在夹心ELISA上使用在电化学发光链霉抗生物素板上捕获的EGFR-生物素定量在血浆中存在的pJB0169的量，其中磺基标记的抗XTEN抗体作为检测。使用WinNonLin软件分析药代动力学参数，包括Cmax、Tmax、曲线下面积、半衰期和暴露谱。
细胞因子组包括使用Meso-Scale Discovery平台按照生产商的说明书测量IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10。这些细胞因子的检测下限分别为2.0pg/mL、0.32pg/mL、0.11pg/mL、0.68pg/mL、0.04pg/mL、0.23pg/mL和0.10pg/mL。血液学组包括对以下的测量：白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞血红蛋白体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、平均血小板体积、％嗜中性粒细胞、％淋巴细胞、％单核细胞、％嗜酸性粒细胞和％嗜碱性粒细胞。血清化学组包括对以下的测量：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、球蛋白、白蛋白/球蛋白比率、γ-谷氨酰基转移酶、葡萄糖、尿素、肌酸酐、钙、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、钠、钾、氯和肌酸激酶。
结果：pJB0169在8.5μg/kg的剂量被良好耐受。体重没有下降。未观察到寒战、发热、恶心、呕吐、皮疹、试验物注射部位反应。除IL-6外，所有测量的细胞因子水平均低于检测限。虽然在单剂量和多剂量阶段可检测到，但检测到的IL-6水平被认为是背景，其中在评价的时间点范围内，最高水平在雄性动物中不超过51pg/mL，并且在雌性动物中不超过19pg/mL。血液学和临床组均在正常范围内。在第1天施用后，在8.5μg/kg，平均Cmax值是372ng/mL，平均AUC0-168h是15839ng*h/mL，平均AUC0-inf是16342ng*h/mL，平均CL值是0.00886mL/min/kg，且平均T1/2值是24.2小时。分布容积(Vd)是0.0238L/kg。第36天施用后，平均Cmax值是410ng/mL，平均AUC0-168h是22985ng*h/mL，平均AUC0-inf是24663ng*h/mL，平均CL值是0.00578mL/min/kg，且平均T1/2值是44.0小时。分布容积(Vd)是0.0196L/kg。以8.5μg/kg单次或多次IV输注施用pJB0169后，Cmax和AUC0-168h在猴中的累积指数为1.10和1.45。在第1天和第36天施用之间的全身暴露没有显著差异。数据还表明没有出现抗药物抗体。
实施例22：抗EGFR x抗CD3双特异性抗原结合多肽在非人灵长类动物中的剂量范 围发现
在健康的、未经治疗的食蟹猴中进行pJB0169双特异性抗原结合多肽在非人灵长类动物中的剂量范围发现研究，每个组群有一只雌性和一只雄性猴子。简而言之，给一只雌性和一只雄性猴子通过头静脉静脉内输注pJB0169。监测两只动物两周。在没有可观察到的不良事件后，动物接受多剂量方案，该方案以每三天一剂启动，持续三周(在研究中总共9剂)。多剂量阶段从第15天开始，并在第36天结束。在整个研究中的特定时间点，收集血液用于测定药代动力学、细胞因子、血液学和血清化学。在最后一次给药后二十四小时(即第37天)，对动物进行尸体剖检以进行组织病理学评价。当在组群中在第一剂后一周未观察到不良事件时，将pJB0169在下一个组群中增加剂量2倍或3倍。剂量递增将进行直到观察到不良事件。
在研究持续时间期间，动物监测包括体重、食物消耗、体温和笼边观察，每天一次或两次。监测动物的一般健康和外观；疼痛和痛苦的迹象；发烧、寒战、恶心、呕吐和皮肤完整性。在给药日，在试验物施用之前和之后检查动物的注射部位反应。
将在夹心ELISA上使用在电化学发光链霉抗生物素板上捕获的EGFR-生物素定量在血浆中存在的pJB0169的量，其中磺基标记的抗XTEN抗体作为检测。将使用WinNonLin软件分析药代动力学参数，包括Cmax、Tmax、曲线下面积、半衰期和暴露谱。
细胞因子组包括使用Beckon Dickinson细胞测量珠阵列测量IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ和TNF-α。
血液学组包括对以下的测量：白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞血红蛋白体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、平均血小板体积、％嗜中性粒细胞、％淋巴细胞、％单核细胞、％嗜酸性粒细胞和％嗜碱性粒细胞。
血清化学组包括对以下的测量：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、球蛋白、白蛋白/球蛋白比率、γ-谷氨酰基转移酶、葡萄糖、尿素、肌酸酐、钙、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、钠、钾、氯和肌酸激酶。
对一组组织进行用H&E染色法的组织病理学评价，所述组织包括肾上腺、主动脉、骨、脑、附睾、食管、眼、输卵管(仅雌性)、心脏、肾、大肠、肝脏和胆囊、肺、淋巴结、乳腺(仅雌性)、卵巢(仅雌性)、胰腺、垂体、前列腺、唾液腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、睾丸(仅雄性)、胸腺、甲状腺、气管、膀胱、子宫和注射部位。
中期结果：在本剂量范围发现研究中的起始剂量是组群1在25.5μg/kg pJB0169。在单剂量和多剂量阶段未观察到可观察到的不良事件，诸如发热、寒战、皮疹、恶心、呕吐、异常的血液学和血清化学。因此，在组群2中将pJB0169的剂量增加了3倍，达到76.5μg/kg。在组群2中没有观察到可观察到的不良事件，并且在组群3中将pJB0169的剂量增加了3倍，达到230μg/kg。除了AST、ALT和总胆红素读数高于正常范围的可逆增加之外，没有观察到其它不良事件，并且在组群4中将pJB0169的下一剂量增加了2倍，达到460μg/kg。在组群4中未观察到可观察到的不良事件。pJB0169的进一步剂量递增正在进行中。
在整个研究时段期间没有发现死亡和垂死的动物。在任何治疗组中都没有试验物相关的器官重量变化。在所有测试动物中均未观察到肉眼损伤。在显微镜下，主要发现是在一些动物的注射部位处的皮下出血、组织坏死、嗜中性粒细胞浸润、静脉坏死或血栓形成以及皮肤结痂。这些变化可能归因于静脉内输注程序。
中期结论：在高达460μg/kg的剂量，pJB0169双特异性抗原结合多肽在非人灵长类动物中良好耐受。在所有测试剂量组中均未观察到试验物相关的器官重量和病理变化。
实施例23：抗原结合片段的等电点(pI)的确定
为了确定各种CD3和EGFR变体抗原结合片段的等电点，使用Maestro(
Figure BDA0003525090100006802
德国)的Biologics套件中的蛋白滴定曲线板(Protein Titration CurvePanel)分析每种片段。如下从可滴定基团(单个可电离残基和末端)的pKa值计算出蛋白的滴定曲线：将每个这样的基团在pH值中的区间处的电荷分数相加。用ProPKA产生pKa值(Sondergaard,C.等人.Toxicol Lett.205(2):116(2011)；Olsson,M.等人.Proteins 79:3333(2011))。绘制滴定曲线并确定每条曲线的等电点(pI)，结果列于下表中。
表20：CD3变体的等电点
抗体 变体 等电点(pI)
CD3 3.9 6.8
CD3 CD3.30 6.8
CD3 CD3.31 6.2
CD3 CD3.32 6.2
CD3 CD3.33 6.2
表21：EGFR变体的等电点
Figure BDA0003525090100006801
Figure BDA0003525090100006811
实施例24：通过HER2-XPAT对比HER2-PAT的体外细胞毒性测定评估XTEN对XPAT的 掩蔽作用
使用基于PBMC的效应细胞测定比较HER2-XPAT(XTEN化的HER2/CD3结合剂,前药)和HER2-PAT(未XTEN化的HER2/CD3结合剂,药物)的体外T细胞定向细胞毒性，以评估在前者中所含的XTEN分子的保护/掩蔽作用。HER2-XPAT构建体从N-端至C-端包含：(1)具有组氨酸标签的N-端XTEN(AE292 SEQ ID NO:714)，(2)释放区段，(3)抗HER2 scFv(Her2.2 scFv,SEQ ID NO:1140)，(4)抗CD3 scFv(CD3.23 scFv,SEQ ID NO:1141)，(5)释放区段，和(6)C-端XTEN(AE584,SEQ ID NO:926)。HER2-PAT包含与HER2-XPAT相同的元件，但是N-端和C-端XTEN分子通过在释放区段处的蛋白酶处理而切掉。
表22：本文使用的XPAT的蛋白组分
Figure BDA0003525090100006812
Figure BDA0003525090100006821
使用体外细胞毒性方法验证两种分子的细胞毒性，所述方法利用在处理后裂解的靶细胞的孔中存在的ATP量作为测量细胞生存力的指标。将表达HER2的靶细胞以不同密度(BT474和NUGC4-20k个细胞/孔、SKOV3和RT-112-10k个细胞/孔、MCF7和MDA-MB-231-7.5k个细胞/孔)接种在白色透明底板上，并允许在37℃、5％CO2温育过夜(18-24小时)。在过夜温育结束之前，将PBMC解冻并在37℃、5％CO2下温育4小时。通过从BioIVT获得的全血或富含淋巴细胞的血沉棕黄层制剂通过ficoll密度梯度离心从筛选的健康供体分离PBMC。使用11点、3倍滴定(第12点是未处理)制备10X HER2-XPAT和HER2-PAT剂量-响应滴定，HER2-XPAT的起始浓度为2400nM，并且HER2-PAT的起始浓度为10nm。将PBMC以不同的效应物:靶标(E:T)比(BT474-5:1,MCF7,RT-112,MDA-MB-231和SKOV3-10:1,NUGC4-～8:1)接种在孔中。将10X HER2-XPAT和AMX-818-P1(PAT)滴定液在孔中稀释10倍，起始浓度分别为240nM和1nM。将板在37℃、5％CO2下温育48小时。温育48小时后，将板用1X PBS洗涤3次，并将100μL 1XPBS添加到所有孔中。对于ATP测定，将100μLCellTiter-
Figure BDA0003525090100006822
发光底物溶液添加到所有孔中，并允许板在室温温育1-5分钟。然后将板在板振荡器上以300-500rpm振荡30-60秒以混合孔中的内容物，并使用100ms的积分时间在照度计中读数。产生的信号强度与在孔中存在的活细胞的量相关。计算来自所有非处理孔的信号的平均值，并用于确定来自处理孔的％活细胞((处理信号/非处理信号的平均值)*100＝％活细胞)。％活细胞按浓度绘制，且使用GraphPad Prism软件用4-参数逻辑回归方程式得出半数最大应答(IC50)值。
这些研究的结果表明，相对于其切割的HER2-PAT相应物，XTEN化能够减轻XPAT分子的细胞毒性。HER2-XPAT和HER2-PAT对测试的所有表达HER2的细胞系显示出巨大的效能差异，证实XTEN化导致HER2-XPAT的细胞裂解活性的降低(灭活状态)。这可以在图7和图8B中看到。图7显示了剂量-响应SK-OV3细胞胱天蛋白酶测定的结果，其中将细胞用HER2-XPAT或HER2-PAT处理，表明在两条剂量响应曲线之间存在大差异，且因此两种构建体的细胞毒性存在大差异。图8B显示了针对BT-474细胞、SK-OV-3细胞和MCF-7细胞的相同HER2-XPAT/HER2-PAT实验的类似剂量响应结果，也表明两种化合物在其它细胞系中的剂量响应曲线之间的大差异。
此外，实验表明不含XTEN的XPAT分子(HER2-PAT)的效能与HER2细胞表达相关，表明细胞杀伤机制对HER2具有特异性。这可以在图8A和图8B中看到。图8A显示了HER2-PAT在具有不同HER2表面表达的一系列不同细胞系中的剂量响应；HER2-PAT分子对高HER2表达者(SK-OV-3、BT-474)显示出最高效能/最低表观EC50，对中间表达者(MCF-7、NUGC-4、RT-112)显示出中等效能，和对低/负表达者(MDA-MB-231)显示出低效能。图8B显示了针对选定的HER2高(BT-474、SK-OV-3)和HER2中-低(MCF-7)细胞系的相同数据的不同呈现，仅与HER2-XPAT分子的效能并列，证明XPAT分子的两种形式(+和-XTEN分子)的效能都依赖于HER2表达，因为与HER2中-低细胞系相比，XTEN化的分子对HER2高细胞系的EC50较低(表明更大效能)。观察到HER2-PAT对RT-112和NUGC4的细胞毒性呈剂量依赖性方式，在1nM HER2-PAT观察到约80％的最大杀伤。HER2-PAT对MCF7细胞表现出127.3pM的估计IC50，而HER2-XPAT的IC50>26,667pM(效能差异>200倍)。对HER2增多的细胞系，HER2-PAT获得4.4pM(BT474)和5.71pM(SKOV3)的IC50值，而AMX-818(P1)获得1,364pM(BT474)和15,256pM(SKOV3)的IC50值。根据HER2表面表达的这种效能变化，我们得出结论，HER2-PAT对具有低到高HER2表达的细胞系具有细胞毒性潜力，并且XTEN化掩盖(或屏蔽)XPAT分子在T细胞和靶癌细胞之间形成免疫突触的能力，导致XPAT分子的效能的降低(所提出的作用机理的图示出现在图9A中)。
实施例25：XTEN化的抗CD3/抗HER2 XPAT在心肌细胞中的毒性的评估
正常人心肌细胞表达低水平的HER2，因此，在用某些HER2-靶向疗法治疗的患者中观察到罕见的心脏毒性病例。因此，再次使用PBMC效应细胞测定在正常人心肌细胞中评估来自实施例24的XTEN化的(HER2-XPAT,前药)和未XTEN化的(HER2-PAT,药物)PAT的T细胞定向细胞毒性。在测定中，使用从FujiFilm Cellular Dynamics购买的正常人心肌细胞。将icell心肌细胞(Cellular Dynamics International)从液氮中复苏，并以每96孔20,000个细胞铺板7天，并按照生产商的说明书进行处理。将人外周血淋巴细胞以10:1效应物:靶标比添加到icell心肌细胞上，并在37℃、5％CO2温育48小时，其中将HER2-XPAT(在300nM开始)或HER2-PAT(在1nM开始)以3倍浓度增加。测定在RPMI和10％热灭活的胎牛血清中进行。通过ATP定量确定心肌细胞细胞生存力，并使用Cell Titer-Glo发光细胞生存力测定系统(Promega)进行。吸出细胞上清液，并将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，抽吸，并且然后加入PBS(100μl/孔)。使用LS405微量板洗涤分配器(BioTek)进行自动化的板洗涤。加入Cell Titer-Glo试剂(100μl/孔)，并将测定板在室温温育5分钟。使用带有发光检测器的多标签读取器(Molecular Devices)对发光进行量化。为了分析细胞毒性，从相对发光单位(RLU)计算％活细胞。％活细胞＝(试验孔RLU/仅靶细胞RLU)*100。对于EC50确定，将数据在Microsoft Excel中进行转换，并使用Graph Pad Prism8.3.1软件‘log(激动剂)对比应答-变量斜率(四参数)进行分析。
