CN113214131A - 一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括碘代甲状腺素与氯化亚砜反应合成中间体化合物1；将所述中间体化合物1与琥珀酸酐反应合成中间体化合物2：将中间体化合物2和N‑羟基琥珀酰亚胺、缩合剂合成所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。本发明具有原料价格低廉易得、合成步骤少、操作简单、提取纯化方便、收率高的优点，首次提出了合成半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，解决了这些小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成技术领域，具体涉及的是一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法。
背景技术
目前合成半抗原琥珀酸碘代甲状腺素(T4和反T4、T3和反 T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的方法未见报道。
碘代甲状腺素是分子质量小于1000u，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原。碘代甲状腺素中有氨基、羧基和酚羟基。设计合成保留原分子结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备针对该半抗原的特异性抗体。
碘代甲状腺素是小分子半抗原，缺乏可作免疫检测夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗夹心法进行测定，只能采用竞争法模式检测，而在现行的主流化学发光免疫检测试剂盒的开发中，需要用到和半抗原碘代甲状腺素结构类似的活性衍生物试剂去和载体蛋白偶联形成抗原标记物，和待检样品中的游离抗原进行竞争反应。
因此开发出低成本、易操作和原料便宜易得的通用工艺合成半抗原碘代甲状腺素活性偶联试剂的方法非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素(包括T4和反T4、T3和反T3以及T2 和反T2)活性偶联试剂的制备方法，解决目前没有该类化合物的合成方法的技术问题。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
本发明公开了一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、碘代甲状腺素与氯化亚砜反应合成中间体化合物1；
S2、将所述中间体化合物1与琥珀酸酐反应合成中间体化合物 2：
S3、将中间体化合物2和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂3；
合成反应式为：
作为本发明实施方式的进一步改进，所述碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，所述式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1的具体步骤为把碘代甲状腺素加入到甲醇中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜，在室温反应30min，再在第一反应温度下反应第一预设反应时间，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，即中间体化合物1。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2的具体步骤为氮气保护下，把所述中间体化合物1加入第一反应溶剂中，加入 TEA，再加入DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，加入琥珀酸酐，在室温反应第二预设反应时间，反应完成后，加入适量的水和少量的稀酸溶液，适量的萃取剂萃取3次，分离萃取剂层，饱和 NaCl水溶液洗2次，干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物2和HOSU加入到第二反应溶剂中，在第二反应温度以下少量多次加入缩合剂，搅拌5min后在第三反应温度下搅拌第三反应预设时间，加适量的水，再用适量的萃取剂萃取3次，分离萃取剂层，饱和NaCl水溶液洗2次，干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为PE∶EA∶DCM＝1∶1∶1，得到白色固体粉末，即为产品半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中的第一反应溶剂和所述步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1中的所述第一反应温度为10℃-60℃；所述第一预设反应时间为2h-24h。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3中所述第二反应温度和第三反应温度为10℃-50℃；所述缩合剂为1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中所述第二预设反应时间和步骤S3中第三预设反应时间为0.5h-24h。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液或稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶过柱提纯得到所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种制备半抗原琥珀酸碘代甲状腺素(T4和反 T4、T3和反T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的通用工艺方法，不需要提纯中间体化合物1和中间体化合物2，大大缩减了处理步骤和节约了制备成本，操作简便，生产周期短，且收率高；本发明制备得到的琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂很容易和载体蛋白质中的氨基发生反应得到人工抗原，且本发明首次提出了合成半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，解决了这些小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
需要说明的是，本发明中用到的试剂缩写表示如下：
T4：四碘甲状腺原氨酸
T3：三碘甲状腺原氨酸
T2：二碘甲状腺原氨酸
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
EA:乙酸乙酯
DCM:二氯甲烷
HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
SOCl2：二氯亚砜
DMAP：4-二甲氨基吡啶
TEA:三乙胺
HCl：氯化氢
Na2SO4：硫酸钠
MgSO4：硫酸镁。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
本发明公开了一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、碘代甲状腺素与氯化亚砜反应合成中间体化合物1；
S2、将中间体化合物1与琥珀酸酐反应合成中间体化合物2：
S3、将中间体化合物2和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应合成半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂3；
合成反应式为：
