CN113215266A - 一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法 - Google Patents

一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法 Download PDF

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Abstract

一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法，属于分子标记技术领域。本申请一方面提供了一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物，另一方面提供了一种利用引物进行快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的方法。本发明利用5S rDNA基因开发特异性分子标记，并且只需对实验样本基因组DNA进行PCR扩增就可成功对杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼及大黄鱼进行鉴定。

Description

一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及 方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法。
背景技术
小黄鱼（Larimichthys polyactis）和大黄鱼（Larimichthys crocea），均属于鲈形目（Perciformes），石首鱼科（Sciaenidae），黄鱼属（Larimichthys），是我国近海两种重要的经济鱼类，与带鱼、曼氏无针乌贼并称为四大海产。同时，二者在形态、生活习性、生长及抗逆性等方面又有着较大差异。大黄鱼性成熟期晚，个体大，抗应激性较强，但不耐低温；小黄鱼相对耐低温，但其体型小，抗应激性差。杂交育种作为重要的技术手段，在种质改良方面发挥着极其重要的作用。因小黄鱼与大黄鱼的繁殖温度不同，在自然海区尚未发现杂交现象。为进行遗传改良，本申请人利用大黄鱼（♀）和小黄鱼（♂）进行人工杂交，获得了正常生长的杂交子代（大黄鱼♀×小黄鱼♂）。
杂交子代（大黄鱼♀×小黄鱼♂）及其亲本的亲缘关系较近，外观形态相似，尤其在苗种阶段较易混淆。现有的杂交子代鉴定方法主要是根据形态学进行区分，但其准确性易受主观因素的影响，在养殖生产过程中容易造成种质的混杂。
公开号为CN106701969A的发明专利公开了一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的引物及方法，但是其鉴定的小黄鱼和大黄鱼杂交种为小黄鱼♀×大黄鱼♂，其并不能鉴定大黄鱼♀×小黄鱼♂的杂交子代。
因此，建立一种快速鉴定杂交子代（大黄鱼♀×小黄鱼♂）及其亲本（小黄鱼、大黄鱼）的特异性分子标记及方法是非常必要的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法的技术方案。
本发明具体采用以下技术方案实现：
本发明一方面提供了一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼，该引物包括引物5S-F和引物5S-R，所述引物5S-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物5S-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明一方面提供了上述引物在快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本中的应用，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼。
本发明另一方面提供了一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的方法，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼，其包括以下步骤：
1）提取大黄鱼、小黄鱼以及大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼的DNA；
2）分别以大黄鱼、小黄鱼和杂交鱼的DNA样品为模板，并使用引物5S-F和5S-R进行PCR扩增；
3）PCR反应结束后，用1.2%的琼脂糖凝胶检测扩增产物；
4）根据电泳条带大小对大黄鱼、小黄鱼和杂交鱼进行区分，其中，小黄鱼有两条特异性条带，分别为190bp和320bp；大黄鱼有三条特异性条带，分别为100bp、320bp和410bp；杂交鱼同时具有小黄鱼和大黄鱼的特异性条带，但其条带分为两种情况，分别为100bp、190bp、320bp三条带和100bp、190bp、320bp、410bp四条带。
进一步，本发明采用的PCR反应体系为：2×Taq PCR mix 10μL；Depc H2O 8μL；DNA模板 1μL；5S-F/-R各0.5μL；反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，12℃保存。
本发明利用5S rDNA基因开发特异性分子标记，并且只需对实验样本基因组DNA进行PCR扩增就可成功对杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼及大黄鱼进行鉴定。本发明克服了形态学鉴定上的不足，具有准确、高效、客观等特点，在育种工作中具有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例中PCR电泳检测结果，其中1-4：小黄鱼；5-8：杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）；9-12：大黄鱼。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步说明。
实施例
1. 实验材料
本实施例所用杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼及大黄鱼均取自象山港湾水产苗种有限公司。分别采集三种鱼类鳍条组织并保存于95％的乙醇中，用于提取基因组DNA。
2. 基因组DNA提取
利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒-离心柱型（天根生化科技有限公司）分别提取杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼及大黄鱼的基因组DNA。经超微量紫外-可见光分光光度计（Therom Fisher Scientific，NanoDrop™ One）测定，所有DNA样品的OD260/OD280比值均在1.7-1.9之间，纯度符合要求。
3. 特异性引物设计
在小黄鱼、大黄鱼基因组中分别检索获得5S rDNA序列，序列比对后设计并筛选到一对特异性引物5S-F/-R（5S-F: GCTGTGTCATCGGAGAACT（如SEQ ID No.1所示）；5S-R:CTGGAGGACAGCGGGAG（如SEQ ID No.2所示））。
4. PCR扩增
分别以杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼及大黄鱼基因组DNA为模板，利用引物5S-F/-R进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×Taq PCR mix，10μL；Depc H2O，8μL；DNA模板，1μL；5S-F/-R各0.5μL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，12℃保存。
5. 琼脂糖凝胶电泳检测
PCR反应结束后，用1.2%的琼脂糖凝胶检测扩增产物。电泳时，Marker为D2000，U=120V，I=60mA，T=30min。电泳结束后，利用凝胶成像系统检测并拍照记录电泳结果。
6. 结果分析
PCR反应结束后，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。电泳结束后，利用凝胶成像系统（BIO-RAD， BIO-RAD Gel Doc XR+）检测PCR扩增产物的长度，拍照记录电泳结果（图1）。根据电泳条带显示：小黄鱼有两条特异性条带，分别位于190bp和320bp（泳道1-4）；大黄鱼有三条特异性条带，分别位于100bp、320bp和410bp（泳道9-12）；杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）同时具有小黄鱼和大黄鱼的特异性条带，但其条带分为两种情况，分别为三条带（100bp、190bp、320bp）（泳道7-8）和四条带（100bp、190bp、320bp、410bp）（泳道5-6）。因此，通过电泳条带大小即可将杂交鱼（大黄鱼♀×小黄鱼♂）、小黄鱼以及大黄鱼区分开来。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
gctgtgtcat cggagaact 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ctggaggaca gcgggag 17

Claims (4)

1.一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的引物，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼，其特征在于该引物包括引物5S-F和引物5S-R，所述引物5S-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物5S-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的引物在快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本中的应用，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼。
3.一种快速鉴定大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼及其亲本的方法，该杂交鱼母本为大黄鱼，父本为小黄鱼，其特征在于包括以下步骤：
1）提取大黄鱼、小黄鱼以及大黄鱼与小黄鱼的杂交鱼的DNA；
2）分别以大黄鱼、小黄鱼和杂交鱼的DNA样品为模板，并使用引物5S-F和5S-R进行PCR扩增；
3）PCR反应结束后，用1.2%的琼脂糖凝胶检测扩增产物；
4）根据电泳条带大小对大黄鱼、小黄鱼和杂交鱼进行区分，其中，小黄鱼有两条特异性条带，分别为190bp和320bp；大黄鱼有三条特异性条带，分别为100bp、320bp和410bp；杂交鱼同时具有小黄鱼和大黄鱼的特异性条带，但其条带分为两种情况，分别为100bp、190bp、320bp三条带和100bp、190bp、320bp、410bp四条带。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤3）中PCR反应体系为：2×Taq PCRmix 10μL；Depc H2O 8μL；DNA模板 1μL；5S-F/-R各0.5μL；反应程序为：94℃ 5 min；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，12℃保存。
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