结果表明，XTEN化可有效保护心肌细胞免于由XPAT分子引起的T细胞定向细胞毒性。这可以在图10A中看到。图10A显示了HER2-XPAT和HER2-PAT二者的剂量响应曲线，其中活性药物HER2-PAT表现出小于约1nM的表观EC50，而XTEN化的前药HER2-XPAT在大于100nM浓度没有表现出显著的细胞毒性。
实施例26：HER2-XPAT和它的蛋白水解代谢物的体外T细胞活化证实了XTEN对XPAT (XTEN化的蛋白酶活化的T细胞衔接物)的掩蔽作用
已经观察到HER2-CD3平台的效力和XTEN分子在保护其免于失调活性的效力后，接下来进行实验以评估：(a)XPAT的T细胞活化对HER2衔接的依赖性；(b)单XTEN化(N-或C-端)减轻由XPAT分子引起的细胞毒性活性的效力。
对于(a)和(b)，使用体外T细胞活化方法验证了HER2-XPAT和它的蛋白水解代谢物对CD3阳性T细胞的活化。被基因工程改造以表达由NFAT-应答元件驱动的萤光素酶报告物的Jurkat T细胞用于通过测量处理后孔中存在的萤光素酶来确定T细胞活化水平。对于(a)和(b)二者，将表达HER2的靶细胞以不同的密度(BT474-20k个细胞/孔,SKOV3-10k个细胞/孔)接种在白色透明底板上，并允许在37℃、5％CO2温育过夜(18-24小时)。
为了评估XPAT分子的T-细胞活化对HER2细胞表面衔接的依赖性(a)，进行了Jurkat T细胞活化测定，其中给一部分孔仅接种培养基(例如，没有表达HER2的细胞)。在上述过夜温育结束之前，使用7点、6倍滴定(第8点是未处理)以6000nM(对于HER2-XPAT)和150nM(对于HER2-PAT)的起始浓度制备7.5X HER2-XPAT和HER2-PAT剂量-响应滴定。将Jurkat报道细胞以5:1效应物:靶标(E:T)比率(BT474-100k个细胞/孔)接种在孔中。将7.5XHER2-XPAT和HER2-XPAT(PAT)滴定液在孔中稀释7.5倍，起始浓度分别为800nM和20nM。将7.5X HER2-XPAT(在6000nM)和HER2-PAT(在150nM)在仅含Jurkat细胞(无BT474)的孔中稀释7.5倍。将板在37℃、5％CO2下温育6小时。温育6小时后，将75μL
Figure BDA0003525090100006852
发光底物溶液加入所有孔中，并将板在室温温育5-10分钟。然后将板在板振荡器上以300-500rpm振荡30秒以混合孔中的内容物并使用500ms的积分时间在照度计中读数。产生的信号强度与孔中存在的来自裂解的Jurkat的萤光素酶的量相关。将信号按浓度绘制，并使用GraphPadPrism软件用4-参数逻辑回归方程式得出半数最大应答(EC50)值。
结果表明，Jurkat细胞的活化依赖于HER2在靶细胞表面的衔接。这可以在图11中看到。图11A显示了在有和没有带有HER2的BT-474细胞存在下，药物HER2-PAT(“HER2-PAT”)和前药HER2-XPAT(“HER2-XPAT”)的Jurkat细胞活化/NFAT反式激活(以萤光素酶活性的RLU测量)的剂量响应。图11B显示了对比HER2-PAT(“HER2-PAT”)和HER2-XPAT(“HER2-XPAT”)诱导的T细胞活化与带有HER2的SK-OV-3细胞的相似数据。在图11A中，T细胞显示在没有表达HER2的细胞存在下HER2-PAT(“HER2-PAT”)和HER2-XPAT(“HER2-XPAT”)二者的活化的缺乏，如与在有BT-474细胞存在下的最大浓度HER2-PAT(“HER2-PAT”)条件相比，含有非HER2细胞的条件在最大浓度不能达到有意义的T细胞活化水平所证实的。在图11A和图11B二者中，HER2-PAT(“HER2-PAT”)和HER2-XPAT(“HER2-XPAT”)继续显示先前观察到的剂量响应活性迁移，表明XTEN分子似乎也阻断T细胞活化。观察到HER2-XPAT的从最大信号的内插浓度在800nM，HER2-PAT的从最大信号的内插浓度在25.6pM，指示出，在这些条件下在HER2-XPAT和HER2-PAT之间的活性存在约31,257倍差异。
为了评价单XTEN化的中间体对减轻XPAT活性的影响，在有2x N-/C-端XTEN化的XPAT前药(HER2-XPAT)、仅N-端XTEN化的XPAT中间体(HER2-XPAT(1x-N))、仅C-端XTEN化的XPAT中间体(HER2-XPAT(1x-C))和未XTEN化的药物(HER2-PAT)存在下，进行了Jurkat T细胞活化测定。在上述过夜温育结束之前，使用11点、4倍滴定(第12点是未处理)制备10XHER2-XPAT、HER2-XPAT(1x-N)、HER2-XPAT(1x-C)和HER2-PAT滴定，其中HER2-XPAT、HER2-XPAT(1x-N)、HER2-XPAT(1x-C)的起始浓度为7320nM，且HER2-PAT的起始浓度为158.3nm。将10X HER2-XPAT、HER2-XPAT(1x-N)、HER2-XPAT(1x-C)和AMX-818-P1(PAT)滴定液在孔中10倍稀释，起始浓度分别为732nM和15.83nm。将Jurkat细胞以5:1效应物:靶标(E:T)比率(BT474-100k个细胞/孔,SKOV3-50k个细胞/孔)接种在孔中。将板在37℃、5％CO2温育6小时。温育6小时后，将100μL Bio-
Figure BDA0003525090100006851
发光底物溶液加入所有孔中，并将板在室温温育5-10分钟。然后将板在板振荡器上以300-500rpm振荡30秒以混合孔中的内容物并使用500ms的积分时间在照度计中读数。产生的信号强度与孔中存在的裂解的Jurkat细胞的萤光素酶的量相关。将信号按浓度绘制，并使用GraphPad Prism软件用4-参数逻辑回归方程式得出半数最大应答(EC50)值。
结果表明，与N-端和C-端均XTEN化的XPAT前药相比，N-端和C-端XTEN化的中间体二者都提供了XPAT Jurkat细胞活化的部分减轻。这可以在图12中看到，其显示了2x N-/C-端XTEN化的XPAT前药(HER2-XPAT)、仅N-端XTEN化的XPAT中间体(“HER2-XPAT(1x-N)”)、仅C-端XTEN化的XPAT中间体(“HER2-XPAT(1x-C)”)和未XTEN化的药物(“HER2-PAT”)在BT-474(图12A)和SK-OV-3(图12B)细胞中的剂量响应曲线。在图12中，仅N-端和仅C-端(“HER2-XPAT(1x-N)”和“HER2-XPAT(1x-C)”)构建体二者表现出的EC50值是：(a)大约彼此相等，以及(b)在完全XTEN化的前药(“HER2-XPAT”)和未XTEN化的药物(“HER2-PAT”)之间的中间值。对BT-474和SK-OV-3细胞二者进行测试时确实如此。对于BT-474细胞，通过在关于每对条件用HER2-XPAT获得的信号，将与HER2-XPAT获得的最大值相关的浓度与用其它分子获得的信号相关的浓度进行对比，可以估计效能的数字差异：(a)732nM的HER2-XPAT和2,494.9pM的HER2-XPAT(1x-N)–大约293倍差异，(b)732nM的HER2-XPAT和3,917.4pM的HER2-XPAT(1x-C)–大约187倍差异，以及(c)732nM的HER2-XPAT和33.4pM的HER2-PAT–大约21,924倍差异。对于SK-OV-3细胞，可以通过曲线估计效能差异：(a)HER2-XPAT是最低效能的，(b)HER2-XPAT(1x-N)是中等效能的，(c)HER2-XPAT(1x-C)是中等效能的，和(d)HER2-PAT是最高效能的。因此，仅N-端或C-端XTEN被切割的分子仍显示出减弱的Jurkat T细胞活化，从而提示，两个XTEN部分的切割是最大活性所必需的。
实施例27：在有XTEN化的和未XTEN化的抗HER2/抗CD3构建体存在下PBMC的体外活 化
已经观察到HER2-XPAT/HER2-PAT构建体对Jurkat T-细胞的活化后，构建了一种测定以直接测量HER2-XPAT/HER2-PAT构建体是否能够在原代细胞中诱导T细胞活化的常规表型。
因此，构建了使用T细胞活化的CD69早期标志物的基于流式细胞计量术的SK-OV-3/PBMC模型，以评价这些构建体的体外活性。SKOV3细胞购自ATCC(目录号HTB-77)，并在补充有10％热灭活胎牛血清(Life Technologies,10082147)的McCoy氏5A培养基(LifeTechnologies,16600-082)中培养细胞。冷冻的人外周血单个核细胞(PBMC)购自BioIVT。在进行细胞毒性测定前四小时，将冷冻的PBMC解冻并在T75组织培养瓶中在补充有10％FBS的RPMI(Life Technologies,72400-047)中培养；将SKOV3细胞通过胰蛋白酶(LifeTechnologies,25200114)分离，并将40,000个细胞铺板在48孔平底组织培养板的每个孔中。4小时温育后，将200,000个PBMC添加给SKOV3细胞(效应细胞与靶细胞的比例为5:1)，然后添加如下表所示的递增浓度的HER2-PAT和HER2-XPAT。将细胞共培养72小时，然后通过流式细胞计量术评估CD3-门控的细胞上的表面CD69表达。对于细胞表面受体染色，首先将细胞用抗人Fc受体封闭溶液(Biolegend,422302)在4C封闭10分钟，然后在有AF488标记的抗CD3(Biolegend,317310)和APC/Fire750-标记的抗CD69抗体(Biolegend,310945)存在下在4C温育1小时。在样品采集之前，添加7-AAD(Life Technologies,00-6993-50)以排除死细胞。将数据用Flowjo软件分析并在Prism中绘制。
结果表明，HER2-XPAT和HER2-PAT构建体能够在有HER2+细胞(SK-OV-3细胞)存在下诱导PBMC上T细胞活化的常规标志物，并且HER2-XPAT和HER2-PAT构建体表现出在其它模型系统中观察到的效能的相同差异。这可以在图9B中看到，该图显示了如通过流式细胞计量术所评估的％CD69+(“活化的”)T细胞对比XPAT/PAT试剂浓度的剂量响应曲线。在图9B中，HER2-PAT和HER2-XPAT构建体二者都能够诱导高水平的T细胞活化(在饱和浓度为约80％活化)。此外，HER2-PAT构建体表现出的EC50(3.19pM)显著低于HER2-XPAT构建体(3634pM)，表明在HER2-XPAT构建体上的N-/C-端XTEN分子有效降低了T细胞(当存在时)的活化。
实施例28：在BT-474异种移植物模型中的抗肿瘤效力和肿瘤内T细胞活化
在体外模型中观察HER2-CD3 XTEN化的XPAT(HER2-XPAT)的作用后，建立了BT-474异种移植物/人PBMC模型以评估该分子在体内环境中诱导肿瘤消退的能力。
小鼠模型
使BT-474细胞(ATCC目录号HTB-20)在37℃在加湿气氛(5％CO2,95％空气)中作为单层生长。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(ref.L0104-500,Lonza,比利时)的DMEM，补充了10％胎牛血清(ref.P30-3306,Pan Biotech)。细胞粘附在塑料烧瓶上。对于实验用途，通过在不含钙或镁的汉克氏培养基(ref.L0611-500,Dutscher)中用胰蛋白酶-依地酸(ref.X0930,Dutscher)处理5分钟，使肿瘤细胞从培养瓶脱离，并通过添加完全培养基进行中和。在血球计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％锥虫蓝排除测定评估它们的生存力。
将外周血单个核细胞(PBMC)收集为来自健康供体的血沉棕黄层样品。在全血收集的24小时内，根据
Figure BDA0003525090100006882
plus程序(Ref 07907,StemCell Technologies,Meylan,法国)使用梯度离心从血沉棕黄层纯化PBMC。在体内注射前，通过0.25％锥虫蓝排除测定评估PBMC的生存力。只有生存力≥90％的PBMC制剂才可接受用于研究中。
为了建立异种移植小鼠，通过将在200μL含有50％(v/v)基质胶的不含酚红的RPMI1640中的2x107个BT-474细胞皮下注射到6-7周龄的雌性NOG(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicTac)小鼠(Taconic,USA)的右胁腹中来诱导肿瘤。肿瘤细胞植入的那天被认为是第0天(D0)。在用γ-源(1.44Gy,60Co,BioMep,法国)全身辐照后24小时进行BT-474肿瘤细胞植入。
为了在异种移植小鼠中建立人PBMC，在第23天注射PBMC，此时平均肿瘤体积达到100-200mm3。一部分荷瘤小鼠未进行人源化，并注射了200μL不含酚红的RPMI 1640作为对照(“非人源化的小鼠”)。携带PBMC的小鼠接受在200μL不含酚红的RPMI 1640中的1x107个PBMC的单次静脉内(IV)注射(“人源化的小鼠”)。在D26，即PBMC接种后3天，通过平均肿瘤体积将动物随机化。将非人源化的小鼠根据其肿瘤体积随机化。将人源化的小鼠根据肿瘤体积和PBMC供体随机化到治疗组中。在随机化当天(即第13天)开始用媒介物(即Amunix稀释剂)和试验物进行静脉内治疗。
试剂施用/处理/测量
将实验试剂(媒介物、HER2-XPAT、HER2-PAT或HER2-XTEN[HER2-XPAT的不可切割变体])通过静脉内注射(IV)施用进治疗的小鼠的尾静脉中。施用体积为10mL/kg(IV)，根据最近的个体体重进行调整。于D26开始治疗。根据下述给药时间表施用试剂。
表23：试剂在人源化的BT-474异种移植小鼠中的给药时间表
Figure BDA0003525090100006881
Figure BDA0003525090100006891