其中，碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
其中，步骤S1的具体步骤为把碘代甲状腺素加入到甲醇中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜，在室温反应30min，再在第一反应温度下反应第一预设反应时间，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，即中间体化合物1。
进一步地，步骤S2的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物1加入第一反应溶剂中，加入TEA，再加入DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，加入琥珀酸酐，在室温反应第二预设反应时间，反应完成后，加入适量的水和少量的稀酸溶液，适量的萃取剂萃取 3次，分离萃取剂层，饱和NaCl水溶液洗2次，干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应。
具体地，步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物2 和HOSU加入到第二反应溶剂中，在第二反应温度以下少量多次加入缩合剂，搅拌5min后在第三反应温度下搅拌第三反应预设时间，加适量的水，再用适量的萃取剂萃取3次，分离萃取剂层，饱和NaCl水溶液洗2次，干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为PE:EA:DCM＝1∶1∶1，得到白色固体粉末，即为产品半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
优选地，步骤S2中的第一反应溶剂和步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO。
优选地，步骤S1中的第一反应温度为10℃-60℃；第一预设反应时间为2h-24h。
优选地，步骤S3中第二反应温度和第三反应温度为10℃-50℃；缩合剂为EDC·HCl。
优选地，步骤S2中第二预设反应时间和步骤S3中第三预设反应时间为0.5h-24h。
优选地，步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM。
优选地，步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
优选地，步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液，也可以是稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液等。
进一步地，步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶过柱提纯得到半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
具体例1
本发明具体例1的反应式如下：
S1、中间体化合物1的合成：氮气保护下，把T4(3g)加入到甲醇(100ml)中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜(1.5g)，再室温反应30min，再60℃反应过夜，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，无需纯化，直接用于下步反应；
S2、中间体化合物2的合成：氮气保护下，把中间体化合物1 (1.5g，1eq)加入DMF(20ml)中，加入TEA(0.54g，3eq)，再加入催化量的DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，然后加入琥珀酸酐(0.2g，1.1eq)，再室温反应过夜，反应完成后，加入适量的水和少量的稀HCl水溶液，适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和NaCl 水溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应；
S3、产物3的合成：氮气保护下，把中间体化合物2(1.8g，1eq) 和HOSU(0.3g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下少量多次加入EDC·HCl(0.5g，1.2eq)，搅拌5min后在25℃下搅拌过夜，加适量的水，再用适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和NaCl水溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为 PE:EA:DCM＝1∶1∶1，得到1.75g白色固体粉末；具体例1的三步总收率为57％，HPLC纯度98.16％，1H NMR(DMSO-d6)9.31(s,1H)，8.55(d，1H)，7.80(s，2H)，7.05(s，2H)，4.49(m，1H)，3.61(s， 3H)，3.01(m，1H)，2.79(m，9H)。
具体例2
步骤S1、中间体化合物1的合成：氮气保护下，把T3(5g，1eq) 加入到甲醇(100ml)中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜(2.7g， 3eq)，再室温反应30min，再60℃反应过夜，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，无需纯化，直接用于下步反应；
步骤S2、中间体化合物2的合成：氮气保护下，把中间体化合物1(3g，1eq)加入DMF(40ml)中，加入TEA(1.3g，3eq)，再加入催化量的DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，然后加入琥珀酸酐(0.473g，1.1eq)，再室温反应过夜，反应完成后，加入适量的水和少量的稀HCl水溶液，适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和 NaCl水溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应；
步骤S3、产物3的合成：氮气保护下，把中间体化合物2(1.7g， 1eq)和HOSU(0.31g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下少量多次加入EDC·HCl(0.52g，1.2eq)，搅拌5min后在25℃下搅拌过夜，加适量的水，再用适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和NaCl 水溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为 PE:EA:DCM＝1∶1∶1，得到1.53g白色固体粉末；三步总收率54％， HPLC纯度97.43％，1H NMR(DMSO-d6)9.99(s,1H),8.54(d，1H)， 7.78(s，2H)，6.95(d，1H),6.82(d，1H),6.59(dd，1H)，4.50(m，1H)，3.61(s，3H)，3.02(m，1H)，2.80(m，9H)。
具体例3
S1、中间体化合物1的合成：氮气保护下，把T2(5g，1eq)加入到甲醇(100ml)中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜(3.4g，3eq)，再室温反应30min，再60℃反应过夜，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，无需纯化，直接用于下步反应；