在整个研究期间定期收集治疗组的血液样品。在第九次(第9次)治疗前(第八次(第8次)治疗后47小时)，根据标准程序，通过颈静脉将血液从3只小鼠(每种供体1只小鼠)收集到含有抗凝剂(K2EDTA)的管中。离心样品以获得血浆，并将血浆样品在-80℃储存直至分析。
在某些情况下，在治疗后收集肿瘤样品。为了收集肿瘤，将肿瘤的中心部分切下并在中性缓冲福尔马林中固定并包埋在石蜡中。将肿瘤的剩余部分处理并用于流式细胞计量术分析。使用解剖刀将切下用于流式细胞计量术分析的肿瘤切成更小的碎片，在非酶促细胞解离缓冲液中进一步解离成单细胞悬浮液，在37℃温育30分钟，并然后通过70μm细胞过滤网机械分离。然后使用基于ficoll的梯度离心富集活细胞。
在最大限度地减少与FcR封闭试剂的非特异性结合后，通过表面染色对活细胞进行流式细胞计量术分析(生存力染料也用于允许排除死细胞)。根据供应商为每种抗体描述的程序，加入萦光地标记的表面靶抗体。将混合物在室温避光温育20分钟，洗涤，并然后用200μL含有PKH26珠子的PBS中的1％甲醛固定。将所有样品在+4℃并避光储存，直到在细胞仪上采集。为了鉴定阳性和阴性群体，使用萦光减一(“FMO”)原理来说明背景抗体萦光。使用来自组0的小鼠(剩余小鼠)，将FMO对照用于每个器官的对照。使用补偿珠和/或单染色细胞进行补偿。为了分析生存力，使用了CD4、CD8、CD25标志物、CD45标志物和CD3标志物、Viobility 405/452可固定染料(Miltenyi Biotec)、PE抗人CD4(BD Biosciences)、PE-Vio615抗人CD8(Miltenyi Biotec)、PE-Vio770抗人CD25(Miltenyi Biotec)、FITC抗人CD45(BD Biosciences)和APC抗人CD3(BD Biosciences)。为了分析白细胞，使用了hCD45标志物。为了分析T细胞，使用了对hCDR45、随后对hCD3的门控。为了分析CD4+或CD8+细胞，使用了对hCD45、随后是对hCD3、随后是hCD8对比hCD4的门控。通过对CD4或CD8的门控随后是CD25分析，评估活化的CD8+或CD4+细胞。
在整个研究过程中监测肿瘤生长。使用卡尺(品牌:Fowler Sylvac,型号:699371)在随机化后在两个维度每周测量肿瘤两次。使用以下公式计算肿瘤体积并以mm3表示：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤维度)，且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤维度)。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体重测量。将肿瘤体积和肿瘤生长抑制的参数用于评价治疗效力。此外，将在研究的最后一天的肿瘤体积与至少80％的剩余动物进行对比。
结果
在治疗的第25天，非人源化的和人源化的媒介物治疗的组1和2中的平均肿瘤体积是相似的，表明单独的人源化不影响肿瘤体积。用6nmol/kg HER2-PAT(组3)和6nmol/kgHer2-XPAT-XTEN-576和-XTEN-864(组5和7)治疗的组在治疗第25天的肿瘤体积显著低于媒介物治疗组2(参见图13A和B)，表明药物和前药二者均可有效降低小鼠的肿瘤负荷。相比之下，与对照组2相比，用不可切割的Her2-XTEN治疗没有显著降低肿瘤体积，表明Her2-XPAT构建体的抗肿瘤作用依赖于XTEN掩蔽物的蛋白水解性切割和释放(参见图13B)。此外，HER2-XPAT和HER2-PAT构建体二者在等摩尔剂量似乎具有相似的效力，表明可切割的XTEN分子的添加不会影响药物的效力。
HER2-PAT此外，从动物肿瘤分离的肿瘤浸润性淋巴细胞的流式细胞计量术分析表明，HER2-PAT和Her2-XPAT均能有效活化肿瘤浸润的人CD4+和CD8+ T细胞。这可以在图14中看到，该图呈现了从媒介物、HER2-PAT和Her2-XPAT治疗的异种移植小鼠分离的肿瘤中％hCD25+/CD4+(活化的CD4+ T细胞,图14A)和％hCD25+/CD8+(活化的CD8+ T细胞,图14B)的散点图。在图14中，HER2-PAT治疗和HER2-XPAT治疗二者均显示出与媒介物对照相比CD4+和CD8+ T细胞的可比较活化，其中CD4+细胞以p<0.05置信水平升高，且CD8+细胞以p<0.001置信水平升高。
实施例29：使用改变的HER2-XPAT给药时间表的抗肿瘤效力
在使用实施例27中的给药时间表在异种移植小鼠中观察效力之后，评估了其它给药参数以确定是否可以使用比每周3次更低的频率。具体地，使用在实施例27中描述的相同小鼠建立和注射方案，研究了HER2-XPAT以2.1mg/kg每周施用1次。
结果表明，每周1次给药也足以导致肿瘤负荷消退。这可以在图14C中看出，其呈现了对于媒介物+PBMC或HER2-XPAT给药的肿瘤体积对比治疗后天数的图。在图14C中，与相同条件的第0天和媒介物+PBMC给药的终点相比，用HER2-XPAT治疗的小鼠在终点显示出显著降低的肿瘤负荷。
实施例30：HER2-XPAT在食蟹猴中具有与HER2-PAT相比显著增加的治疗指数
已经确定HER2 XPAT构建体的XTEN化会提高体外治疗指数，但可以在体内环境中在鼠肿瘤模型中诱导与HER2PAT相当的效力，接下来在食蟹猴(NHP)模型中评价XTEN化的前药分子以确定其在更接近预期人群的动物中的安全性谱。
食蟹猴接收自Charles River Laboratories,Houston,TX,Covance ResearchProducts,Alice,TX,和Worldwide Primates,Miami,FL。在开始给药时，动物的年龄在2.5至3.2岁之间，并且体重在2.4至2.7kg之间。对于实验试剂，选择IV暴露途径，因为它是人暴露的预期途径。
用2.5mg/kg、7.5mg/kg和15mg/kg HER2-XPAT(AC2038，其具有改变的C-端XTEN分子AE868替代在实施例24中描述的AE584)和21mg/kg、42mg/kg和50mg/kg具有在实施例24中描述的较短C-端XTEN分子(AE584)的HER2-XPAT变体(AC2275)进行单剂量耐受性研究以评估XTEN化的HER2构建体的毒性。使用1mg/kg和0.3mg/kg HER2-PAT进行连续输注耐受性研究以评估未XTEN化的HER2构建体的毒性。这些参数总结在图15A中。
对于HER2-XPAT 2038和短HER2-XPAT 2275变体，所有低于50mg/kg的剂量都是耐受的，即使在多天之后(参见图15B，其显示了不同剂量以后在动物中随时间变化的HER2-XPAT分子的血清浓度)。相比之下，通过连续输注施用的1mg/kg和0.3mg/kg HER2-PAT二者均不是耐受的，并导致动物的致死和安乐死(参见图15B，其显示了死亡前HER2-PAT分子的血清浓度)。基于测得的血清浓度，数据提示HER2-XPAT提供的耐受Cmax比HER2-PAT的致死Cmax高>1000倍，表明XTEN化似乎提高了在NHP动物中的治疗指数。
实施例31：HER2-PAT和HER2-XPAT对食蟹猴中的T细胞群体的活性
已经确定了分子在食蟹猴中的近似最大耐受剂量，我们进一步分析了给药的动物以评估构建体在实施例30中治疗的动物中的其它药效动力学效应。具体地，评估了两种分子对T细胞的特定亚群大小的影响。
在给药后第1天的6小时和24小时以及第4天的24小时，收集血液样品。
手动检查(即，条棒检查)血液样品的凝块，并将血液样品在收集当天在室温转移到适当的实验室。将样品保持在环境温度直至分析。
使用针对标志物抗原的特异性抗体，使用流式细胞计量术定量在下表中鉴定的细胞抗原和细胞群体，以评估对各种T细胞群体的影响。以下是使用的抗体组合和鉴定的细胞群体。
表25：在治疗的猴中用于免疫细胞分析的流式细胞计量术标志物组合
Figure BDA0003525090100006921
a计算并报告了基线的绝对计数和绝对计数百分比。
b报告了CD69-BV421门控的阳性的平均萦光强度(MFI)。
c报告了CD25-APC门控的阳性的MFI。
结果表明，如从血液样品评估的，HER2-XPAT 2038和HER2-XPAT 2275的施用导致对全身淋巴细胞和全身活化的淋巴细胞亚群的影响。这可以在图16中看出，该图显示了药剂施用对总血液淋巴细胞的影响(A)和AC2275对活化的淋巴细胞的特定群体的影响(B)。关于绝对全身淋巴细胞群体，虽然HER2-PAT在所有剂量都引起明显的淋巴细胞边缘化(参见淋巴细胞群体的减少)，但HER2-XPAT 2038仅在7.5mg/kg剂量和更高剂量显示边缘化，且HER2-XPAT 2275在21.1mg/kg剂量显示边缘化(参见图16A)。此外，关于HER2-XPAT 2275，表达CD69或CD25活化标志物的活化的CD4+和CD8+ T细胞群体主要是在给药前范围内(参见图16B)。
进行了进一步分析以观察试剂对其它T细胞亚群的影响。结果表明，虽然HER2-PAT和HER2-XPAT二者的施用导致T辅助细胞和T细胞毒性的淋巴细胞的瞬时减少(由于明显的边缘化)，但是HER2-XPAT未能在高达50mg/kg的剂量诱导T细胞毒性和T辅助细胞淋巴细胞上的CD69表达的增加。
实施例32：HER2-PAT和HER2-XPAT对食蟹猴中的全身细胞因子释放的影响
进一步研究了HER2-PAT和HER2-XPAT(AC2275)在食蟹猴中诱导有害全身细胞因子释放的能力。给按照前两个实施例制备的猴子注射逐渐增加的静脉内剂量的HER2-PAT或HER2-XPAT，并通过Luminex测定测量IL-6、TNFα和IFNγ的血浆浓度。
所有试剂均在室温(RT)制备，如Luminex Performance Assay NHP XL细胞因子预混试剂盒指南中所述。将血浆样品在Calibrator Diluent-RD6-65中稀释2倍。将标准混合液1和2用Calibrator Diluent-RD6-65重构，并允许在RT静置15分钟。1:1混合后，将混合液稀释3倍，以便在聚丙烯管中生成8-点标准曲线。然后将50μl标准品或样品一式两份地铺板在试剂盒提供的Greiner 96孔板上。然后将50μl标准品或样品一式两份地铺板在试剂盒提供的Greiner 96孔板上。在提供的混合瓶中重构NHP XL细胞因子组微粒混合物后，将50μl添加到每个孔的顶部，并将板在RT以800rpm振荡温育2小时。然后使用R&D systems提供的磁体手动进行洗涤。制备1X洗涤缓冲溶液后，将100μl洗涤缓冲液加入每个孔中并静置刚好1分钟。除去液体并洗涤另外两次。用测定稀释剂RD2-1重构NHP XL Panel生物素-抗体混合物20分钟后，将重构的NHP XL panel生物素-抗体混合物在测定稀释剂RD2-1中进行10X稀释，并在每个孔中铺板50μl，并在RT以800rpm振荡温育1小时。重复洗涤步骤后，将50μl稀释的链霉抗生物素-PE添加到每个孔中，并在RT以800rpm在振荡器上温育20分钟。第三次重复洗涤步骤后，向每个孔中加入100μl洗涤缓冲液，并将板在RT以800rpm振荡器上温育2分钟。然后立即使用MAGPIX分析仪读取平板。
在HER2-PAT或Her2-XPAT的每个评价剂量在6-24小时之间测量的细胞因子的最大值示于图17中。图17显示了递增剂量系列的HER2-PAT或HER2-XPAT的IL-6(A)、TNFα(B)或IFNγ(C)的以pg/ml为单位的浓度。虽然HER2-PAT在所有测试浓度诱导了所有三种细胞因子的细胞因子释放，但HER2-XPAT诱导的所有细胞因子的浓度都接近基线，表明HER2-XPAT中的XTEN分子减轻了在前药背景下有害的全身细胞因子释放。

Claims (127)

1.一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，且其中所述抗原结合片段，
a.特异性地结合分化簇3T细胞受体(CD3)；并且
b.包含分别具有SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
2.一种多肽，所述多肽包含抗-CD3抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，且其中所述抗原结合片段
a.特异性地结合CD3；
b.包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且
c.表现出较高的热稳定性，如在体外测定中所证实的，
(i)相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段更高的解链温度(Tm)，或
(ii)在将所述抗-CD3抗原结合片段掺入抗-CD3双特异性抗体后，所述双特异性抗体表现出相对于对照双特异性抗体更高的Tm，其中所述抗-CD3双特异性抗体包含所述抗-CD3结合片段和结合除了CD3以外的抗原的参考抗原结合片段，且其中所述对照双特异性抗原结合片段由SEQ ID NO:41和所述参考抗原结合片段组成。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述抗原结合片段的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃。
4.一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述抗原结合片段
a.特异性地结合CD3；
b.包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且
c.包含FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，其各自分别表现出与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，或与SEQ ID NO:22、23、25和26的氨基酸是相同的。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，其各自分别表现出与SEQ ID NO:12、13、18和19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，或与SEQID NO:12、13、18和19的氨基酸序列是相同的。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的多肽，其中所述CDR-H1和所述CDR-H2分别包含SEQID NO:8和9的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1,
b.具有SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2，和
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；
c.具有SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列的CDR-L3。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
10.根据权利要求8所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L2；
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
11.根据权利要求1-7和9中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
c.具有SEQ ID NO:14-17中的任一个的氨基酸序列的FR-L3；
d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
e.具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
h.具有SEQ ID NO:26中的任一个的氨基酸序列的FR-H4。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
c.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的FR-L3；
d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
e.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR-H1；
f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
c.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的FR-L3；
d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
c.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的FR-L3；
d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段进一步包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
b.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
c.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的FR-L3；
d.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
e.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
f.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
g.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
h.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段包含与SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相同的可变重(VH)氨基酸序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段包含与SEQ IDNO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列相同的可变轻(VL)氨基酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段包含与SEQ IDNO:36-40中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。
22.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段结合选自CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε单元的CD3复合物亚基。
23.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段结合CD3的CD3ε片段。
24.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段表现出在6.0和6.6之间、包括端点的pI。
26.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段表现出的pI比由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段以在约10nM和约400nM之间的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在包含人或食蟹猴CD3抗原的体外抗原结合测定中所确定的。
28.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段以小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM、或小于约350nM、或小于约400nM的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中相对于由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的抗原结合片段的结合亲和力，所述抗原结合片段表现出的对CD3的结合亲和力弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。
30.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含第一释放区段肽(RS1)，其中所述RS1是哺乳动物蛋白酶切割的底物。
31.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1是选自由天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase组成的组的蛋白酶的底物。
32.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1包含选自以下序列的氨基酸序列：RSR-2089、RSR-2295、RSR-2298、RSR-2488、RSR-2599、RSR-2485、RSR-2486、RSR-2728、RSN-2089、RSN-2295、RSN-2298、RSN-2488、RSN-2599、RSN-2485、RSN-2486、RSN-2728、RSC-2089、RSC-2295、RSC-2298、RSC-2488、RSC-2599、RSC-2485、RSC-2486和RSC-2728，它们中的每一个如在表5中所示。
34.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含第一延长重组多肽(XTEN1)，其中所述XTEN1的特征在于
a.它具有至少约100个氨基酸；
b.所述XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和
c.它具有至少4-6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述XTEN1具有至少约100至约1000个氨基酸。
36.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含选自SEQ ID NO:661-664中的至少三个的氨基酸序列。
37.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。
39.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段是嵌合的或人源化的抗原结合片段。
40.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和单链可变片段(scFv)组成的组。
41.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽被表达为融合蛋白，其中处于未切割状态的所述融合蛋白具有AF1-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-AF1的从N-端至C-端结构排列，其中AF1是第一抗原结合片段。
42.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含特异性地结合除CD3以外的靶细胞标志物的第二抗原结合片段(AF2)。
43.根据权利要求42所述的多肽，其中所述AF2通过柔性肽接头融合至所述AF1。
44.根据权利要求43所述的多肽，其中所述柔性接头包含2或3类选自由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的组的氨基酸。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的多肽，其中(1)所述AF2片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)将所述AF1和所述AF2构造为(Fab’)2或单链双体。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的多肽，其中所述靶细胞标志物是肿瘤抗原。
47.根据权利要求46所述的多肽，其中所述靶细胞标志物选自1-40-β-淀粉样蛋白，4-1BB，5AC，5T4，707-AP，A激酶锚蛋白4(AKAP-4)，激活素受体2B型(ACVR2B)，激活素受体样激酶1(ALK1)，腺癌抗原，脂肪分化相关蛋白，肾上腺素受体β3(ADRB3)，AGS-22M6，α叶酸受体，甲胎蛋白(AFP)，AIM-2，间变性淋巴瘤激酶(ALK)，雄激素受体，血管生成素2，血管生成素3，结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)，炭疽毒素，AOC3(VAP-1)，B细胞成熟抗原(BCMA)，B7-H3(CD276)，炭疽芽孢杆菌性炭疽，B细胞活化因子(BAFF)，B淋巴瘤细胞，骨髓间质细胞抗原2(BST2)，印迹位点的调节剂的同系物(BORIS)，C242抗原，C5，CA-125，癌症抗原125(CA-125或MUC16)，癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)，癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)，碳酸酐酶9(CA-IX)，癌胚抗原(CEA)，心脏肌球蛋白，CCCTC结合因子(CTCF)，CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CD11，CD123，CD125，CD140a，CD147(basigin)，CD15，CD152，CD154(CD40L)，CD171，CD179a，CD18，CD19，CD2，CD20，CD200，CD22，CD221，CD23(IgE受体)，CD24，CD25(IL-2受体的α链)，CD27，CD274，CD28，CD3，CD3ε，CD30，CD300分子样家族成员f(CD300LF)，CD319(SLAMF7)，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD40配体，CD41，CD44v7，CD44 v8，CD44 v6，CD5，CD51，CD52，CD56，CD6，CD70，CD72，CD74，CD79A，CD79B，CD80，CD97，CEA相关抗原，CFD，ch4D5，染色体X开放读码框61(CXORF61)，封闭蛋白18.2(CLDN18.2)，封闭蛋白6(CLDN6)，艰难梭菌，凝聚因子A，CLCA2，集落刺激因子1受体(CSF1R)，CSF2，CTLA-4，C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)，C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)，C-X-C趋化因子受体类型4，细胞周期蛋白B1，细胞色素P4501B1(CYP1B1)，cyp-B，巨细胞病毒，巨细胞病毒糖蛋白B，达比加群，DLL4，DPP4，DR5，大肠杆菌志贺毒素1型，大肠杆菌志贺毒素2型，外-ADP-核糖基转移酶4(ART4)，含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)，EGF样结构域多倍体7(EGFL7)，突变的延伸因子2(ELF2M)，内毒素，肝配蛋白A2，肝配蛋白B2，肝配蛋白A型受体2，表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)，上皮唾蛋白，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，上皮糖蛋白2(EGP-2)，上皮糖蛋白40(EGP-40)，ERBB2，ERBB3，ERBB4，ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)，大肠杆菌，位于染色体12p的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)，呼吸道合胞病毒的F蛋白，FAP，IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)，Fc受体样5(FCRL5)，胎儿乙酰胆碱受体，纤维蛋白IIβ链，成纤维细胞活化蛋白α(FAP)，纤连蛋白外结构域-B，FGF-5，Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)，叶酸结合蛋白(FBP)，叶酸水解酶，叶酸受体1，叶酸受体α，叶酸受体β，Fos相关抗原1，卷曲受体，岩藻糖基GM1，G250，G蛋白偶联受体20(GPR20)，G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)，神经节苷脂G2(GD2)，GD3神经节苷脂，糖蛋白100(gp100)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，GMCSF受体α-链，GPNMB，GnT-V，生长分化因子8，GUCY2C，突变的热激蛋白70-2(muthsp70-2)，血凝素，甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)，乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎病毒，HER1，HER2/neu，HER3，globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)，HGF，HHGFR，高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA)，组蛋白复合物，HIV-1，HLA-DR，HNGF，Hsp90，HST-2(FGF6)，人乳头瘤病毒E6(HPV