S2、中间体化合物2的合成：氮气保护下，把中间体化合物1(2g， 1eq)加入DMF(20ml)中，加入TEA(1g，3eq)，再加入催化量的DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，然后加入琥珀酸酐(0.42g， 1.1eq)，再室温反应过夜，反应完成后，加入适量的水和少量的稀 HCl水溶液，适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和NaCl水溶液洗2 次，无水Na2SO4干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应；
S3、产物3的合成：氮气保护下，把中间体化合物2(1.8g，1eq) 和HOSU(0.4g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下少量多次加入EDC·HCl(0.65g，1.2eq)，搅拌5min后在25℃下搅拌过夜，加适量的水，再用适量的EA萃取3次，分离EA层，饱和NaCl水溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为 PE:EA:DCM＝1∶1∶1，得到1.78g白色固体粉末；三步总收率56％， HPLC纯度98.87％，1H NMR(DMSO-d6)9.10(s,1H),8.53(d，1H)， 7.77(s，2H)，6.68(d，2H),6.51(d，2H),4.47(m，1H)，3.62 (s，3H)，3.02(m，1H)，2.82(m，9H)。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种制备半抗原琥珀酸碘代甲状腺素(T4和反 T4、T3和反T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的通用工艺方法，不需要提纯中间体化合物1和中间体化合物2，大大缩减了处理步骤和节约了制备成本，操作简便，生产周期短，且收率高；本发明制备得到的琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂很容易和载体蛋白质中的氨基发生反应得到人工抗原，且本发明首次提出了合成半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，解决了这些小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
Claims (10)
1.一种半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、碘代甲状腺素与氯化亚砜反应合成中间体化合物1；
S2、将所述中间体化合物1与琥珀酸酐反应合成中间体化合物2：
S3、将中间体化合物2和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂3；
合成反应式为：
2.根据权利要求1所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，所述式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
3.根据权利要求1所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为把碘代甲状腺素加入到甲醇中，降温至0℃以下，滴加氯化亚砜，在室温反应30min，再在第一反应温度下反应第一预设反应时间，反应完成后降温至室温，旋蒸除去溶剂得到土黄色产品，即中间体化合物1。
4.根据权利要求3所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为氮气保护下，把所述中间体化合物1加入第一反应溶剂中，加入TEA，再加入DMAP，搅拌溶解后，冷却至0℃以下，加入琥珀酸酐，在室温反应第二预设反应时间，反应完成后，加入适量的水和少量的稀酸溶液，适量的萃取剂萃取3次，分离萃取剂层，饱和NaCl水溶液洗2次，干燥，旋转蒸发仪中除去溶剂后直接用于下步反应。
5.根据权利要求4所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物2和HOSU加入到第二反应溶剂中，在第二反应温度以下少量多次加入缩合剂，搅拌5min后在第三反应温度下搅拌第三反应预设时间，加适量的水，再用适量的萃取剂萃取3次，分离萃取剂层，饱和NaCl水溶液洗2次，干燥，然后过柱提纯，洗脱剂为PE:EA:DCM＝1:1:1，得到白色固体粉末，即为产品半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
6.根据权利要求5所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的第一反应溶剂和所述步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO。
7.根据权利要求3所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的所述第一反应温度为10℃-60℃；所述第一预设反应时间为2h-24h。
8.根据权利要求5所述的半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述第二反应温度和第三反应温度为10℃-50℃；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
9.根据权利要求5所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述第二预设反应时间和步骤S3中第三预设反应时间为0.5h-24h；
所述步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM；所述步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
所述步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液或稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液。
10.根据权利要求5所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶过柱提纯得到所述半抗原琥珀酸碘代甲状腺素活性偶联试剂。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0576095A1 (en) * | 1992-06-26 | 1993-12-29 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Immunoassays with labeled thyronine hapten analogues |
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2021
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0576095A1 (en) * | 1992-06-26 | 1993-12-29 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Immunoassays with labeled thyronine hapten analogues |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 宋小礼等: "N-叔丁氧酰基-O-烷基-L-酪氨酸甲酯的合成工艺研究", 《 西南大学学报（自然科学版）》 * |
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