E6)，人乳头瘤病毒E7(HPV E7)，人散射因子受体激酶，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，人TNF，ICAM-1(CD54)，iCE，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IgE，IgE Fc区，IGF-1，IGF-1受体，IGHE，IL-12，IL-13，IL-17，IL-17A，IL-17F，IL-1β，IL-20，IL-22，IL-23，IL-31，IL-31RA，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6受体，IL-9，免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)，甲型流感血凝素，胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，胰岛素样生长因子2(ILGF2)，整联蛋白α4β7，整联蛋白β2，整联蛋白α2，整联蛋白α4，整联蛋白α5β1，整联蛋白α7β7，整联蛋白αIIbβ3，整联蛋白αvβ3，干扰素α/β受体，干扰素γ诱导的蛋白，白介素11受体α(IL-11Rα)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)，肠羧基酯酶，激酶结构域区域(KDR)，KIR2D，KIT(CD117)，L1-细胞粘附分子(L1-CAM)，天冬酰胺肽链内切酶，白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)，白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)，淋巴细胞抗原6(Ly-6)，Lewis-Y抗原，LFA-1(CD11a)，LINGO-1，脂磷壁酸，LOXL2，L-选择蛋白(CD62L)，淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)，淋巴细胞抗原75(LY75)，淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)，淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF)，M-CSF，乳腺分化抗原(NY-BR-1)，MCP-1，黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)，黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)，细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)，黑素瘤相关的抗原1(MAGE-A1)，间皮素，细胞表面有关的粘蛋白1(MUC1)，MUC-2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，MUC16，粘蛋白CanAg，髓磷脂相关的糖蛋白，肌肉生长抑制素，N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)，NCA-90(粒细胞抗原)，连接素-4，神经生长因子(NGF)，调节神经细胞凋亡的蛋白酶1，神经细胞粘附分子(NCAM)，神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A，NOGO-B，NOGO-C)，神经纤毛蛋白-1(NRP1)，N-羟乙酰基神经氨酸，NKG2D，Notch受体，o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)，嗅觉受体51E2(OR51E2)，癌胚胎抗原(h5T4)，由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)，穴兔，OX-40，oxLDL，p53突变体，配对框蛋白Pax-3(PAX3)，配对框蛋白Pax-5(PAX5)，泛连接蛋白3(PANX3)，P-钙粘着蛋白，磷酸钠协同转运蛋白，磷脂酰丝氨酸，胎盘特异性的1(PLAC1)，血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα)，血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)，聚唾液酸，顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES1)，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，程序性死亡-配体1(PD-L1)，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)，前列腺酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)，P15，P53，PRAME，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性的膜抗原(PSMA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，前列腺癌细胞，prostein，蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)，蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基β型9(LMP2)，铜绿假单胞菌，狂犬病病毒糖蛋白，RAGE，Ras同源物家族成员C(RhoC)，核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL)，高级糖化终产物的受体(RAGE-1)，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)，肾普遍存在的1(RU1)，肾普遍存在的2(RU2)，呼吸道合胞病毒，Rh血型D抗原，猕猴因子，肉瘤易位断点，硬骨素(SOST)，选择蛋白P，唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)，精子蛋白17(SPA17)，鞘氨醇-1-磷酸，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3)，阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)，金黄色葡萄球菌，STEAP1，黏结蛋白聚糖1(SDC1)+A314，SOX10，存活素，存活素-2B，滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)，T细胞受体，TCRΓ交替读码框蛋白(TARP)，端粒酶，TEM1，生腱蛋白C，TGF-β(例如，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3)，促甲状腺激素受体(TSHR)，组织因子途径抑制剂(TFPI)，Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))，TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)，TNF-α，TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRG，转谷氨酰胺酶5(TGS5)，肿瘤抗原CTAA16.88，肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)，肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)，肿瘤蛋白p53(p53)，MUC1的肿瘤特异性糖基化，肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TROP-2)，肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)，肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)+A327，TWEAK受体，酪氨酸酶，酪氨酸酶相关的蛋白1(TYRP1或糖蛋白75)，酪氨酸酶相关的蛋白2(TYRP2)，尿空斑蛋白2(UPK2)，血管内皮生长因子(例如，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，PIGF)，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，波形蛋白，v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)，血管性假血友病因子(VWF)，肾母细胞瘤蛋白(WT1)，X抗原家族成员1A(XAGE1)，β-淀粉样蛋白，κ-轻链，成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)，雌激素调节的LIV-1蛋白(LIV1，又称SLC39A6)，神经营养性的受体酪氨酸激酶1(NTRK1，又称TRK)，Ret原癌基因(RET)，B细胞成熟抗原(BCMA，又称TNFRSF17)，转铁蛋白受体(TFRC，又称CD71)，活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM，又称CD166)，生长抑素受体2(SSTR2)，KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(cKIT)，V-Set免疫调节性受体(VSIR，又称VISTA)，糖蛋白Nmb(GPNMB)，δ样典型Notch配体3(DLL3)，白介素3受体亚基α(IL3RA，又称CD123)，溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)，钙粘着蛋白3类型1,P-钙粘着蛋白(CDH3)，肝配蛋白A4(EFNA4)，蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，溶质载体家族34成员2(SLC34A2，又称NaPi-2b)，GCC，含有PLAUR结构域的3(LYPD3，又称LY6或C4.4a)，粘蛋白17，细胞表面有关的(MUC17)，Fms有关的受体酪氨酸激酶3(FLT3)，NKG2D配体(例如ULBP1，ULBP2，ULBP3，H60，Rae-1α，Rae-1β，Rae-1δ，Rae-1γ，MICA，MICB，hHLA-A)，SLAM家族成员7(SLAMF7)，白介素13受体亚基α2(IL13RA2)，C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A，又称CLL-1)，CEA细胞粘附分子5(CEACAM，又称CD66e)，白介素3受体亚基α(IL3RA)，CD5分子(CD5)，UL16结合蛋白1(ILBP1)，含有V-Set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1，又称B7-H4)，硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，黏结蛋白聚糖1(SDC1，又称CD138)，白介素1受体辅助蛋白(IL1RAP)，含有杆状病毒IAP重复的5(BIRC5，又称存活素)，CD74分子(CD74)，甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1，又称TIM1)，SLIT和NTRK样家族成员6(SILTRK6)，CD37分子(CD37)，凝血因子III，组织因子(CD142，又称F3)，AXL受体酪氨酸激酶(AXL)，内皮素受体类型B(EDNRB，又称ETBR)，钙粘着蛋白6(CDH6)，成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)，碳酸酐酶6(CA6)，MUC1的CanAg糖型，整联蛋白亚基αV(ITGAV)，畸胎癌衍生的生长因子1(TDGF1，又称Crypto 1)，SLAM家族成员6(SLAMF6，又称CD352)，和Notch受体3(NOTCH3)。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的多肽，其中所述AF2以在约0.1nM和约100nM之间的Kd特异性地结合所述靶细胞标志物，如在包含所述靶细胞标志物的体外抗原结合测定中所确定的。
49.根据权利要求42-48中任一项所述的多肽，其中所述AF2对所述靶细胞标志物的结合亲和力比所述AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含对所述靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的CDR。
51.根据权利要求49所述的多肽，其中所述AF2的CDR选自SEQ ID NO:719-918的序列。
52.根据权利要求42-51中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含对所述靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH。
53.根据权利要求52所述的多肽，其中所述VL选自SEQ ID NO:819-918的序列，且所述AF2的VH选自SEQ ID NO:719-818的序列。
54.根据权利要求30-53中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含第二释放区段(RS2)，其中所述RS2是哺乳动物蛋白酶切割的底物。
55.根据权利要求54所述的多肽，其中所述RS2是选自天冬酰胺肽链内切酶、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase的蛋白酶的底物。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的多肽，其中所述RS2包含与选自SEQ ID NO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的多肽，其中所述RS1和RS2的序列是相同的。
58.根据权利要求54-56中任一项所述的多肽，其中所述RS1和RS2的序列是不同的。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的多肽，其中所述RS1和RS2各自是多种蛋白酶在每个释放区段序列内的一、二或三个切割位点处切割的底物。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含第二延长重组多肽(XTEN2)，其中所述XTEN2的特征在于
a.它具有至少约100个氨基酸；
b.所述XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和
c.它具有至少4-6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。
61.根据权利要求60所述的多肽，其中所述XTEN2包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％包含选自SEQID NO:661-664中的至少三个的不重叠序列。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的多肽，其中所述XTEN2包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个如在表7中所示。
64.根据权利要求60-63中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有如下的从N-端至C-端结构排列：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-双体-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-双体-RS2-XTEN2，其中所述双体包含所述AF1和AF2的VL和VH，其中所述AF1特异性地结合CD3且AF2特异性地结合靶细胞标志物，且其中XTEN1和XTEN2具有不同的氨基酸长度或序列。
65.一种多肽，所述多肽包含RS1、RS2、AF1、AF2、XTEN1和XTEN2，其中：
a.所述RS1和所述RS2各自是哺乳动物蛋白酶切割的底物且各自包含与选自SEQ IDNO:42-660的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
b.所述AF1是对CD3具有结合特异性的单克隆抗体的抗原结合片段；
c.所述AF2是抗原结合片段，该片段包含对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH；
d.所述XTEN1包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
e.所述XTEN2包含与选自SEQ ID NO:665-718和922-926的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
f.所述多肽具有如下的从N-端至C-端结构排列：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1或XTEN2-RS2-双体-RS1-XTEN1，其中所述双体包含所述AF1和AF2的VL和VH；和
g.相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗体片段，所述多肽表现出较高的热稳定性，如通过在体外测定中解链温度(Tm)的增加所确定的。
66.根据权利要求65所述的多肽，其中所述AF1
a.包含重链互补决定区(CDR-H)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
b.相对于由在SEQ ID NO:41中所示的序列组成的抗原结合片段，表现出较高的热稳定性，如通过在体外测定中增加的解链温度(Tm)所确定的。
67.根据权利要求65所述的多肽，其中所述AF1包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述AF1
a.包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且
b.包含FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4，各自分别表现出与SEQ ID NO:20或21、23、24和26的氨基酸的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:20或21、23、24和26的氨基酸是相同的。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的多肽，其中所述AF1进一步包含FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，各自分别表现出与SEQ ID NO:12、13、14-17和19的氨基酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:12、13、14-17和19的氨基酸序列是相同的。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的多肽，其中所述CDR-H1和所述CDR-H2分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2；和
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
72.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:4或5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
73.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；
b.SEQ ID NO:4中的任一个的CDR-L2氨基酸序列；和
c.SEQ ID NO:6的CDR-L3氨基酸序列。
74.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述CDR-L包含：
a.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1；
b.具有SEQ ID NO:5中的任一个的氨基酸序列的CDR-L2；和
c.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
75.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述AF1包含：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
j.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
k.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的FR-L3；
l.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
m.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR-H1；
n.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
o.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
p.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
76.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述AF1包含：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
j.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
k.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的FR-L3；
l.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
m.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
n.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
o.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
p.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
77.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述AF1包含：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
j.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
k.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的FR-L3；
l.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
m.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
n.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
o.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
p.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
78.根据权利要求67-70中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含轻链框架区(FR-L)和重链框架区(FR-H)，且其中所述AF1包含：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的FR-L1；
j.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR-L2；
k.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的FR-L3；
l.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR-L4；
m.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR-H1；
n.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR-H2；
o.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR-H3；和
p.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FR-H4。
79.根据权利要求65-78中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:28或SEQID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列相同的可变重(VH)氨基酸序列。
80.根据权利要求65-79中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:27、29、30、32或33中的任一个的氨基酸序列相同的可变轻(VL)氨基酸序列。
81.根据权利要求65-80中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与SEQ ID NO:36-40中的任一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
82.根据权利要求65-81中任一项所述的多肽，其中(1)所述AF1和AF2片段各自选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)将所述AF1和AF2构造为(Fab’)2或单链双体。
83.根据权利要求65-82中任一项所述的多肽，其中所述AF1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。
84.根据权利要求65-82中任一项所述的多肽，其中所述AF1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。
85.根据权利要求65-84中任一项所述的多肽，其中所述AF1结合选自CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε片段的CD3复合物亚基。
86.根据权利要求65-85中任一项所述的多肽，其中所述AF1结合CD3ε。
87.根据权利要求66-86中任一项所述的多肽，其中所述AF1的Tm比由SEQ ID NO:41的序列组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如通过在体外测定中解链温度的增加所确定的。
88.根据权利要求65-87中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。
89.根据权利要求65-88中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出在6.0和6.6之间、包括端点的pI。
90.根据权利要求65-87中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出的pI比由在SEQ IDNO:41中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
91.根据权利要求65-90中任一项所述的多肽，其中所述AF1以在约10nM和约400nM之间的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。
92.根据权利要求65-90中任一项所述的多肽，其中所述AF1以小于约3nM、或小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM的解离常数(Kd)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。
93.根据权利要求65-90中任一项所述的多肽，其中所述AF1以比由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的AF1低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴CD3，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(Kd)所确定的。
94.根据权利要求65-93中任一项所述的多肽，其中所述AF2以在约0.1nM和约100nM之间的Kd特异性地结合靶细胞标志物，如在体外抗原结合测定中所确定的。
95.根据权利要求65-94中任一项所述的多肽，其中所述AF2对所述靶细胞标志物的结合亲和力比所述AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。
96.根据权利要求65-95中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含对所述靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的CDR。
97.根据权利要求96所述的多肽，其中所述AF2的CDR选自SEQ ID NO:719-918的序列的CDR序列。
98.根据权利要求65-95中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含对所述靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体的VL和VH。
99.根据权利要求98所述的多肽，其中所述VL序列选自SEQ ID NO:719-818的序列且VH序列选自SEQ ID NO:819-918的序列。
100.一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链互补性决定区(CDR-L)和重链互补性决定区(CDR-H)，其中所述抗原结合片段
a.特异性地结合CD3的ε亚基；并且
b.包含含有SEQ ID NO:920的VH氨基酸序列。
101.根据权利要求100所述的多肽，其中所述抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:919的VL氨基酸序列。
102.根据权利要求100或权利要求101所述的多肽，其中所述抗原结合片段由SEQ IDNO:921组成。
103.根据权利要求42-102中任一项所述的多肽，其中所述AF1通过柔性肽接头融合至所述AF2，其中
a.所述AF2特异性地结合除CD3以外的第二参考抗原，使得所述多肽是能够结合CD3和所述第二参考抗原两者的双特异性抗原结合片段；
b.相对于对照双特异性抗原结合片段，所述双特异性抗原结合片段表现出更高的热稳定性，如通过在体外测定中解链温度(Tm)的增加所确定的，其中所述对照双特异性抗原结合片段包含SEQ ID NO:41和AF2。
104.根据权利要求103所述的多肽，其中所述AF1和AF2各自表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。
105.根据权利要求103或权利要求104所述的多肽，其中所述AF1和AF2各自表现出在5.5和6.6之间、包括端点的pI。
106.根据权利要求103-105中任一项所述的多肽，其中所述AF1的pI是在所述AF2的pI的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5个pH单位内。
107.根据权利要求103-106中任一项所述的多肽，其中所述第二参考抗原是选自以下的靶细胞标志物：1-40-β-淀粉样蛋白，4-1BB，5AC，5T4，707-AP，A激酶锚蛋白4(AKAP-4)，激活素受体2B型(ACVR2B)，激活素受体样激酶1(ALK1)，腺癌抗原，脂肪分化相关蛋白，肾上腺素受体β3(ADRB3)，AGS-22M6，α叶酸受体，甲胎蛋白(AFP)，AIM-2，间变性淋巴瘤激酶(ALK)，雄激素受体，血管生成素2，血管生成素3，结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)，炭疽毒素，AOC3(VAP-1)，B细胞成熟抗原(BCMA)，B7-H3(CD276)，炭疽芽孢杆菌性炭疽，B细胞活化因子(BAFF)，B淋巴瘤细胞，骨髓间质细胞抗原2(BST2)，印迹位点的调节剂的同系物(BORIS)，C242抗原，C5，CA-125，癌症抗原125(CA-125或MUC16)，癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)，癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)，碳酸酐酶9(CA-IX)，癌胚抗原(CEA)，心脏肌球蛋白，CCCTC结合因子(CTCF)，CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CD11，CD123，CD125，CD140a，CD147(basigin)，CD15，CD152，CD154(CD40L)，CD171，CD179a，CD18，CD19，CD2，CD20，CD200，CD22，CD221，CD23(IgE受体)，CD24，CD25(IL-2受体的α链)，CD27，CD274，CD28，CD3，CD3ε，CD30，CD300分子样家族成员f(CD300LF)，CD319(SLAMF7)，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD40配体，CD41，CD44 v7，CD44 v8，CD44 v6，CD5，CD51，CD52，CD56，CD6，CD70，CD72，CD74，CD79A，CD79B，CD80，CD97，CEA相关抗原，CFD，ch4D5，染色体X开放读码框61(CXORF61)，封闭蛋白18.2(CLDN18.2)，封闭蛋白6(CLDN6)，艰难梭菌，凝聚因子A，CLCA2，集落刺激因子1受体(CSF1R)，CSF2，CTLA-4，C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)，C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)，C-X-C趋化因子受体类型4，细胞周期蛋白B1，细胞色素P4501B1(CYP1B1)，cyp-B，巨细胞病毒，巨细胞病毒糖蛋白B，达比加群，DLL4，DPP4，DR5，大肠杆菌志贺毒素1型，大肠杆菌志贺毒素2型，外-ADP-核糖基转移酶4(ART4)，含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)，EGF样结构域多倍体7(EGFL7)，突变的延伸因子2(ELF2M)，内毒素，肝配蛋白A2，肝配蛋白B2，肝配蛋白A型受体2，表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)，上皮唾蛋白，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，上皮糖蛋白2(EGP-2)，上皮糖蛋白40(EGP-40)，ERBB2，ERBB3，ERBB4，ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)，大肠杆菌，位于染色体12p的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)，呼吸道合胞病毒的F蛋白，FAP，IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)，Fc受体样5(FCRL5)，胎儿乙酰胆碱受体，纤维蛋白IIβ链，成纤维细胞活化蛋白α(FAP)，纤连蛋白外结构域-B，FGF-5，Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)，叶酸结合蛋白(FBP)，叶酸水解酶，叶酸受体1，叶酸受体α，叶酸受体β，Fos相关抗原1，卷曲受体，岩藻糖基GM1，G250，G蛋白偶联受体20(GPR20)，G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)，神经节苷脂G2(GD2)，GD3神经节苷脂，糖蛋白100(gp100)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，GMCSF受体α-链，GPNMB，GnT-V，生长分化因子8，GUCY2C，突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)，血凝素，甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)，乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎病毒，HER1，HER2/neu，HER3，globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)，HGF，HHGFR，高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA)，组蛋白复合物，HIV-1，HLA-DR，HNGF，Hsp90，HST-2(FGF6)，人乳头瘤病毒E6(HPV E6)，人乳头瘤病毒E7(HPVE7)，人散射因子受体激酶，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，人TNF，ICAM-1(CD54)，iCE，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IgE，IgE Fc区，IGF-1，IGF-1受体，IGHE，IL-12，IL-13，IL-17，IL-17A，IL-17F，IL-1β，IL-20，IL-22，IL-23，IL-31，IL-31RA，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6受体，IL-9，免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)，甲型流感血凝素，胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，胰岛素样生长因子2(ILGF2)，整联蛋白α4β7，整联蛋白β2，整联蛋白α2，整联蛋白α4，整联蛋白α5β1，整联蛋白α7β7，整联蛋白αIIbβ3，整联蛋白αvβ3，干扰素α/β受体，干扰素γ诱导的蛋白，白介素11受体α(IL-11Rα)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)，肠羧基酯酶，激酶结构域区域(KDR)，KIR2D，KIT(CD117)，L1-细胞粘附分子(L1-CAM)，天冬酰胺肽链内切酶，白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)，白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)，淋巴细胞抗原6(Ly-6)，Lewis-Y抗原，LFA-1(CD11a)，LINGO-1，脂磷壁酸，LOXL2，L-选择蛋白(CD62L)，淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)，淋巴细胞抗原75(LY75)，淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)，淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF)，M-CSF，乳腺分化抗原(NY-BR-1)，MCP-1，黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)，黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)，细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)，黑素瘤相关的抗原1(MAGE-A1)，间皮素，细胞表面有关的粘蛋白1(MUC1)，MUC-2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，MUC16，粘蛋白CanAg，髓磷脂相关的糖蛋白，肌肉生长抑制素，N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)，NCA-90(粒细胞抗原)，连接素-4，神经生长因子(NGF)，调节神经细胞凋亡的蛋白酶1，神经细胞粘附分子(NCAM)，神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A，NOGO-B，NOGO-C)，神经纤毛蛋白-1(NRP1)，N-羟乙酰基神经氨酸，NKG2D，Notch受体，o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)，嗅觉受体51E2(OR51E2)，癌胚胎抗原(h5T4)，由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)，穴兔，OX-40，oxLDL，p53突变体，配对框蛋白Pax-3(PAX3)，配对框蛋白Pax-5(PAX5)，泛连接蛋白3(PANX3)，P-钙粘着蛋白，磷酸钠协同转运蛋白，磷脂酰丝氨酸，胎盘特异性的1(PLAC1)，血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα)，血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)，聚唾液酸，顶体蛋白原结合蛋白sp32(OY-TES1)，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，程序性死亡-配体1(PD-L1)，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)，前列腺酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)，P15，P53，PRAME，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性的膜抗原(PSMA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，前列腺癌细胞，prostein，蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)，蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基β型9(LMP2)，铜绿假单胞菌，狂犬病病毒糖蛋白，RAGE，Ras同源物家族成员C(RhoC)，核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL)，高级糖化终产物的受体(RAGE-1)，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)，肾普遍存在的1(RU1)，肾普遍存在的2(RU2)，呼吸道合胞病毒，Rh血型D抗原，猕猴因子，肉瘤易位断点，硬骨素(SOST)，选择蛋白P，唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)，精子蛋白17(SPA17)，鞘氨醇-1-磷酸，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3)，阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)，金黄色葡萄球菌，STEAP1，黏结蛋白聚糖1(SDC1)+A314，SOX10，存活素，存活素-2B，滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)，T细胞受体，TCRΓ交替读码框蛋白(TARP)，端粒酶，TEM1，生腱蛋白C，TGF-β(例如，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3)，促甲状腺激素受体(TSHR)，组织因子途径抑制剂(TFPI)，Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))，TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)，TNF-α，TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRG，转谷氨酰胺酶5(TGS5)，肿瘤抗原CTAA16.88，肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)，肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)，肿瘤蛋白p53(p53)，MUC1的肿瘤特异性糖基化，肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TROP-2)，肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)，肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)+A327，TWEAK受体，酪氨酸酶，酪氨酸酶相关的蛋白1(TYRP1或糖蛋白75)，酪氨酸酶相关的蛋白2(TYRP2)，尿空斑蛋白2(UPK2)，血管内皮生长因子(例如，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，PIGF)，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，波形蛋白，v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)，血管性假血友病因子(VWF)，肾母细胞瘤蛋白(WT1)，X抗原家族成员1A(XAGE1)，β-淀粉样蛋白，κ-轻链，成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)，雌激素调节的LIV-1蛋白(LIV1，又称SLC39A6)，神经营养性的受体酪氨酸激酶1(NTRK1，又称TRK)，Ret原癌基因(RET)，B细胞成熟抗原(BCMA，又称TNFRSF17)，转铁蛋白受体(TFRC，又称CD71)，活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM，又称CD166)，生长抑素受体2(SSTR2)，KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(cKIT)，V-Set免疫调节性受体(VSIR，又称VISTA)，糖蛋白Nmb(GPNMB)，δ样典型Notch配体3(DLL3)，白介素3受体亚基α(IL3RA，又称CD123)，溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)，钙粘着蛋白3类型1，P-钙粘着蛋白(CDH3)，肝配蛋白A4(EFNA4)，蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，溶质载体家族34成员2(SLC34A2，又称NaPi-2b)，GCC，含有PLAUR结构域的3(LYPD3，又称LY6或C4.4a)，粘蛋白17，细胞表面有关的(MUC17)，Fms有关的受体酪氨酸激酶3(FLT3)，NKG2D配体(例如ULBP1，ULBP2，ULBP3，H60，Rae-1α，Rae-1β，Rae-1δ，Rae-1γ，MICA，MICB，hHLA-A)，SLAM家族成员7(SLAMF7)，白介素13受体亚基α2(IL13RA2)，C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A，又称CLL-1)，CEA细胞粘附分子5(CEACAM，又称CD66e)，白介素3受体亚基α(IL3RA)，CD5分子(CD5)，UL16结合蛋白1(ILBP1)，含有V-Set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1，又称B7-H4)，硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，黏结蛋白聚糖1(SDC1，又称CD138)，白介素1受体辅助蛋白(IL1RAP)，含有杆状病毒IAP重复的5(BIRC5，又称存活素)，CD74分子(CD74)，甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1，又称TIM1)，SLIT和NTRK样家族成员6(SILTRK6)，CD37分子(CD37)，凝血因子III，组织因子(CD142，又称F3)，AXL受体酪氨酸激酶(AXL)，内皮素受体类型B(EDNRB，又称ETBR)，钙粘着蛋白6(CDH6)，成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)，碳酸酐酶6(CA6)，MUC1的CanAg糖型，整联蛋白亚基αV(ITGAV)，畸胎癌衍生的生长因子1(TDGF1，又称Crypto 1)，SLAM家族成员6(SLAMF6，又称CD352)，和Notch受体3(NOTCH3)。
108.根据权利要求103-107中任一项所述的多肽，其中(1)所述AF2片段选自由Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)将所述AF1和所述AF2构造为(Fab’)2或单链双体。
109.根据权利要求103-108中任一项所述的多肽，其中所述AF2对所述靶细胞标志物的结合亲和力比所述AF1对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。
110.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽和一种或更多种药学上合适的赋形剂。
111.根据权利要求110所述的药物组合物，其中将所述药物组合物配制用于真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用。
112.根据权利要求111所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈液体形式或冷冻形式。
113.根据权利要求110-112中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是在用于单次注射的预充注射器中。
114.根据权利要求110所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为要在施用前重构的冻干粉末。
115.根据权利要求1-109中任一项所述的多肽在制备用于治疗受试者中的疾病的药物中的用途。
116.根据权利要求115所述的用途，其中所述疾病选自由以下组成的组：上皮癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌的任何形式、黑素瘤、生殖泌尿道癌、卵巢癌、具有恶性腹水的卵巢癌、阴道癌、外阴癌、尤因肉瘤、腹膜癌扩散、子宫浆液性癌、甲状旁腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、子宫癌、腹膜肾癌中的间皮瘤、肺癌、喉癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胃癌、小肠癌、肝癌、肝细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、脂肪肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、睾丸癌、胆管癌、骨癌、唾液腺癌、甲状腺癌、颅咽管瘤、类癌瘤、上皮癌、卵巢雄性细胞瘤、腺癌、任何起源的肉瘤、原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓细胞性白血病、B细胞衍生的慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍、重症肌无力、格雷夫斯病、卡波西肉瘤、神经母细胞瘤、桥本甲状腺炎、肾母细胞瘤或古德帕斯丘综合征。
117.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用一个或更多个治疗有效剂量的根据权利要求110-114中任一项所述的药物组合物。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：上皮癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌的任何形式、黑素瘤、生殖泌尿道癌、卵巢癌、具有恶性腹水的卵巢癌、腹膜癌扩散、子宫浆液性癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、具有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、子宫癌、腹膜肾癌中的间皮瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胃癌、小肠癌、肝癌、肝细胞癌、肝母细胞瘤、脂肪肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、唾液腺癌、甲状腺癌、上皮癌、腺癌、任何起源的肉瘤、原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓细胞性白血病、骨髓增生性赘生性障碍或骨髓增生异常障碍、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎或古德帕斯丘综合征。
119.根据权利要求117或权利要求118所述的方法，其中以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用的一个或更多个治疗有效剂量将所述药物组合物施用给所述受试者。
120.根据权利要求117-119中任一项所述的方法，其中以至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的阶段中的一个或更多个治疗有效剂量将所述药物组合物施用给所述受试者。
121.根据权利要求117-120中任一项所述的方法，其中真皮内地、皮下地、静脉内地、动脉内地、腹内地、腹膜内地、鞘内地或肌肉内地施用所述剂量。
122.根据权利要求117-121中任一项所述的方法，其中所述受试者选自由小鼠、大鼠、猴和人组成的组。
123.一种分离的核酸，所述核酸包含(a)编码根据权利要求1-109中任一项所述的多肽的多核苷酸；或(b)(a)的多核苷酸的互补物。
124.一种表达载体，其包含根据权利要求123所述的多核苷酸序列和可操作地连接至所述多核苷酸序列的重组调节序列。
125.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求124所述的表达载体。
126.根据权利要求126所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核生物。
127.根据权利要求125或权利要求126所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
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